Giáo trình Miễn dịch học thú y - Chương 7 pdf

Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp, Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng.. Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết t

Chương 7

PHẢN ỨNG KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ

I Cơ chế kết hợp kháng nguyên - kháng thể

Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết lý hóa sau:

* Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals

* Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau Ví dụ giữa nhóm amin và nhóm carboxyl

* Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau

* Lực kỵ nước

Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng thể

II Phản ứng ngưng kết - Agglutination test

1 Nguyên lý

Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn) Khi găp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp,

Khi cơ thể được miễn dịch, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện

bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng

Các phản ứng ngưng kết thường đơn giản, dễ làm, có độ nhạy cao, không tốn kém, được sử dụng rộng rãi, nhưng có nhược điểm là khó đạt trình độ chính xác cao, thường hay cho phản ứng dương tính giả

2 Các loại phản ứng ngưng kết

2.1 Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Là phản ứng có tính chất định tính, thường sử dụng kháng nguyên

đã biết và nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh

Hình 20: Phản ứng ngưng kết

A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một

xác vi khuẩn

B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn

C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM

Dùng một phiến kính, nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau

đó nhỏ vào một giọt kháng nguyên đã biết, trộn đều, sau đó vài phút đọc kết quả, nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng, thì kết hợp kháng nguyên kháng thể tạo thành đám ngưng kết, nếu kháng nguyên được nhuộm màu, thì đám ngưng kết có màu cụm lại, xung quanh nhạt màu hơn

2.2 Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm

Là phản ứng vừa có tính định tính vừa có thể định lượng được hàm lượng kháng thể

Dùng một loạt ống nghiệm, mỗi ống cho vào một lượng không đổi huyết thanh có độ pha loãng khác nhau theo cơ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 ) hoặc theo cơ số 10 (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 ) sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng tương đương kháng nguyên, để ở nhiệt độ thích hợp theo yêu cầu của phản ứng, sau 30 phút hoặc vài giờ đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết Hiệu giá ngưng kết là độ pha loãng cao nhất mà ở đó vẫn xảy ra hiện tượng ngưng kết

2.3 Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động

Khi dùng một kháng nguyên hòa tan để phát hiện một kháng thể tương ứng trong phản ứng ngưng kết, phải cần đến tế bào mang, người ta thường dùng hồng cầu, hạt chất dẻo như hạt latex, bentonit

Nguyên lý: Làm cho kháng nguyên hòa tan trở thành kháng nguyên hữu hình, bằng cách gắn kháng nguyên vào hồng cầu, như vậy hồng cầu đóng vai trò là giá đỡ cho kháng nguyên, khi kháng nguyên đã gắn trên hồng cầu thì kháng nguyên đó trở thành kháng nguyên hữu hình và phản ứng ngưng kết xảy ra dễ dàng

Có nhiều phương pháp để gắn kháng nguyên hòa tan trên bề mặt hồng cầu Có thể xử lý bằng các hóa chất như a xít tanic, benzidin, các muối crom, glutaraldehyd các hóa chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu

và nhóm chức còn lại gắn với kháng nguyên

Khi có phản ứng xảy ra, nghĩa là khi có kháng thể tương ứng với kháng nguyên, thì các kháng thể sẽ nối các kháng nguyên lại và các kháng nguyên đã gắn với hồng cầu hoặc đã hấp phụ vào các hạt chất dẻo, tạo nên

sự ngưng kết nhìn thấy rõ ràng

2 4 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Phản ứng HI)

Nguyên lý: Một số loại vi rút (vi rút cúm, vi rút Newcastle) có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu của một số loài gia súc gia cầm Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì vi rút bị kháng thể trung hòa, không còn vi rút để tiếp xúc với hồng cầu, hay nói cách khác, kháng thể đã ngăn trở ngưng kết hồng cầu của vi rút Còn nếu vi rút không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng,

vi rút sẽ không bị trung hòa và vi rút sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau

- Phương pháp tiến hành phản ứng: thường dùng vi rút đã biết để làm phản ứng HI với huyết thanh cần chẩn đoán Phản ứng vừa có tính chất định tính vừa có tính chất định lượng

