Sản xuất protein tái tổ hợp có dược tính sinh học (phần II) pot

Các bước kiểm tra cần được thực hiện để tính toán khoảng thời gian hiệu quả của cột và sản phẩm được tinh sạch để xác định các điều kiện mà protein vẫn có khả năng hoạt... Tính toán ở qu

Sản xuất protein tái tổ

hợp có dược tính sinh học (phần II)

Kiểm tra các điểm mạnh của quy trình

Các tế bào là các hệ thống phản

ứng sinh học nhỏ sản xuất hiệu quả nhiều hay ít các protein tái tổ hợp dựa vào các yếu tố đã biết hay chưa

biết Sản phẩm quá trình lên men

chứa nhiều loại protein, mặc dù quy trình đã đựơc thiết kế tốt trong giai đoạn này Điều này phụ thuộc rất nhiều vào các bước tinh sạch

Trong một quy trình hiệu quả, các chất nền cột có thể gắn nhiều

protein (10-20% nhiều hơn hay ít hơn số lượng mong đợi) Tốc độ

dòng chảy cột và số lượng mẫu có khả năng chứa có thể được mất

nhiều trong suốt quá trình chạy cột

và độ sạch của quá trình phân tách Các bước kiểm tra cần được thực hiện để tính toán khoảng thời gian hiệu quả của cột và sản phẩm được tinh sạch để xác định các điều kiện

mà protein vẫn có khả năng hoạt

động Cuối cùng, tính hiệu quả của quy trình phụ thuộc mạnh vào các thông số như pH, độ dẫn điện và

tính phân cực Nhìn chung, một cột tinh sạch linh động thì tính hiệu

quả của quy trình càng tăng thêm

Tính toán ở quy mô nhỏ

Một khi tính hiệu quả của quy trình

đã được kiểm tra, quy trình này cần lặp lại từ ba đến năm lần để xác

định các thông số, bắt đầu từ tế bào nuôi cấy đến sản xuất quy mô lớn Mục đích là để xác định độ lập lại

và tính hiệu quả của mỗi bước liên quan đến chất lương và đặc tính

của các chất trung gian và các chất thuốc ở nồng độ lớn

Sau khi vận hành thành công ở quy

mô phòng thí nghiệm, quy trình

được nâng cấp từ từ thành quy mô pilot lớn hơn gấp 10 lần quy mô

phòng thí nghiệm và sau đó là sản xuất ở quy mô lớn Tất cả các

thông số của các bước đơn rẽ được kiểm tra tất cả ngay cả khi quy

trình đã vận hành ở quy mô lớn

thành công, quy trình cần được

kiểm tra ở quy mô nhỏ một lần nữa

đễ tính toán tổ hợp các thông số kỹ thuật trong một hệ thống đầy đủ

Lúc này, khi quy trình nhỏ được

thẩm định lại quá trình làm sạch

virus phải được thực hiện

Loại bỏ virus

Một thành phần cần thiết của các nghiên cứu thẩm định quy trình của

các sản phẩm thu nhận từ tề bào

eukaryotic là hiểu được quy trình tinh sạch để loại bỏ các các thành phần virus bất hoạt bị nhiễm Các virus nhiễm vào quy trình sinh học được chia thành loại:

Các virus nội sinh tồn tại như một phần của tế bào được sử dụng

để biểu hiện sản phẩm protein (retrovirus chuột) Các virus không thuộc loại virus nội sinh là các virus từ các nguồn bên ngoài hiện diện trong các ngân hàng tế bào cao cấp (như Epstein Barr virus) Các virus ngoại sinh thường nhiễm vào sản phẩm thông qua trình sản xuất cũng như nhiễm từ nguyên liệu thô hay do tạp nhiễm

(parvovirus)

Ngày hôm nay các sản phẩm công nghệ sinh học thu nhận từ các dòng tế bào bắt buộc không có chứa bất kể thành phần virus nào Nhưng trong các quy trình sản xuất hiện nay, do thiên nhiên có thể bị nhiễm từ các nguồn virus ngoại sinh Do đó, để chắc chắn có sản phẩm an toàn, giám định các bước làm sạch virus phải trở thành một phần của quá trình sản xuất

Loại nhiễm virus

Các bước làm virus phải được giám định trứơc giai đoạn I của sản phẩm

và được thực hiện bởi chuyên gia Phương pháp chung cho các nhà

sản xuất là sử dùng các dòng tế bào

chuột lang (rodent cell lines) để

giám sát các bước tinh sạch virus

để loại bỏ hay bất hoạt các virus

gây ung thư máu ở chuột (murine leukemia virus), virus này đóng vai trò như là một mô hình chuyên biệt đối với các tiểu phần giống

retrovirus được sản xuất bởi các hệ thống biểu hiện trong dòng tế bào chuột và để thêm vào và giám sát bước tinh sạch parvo virus trong

quá trình sản xuất sản phẩm ở giai đoạn I

Sự bất hoạt virus có thể được thực hiện bằng nhiệt độ, pH, chất tẩy

rửa, phóng xạ và các dung môi sự loại bỏ virus có thể được thực hiện bằng phương pháp lọc và chạy sắc

