Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR ppsx

Những thành phần đó là: - DNA mẫu template chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồiprimer, để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại xem phần tiếp theo về mồi - DNA-polymera

Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR

The PCR technique was patented by Cetus

Corporation, where Mullis worked when he

invented the technique The Taq polymerase

enzyme is also covered by patents There have been several high-profile lawsuits related to the

technique, including most famously a lawsuit

brought by DuPont The pharmaceutical

company Hoffmann-La Roche purchased the rights

to the patents in 1992 and currently holds them Thực nghiệm PCR

Figure 1: PCR machine

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA

ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base) DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi

là cặp base Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với

nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base

Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều

thành phần Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới

- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD

Đoạn mồi

Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc

của DNA cần khuếch đại Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới

Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt

độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và

sẽ cho kết quả không rõ ràng Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính Nhiệt

độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ

60 – 75°C

Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng Những đoạn mồi này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn Nó có thể thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ

những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là tương tự nhưng không giống nhau Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên chuỗi protein Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường

rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin isoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine,

T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay cytosine (Xem mã di truyền để hiểu them về

codons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR Vấn

đề có thể được giải quyết bằng phương pháp

touchdown PCR

Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C - Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50°C Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh

nghiệm cho từng trường hợp cụ thể - Tránh … - Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổ sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp với mẫu Có cả chương trình hỗ trợ việc thiết kế mồi (xem External links)

Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2)

(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA

ra Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA

thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt

độ biến tính 50°C (45-60°C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút

(3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của

bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút

[[Tập tin:pcr.png|frame|none|Figure 2: Hình 2: Chu

trình PCR dưới dạng sơ đồ (1) Nóng chảy ở 96°C (2)Gắn mồi ở 68°C (3)Kéo dài ở 72°C

(P=Polymerase) (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu

trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ

Ví dụ

Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân

đoạn 250bp của đầu C của insulin-like growth

factor (IGF)

Hỗn hợp phản ứng gồm:

 1.0 µl DNA khuôn (100 ng/µl)

 2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mỗi mồi(100 ng/µl)

 1.0 µl Pfu-Polymerase

 1.0 µl nucleotide

 5.0 µl đệm

 89.5 µl H2O

100 µl hỗn hợp phản ứng ( sử dụng ống eppendorf

200 μl) được đưa vào máy PCR

Quy trình PCR bao gồm các bước sau:

Bước 1

Khởi đầu Đun hỗn hợp ở 96°C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng DNA-Polymerase có thể có trong giai đoạn khởi đầu, hoặc nó có thể được thêm vào ngay sau bước này

Bước 2

Biến tính (Melting) 96°C trong 30 giây Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ để biến tính DNA

Bước 3

Gắn mồi (Annealing) 68°C trong 30 giây

Bước 4

Kéo dài (Elongation).72°C trong 45 giây

Bước 5

Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy nhiên với mồi và polymerase tốt, 15 đến 20 chu kỳ có thể là đủ

Bước 6

Giữ hỗn hợp ở 7°C Tại nhiệt độ này DNA sẽ không bị hư hại trong vòng 1 đêm

Figure 3: PCR product compared

with DNA ladder in agarose gel DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3) Image published with permission of Helmut W Klein, Institute of Biochemistry,

University of Cologne, Germany Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc sử dụng sắc ký gel agarose Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc nhỏ

mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy điện di trên gel Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel

từ cực âm đến cực dương Kích thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh

vói thang DNA, thang này có

chứa các DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel (hình 3)

Tối ưu hoá PCR

Do PCR rất nhạy, nên phải tránh

ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn,

virus, DNA, ) Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên

được thực hiện trong một khu vực riêng biệt Ở giai đoạn chuẩn

bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn

bị phòng riêng biệt với đèn UV Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục

đích này Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA

khác Phản ứng có kiểm soát

(kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được htực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn

[sửa]Recent developments in

PCR techniques

 A more recent method which excludes a temperature cycle, but uses enzymes, ishelicase-dependent amplification