Vi rút được pha với nồng độ 4 đơn vị HA (Haemagglutination)

Hình 21 Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động

Huyết thanh được pha loãng theo cơ số 2: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 hoặc theo cơ số 10 : 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000

Cho hỗn hợp vi rút và huyết thanh ở mỗi nồng độ với lượng nhất định, để ở nhiệt độ thích hợp

Sau một thời gian 10-20 phút, cho một lượng hồng cầu pha loãng

từ 0,5-1% với một lượng nhất định vào tất cả các ống

Đọc kết quả sau 15-30 phút

Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, chứng tỏ huyết thanh tương ứng với vi rút

Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết thành mạng, chứng tỏ huyết thanh không tương ứng với vi rút, nên vi rút đã làm ngưng kết hồng cầu

III Phản ứng kết tủa (Precipitation test)

1- Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong

phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng là chất hòa tan trong huyết thanh

Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được

Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi trường điện giải

1 Phản ứng kết tủa trong môi trường lỏng

1.1 Phản ứng kết tủa vòng

Là phản ứng có tính chất định tính

Dùng ống nghiệm loại nhỏ, cho kháng nguyên hòa tan vào trước, sau đó dùng pipet đã hút huyết thanh có kháng thể tương ứng, để đầu mút pipet vào sát đáy ống nghiệm rồi nhỏ từ từ cho kháng thể vào, với một lượng tương đương, kháng thể sẽ đội kháng nguyên lên (vì là kháng nguyên hòa tan nên nhẹ hơn kháng thể)

Để yên trong vòng 15-20 phút sẽ thấy xuất hiện vòng kết tủa màu trắng ở chỗ tiếp xúc giữa lớp kháng nguyên và kháng thể, nếu kháng nguyên

và kháng thể tương ứng (hình 23a)

Người ta thường dùng kháng thể dịch thể chuẩn đã biết để chẩn đoán kháng nguyên chưa biết với điều kiện kháng nguyên đó phải được chiết xuất thành dung dịch hòa tan

Phản ứng kết tủa vòng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh nhiệt thán, gọi là phản ứng kết tủa của Ascoli (hình 23b)

Dung dịch

kháng nguyên

Vòng ngưng kết

Kháng huyết

thanh

Kháng huyết thanh 0,5ml

Kháng nguyên 0,5ml nguyên Kháng

âm 0,5ml

Kháng nguyên Vòng trắng đục Kháng huyết

Kháng nguyên âm

Hình 22a Phản ứng

kết tủa vòng

Hình 22b Phương pháp làm phản ứng

Ascoli

1.2 Phản ứng kết tủa trong ống nghiệm

Là phản ứng vừa có tính định tính, vừa có tính định lượng

Dùng một loạt ống nghiệm, cho huyết thanh đều vào các ống nghiệm đó, sau đó cho kháng nguyên vào với lượng từ ít đến nhiều

Kết quả sẽ thấy có kết tủa xảy ra càng rõ tại những ống có kháng nguyên vừa đủ với kháng thể, còn ở những ống có thừa kháng nguyên thì kết tủa không xảy ra

1.3 Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc

Cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau trong môi trường thạch và quan sát đường kết tủa

Kháng nguyên

Vùng trung gian

Kháng thể

Hình 23 Miễn dịch khuếch tán đơn (A) và miễn dịch khuếch tán

kép (B) trong ống nghiệm

Nguyên lý: Lợi dụng tính chất khuếch tán của chúng về phía nhau, rồi gặp nhau, kết hợp với nhau bão hòa và kết tủa ở vùng có tỷ lệ tương ứng đồng đều giữa kháng nguyên và kháng thể

Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch ống nghiệm (Kỹ thuật Oudin):

Có thể chia làm hai loại: Phản ứng kết tủa khuếch tán đơn và kép Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch đơn

Thạch đã trộn sẵn kháng thể (hoặc kháng nguyên) rồi cho vào trong ống nghiệm trước, sau đó cho lên mặt thạch một lượng dung dịch kháng nguyên (hoặc kháng thể)

