Phân lập đoạn gen CP từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

1. Đặt vấn đềĐậu tương (Glycine max(L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệpvà có tác dụngcải tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa caodo mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễbị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá(Soybean mosaic virus –SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –BYMV) vàmột sốvirus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớnnhất đến cây đậu tương.SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ dorệp là môi giớivàvirus có thểtruyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm pháttriển, số lượng quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương. Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoavà 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém 87. Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt 95.Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trênthường có hiệu quả 2thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loàiSMV và BYMV là sử dụngcác giống đậu tương kháng bệnh, nhưngnguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi trong chiến lược tạo cây chuyểngen kháng virus 3, 31, 98.Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôitiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị

kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải tạo đất trồng và bảo vệ môi trường Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ

bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus – SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus – BYMV) và một số virus gây bệnh khác Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương

SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là môi giới và virus có thể truyền qua hạt Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi

ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87] Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt [95]

Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV Do đó các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả

thấp và tốn nhiều công sức Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV

và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế Chính

vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi)

RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng

để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây đậu tương bằng kỹ thuật RNAi

2.2 Mục tiêu cụ thể

(i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu

tương Việt Nam

(ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của

SMV và cả hai loài SMV và BYMV

(iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen;

(iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV Phân tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen

CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân

hàng gen quốc tế

3.2 Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác nhau Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP

3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của

SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway Biến nạp

vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A tumefaciens

3.4 Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá Phân tích sự có mặt của đoạn

gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ

thuật PCR Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen

so với cây đối chứng không chuyển gen

3.5 Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A tumefaciens Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương

chuyển gen

4 Những đóng góp mới của luận án

4.1 Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã

được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103 4.2 Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV

4.3 Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng cả hai loài SMV và BYMV

4.4 Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Về khoa học

Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi

chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV,

BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và

BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa

học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi

5.2 Về thực tiễn

Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương

đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc

RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng

dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam

Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và

BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng

ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương

Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) Đậu tương là

loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất Hạt đậu tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin, tocopherol và saponin Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người [149], [158] Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể

so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82]

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây hàng năm Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm Trên rễ có

nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm

[1] Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm,

có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng

và nhiệt độ [1], [2] Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen Quả thẳng

hoặc hơi cong Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt Hạt đậu tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt Vỏ hạt thường nhẵn

và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… nhưng đa số là hạt màu vàng Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2]

Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu

và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể Đậu tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Cây đậu tương ở nước ta được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng 65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông Hồng Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với những năm trước Nguồn giống đậu tương kháng bệnh và chống chịu cao là một trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của ngành sản xuất đậu tương ở nước ta Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tương là cách tiếp cận mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tương hiện nay

Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus, như bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm

Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số

bệnh hại khác Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại

trên cây đậu tương Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm Tại những nơi bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm [17] Một số nước

có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-50%) [28], [80], [158]

Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu tương đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [80] Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung

ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [1], [12]

Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm, gây hại trên cây đậu tương, trong đó có SMV và BYMV [17], [73] SMV là loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ

Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương,

bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44] SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn

sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [85] [86] Họ Potyviridae được biết

đến là có số lượng loài lớn nhất trong các loài virus gây bệnh ở thực vật Nếu

nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng

hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145] Những cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145] SMV có thể lây nhiễm qua hạt với

tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật và thời gian bị nhiễm [104]

Phản ứng khác biệt của giống về sức đề kháng với SMV được biểu hiện

ở hiện tượng cây đậu tương mẫn cảm với bệnh khảm hoặc khảm hệ thống (S), chết hoại (N), và không có triệu chứng hoặc kháng (R) Quan sát này đã được Cho và Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành các nhóm, chủng SMV từ G1 đến G7 [49]

BYMV là loài virus cũng thuộc nhóm Potyvirus, có thể tìm thấy ở các cây thuộc họ đậu đỗ (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, …) và một số loài thực vật khác [28], [80] Khi cây đậu tương nhiễm BYMV sẽ xuất hiện những vết khảm và đường biến vàng ngoằn ngoèo trên bề mặt lá, làm cây không phát triển được và dẫn tới bị chết Bệnh khảm vàng do BYMV cũng gây thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, đặc biệt đối với các cây đậu đỗ, trong

đó có đậu tương [137] Khi cây bị nhiễm BYMV, năng suất hạt đậu tương bị giảm, một số trường hợp có thể giảm tới 74% - 80% [96]

Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt Ảnh hưởng của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm

từ 66% - 80% [80], [91] Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine

đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển

vi điện tử và kỹ thuật ELISA [103] Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào cây chủ [142] Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [41]

1.1.2 Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tương

SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc

có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp Virus và cơ thể côn trùng có

mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng truyền bệnh một cách nhanh chóng Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [12], [13]

SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây SMV di chuyển trong tế bào chất

và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào Sau 3 ngày virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá kép và một phần đoạn thân sát gốc [80], [145] Sau 5 ngày virus nhiễm hết dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn

bộ cây Virus có thể nhiễm qua nhân giống vô tính, qua hạt giống, qua phấn hoa, hoặc qua côn trùng [108] Cách thức truyền virus gây bệnh qua trung gian làm cho cây đậu tương có khả năng nhiễm bệnh rất cao, khi cây trưởng thành

có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau [80], [161]

SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [80], [91] Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)) Đời sống của Potyvirus sau khi xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã,

xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và các cây khác [145] Quá trình xâm nhiễm của SMV và BYMV cùng với quá trình nhân lên của RNA được mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1 Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm và nhân lên của SMV và

BYMV vào tế bào cây đậu tương

1. Virus xâm nhập vào tế bào qua màng; 2. Phân tử RNA (+) của virus được giải phóng vào nhân tế bào chủ; 3 RNA (+) virus làm khuôn để tổng hợp sợi RNA(-); 4. RNA (-) phiên

mã tổng hợp mRNA; 5. mRNA dịch mã tạo các protein của virus; 6. RNA(-) làm khuôn tổng hợp các RNA (+) tức hệ gen virus; 7. Các phân tử RNA(+) kết hợp với protein vỏ tạo thành các virus mới; 8. Virus phá vỡ màng tế bào ra ngoài và xâm nhiễm vào các tế bào khác

1.1.3 Hệ gen của SMV và BYMV

1.1.3.1 Đặc điểm hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirus

Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đường kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ được sắp xếp đối xứng, xoắn ốc xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương có khoảng 10.000 nucleotide Hệ gen RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A và một protein virion kết nối gen (VPg) ở đầu 5’ RNA virus được dịch mã tạo ra một polyprotein được phân cắt bởi protease tạo thành ít nhất 10 phân tử protein [93]

Các gen trong hệ gen của virus đang được sử dụng ngày càng nhiều để phân tích các loài virus và các chủng virus khác nhau Jayaram và đtg (1992)

đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của các chủng SMV G2 và G7

và trình tự CP của của một số chủng SMV cũng được mô tả [93] Các vùng trong hệ gen của các Potyvirus chứa hầu hết các gen mã hóa protein thể vùi ở dạng hình trụ (Cl), gen RNA polymerase - phụ thuộc- RNA (POL hoặc Nib

và gen protein vỏ (CP) [93], [132] Các protein 21K và 27K ở SMV là giống như protein NIa ở TEV và VPg, NIa, PI, P3 và HC-Pro là các loại protein chịu trách nhiệm về hoạt động xử lý protein sau khi được tổng hợp [61], [93]