ký

Trong một nghiên cứu giám sát

virus , được thực hiện truớc khi sản xuất các vật liệu cho giai đoạn III

củ sản phẩm, các nhà xuất sẽ chọn một quy trình bao gồm từ hai tới

bốn bước kiểm tra bổ sung Sự lựa chọn virus phụ thuộc vào dòng tế bào và nguồn gốc của môi trường bao gồm vả hai loại virus mô hình chuyên biệt và không chuyên biệt Các dòng virus được lựa chọn để bất hoạt và loại bỏ nhiều loại virus trong quá trình sản xuất mà vẫn suy trì hoạt tính và chất lượng sản

phẩm

Một virus đáng quan tâm là cũng như virus được xác định cũng như

các chủng loài virus được biệt cũng như nhiễm vào vật liệu trong quá trình sản xuất Một mô hình virus chuyên biệt cần được chính xác

nhất các chủng loại virus (cùng

chủng hay họ), có các đặc tính hoá học và vật lý tương tự nhau Cuối cùng, một mô hình virus chuyên

biệt được sự dụng để đặc tính hoá khả năng loại bỏ hay bất hoạt virus tổng số… cho thấy tính hiệu quả

của quy trình tinh sạch

Quan trọng là, virus trong hạn mục

là sự lựa chọn đầu tiên Nếu sử

dụng đã biết chính xác là điều

không thể Các nhà sản xuất chọn một mô hình virus chuyên biệt nhất

để làm một mô hình virus cần khảo

sát Để khảo sát “sự sạch của

virus”, các nghiên cứu hỗ trợ để

tính toán sự sạch của virus của một nhóm virus không chuyên biệt nào

đó Những virus này được kết hợp cac mộ hình chuyên biệt và tương đương để tạo ra một quy trình kiểm tra sự hiện diện của virus từ các bộ gene khác nhau (DNA và RNA), kích thước và các đặc tính bề mặt (virus có vỏ hay không)

Nghiên cứu về sự bổ sung virus

để giám sát

Trong nghiên cứu về sự bổ sung

virus để giám sát, các bước này

nằm trong một quá trình sản xuất với tính hiệu quả cao nhất để loại

bỏ hay bất hoạt các thành phần

virus là một thách thức khi gặp phải

số lượng virus cao Số lượng virus cao cho phép các yếu tố khử virus lớn hơn và cho phép gặp phải

những khó khăn khi làm sạch virus trong một quy trình

Với lý do đó, các văn bản hướng

dẫn cho phép lượng virus có thể bị nhiễm vào trong vật liệu ban đầu

vào bước sản xuất phải được giám sát càng nhiều càng tốt Tuy nhiên khôn phải thành phần ban đầu nào quá trình sản xuất cũng được chấp nhận Thể tích cho vào phải được giữ ở mức thấp, bình thường phải thấp hơn 10%

Trong khi nghiên cứu lượng cần

được thêm vào, mô hình virus được

bổ sung trực tiếp vào các bước

thích hợp ở quy mô nhỏ đã được

tính toán trước Những nghiên cứu này cho phép nhà sản xuất tiên

lượng được khả năng loại bỏ toàn

bộ virus của quy trình sản xuất và xác định quy trình sản xuất nào có khả năng cung cấp một mức thích hợp trong quy trình làm sạch virus

để chắc chắn rằng các sản phẩm

thuốc được an toàn

Yếu tố khử

Cần thiết để biết có bao nhiêu virus

có trong mẩu không qua chế biến bởi vì qua trình phải được thiết kế

để có khả năng loại bỏ toàn bộ

virus Bình thường virus trong mẫu không qua chế biến được định

lượng bằng kính hiển vi điện tử

truyền qua theo một nồng độ đậm đặc hay bằng các thực nghiệm cho nhiễm (bioassays)

Yếu tố khử được xác định theo

log10 theo tỷ lệ giữa tổng số virus cho vào trước khi làm sạch và tổng

số virus cho vào được đo lường

trong sản phẩm sau khi làm sạch Nhìn chung các đòi hỏi về yếu tố khử được thiết kế chuyên biệt cho các virus đã biết nhiễm vào quy

trình sản xuất

Các tiểu phần giống như retrovirus được sản xuất bởi các hệ thống

biểu hiện protein trong các tế bào chuột là các mẫu phổ biến Với

mục tiêu của yếu tố khử chuyên

biệt theo quy trình đã được thiết kế sẳn, các nhà sản xuất bổ sung các bước làm sạch virus vào quy trình

và thực hiện các bước có tính giám sát để theo dõi tính hiệu quả của

quá trình làm sạch virus khi vận

hành một vài hệ thống

Điều cơ bản của yếu tố khử và tính hiệu quả, tính hiệu quả được đặt lên hàng đầu Một sự vận hành có thể được tính toán theo tính hiệu quả, không hiệu quả hay hiệu quả tương đối Các bước hiệu quả cung cấp

một yếu tố khử của ít nhất 4 yếu tố

và không ảnh hưởng bởi bởi sai số trong một quy trình nhiều yếu tố Các bước không hiệu quả cung cấp một yếu tố khử của một hay ít hơn

và các bước hiệu qủa ở mức tương đối rơi vào một trong hai yếu tố có tính quyết định

Thiết kế quy trình vẫn còn là một thách thức trong việc phát triển quy trình ở mức độ nhỏ và các yếu tố có tính phân tích bởi vì quy trình phải thích hợp với sự sản xuất các

protein có hoạt tính trong một tiêu chuẩn nghiêm gặt theo các quy

định an toàn dược phẩm