 A style of PCR that reduces nonspecific primer annealing

is Touchdown PCR

 Real-Time PCR is a quantative PCR technique

Những ứng dụng của PCR

PCR can be used for a broad

variety of experiments and

analyzes Some examples are discussed below

Vân tay di truyền

Genetic fingerprinting is a

forensic technique used to

identify a person by comparing his or her DNA with a given

sample, e.g., blood from a crime scene can be genetically

compared to blood from a

suspect The sample may contain only a tiny amount of DNA,

obtained from a source such as blood, semen, saliva, hair, etc Theoretically, just a single strand

is needed First, one breaks the DNA sample into fragments, then amplifies them using PCR The amplified fragments are then

separated using gel

electrophoresis The overall

layout of the DNA fragments is

called a DNA fingerprint

]Kiểm tra huyết thống

Figure 4: Electrophoresis of

PCR-amplified DNA fragments

(1) Father (2) Child (3) Mother The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each

of its parents, giving it a new, unique fingerprint

Although these resulting

'fingerprints' are unique (except for identical twins), genetic

relationships, for example,

parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can

be used for paternity tests (Fig 4) A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships

between organisms

Chẩn đoán bệnh di truyền

The detection of hereditary

diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR Each gene in

question can easily be amplified through PCR by using the

appropriate primers and

then sequenced to detect

mutations

Viral diseases , too, can be

detected using PCR through amplification of the viral DNA This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual

symptoms occur Such early Tách dòng gene

Cloning a gene not to be

confused with cloning a whole organism describes the process

of isolating a gene from one

organism and then inserting it into another organism PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into

a vector (a vector is a means of inserting a gene into an

organism) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig 5) The DNA can then be transferred into a different organism where the gene and its product can be studied more closely Expressing

a cloned gene (to express a gene

means to produce the protein that

it determines the production of) can also be a way of

mass-producing usefulproteins for example, medicines

Figure 5: Cloning a gene using a

plasmid

(1) Chromosomal DNA of

organism A (2) PCR (3)

Multiple copies of a single gene from organism A (4) Insertion of the gene into a plasmid (5)

Plasmid with gene from organism

A (6) Insertion of the plasmid in organism B (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B

Gây đột biến điểm

Mutagenesis is a way of making

changes to the sequence of

nucleotides in the DNA There are situations in which one is

interested in mutated (changed)

copies of a given DNA strand, for example, when trying to

assess the function of a gene or

in in-vitro proteinevolution

Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process Site-directed

mutagenesis allows the

experimenter to introduce a

mutation at a specific location on the DNA strand Usually, the

desired mutation is incorporated

in the primers used for the PCR

program Random

mutagenesis, on the other hand,

is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process

In the case of random

mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships

of a protein By randomly

altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein

Phân tích mẫu DNA cổ

Using PCR, it becomes possible

to analyze DNA that is thousands

of years old PCR techniques

have been successfully used on animals, such as a

forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in

applications ranging from the analysis of Egyptianmummies to the identification of a

Russian tsar

Xác định kiểu gene của các đột biến

Through the use of allele-specific PCR, one can easily determine which allele of a mutation or

polymorphism an individual has Here, one of the two primers is common, and would anneal a short distance away from the

mutation, while the other anneals right on the variation The 3' end

of the allele-specific primer is modified, to only anneal if it

matches one of the alleles If the mutation of interest is a T or

C single nucleotide

polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one

containing a primer ending in T, and the other ending in C The common primer would be the same Following PCR, these two sets of reactions would be run out

on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the

individual is homozygous T,

homozygous C, or heterzygous T/C This methodology has

several applications, such as

amplifying certain haplotypes (when certain alleles at 2 or more SNPs occur together on the same chromosome [Linkage

Disequilibrium]) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic

recombination

So sánh mức độ biểu hiện của gene

Researchers have used traditional PCR as a way to estimate

changes in the amount of a gene's expression Ribonucleic

acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior

to making a protein, and those strands of RNA that hold the

instructions for protein sequence are known as messenger RNA (mRNA) Once RNA is isolated

it can be reverse transcribed back into DNA (complementary DNA

to be precise, known as cDNA),

at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT-PCR In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will

be generated When the product

of the PCR reaction are run on an agarose gel (see Figure 3 above)

a band, corresponding to a gene, will appear larger on the gel (note that the band remains in the same location relative to the ladder, it will just appear fatter or

brighter) By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest A quantative RT-PCR method has been developed, it is called Real-Time PCR