Nghiên cứu của Jayaram & đtg (1992) lưu ý rằng sự khác biệt lớn nhất

về trình tự NIa giữa các dòng SMV G2 và G7 biểu hiện ở vùng đầu 5' của hệ gen virus, chủ yếu ở ở các gen PI, P3, Cl và HC - Pro của hệ gen virus [93]

Kim & đtg đã sử dụng enzyme giới hạn EcoRI để cắt các sản phẩm RT-PCR

của gen Cl phân lập từ SMV và phân biệt được năm chủng (G5H, G5, G3, G6

và G7) [102] Các chủng gây bệnh đốm vòng đu đủ Potyviruses và virus khảm

xà lách cũng đã được phân loại bằng cách sử dụng enzyme giới hạn [35], [109]

Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) (Hình 1.2) Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm

10 chuỗi polypeptid giống như ở SMV [182]

Won-Seok Lim và đtg (2003) đã thông báo trình tự nucleotide hoàn chỉnh của hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide (chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng So sánh trình tự amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho thấy sự tương đồng lớn giữa chúng Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và

trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99% [168] Trình tự đầy đủ các nucleotide của các chủng này có thể cung cấp những cơ sở

để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm ở cây đậu tương,

từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho cây đậu tương

Hình 1.2 Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease

Bản đồ được xây dựng dựa trên cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo Jayaram và đtg, 1992 [95] Các hộp đề cập đến các gen khác nhau và UTR là vùng chưa dịch mã ở 5 'và 3' Các số ở dưới đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein và các con số trong ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen của SMV G2 và G7 CP là protein vỏ của virus, CI là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và protease; NIb là RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là protease; VPg là

protein liên kết

Gen P1 mã hóa proteinase serine, tương tự trypsin – nằm ở đầu N của polyprotein tự động tách từ polyprotein P1 không có vai trò sự lây nhiễm virus vào tế bào chủ mà nó kích thích sự tái bản hệ gen và cùng với HC-Pro hoạt động theo hướng tăng cường khả năng gây bệnh bằng cách ức chế gen của tế bào chủ [159]

HC - Pro là một proteinase nhiều thành phần tham gia vào quá trình lây nhiễm virus của rệp, khuếch đại gen và vận chuyển polyprotein trong cây chủ Kasschau và đtg (1997) đưa ra giả thuyết rằng, HC-Pro có thể hoạt động như

một chất ức chế sao chép, hạn chế phản ứng phòng vệ và vận chuyển trong cây chủ [99] HC-Pro của virus khảm đậu tương ức chế sự tích lũy mRNA ở cây chủ trong sự thúc đẩy việc lây nhiễm virus ở phôi hạt đậu non [164] Vùng trung tâm của HC-Pro có chức năng trong sự di chuyển của virus trong cây thuốc lá và có liên quan đến sự ức chế làm bất hoạt gen sau phiên mã

[99] Mặc dù đã có nghiên cứu về gen Rsv4 kháng SMV trên cây đậu tương,

nhưng vai trò tiềm năng của HC-Pro trong sự tương tác của SMV với cây đậu tương vẫn chưa được nghiên cứu nhiều

Chức năng của sản phẩm từ gen P3 không được biết nhiều, nhưng nó được cho là có vai trò trong sự lây nhiễm của virus và được minh chứng bằng kết quả nghiên cứu đột biến liên quan đến việc gây cảm ứng héo ở cây [159]

Gen mã hóa protein Cl của các Potyvirus có chức năng trung gian trong

sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác trong cây chủ Sự thay thế amino acid ở vùng đầu N của protein Cl đã ức chế sự di chuyển của virus trong

cây Nicotiana tabacum Xanthi [47] Protein Cl của Potyvirus hạn chế các cấu

trúc có tổ chức đặc biệt, các thể vùi, gắn vào plasmodesmata ngay sau khi nhiễm virus [90]

Gen NIa mã hóa protein NIa bao gồm cả VPg và miền proteinase ở vùng đầu C NIa nằm ở thể vùi trong nhân tế bào bị nhiễm VPg của nhiều Potyvirus được cho là có liên quan đến sự di chuyển của virus [140], [116] VPg liên kết với màng và có liên quan đến việc nhân lên của virus [135] NIb là RNA

polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) cần cho sao chép của hệ gen và protein

này có liên quan đến hoạt động liên kết với RNA [159]

Bằng chứng về tầm quan trọng của VPg là sự kháng lại sức đề kháng đối với Potyvirus của thực vật khi nghiên cứu TVMV ở các giống thuốc lá

Burley TN86 [119] và ở Pea seed-borne mosaic virus (PSMV; chi Potyvirus) trên cây Pisum sativum [100] Những phát hiện từ kết quả nghiên cứu TVMV

đã chỉ ra rằng, có sự thay đổi ở một trong bốn amino acid ở miền 6 amino acid (Cys, Ser, Lys, và Ser ở các vị trí tương ứng là: 1928, 1929, 1932 và 1923) của vùng TVMV-S VPg có chức năng phá vỡ sức đề kháng virus của cây chủ Đây là báo cáo đầu tiên về yếu tố quyết định trong vùng mã hóa của protein VPg ở virus có liên quan đến sự phá vỡ khả năng kháng bệnh ở cây

Sự thay đổi amino acid có thể phá vỡ sức đề kháng đối với PVY ở cây thuốc

lá “Virgin A Mutant” cũng đã được Masuta & đtg (1998) báo cáo [116]

1.1.3.2 Gen CP và sự đa dạng của các Potyvirus

Các Potyvirus lây nhiễm trên cây họ đậu biểu hiện sự đa dạng về đặc tính sinh học hơn là sự đa dạng về trình tự nucleotide trong nucleic acid Một cách để phân biệt virus về loài, chủng là so sánh trình tự nucleotide, đặc biệt

là vùng đầu 3’ không mã hóa và trình tự gen CP Gen CP là gen đặc trưng

nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein CP và được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C Chức năng của CP thể hiện trong sự nhân lên,

capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong sự truyền virus

của rệp [159]

Thành phần và trình tự amino acid của CP là đặc trưng cho loài virus

và từng cá thể Rất ít có sự tương đồng về trình tự của CP giữa các chi virus

thực vật khác nhau Tuy nhiên, sản phẩm của các gen ở Potyvirus (trừ sản

phẩm của gen CP) lại có sự tương đồng về trình tự amino acid so với các chi

và họ virus thực vật khác Điều này cho thấy sự phân loại các thành viên của

nhóm Potyvirus có thể dựa trên trình tự gen CP và trình tự amino acid của CP

[144]

Phân tích trình tự amino acid của CP và trình tự nucleotide của gen CP

từ các Potyvirus đã được coi là công cụ mạnh mẽ không chỉ để nghiên cứu phân loại các virus thuộc chi mà còn đối với các chủng trong Potyvirus [118] Phân tích sự phát sinh loài dựa trên trình tự nucleotide của Potyvirus cho thấy,

các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng là 38% - 71% được nhận dạng

là các loài virus khác nhau; còn các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng ít nhất là 90% được nhận dạng là cùng chủng virus [144]

Trình tự gen CP phân lập từ bốn chủng SMV đã khẳng định vị trí của gen CP ở vùng đầu 3, tiếp theo là vùng chưa dịch mã (UTR) và đến đuôi polyA [93], [132] Trong vùng đầu N của CP ở Potyvirus, bộ ba amino acid DAG được biết là có liên quan đến côn trùng truyền bệnh và các vùng của CP

giữ vai trò khác nhau đối với sự di chuyển của virus trong tế bào [92] Bộ ba amino acid GRD ở vị trí 2120 đến 2122 trong protein VPg tồn tại giống nhau