Kháng nguyên (hoặc kháng thể) sẽ khuếch tán vào trong thạch đi xuống phía dưới và sẽ gặp kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã có trong đó kết hợp, bão hòa, và kết tủa thành đường màu trắng

Nếu dùng nhiều đôi kháng nguyên và kháng thể khác nhau trong cùng một ống nghiệm để chẩn đoán thì sẽ xuất hiện nhiều đường kết tủa riêng rẽ ở độ nông sâu khác nhau theo từng cặp kháng nguyên-kháng thể tương ứng

1.4 Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch kép

Cho kháng thể vào trước, rồi cho vào trên kháng thể một lớp thạch bình thường: (không chứa kháng nguyên, kháng thể) Sau đó cho lên mặt thạch dung dịch kháng nguyên hòa tan (hoặc là ngược lại)

Kháng nguyên bên trên sẽ khuyêch tán xuống dưới và đi vào trong thạch, và kháng thể bên dưới khuếch tán lên trên cũng đi vào trong thạch, gặp nhau ở một nơi nào đó, kết hợp bão hòa và kết tủa

Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch trên phiến kính hoặc trên đĩa petri, khi thạch đông đặc, đục các lỗ tròn nhỏ có kích thước và khoảng cách bằng nhau, tthường đục một cụm 6 lỗ, 1 lỗ trung tâm và 5 lỗ xung quanh

Nhỏ vào lỗ trung tâm kháng nguyên hoặc kháng thể chuẩn đã biết, còn các lỗ xung quanh nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên cần chẩn đoán, chúng sẽ khuếch tán về phía nhau và xuất hiện vạch kết tủa, nếu kháng nguyên và kháng thể tương ứng

I II Hình 24a (Theo Ian R Tizard 2004 )

I Định hiệu giá huyết thanh II Định hiệu gía kháng nguyên

1 - Kháng nguyên 1 - Kháng thể

2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng 2, 3, 4, 5, 6 - kháng thể pha loãng

lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32 lần lượt từ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/32

I II Hình 24b (Theo Ian R Tizard 2004 )

I Định loại kháng nguyên II Định loại kháng thể

1 - Kháng thể đã biết 1- Kháng nguyên đã biết

2, 3, 4, 5 - kháng nguyên chưa biết 2, 3, 4, 5 - kháng thể chưa biết

6 - kháng nguyên tương ứng 6 - kháng thể tương ứng

Phản ứng dương tính Phản ứng âm tính

Hình 24c Phản ứng kết tủa khuyếch tán làm trên đĩa lồng

(Theo Ian R Tizard 2004 )

Hình 25 Hiện tượng hai kháng nguyên: Không đồng nhất (A); đồng nhất (B); đồng nhất một phần (C) phát hiện bằng phản ứng

Ouchterlony

Nhận định kết quả được căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp sau:

Các lỗ chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa sẽ gặp nhau và nối liền nhau

Nếu hai lỗ chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức là các kháng nguyên không có liên quan với nhau

Nếu 2 lỗ chứa kháng nguyên có liên quan một phần cùng có chung một nhóm quyết định X (KN XY và KNXZ) phản ứng với một hỗn hợp kháng thể chống XY, sẽ tạo ra 2 đường kết tủa gặp nhau, nhưng một đường dài và một đường ngắn hơn (giống hình cựa gà)

1.5 Phương pháp điện di miễn dịch (Electrophoresis)

Là phương pháp cải tiến của phương pháp kết tủa khuếch tán trong thạch nhưng sử dụng điện trường để cho kháng nguyên và kháng thể gặp nhau, phương pháp này thực hiện qua 2 giai đoạn Giai đoạn 1, tách rời từng thành phần kháng nguyên trước bằng điện di Giai đoạn 2, miễn dịch khuếch tán, đặt huyết thanh có chứa kháng thể vào rãnh dọc theo trục đi, kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán để gặp nhau và kết tủa

IV Phản ứng kết hợp bổ thể

Phản ứng kết hợp bổ thể thực hiện được nhờ 2 hệ thống: hệ thống dung khuẩn và hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể, bởi vì hiện tượng dung huyết không thể quan sát được bằng mắt thường, do đó phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả

Cho hệ thống dung khuẩn (hệ thống 1) vào ống nghiệm trước, gồm có kháng nguyên đã biết và huyết thanh con vật cần chẩn đoán đã đun lên 56° trong 30 phút để diệt bổ thể, sau đó cho tiếp vào ống nghiệm một lượng bổ thể đã được chuẩn độ vủa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết thanh tươi chuột lang) ủ ở 37°trong vòng 20-30 phút

- Sau đó cho tiếp vào ống nghiệm hệ thống 2 (hệ thống dung huyết) gồm có hồng cầu và huyết thanh miễn dịch chống hồng cầu cừu đã được đun 56° trong 30 phút để diệt bổ thể, ủ tiếp cả 2 hệ thống ở 37° trong 20-30 phút rồi đọc kết quả Nếu ở hệ thống 1 (hệ thống dung khuẩn), kháng nguyên và kháng thể tương ứng, thì sự kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ chiếm lấy bổ thể, không còn bổ thể cho hệ thống 2, nên không có sự dung huyết, hồng cầu đóng thành cục tròn đỏ dưới đáy ống nghiệm Phản ứng dương tính, tức con vật có kháng thể tương ứng với kháng nguyên

- Nếu ở hệ thống 1 không có sự kết hợp kháng nguyên kháng thể

do trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng, thì bổ thể sẽ không được dùng cho hệ thống 1, bổ thể còn sẽ tham gia vào hệ thống 2 làm tan hồng cầu, tạo nên huyễn dịch có màu đỏ Phản ứng âm tính, tức là trong huyết thanh không có kháng thể tương ứng

V Phản ứng trung hòa

1 Phản ứng trung hòa độc tố

Độc tố của vi khuẩn khi được vô độc bằng formol thì trở thành giải độc tố, không còn tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên cao, nên người ta thường dùng giải độc tố làm vắc xin, và khi tiêm cho cơ thể, chúng kích thích cơ thể sinh kháng thể rất tốt Khi kháng thể đặc hiệu

Hình 26 Nguyên lý của phản ứng kết hợp bổ thể

(Theo Ian R Tizard 2004)

Nếu bổ thể kết hợp với KN-KT sẽ không xảy ra hiện tượng tan hồng cầu Nếu không có kháng thể để kết hợp thì bổ thể sẽ làm tan hồng cầu

này gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm cho độc tố đó không còn hoạt tính nữa hay còn gọi là độc tố đã bị trung hòa

Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố được gọi là huyết thanh kháng độc tố và được sử dụng vào mục đích chữa bệnh Khi tiêm huyết thanh kháng độc tố vào cơ thể, nếu gặp độc tố, chúng sẽ kết hợp và trung hòa độc tố đó, đây là phản ứng trung hòa trên cơ thể

Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp với độc tố tương đương, thì phản ứng trung hòa sẽ xảy ra, nếu thực hiện in vitro trong ống nghiệm, sẽ thấy phức hợp miễn dịch này biểu hiện như

những cụm bông lơ lửng, vì vậy người ta gọi là phản ứng lên bông

2 Phản ứng trung hòa virus

Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus

Người ta có thể dùng kháng huyết thanh liệu pháp (huyết thanh miễn dịch có chứa kháng thể đặc hiệu) để can thiệp vào ổ dịch do virus gây ra Lúc này sự trung hòa virus xảy ra ngay sau khi tiêm huyết thanh miễn dịch vào cơ thể và con vật không còn bị virus gây bệnh được nữa

Với mục đích chẩn đoán virus trong phòng thí nghiệm in vitro,

người ta có thể thực hiện phản ứng trung hòa virus trên phôi gà, trên động vật cảm thụ, và trên môi trường tế bào nuôi cấy

Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích

Nếu pha loãng virus (theo cơ số 10) rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết thanh miễn dịch ở mỗi nồng độ, rồi thực hiện phản ứng trung hòa trên các đối tượng trên, người ta gọi đó là phản ứng trung