Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli) ppt

Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn Các chủng E... coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp.. Sự khác nhau giữa các

Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn

(Các chủng E coli )

Nhà máy E coli

Nhà máy E coli

E coli là loài vật chủ vi khuẩn

Gram âm được ưa chuộng nhất

trong sản xuất protein tái tổ hợp

Một trong những lý do là vì những

thao tác kỹ thuật với E coli khá dễ

dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm Thông thường, tất cả các

chủng E coli dùng trong biểu hiện đều xuất phát từ chủng E coli K-12

hay B Sự khác nhau giữa các

chủng biểu hiện được phát triển và thương mại hiện nay là nhằm để

giảm thiểu những vấn đề biểu hiện nhất định (xem chi tiết ở bảng phía dưới) Rất nhiều hệ thống promoter

đã được thiết kế cho việc biểu hiện protein tuy nhiên chỉ có một số ít

trở nên phổ biến và thương mại

Một promoter hữu ích phải có khả năng biểu hiện mạnh, có một mức

độ biểu hiện nền thấp và dễ dàng

chuyển nạp giữa các chủng E

coli khác nhau Ngoài ra quá trình

cảm ứng cũng cần đơn giản và rẻ tiền

Một trong những bất lợi trong việc

sản xuất protein ở E coli nhằm

mục đích liệu pháp y học là thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người Vì lý do như

vậy mà một số loài vật chủ vi

khuẩn khác như Caulobacter,

Staphylococcus và Streptomyces

được lựa chọn để biểu hiện protein Các chủng vi khuẩn Bacillus Gram

dương cũng là vật chủ được ưa

thích, trong đó phải kể đến B

megaterium, B subtilis và B

brevis Những điểm nổi bật của các

vật chủ này là: hoạt tính protease

thấp, các plasmid tương đối bền về

cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào, khả năng sinh trưởng trên

nhiều loại cơ chất khác nhau và

hiệu suất biểu hiện cực cao Trong

đó, B subtilis được nghiên cứu sâu

và ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài còn lại Mức độ biểu hiện cao nhất là

đạt được ở chủng đột biến sacUh

Chủng WB800 bị bất hoạt tất cả

các protease ngoại bào và đã được tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và lên men quy mô lớn, tuy nhiên hiện giờ

chưa được thương mại hóa Các

plasmid với promoter của operon xylose được sử dụng rộng rãi và

cho mức độ biểu hiện gene cao

nhất Những gene này có thể được cảm ứng từ 130 đến 350 lần với

0.5% xylose

Các sản phẩm protein được tạo ra thường hay kém tan hoặc nằm

trong các thể không tan (inclusion bodies) Để khắc phục điều này,

bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôi

cấy khi cảm ứng xuống tới 16°C, thay thế các amino acid, biểu hiện đồng thời với các chaperone, sử

dụng đoạn amino acid kèm có tính

ưa nước cao, bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy sorbitol, glycyl

betain, sucrose, hoặc raffinose, thay đổi pH của môi trường nuôi cấy và sau cùng có thể đổi chủng vi khuẩn khác Tuy nhiên, bạn có thể chọn cách khác là hòa tan trở lại và tái

tạo cấu trúc của protein trong thể

không tan để thu được protein có hoạt tính Việc giảm nồng độ chất cảm ứng thi thoảng cũng có hiệu

quả

Để tăng cường khả năng biểu hiện các protein eukaryote hoặc protein

có chứa codon hiếm ở E coli, bạn

có thể lựa chọn những chủng E

coli đã được cải biến di truyền phù

hợp với mục đích này Ngoài vấn

đề vật chủ, promoter, thì số lượng bản sao plasmid cao, thấp hay trung

bình cũng liên quan đến mức độ

biểu hiện Khi gắn protein tái tổ

hợp với một đoạn cài (tag) lớn có thể làm tăng tính tan của tổng thể protein Các đoạn cài liên kết

maltose hoặc đoạn cài Sumo

(Sumo-tags) có khả năng làm

protein tan cực tốt, tuy nhiên lại kết vón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏi protein tái tổ hợp Protein với các cầu disulfide thường được tiết ra

vùng ngoại vi bào chất (periplasm) thay vì trong tế bào chất

(cytoplasm) Để định hướng tiết

protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất, protein tái tổ hợp cần

được gắn một đoạn peptide dẫn

đường (leader peptide) ở phía đầu

N Thông thường các chủng E

coli K-12 hoặc B thường sử dụng

cơ chế tiết protein kiểu I và kiểu II với các signal peptide sau: Lpp,

LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE, SpA và Tat

Đọc đến đây có thể nhiều bạn

muốn đặt câu hỏi: Vậy hệ thống

biểu hiện nào tốt nhất? Câu trả lời

có lẽ làm bạn không hài lòng

là Không có hệ thống nào là tốt

nhất cho mọi trường hợp Xin

đừng thất vọng! Tuy nhiên, nếu

không thì việc thiết kế biểu hiện

protein sẽ trở nên một công việc tẻ nhạt chứ không nâng tầm thành

một "nghệ thuật biểu hiện gene"

như hiện nay Vậy xin nhớ kỹ quy

tắc ngón tay cái: kiểm tra trình tự

protein trước tiên và sau đó lựa chọn một hệ biểu hiện phù hợp