ở một số Potyvirus khác nhau [82] Bộ ba amino acid GRD có ở SMV G2, nhưng không có ở SMV G7, trong đó lysine được thay thế cho arginine tại vị trí amino acid 2121, kết quả tạo ra bộ ba GKD Sự thay thế amino acid này có liên quan với khả năng kháng SMV chủng G7 ở cây đậu tương [93]

Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804

nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP

được gọi là vùng Poty-coat [93] Ở BYMV, gen CP có kích thước 933

nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong

đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272 [103] Các số liệu so sánh cho thấy có sự khác biệt lớn về kích thước và trình tự amino acid của CP, tuy nhiên lại có sự tương đồng cao về trình tự ở vùng đầu C của CP [75]

Các chủng virus cũng được phân biệt bởi những thay đổi trong hệ gen

của chúng Sử dụng enzyme giới hạn RsaI và HinfI cắt sản phẩm PCR khuếch đại gen CP từ Citrus tristeza virus (Chi Closterovirus) kết quả cho thấy đã có

sự thay đổi về trình tự gen CP [74] Sự khác biệt được xác định bằng phương

pháp PCR có liên quan chặt chẽ với sự khác biệt về mặt sinh học của virus gây

bệnh đốm vòng (Chi Ilarvirus) [77] Phân tích sự phát sinh loài cũng được sử

dụng để phân biệt Potyvirus khác nhau [35], [132]

1.2 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.2.1 Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương

Cho đến nay, các nhà khoa học đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học, bao gồm vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có

vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào,… để tạo protein tái

tổ hợp So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein

có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí thấp về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào, nên giá thành thấp

Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang được ứng dụng trên cây đậu tương và ở nhiều cây trồng khác Gần đây dữ liệu hệ gen học được phát triển dựa trên những thông tin về trình tự các gen trong hệ gen của cây đậu tương [45] và một lượng lớn thông tin về giải mã hệ gen cây đậu tương có thể tìm thấy ở Ngân hàng gen quốc tế [182] Ngoài ra, nguồn thông tin khác cũng được phát triển, như dữ liệu EST (expressed sequence tag), thư viện cDNA, microarray [182] Những nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng các tiến bộ chọn giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử và kỹ thuật chuyển gen, là cơ sở của những hiểu biết về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phương pháp di truyền ngược Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu quả ở cây đậu tương là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến lược chọn giống đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen

Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Trong đó, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông

qua A tumefaciens đã được ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây đậu

tương [56]

1.2.1.1 Chuyển gen bằng súng bắn gen vào phôi soma đậu tương

Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển đoạn DNA trực tiếp vào tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý, trong đó kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen đã được ứng dụng thành công ở cây đậu tương [171]

Chuyển gen bằng súng bắn gen ở thực vật là kỹ thuật dẫn các hạt nhỏ bằng vàng hoặc bằng tungsten được bọc bởi gen chuyển vào tế bào, mô đích [50], [171] Ưu điểm của phương pháp bắn gen là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào, nguyên liệu để bắn gen đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy,

tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh) Giống đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng kỹ thuật sử dụng súng bắn gen từ năm 1988, đến nay phương pháp chuyển gen này đã được cải tiến, phát triển và áp dụng cho hầu hết các giống đậu tương [117], [171], và hàng loạt các công bố về biến nạp thành công trên cây lúa, đu đủ, mía, bông,… những kết quả này đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp bắn gen Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm

Kể từ khi súng bắn gen được sử dụng lần đầu tiên trên cây đậu tương,

kỹ thuật chuyển gen đã đạt được thành công đối với phôi mầm hạt chưa chín [117], phôi soma [66] và đỉnh mô phân sinh [30] Phôi soma được tạo ra từ lá mầm non nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ cao và được sử dụng để tạo ra các phôi mầm có thể tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh [66] Vì quá trình hình thành mô phân sinh phụ thuộc vào kiểu gen cho nên chỉ có một số ít giống đậu tương sử dụng chuyển gen thành công Căn cứ vào tiềm năng của phôi soma, phôi tăng sinh và tái sinh cây mà giống đậu tương

“Jack” được xem là có đủ các đặc tính cần thiết cho chuyển gen và được sử

dụng để tạo ra cây đậu tương chuyển gen [154], bởi sự thay đổi quy trình nuôi cấy mô chỉ có thể khắc phục được một phần ảnh hưởng của kiểu gen đến hiệu quả chuyển gen Phôi soma là một đặc tính di truyền nhưng cũng có thể cải thiện được nhờ lai giống [125] Khả năng tạo phôi soma có thể thành công đối với các kiểu gen đậu tương khác nhau [106]

Các quá trình vật lý trong chuyển gen có xu hướng dẫn đến sự kết hợp, phân mảnh và tái cấu trúc gen chuyển, điều này đôi khi dẫn đến làm bất hoạt gen chuyển Việc sử dụng các gen thông báo và gen chỉ thị chọn lọc có thể trợ giúp làm giảm sự bất hoạt gen chuyển của hệ thống chuyển gen vật lý và tạo điều kiện cho sự phục hồi cây chuyển gen cũng như sự thể hiện của gen đích giữa hai gen chỉ thị [120]

Phôi soma đậu tương đã thu hút sự chú ý như một mô hình phôi zygotic Phôi soma tăng sinh có thể duy trì các đặc tính tái sinh trong hơn một năm và khi cần nó có thể được làm cho trở lại trạng thái biệt hóa và phát triển một cách nhanh chóng [66] Phôi soma sinh trưởng tích lũy protein dự trữ hạt

có các đặc tính như hạt đang phát triển [56] và thành phần acid béo của chúng cũng tương tự như ở hạt [57] Phôi chuyển gen thường được tạo ra sau 7 tuần

kể từ khi dùng súng bắn gen để biến nạp gen chuyển vào phôi [101], các khối

mô đồng nhất chuyển gen có thể dễ dàng và liên tục tạo ra sự biệt hóa Vì vậy phôi soma đã được sử dụng để đánh giá đặc tính của hạt chuyển gen trước khi tạo cây hoàn chỉnh, và sau đó là quá trình chọn lọc các dòng cây chuyển gen

tái sinh in vitro [84], [121]

1.2.1.2 Chuyển gen ở đậu tương nhờ vi khuẩn A tumefaciens lây nhiễm qua nách lá mầm tổn thương

Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương

pháp chuyển gen gián tiếp được thực hiện thông qua vi khuẩn đất A tumefaciens Đối với cây đậu tương, phương pháp chuyển gen nhờ A

tumefaciens được ứng dụng từ năm 1988 và hiện nay đã đạt được những thành tựu rất đáng khích lệ [87]

Chuyển gen gián tiếp ở đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium

là kỹ thuật bao gồm các bước: (i) Nghiên cứu thu thập thông tin về gen liên

quan đến đặc tính, tính trạng quan tâm và phân lập gen; (ii) Thiết kế vector chuyển gen; (iii) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (iv) Lây nhiễm vào

mô tế bào thực vật; (v) Chọn lọc các thể biến nạp và tái sinh cây biến nạp; (vi) Phân tích cây chuyển gen

Agrobacterium là loài vi khuẩn đất Gram âm gây bệnh khối u ở thực

vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên giữa các loài thực vật khác

nhau [58] Agrobacterium có thể gây ra bệnh khối u (A tumefaciens) và gây bệnh rễ tơ (A rhizogenes) phổ biến trên nhiều loài thực vật [72] A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm vào thực vật qua các vết thương và do vậy có thể coi A tumefaciens là một công cụ sử dụng để chuyển các gen mong muốn vào cây đậu tương [37] Ưu điểm của phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens là đơn giản, quen thuộc và yêu cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng

chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ cần số bản copy thấp [79]

Chuyển gen thông qua A tumefaciens ở đậu tương trong môi trường đồng

nuôi cấy được tiến hành trên nách lá mầm [87] mà khởi nguồn phương pháp

này dựa vào kiểu gen đậu tương mẫm cảm với A tumefaciens và khả năng tái

sinh cây từ nách lá mầm [123] Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm và thân chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường nuôi cấy chứa cytokinin Mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm phụ thuộc vào loại cây sử dụng chuyển gen Nhìn chung gây tổn thương nách lá mầm bằng các vết cắt và kim châm đòi hỏi phải có kỹ thuật và sự khéo léo để tạo ra đủ mô đích cho sự nhiễm khuẩn [181] Tuy nhiên, nếu sử dụng bàn chải làm từ thép không gỉ để tạo các vết thương ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt

kỹ thuật [171]

Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên mang cấu trúc gen npII đã

sử dụng kháng sinh kanamycin làm chất chọn lọc [87] và đến nay các dòng tế bào chuyển gen đã sử dụng các chất chọn lọc bởi sự kết hợp gen bar và glufosinate Nồng độ chất chọn lọc có ảnh hưởng lớn đối với tần suất chuyển gen [176], vì thế phương pháp lựa chọn chất chọn lọc là khác nhau giữa các kiểu gen đậu tương Các giống có thời gian sinh trưởng ngắn có thể sử dụng

để phát triển các dòng đậu tương chuyển gen Paz và đtg (2006), Zeng và đtg (2004) cho rằng, hiệu suất chuyển gen có thể đạt từ 0,2% đến khoảng 10% và hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kỹ thuật và kiểu gen của đậu tương [125], [176] Ở Mỹ, cây đậu tương chuyển gen chủ yếu được tạo ra từ phương pháp

chuyển gen nhờ A tumefaciens qua nách lá mầm và các các giống đậu tương

chuyển gen được cung cấp bởi các cơ sở nghiên cứu do chính phủ quản lý, bao gồm Trung tâm Plant Transformation Facility thuộc Đại học Iowa State, Trung tâm Plant Transformation Core Facility thuộc Đại học Missouri [171] Điều này đã gợi ý sự cần thiết và kinh nghiệm tổ chức và quản lý chặt chẽ quá trình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương ở các quốc gia trên thế giới, trong

đó có Việt Nam

1.2.1.3 Phân tích cây đậu tương chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung và chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm của gen chuyển phải được biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu hiện được chức năng sinh học Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và

mô chuyển gen, xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ, kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện

là mRNA, protein và phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen

chuyển Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm chuyển gen và phân tích cây chuyển gen ở sơ đồ hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ các bước chuyển gen và phương pháp phân tích cây chuyển

gen

Quá trình tạo cây chuyển gen đòi hỏi một phương tiện hiệu quả để xác định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ thống chuyển gen được sử dụng Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng gen kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ sẽ cho phép chọn được các vật liệu biến đổi gen [43] Kháng sinh hygromycin đã được sử dụng thành công như một nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn lọc các mô chuyển gen ở đậu tương, đặc biệt là các mô phát sinh phôi [88], [111] và các tế bào của nách lá mầm đậu tương [122] Điều này đã chứng minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm giảm thời gian nuôi cấy

Biện pháp tăng hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương qua nách lá mầm được thực hiện bằng cách sử dụng mức tối ưu glufosinate [176], đồng thời một hệ thống mới cũng được phát triển để chọn lọc tế bào mô phân sinh biến đổi gen từ phôi trục đạt được khả năng kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone

bằng cách đưa vào một gen đột biến của cây Arabidopsis (csr1-2) Rao và đtg

(2009) đã phát triển thành công một hệ thống chọn phôi soma bằng cách sử

dụng gen E coli dap A, mà sản phẩm của gen này có khả năng kháng

glufosinate, glyphosate, S-(2 aminetyl)-L-cysteine và imidazolinones [133]

Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho β-glucuronidase lần đầu tiên được phân lập từ E coli [95] và ngay sau khi phát hiện, nó nhanh

chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho chuyển gen ở thực vật [94]

Ngày nay, việc sử dụng gen gus trong chuyển gen thực vật ngày càng rộng

rãi, nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống cây mới [114]

Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp có thể tồn tại trong tế bào chủ ở ba trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập và (3) ổn định như một đoạn DNA của hệ gen

tế bào chủ và được nhân lên trong tế bào chủ Phương pháp sinh học phân tử

đã được ứng dụng nhằm xác định sự có mặt, sự di truyền và sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào chủ Có thể sử dụng PCR để phân tích cây chuyển gen, tuy nhiên phương pháp lai Southern blot xác định số bản sao trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất Gần đây, một kỹ thuật thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern blot trong việc phát hiện số bản sao

trong cây chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q-PCR) Q-PCR có thể

tiến hành với số lượng cây cần phân tích nhiều, do dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức [92]

Biểu hiện gen là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1)

Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân

tử protein thông qua bộ máy ribosome Để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR, real-time RT-PCR, thực hiện lai Northern blot Đối với các bệnh do virus ở thực vật người ta có thể sử dụng

kỹ thuật real-time RT-PCR để đánh giá cây chuyển gen kháng virus thông qua phiên mã để phát hiện và định lượng virus trên cây nhiễm bệnh [137] Để đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số

kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai Western blot, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme)

1.2.2 Định hướng ứng dụng và thành tựu nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

1.2.2.1 Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện các thành phần của hạt

Cải thiện hàm lượng và chất lượng protein

Kỹ thuật chuyển gen được ứng dụng nhằm tăng cường hàm lượng, chất lượng protein trong hạt đậu tương Protein đậu tương có hàm lượng dinh dưỡng được xem tương đương với protein của thịt và trứng, ngoại trừ sự khác biệt về amino acid chứa lưu huỳnh đặc biệt là methionine [65] Vì vậy để tăng cường các loại protein có hàm lượng methionine cao ở hạt đậu tương, người

ta đã chuyển gen mã hóa β-casein phân lập từ trâu, bò và zein phân lập từ ngô vào cây đậu tương theo nguyên tắc thiết kế vector chuyển gen chứa promoters biểu hiện ở hạt [112] Mặc dù chưa có thông tin về hiện tượng tăng hàm lượng amino acid tự do chứa các gốc lưu huỳnh trong hạt đậu tương, nhưng

ba loại amino acid quan trọng khác là lysine, tryptophan và threonine đã tăng đáng kể trong hạt đậu tương bởi sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme liên quan đến chuỗi phản ứng tổng hợp các amino acid này [130] Cải thiện hàm lượng các loại amino acid trong hạt đậu tương được xem là một cách tiếp cận đáng tin cậy để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu tương

Đậu tương cũng được xem là một lò phản ứng sinh học sản xuất protein

có hiệu quả nhất trong các cây trồng nông nghiệp Các protein có hoạt tính dược học như hormone sinh trưởng người, nhân tố sinh tế bào sợi và vaccine

ăn được đã được tích lũy trong hạt của cây đậu tương chuyển gen [55] Mặc

dù các loại protein có hoạt tính sinh học chiếm tới 3% so với tổng hàm lượng protein trong hạt, nhưng các loại protein có hoạt tính dược học gần như là con

số không so với hàm lượng protein dự trữ trong hạt Thay vào đó, một giải pháp khác là sử dụng các protein dự trữ chính trong hạt, -conglycinin và glycinin, như là một chất vận chuyển các peptid có hoạt tính sinh học [172] Một peptid sáu vòng có hoạt tính sinh học, novo-kinin đã được ghép vào tiểu đơn vị α của -conglycinin ở 4 vị trí bằng cách thay thế amino acid, và các hạt đậu chuyển gen chứa các protein đã được thay đổi với sự biểu hiện các đặc tính mong muốn [172]

Cải thiện thành phần dầu

Khoảng 75% lượng dầu thực vật trên thế giới từ dầu dừa, hạt đậu tương, hạt cải dầu, hạt hướng dương và một số cây trồng khác Dầu đậu tương được sử dụng rộng rãi làm dầu ăn, trong công nghiệp mực in, dầu nhờn và xăng sinh học Với mục đích cải thiện hàm lượng dầu và thành phần dầu trong hạt đậu tương người ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen Dầu được chứa trong hạt

ở dạng triacylglycerol, gen mã hóa acyltransferase đã được chuyển vào đậu tương để tăng cường sinh tổng hợp triacylglycerol kết quả làm tăng tối đa 3,2% hàm lượng dầu trong hạt [133]; hoặc tăng sự tích tụ của acid vernolic và 12-epoxy-18: 2Delta (9,15) trong hạt đậu tương chuyển gen [46]

Đặc tính của dầu được quyết định bởi thành phần lipid Các phương pháp chuyển gen có thể cung cấp nhiều lựa chọn để làm thay đổi thành phần dầu trong hạt đậu tương cho các mục đích sử dụng khác nhau Dầu đậu tương

có các thành phần palmitic, stearic, oleic, linoleic và acids linoleic [170] Hàm lượng cao của các axit béo không no trong dầu đậu tương làm cho dầu không

ổn định và có mùi khó chịu Phương pháp chuyển gen mang cấu trúc RNAi làm bất hoạt gen liên quan đến sự tổng hợp acid béo không no đã được ứng dụng để cải thiện đặc tính này ở cây đậu tương [98]

Vitamin E bao gồm các dạng khác nhau như tocopherols và tocotrienols (dạng , ,  và ) Tất cả đều có khả năng chống oxy hoá lipid, trong đó mạnh nhất là -tocophetal [42], [82] Vitamin E được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như chất chống oxy hoá, đồng thời cũng được dùng cho người và động vật để giúp phòng bệnh Trong chế biến đậu tương, tocopherols được chiết xuất cùng dầu Thành phần của chúng chỉ chiếm 1,5% hàm lượng dầu được chiết xuất, nhưng chúng có vai trò quan trọng đối với sự

ổn định và không bị oxi hoá của dầu [89] Tác động vào bước chính để chuyển đổi -tocophenol sang -tocophenol làm tăng hàm lượng - tocophenol lên 95% của tocophenol toàn phần trong hạt đậu tương chuyển gen [153]

Cải thiện một số thành phần khác

Isoflavones là các thành phần quan trọng được tổng hợp trong cây họ đậu Ngoài vai trò kiểm soát quá trình tương tác giữa cây và vi sinh vật, chúng còn được biết đến như chất nội tiết phyloustogen và các chất hoạt tính sinh học khác liên quan đến sức khoẻ con người, như có hiệu quả chống ung thư, giảm nguy cơ bệnh mạch vành [143] Saponins là một nhóm chất có cấu trúc đa dạng phân bố nhiều trong các loài thực vật Dựa trên cơ sở cấu trúc hoá học người ta đã xác định saponins ở đậu tương được phân bố trong bốn nhóm (A, B, E và DDMP) và chúng có tác dụng dược học khác nhau như chống phù lipid, chống lại sự nhân lên của tế bào ung thư trực tràng Theo Takagi và đtg (2011), gen mã hóa -amyrin synthase tham gia tổng hợp một loại chất trong quá trình sinh tổng hợp saponins của hạt đậu tương chuyển gen

đã bị ức chế bởi cơ chế RNAi [152]

Hạt đậu tương chứa số lượng lớn các acid phytic và chúng sẽ giải phóng phosphor và myoinositol trong quá trình hạt nảy mầm Cây đậu tương chuyển gen có nồng độ phosphor tăng gấp 3 lần và phytate giảm 3 lần [48]

1.2.2.2 Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện tính kháng đối với các tác nhân hữu sinh và vô sinh

Tăng cường khả năng kháng côn trùng và vi sinh vật

Protein tinh thể có tác dụng diệt côn trùng (cry hoặc -endotoxin) là

protein hoạt tính độc tố của Bacillus thuringiensis (Bt), một loại thuốc trừ sâu sinh học [151] Biểu hiện của gen cry Bt ở đậu tương đã được chứng minh là

có hiệu quả cao trong việc kiểm soát côn trùng gây bệnh [148] và kháng lại các loại bướm đã được kiểm chứng trên thực địa [162] Tuy nhiên, việc phát

hiện côn trùng có thể thích ứng với protein cry Bt đã gây nên mối lo ngại về việc sử dụng lâu dài và liều lượng cao cry Bt [117] Giải pháp cho vấn đề này

là sự kết hợp gen cry Bt với gen mã hóa protein diệt côn trùng khác để chuyển vào cây đậu tương [180]

Sản xuất đậu tương trên thế giới đã đạt được những thành tựu đáng kể

về năng suất và sản lượng, tuy nhiên ở nhiều vùng sản xuất đậu tương còn có hạn chế về năng suất, chất lượng do các tác nhân gây bệnh, như sâu bệnh, vi khuẩn, virus [81] Bệnh khảm ở cây đậu tương do SMV gây ra là loại bệnh làm thiệt hại lớn cho ngành sản xuất đậu tương, rệp là vector truyền SMV Đã

có một số nỗ lực lớn để cải thiện tính kháng SMV ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen [70], [71] Ngoài ra khả năng kháng virus gây bệnh đốm quả

và gây bệnh lùn ở cây đậu tương cũng được cải thiện bằng kỹ thuật chuyển gen [157]

Tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh

Hạn hán là yếu tố ngoại cảnh bất lợi làm giảm năng suất và sản lượng

cây trồng Cây đậu tương chuyển gen mã hóa P5CR L-Δ 1

-pyrroline-5-carboxylate reductase xúc tác cho phản ứng tổng hợp proline, dưới sự điều

khiển của promoter sốc nhiệt đã làm tăng khả năng chịu hạn và chịu nóng cao hơn so với cây đối chứng [60] Cũng hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thúy Hường và đtg (2011) đã tạo được cây đậu tương chuyển gen chứa gen

mã hóa enzyme P5CS [9] Hơn nữa, sự biểu hiện của gen mã hóa chất môi giới phân tử liên quan đến tính chống chịu ở đậu tương (soyBiPD) đã làm

chậm quá trình lão hóa của các tế bào lá đậu tương trong thời gian bị hạn [160]

Tăng cường khả năng kháng thuốc diệt cỏ

Thành công nhất trong chuyển gen ở đậu tương là tạo ra giống kháng thuốc diệt cỏ (N-phosphonomethyl-glycine; Roundup) [123] Giống đậu tương chuyển gen Rourdup Ready được thương mại hóa từ năm 1996 và được trồng ở hầu hết các vùng trồng đậu tương kể từ năm 2004 [171] Gen 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase đã được chuyển vào đậu tương làm tăng khả năng chịu glyphosate ở mức độ cao (glyphosate là chất ngăn chặn hoạt động của enzyme, xúc tác tổng hợp amino acid thơm) [124] Ngoài

ra, việc chuyển gen acetohydroxyacid synthase phân lập từ Arabidopsis, gen 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase phân lập từ Pseudomonas fluorescens,

gen phosphinothricin nacetyltransferase phân lập từ vi khuẩn đất đã tăng cường khả năng chống chịu các chất imazapyr, isoxaflutole và phosphinothricin trong thuốc diệt cỏ [107]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tạo cây đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam

1.2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm của gen liên quan đến tính chống chịu của cây đậu tương

Hai hướng tiếp cận nghiên cứu các gen liên quan đến tính chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tương được quan tâm, đó là: (1) các gen có sản phẩm liên quan trực tiếp đến tính chống chịu và (2) các gen mà

sản phẩm là protein điều hòa, kích thích hoặc ức chế nhóm gen chống chịu Các gen liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tương đã được tách dòng và xác định trình tự như gen chaperonin, dehydrin, cystatin [14], [52],

gen P5CS [11], [53], gen GmEXP1 [14],…; Theo hướng nghiên cứu nhân tố

DREB (DREB1, DREB5) kích thích quá trình phiên mã của nhóm gen chống chịu cũng được quan tâm nghiên cứu [18], [51] Những hiểu biết về đặc điểm của các gen liên quan đến đặc tính chống chịu của cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào việc nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu tương Việt Nam đối với các yếu tố ngoại cảnh bất lợi

1.2.3.2 Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen

Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương qua Agrobacterium được Trần

Thị Cúc Hòa (2007) tiến hành thử nghiệm trên 4 phương pháp lây nhiễm khác nhau, trong đó tạo vết thương tại mặt trong của nách lá mầm với dung dịch có chứa vi khuẩn được nuôi cấy ở nhiệt độ 210C là có hiệu quả, với tỷ lệ chuyển gen đạt hiệu suất cao [8] Nguyễn Thị Thúy Hường (2009) đã tối ưu quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua nách lá mầm đậu tương [10] và nhận xét rằng, giống đậu tương DT84 là đối tượng phù hợp để tiến hành các thí nghiệm chuyển gen và đã chuyển thành công cấu trúc gen RD29A/P5CSm vào giống đậu tương DT84, tạo được cây đậu tương mang gen đột biến loại bỏ ức chế phản hồi làm tăng cường khả năng tổng hợp prolin khi cây đậu tương bị hạn [9] Nguyễn Thu Hiền (2011) đã thành công tái sinh đa chồi từ nách lá mầm hạt chín của 2 giống đậu tương ĐT12 và DT84 và thử nghiệm chuyển được

gen gus, hiệu suất chuyển gen kiểm tra ở giai đoạn hạt khoảng 7,6% ở giống

ĐT12 và 4,0 % với giống DT84 [7] Kết quả đã tạo được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T1 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1, dương tính với phản ứng PCR [6] sang thế hệ T2 dòng đậu tương H11

mang đoạn gen HA1 nhận được đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp

HA1 trong hạt của dòng đậu tương này [5]

Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm đồng thời nhiều loại virus và hiện nay trong ngành sản xuất đậu tương đang tìm kiếm biện pháp có hiệu quả để phòng trừ các loại virus gây bệnh Tiếp cận ứng dụng công nghệ gen trong chiến lược tạo giống đậu tương kháng virus đang được quan tâm nghiên cứu, trong đó nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo dòng cây đậu tương chuyển gen kháng virus đặc biệt được chú trọng

1.3 KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS

Bệnh do virus thực vật thường gây hại nghiêm trọng đến năng suất, chất lượng cây trồng và rất khó phòng trị Virus gây bệnh trên thực vật rất đa

dạng về chủng loại, chủ yếu là virus RNA (SMV, BYMV, Tobaco mosaic virus - TMV, .), và cả loại virus DNA (Tomato yellow leaf curl virus - TYLCV, Cauliflower mosaic virus - CMV) Các virus này thường có phổ gây

bệnh rộng, có loài gây hại tới trên 900 loài thực vật khác nhau với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó nhận biết [26]

Biện pháp sử dụng hiện nay để phòng các bệnh do virus ở cây trồng là

sử dụng giống kháng bệnh Phương pháp chọn giống truyền thống đã có một số thành công trong việc đánh giá, tuyển chọn các giống cây trồng kháng virus cung cấp cho sản xuất, nhưng số lượng giống kháng bệnh do virus còn rất ít và hiệu quả kháng bệnh không cao Với biện pháp sử dụng nguồn gen của chính virus gây bệnh và chuyển vào cây trồng, các nhà khoa học đã thành công trong việc tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã - RNAi [26], [31], [69] RNAi là cơ chế làm ức chế gen có thể phát hiện thấy ở giới nấm, thực vật và động vật [36], [67], [165] Ở thực vật, RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tương đồng với gen đích [146]

RNAi là một quá trình sinh học trong đó các phân tử RNA ức chế biểu hiện gen bằng cách phân hủy các phân tử mRNA [67] Hiện tượng này được quan sát lần đầu tiên vào năm 1928 trên những cây thuốc lá kháng bệnh đốm

vòng do Tobacco ring spot virus gây ra sau lần lây nhiễm thứ hai [167] Năm

1986 khi nghiên cứu các cây chuyển gen Ecker và Davis nhận thấy có sự biểu

hiện ức chế phiên mã nhờ RNA ''chiều đối mã'' (antisense RNA) Tuy nhiên

vào những năm 90 của thế kỷ XX các nhà sinh học phân tử gặp khó khăn trong việc giải thích kết quả nghiên cứu mãi cho tới khi Fire và Mello khám phá ra cơ chế can thiệp RNAi - nghiên cứu này giúp họ giành Giải Nobel Y

học năm 2006 Fire và Mello cho rằng RNA mạch kép có thể làm các gen

ngừng hoạt động Cơ chế RNAi hữu hiệu đối với gen mà trình tự của nó bổ sung với những vị trí của phân tử RNA đích [59]

1.3.1 Các cơ chế RNAi ức chế gen ở thực vật

Ở thực vật có ba con đường ức chế gen bởi RNAi Con đường thứ nhất

là sự ức chế gen sau phiên mã (post-transcriptional gen silencing-PTGS) qua trung gian là siRNA (short interfering RNA) Con đường thứ hai là hiện tượng tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều chỉnh biểu hiện gen của tế bào (Hình 1.4)

Con đường thứ ba là sự câm gen phiên mã (transcriptional gene silencing - TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, nó bao gồm sự methyl hóa histone và DNA

Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là những RNA

ức chế nhỏ siRNA hay miRNA, các enzyme Dicer, Doshar và Argonaute trong phức hệ RISC

Hình 1.4 Mô phỏng các con đường làm câm gen thông qua RNAi [119]

AGO: Argonaute); dsRNA: double-stranded RNA; PTGS: posttranscriptional gene silencing; RDR: RNA dependent RNA polymerase; RISC: RNA-induced silencing complex; RITS: RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing; siRNA: short

interfering RNA; miRNA: miro-RNA; TGS: transcriptional gene silencing

Sự ức chế gen sau phiên mã thông qua siRNA

siRNA được tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer, đây là phần tử mấu chốt của cơ chế làm câm gen của RNAi Cấu trúc nguyên vẹn của phân tử siRNA rất quan trọng cho tính đặc hiệu của quá trình RNAi Hai mạch của sợi kép siRNA khác nhau về độ bền với nhiệt độ cuối cùng, một thuộc tính để nhận biết sợi đơn cần thiết trong siRNA sẽ đi vào phức hệ RISC Sự giãn xoắn của siRNA tạo ra sợi dẫn đầu (guide strand) sẽ đi vào phức hệ RISC và liên kết với mRNA đích đặc hiệu bởi sự bổ sung trình tự tương đồng Sợi còn lại được gọi là “sợi chờ” (passenger strand) và sẽ bị phân hủy sau đó Do đó sợi dẫn đầu siRNA phải tương tác với một số protein liên quan trong quá trình RNAi từ khi được tạo ra cho đến lúc nhận biết mRNA đích

Đoạn siRNA được tạo thành dài khoảng 21 – 25 nucleotide mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH với 2 nucleotide ở đầu 3’ [63] Sợi sense của mạch kép siRNA dễ bị thay đổi hóa tính hơn là sợi antisense, sự thay đổi diễn ra ở giữa

và ở phía đầu 3’ của siRNA có ảnh hưởng chặt chẽ tới tính đặc hiệu của RNAi hơn là những thay đổi ở đầu 5’ [22]

Nhiều nghiên cứu cho thấy là sợi đối mã có hoạt động quan trọng trong phức hợp sense và RNA đích Các nucleotide ở đầu 3’ cũng có ý nghĩa trong quá trình xử lý RNAi Khi tăng hoặc giảm số nucleotide đầu 3’ sẽ làm giảm hiệu quả khởi động quá trình Khi tiến hành thử thay thế nhóm 5’-PO4 bằng một nhóm chất lớn hơn như 2’-O- methyl thì kết quả ảnh hưởng nghiêm trọng đến sợi kép siRNA khởi đầu cho chuỗi phản ứng RNAi trong cơ thể Phát hiện này và một số quan sát khác đã làm rõ chức năng quan trọng của nhóm 5’-PO4 Sự có mặt của 5’-PO4 làm ổn định phức hệ RISC và rất quan trọng cho sự xác định bắt cặp chính xác của RISC và phân cắt đúng vị trí trên RNA đích Nếu vắng mặt nhóm 5’-PO4, siRNA sẽ trượt dài theo phức hệ RISC Nhóm 5’-PO4 có thể được tách ra khi quá trình phân cắt đang thực hiện trên RNA đích Một đoạn siRNA sợi kép nếu thiếu cả hai hoặc một nhóm 5’-PO4

sẽ không thể khởi đầu chuỗi RNAi trong tế bào [135] Sự có mặt của nhóm 3’-OH cũng quan trọng nhưng không thật sự cần thiết bởi sự thay đổi diễn ra

ở đầu này không gây ảnh hưởng nhiều đến quá trình RNAi

Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tương bào và là con đường quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus Trong trường hợp là virus DNA thực vật, dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối nhau [36], [76] Khi có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tương bào, Dicer - một loại ribonuclease đặc hiệu cho dsRNA lập tức cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotid, gọi là siRNA

có tiêu hao một phân tử ATP [36] siRNA tạo ra là những sợi đôi có chứa nhóm phosphat ở tận cùng đầu 5’ Sau khi bị cắt ngắn bởi dicer, chuỗi kép

siRNA được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5'

có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết với Argonaute Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA xảy ra trong phức hệ RISC, trong đó có chứa Argounaute và Helicase [141] Phân tử ATP phân tách siRNA sợi đôi để tạo thuận lợi cho RISC hoạt động, phức hệ RISC sau đó nhận biết các phân tử phiên mã mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có mặt trong phức hệ RISC [147] Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base bổ sung với trình

tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’ Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNase

Sự ức chế RNA thông qua miRNA

Ngay sau khi phát hiện ra cơ chế RNAi, người ta nhanh chóng nhận ra rằng, cơ chế này đã tồn tại trong tế bào bởi một hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (miRNA)

Sự khác biệt quan trọng giữa miRNA và siRNA trước hết là nguồn gốc của chúng, miRNA bắt nguồn từ các locus hệ gen trong khi siRNA thường bắt nguồn từ mRNA, transposon hoặc virus Thứ hai, miRNA được chế biến từ phiên mã có thể tạo cấu trúc kẹp tóc RNA trong khi siRNA được chế biến từ RNA sợi đôi dài hoặc dạng kẹp tóc kéo dài Thứ ba, sợi đôi miRNA/miRNA*được tạo ra từ tiền phân tử kẹp tóc miRNA, dẫn tới tích luỹ nhiều miRNA khác nhau từ các sợi dsRNA dài này Thứ tư, trình tự miRNA tương đối bảo thủ ở những sinh vật có quan hệ gần gũi, trong khi siRNA nội sinh hiếm khi bảo thủ [34] Những sự khác nhau này là cơ sở thực tế để phân biệt và chú giải những siRNA nội sinh và miRNA mới khám phá [29]

miRNA là một loại RNA nhỏ dài 21-24 nucleotide không mã hóa có chức năng chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp bazơ có trình tự bổ sung gần như hoàn toàn với mRNA đích [34] Cơ chế miRNA có nhiều điểm

tương đồng với cơ chế siRNA Trong tế bào sinh vật, khi những phân tử miRNA đầu tiên (gọi là pre-miRNAs) được tạo ra trong nhân qua quá trình phiên mã từ gen, pre-miRNAs được cắt gọt bởi một enzyme có trong nhân gọi

là drosha để tạo thành những sợi pre-miRNAs Các pre-miRNAs sau đó được

di chuyển ra ngoài bào tương và tương tác với enzyme dicer tạo thành miRNA rồi kế tiếp là phức hệ RISC như trình bày ở trên Ở thực vật, miRNA được tạo thành nhờ dicer và phần lớn chỉ xảy ra ở nhân, và có một protein liên kết dsRNA đặc hiệu là HYL1 miRNA động vật thường liên kết với vùng 3’ không dịch mã (untranslated region, UTR) của mRNA, trong khi miRNA thực vật có gắn kết với trình tự mã hóa và thậm chí vùng 5’ UTR của mRNA [150] Một điều đáng chú ý là, ở thực vật miRNA ức chế biểu hiện mRNA chủ yếu qua sự tiêu hủy mRNA, trong khi đó ở động vật miRNA can thiệp chủ yếu bằng cách ức chế quá trình dịch mã của mRNA [34] Độ tương đồng trong trình tự của miRNA với mRNA trong phức hệ RISC sẽ quyết định mRNA sẽ bị cắt và tiêu hủy làm bất hoạt quá trình dịch mã của mRNA Nếu trình tự của miRNA giống hệt với trình tự của mRNA, mRNA sẽ bị tiêu hủy Nếu trình tự của miRNA tính từ đầu 5' chỉ cần tối thiểu tương đồng với mRNA từ nucleotid vị trí số 2 đến số 8 thì cơ chế miRNA sẽ kích hoạt, tức là chỉ chặn đứng sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA [59]

Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp ở vùng mã hoá [33], [34], [62] Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan[33], [134], [136] Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã rộng[27] Biểu hiện của chúng

đã chứng tỏ chúng có vai trò quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới hạn áp lực môi trường [134], [150] Các kiểu biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA

có thể điều khiển nhiều quá trình lý sinh và phát triển, có thể giữ vai trò trực tiếp trong sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật [62]

Hình 1.5 Con đường ức chế gen của siRNA và miRNA [59]

Methyl hoá DNA

Con đường làm câm gen thứ ba ở thực vật có liên quan tới sự methyl hoá DNA và sự ức chế phiên mã Bằng chứng đầu tiên cho dạng câm gen này

là khám phá trên thực vật mà gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hoá DNA tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu Gần đây, những phát hiện này

đã được mở rộng bằng việc quan sát sự methyl hoá DNA thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi histone [181]

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus

RNAi là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân thực và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hoà sự phát triển, tái cấu trúc nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus [34], [78] Gần

đây, RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh

do virus gây ra ở thực vật Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus

ở thực vật [36] Nguyễn Thị Hải Yến (2012) đã sử dụng kỹ thuật RNAi bước đầu thành công trong việc tạo cây cà chua chuyển gen kháng virus khảm vàng

số gen khác, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen đích Trên cơ sở

phân tích so sánh trình tự gen của các dòng virus, chọn vùng bảo thủ để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi để chuyển vào đối tượng thực vật Phân tích cây chuyển gen và đánh giá tính kháng của các dòng cây chuyển gen, tuyển chọn dòng cây chuyển gen kháng bệnh do virus gây bệnh [26]

Ngoài ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus, kỹ thuật RNAi có thể giúp cho việc nghiên cứu chức năng của gen trong hệ gen thực vật Điều này

đã mở ra triển vọng sử dụng các thư viện siRNA để nhận biết và phân tích sự

biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan đến các bệnh của thực vật Thư viện các nhân tố RNAi có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu để phân tích chức năng hệ gen cây trồng Xây dựng thư viện RNAi của tất cả các bệnh virus trên một đối tượng cây trồng cụ thể sẽ góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus

Ứng dụng công nghệ RNAi trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus là một lĩnh vực rất mới mẻ và được cả thế giới quan tâm Việc tạo cây chuyển gen kháng virus đã mở ra một triển vọng mới trong tạo thực phẩm sạch và an toàn cho môi trường

Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (CP, Rep ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế Nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này Trong những nghiên cứu đó, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có

sự xâm nhập của virus vào cây Người ta đã nhận thấy rằng, khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo

ra sự câm gen là cao nhất [146], [166] Năm 2007, Shinichiro và đtg đã công

bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng virus cao đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này Nhìn chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus hoặc làm giảm nhẹ các triệu chứng bệnh Cũng vào năm này, Bonfim và đtg đã tạo ra được một dòng đậu tương chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với tính kháng lên đến 93% [39] Furutani và đtg (2007) đã thành công tạo cây đậu tương biến đổi gen kháng SMV bằng kỹ thuật RNAi [70]

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus mới chỉ đang được bắt đầu Từ việc tổng kết các công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong thực tiễn, Đỗ Năng Vịnh (2007) đã khẳng định RNAi là một kỹ thuật mạnh mẽ và có triển vọng to lớn trong việc ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus và là kỹ thuật có thể chủ động tạo ra các giống cây trồng kháng các bệnh do virus gây ra ở thực vật [22] Sự kết hợp kỹ thuật chuyển gen và RNAi sẽ là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc cải

thiện và tăng cường khả năng kháng virus ở cây trồng

Việc phân lập các gen thành phần của virus làm vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen để chuyển vào thực vật tạo cây chuyển gen kháng virus tại Việt Nam là rất cần thiết Chu Hoàng Hà và đtg (2004) đã phân tích tính đa dạng trên cơ sở so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam [4] Tiếp đến là nghiên cứu sự đa dạng trong trình tự gen CP của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua [23], của virus gây bệnh đốm của cây đu đủ [4], của virus Y ở cây khoai tây [16] Ứng dụng

kỹ thuật RNAi để tạo cây trồng kháng virus đã và đang được tiến hành nghiên cứu ở một số phòng thí nghiệm và thu được thành công nhất định Nhóm nghiên cứu của Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là một trong những đơn vị đi đầu và thành công trong việc ứng dụng công nghệ RNAi để tạo cây trồng kháng virus và một số dòng cây chuyển gen kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này [3], [4] Thành công đầu tiên có thể kể đến là cây thuốc lá chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus (CMV) và Tobacco mosaic virus (TMV) Những dòng thuốc lá chuyển

đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen CP của CMVvà TMV đã cho thấy

hiệu quả kháng lên tới 60% đối với hai chủng virus này Các cây biểu hiện khả năng kháng cao sau 3 lần lây nhiễm đồng thời hai chủng virus đã cho thấy khả năng kháng bệnh được duy trì cho thế hệ sau [19] Nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus, các tác giả

đã phát triển thành công 6 cấu trúc RNAi, tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng virus Cucumber mosaic virus cao [19] Tiếp đến là nghiên cứu đu đủ kháng bệnh đốm vòng do

Papaya ringspot virus Kết quả ban đầu cho thấy, trong số 45 dòng đu đủ

chuyển gen được chọn tạo, có 34/45 dòng có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng Dù trồng trong môi trường nhiễm bệnh nhưng các cây đu đủ chuyển gen vẫn phát triển mạnh, cho quả đều, đẹp, năng suất cao [3] Nguyễn Thị Hải Yến và đtg (2009, 2011) đã thiết kế cấu trúc RNAi và tạo được dòng

cà chua kháng Tomato yellow leaf curl Vietnam virus bằng kỹ thuật RNAi [24], [25]

Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng cho thấy, tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector chuyển gen Cấu trúc vector chứa nhiều gen quan trọng của Tomato yellow leaf curl Vietnam virus có khả năng kháng cao hơn cấu trúc vector chứa đơn gen virus [24], [25], [26] Điều này phụ thuộc vào một số gen virus

có khả năng ức chế con đường hoạt động của RNAi Ngoài ra còn một số loại cây trồng khác cũng đang được tiến hành nghiên cứu chuyển gen để tạo dòng cây kháng bệnh virus như đậu tương, cam, quýt, dưa hấu…

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật

Mẫu lá nghi nhiễm bệnh do SMV và BYMV ở giai đoạn cây đậu tương

ra hoa thu từ các tỉnh: Thanh Hóa, Hà Nội, Hưng Yên, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Sơn La, Hà Giang, Bắc Cạn được sử dụng trong thí nghiệm phân lập

gen CP của SMV (Hình 2.1)

Hình 2.1 Hình ảnh các mẫu lá đậu tương nghi nhiễm SMV và BYMV thu thập

từ một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam

A: Mẫu lá nghi nhiễm SMV; B: Mẫu lá nghi nhiễm BYMV; C: Mẫu lá nghi nhiễm đồng thời cả hai loài SMV và BYMV; D: Rệp ở mặt dưới lá đậu tương của cây bị bệnh khảm

Hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008 được sử dụng để thử nghiệm chuyển gen kháng SMV và BYMV Giống ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học

D C