IUH - BÁO CÁO VI SINH VẬT HỌC - PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM ĐẠI THỂ VI THỂ CỦA VI SINH VẬT TRONG MẪU THỰC PHẨM

Mục đích: Để phân lập Xác định đặc điểm của đại thể và vi thể của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc từ mẫu thực phẩm. Nguyên tắc: Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Môi trường dinh dưỡng là môi trường hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hóa - khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. Nhu cầu của môi trường dinh dưỡng: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH thích hợp, có độ nhớt nhất định. Không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng và đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật. Phân loại môi trường dinh dưỡng: Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường. 1.Phân loại theo nguồn gốc: Môi trường tự nhiên: Dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật,... Môi trường nhân tạo: Czapek, Hansen, EMB,... Môi trường bán tự nhiên: Potato Glucose agar ( PGA ), giá đậu tương,... 2.Phân loại theo trạng thái vật lý Môi trường lỏng: Dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác trong thành phần môi trường. Môi trường rắn: Mỗi 1000ml môi trường có 15 - 20 agar ra hay các chất làm giá thể. Môi trường bán lỏng ( bán rắn ): Mỗi 1000ml môi trường có 3 - 5 agar hay các chất làm giá thể khác. 3.Phân loại theo công dụng Môi trường phân lập Môi trường tăng sinh Môi trường lưu giữ giống Môi trường thử nghiệm sinh hóa Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật. Để đảm bảo sự cân bằng để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. II. Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh vật 1. Tủ sấy ( vacuum oven ) Điều chỉnh nhiệt độ từ 60°C - 200°C, dùng để sấy khô, khử trường các loại dụng cụ chịu được sức nóng khử, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160 độ C trong 2 giờ hoặc 180 độ C trong 30 phút. Hình 1: Tủ sấy 2. Tủ ấm ( incubator or etuve ) Nhiệt độ từ 20°C - 60°C có chế độ ổn định nhiệt độ được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy não ở nhiệt độ khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt. 3. Tủ lạnh hay tủ mát ( freezer ) Dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học ( vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,..) hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường. 4. Nồi hấp ướt ( autoclave ) Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước áp suất cao ( hơi nước bão hòa ở áp cao ) được sử dụng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121°C / 1 atm trong 15 phút, 127 °C / 1 atm trong 30 phút với môi trường đất hay 117 °C / 0,8 atm trong 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, chứa nhiều sữa,.. Các bước thực hiện: Bước 1: Trước khi hấp kiểm tra cầu dao có đang bật hay không xong kiểm tra nồi hấp ( mực nước, mở van thông hai nồi, mở van cấp nước châm nước cất nồi ngoài 1/2 hoặc 2/3 cột thủy tinh ) Bước 2: Khóa van cấp nước, van thông hai nồi và van xả Bước 3: Chờ áp suất ngoài đạt nhiệt độ cần dùng Bước 4: Xếp các mẫu cần hấp vào xủng inox và cho vào nồi trong Bước 5: Đậy kín nắp nồi ( vặn khóa theo từng cặp đối xứng) Bước 6: Mở từ từ van thông 2 nồi để dẫn hơi nướcvào nồi trong Bước 7: Khi áp suất nồi trong đạt nhiệt độ thích hợp mở từ từ van xả khoảng 30 °C để đẩy khí từ nồi trong ra ngoài Bước 8: Quan sát, ghi nhận quá trình đuổi khí trong vài phút, sau đó đóng van xả Bước 9: Khi áp suất trong nồi đạt nhiệt độ thích hợp bắt đầu tính thời gian tiệt trùng Bước 10: Khi hết thời gian ta khóa van thông hai nồi rồi mở từ từ van xả đến xấp xỉ 1/2 Bước 11: Áp suất nồi trong về 0, mở khóa nồ theo từng cặp đối xứng để lấy sản phẩm đã được tiệt trùng Bước 12: Tắt công tắc điện nếu không dùng tiếp Hình 2: Nồi hấp ướt 5. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím ( fluoc laminar ) Có không gian vô trùng, được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng. Hình 3: Tủ cấy 6. Máy lắc ( shaker ) Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo cách chiều khác nhau ( lắc vòng và lắc ngang ) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường. 7. Cân phân tích điện tử ( analytical balance ) Cân trọng lượng từ 100 uragan 200g độ chính xác 10^-4 g. Cân kỹ thuật ( technical balance ): Độ chính xác 10^-2 g dùng cân hóa chất môi trường. Trong quá trình sử dụng không đặt trọng lượng quá khoảng lên cân. II.Pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn và vi nấm 1.Dụng cụ Giá ống nghiệm Ống nghiệm Bình tam giác Phễu Đũa thủy tinh Cốc 100m, 500ml Đĩa cân

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

1 Lê Huỳnh Tú Nhi 24655421 Lìm nội dung 100%

2 Nguyễn Thị ThanhNgọc 24633601 Tổng hợp nội dung 100%

3 Đặng Thị Yến Nhi 24641311 Tổng hợp nội dung 100%

4 Võ Thị Thùy Linh 24637411 Tìm nội dung 100%

5 Nguyễn Huy BảoLong 24649751 Tìm nội dung 100%

BUỔI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN VÀ VI NẤM

áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường

Nhu cầu của môi trường dinh dưỡng: Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pH thích hợp,  có độ nhớt nhất định Không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng và đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật

Phân loại môi trường dinh dưỡng: Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường

1.Phân loại theo nguồn gốc:

Môi trường tự nhiên: Dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật,

Môi trường nhân tạo: Czapek, Hansen, EMB,

Môi trường bán tự nhiên:  Potato Glucose agar ( PGA ), giá đậu

tương,

2.Phân loại theo trạng thái vật lý

Môi trường lỏng: Dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác trong thành phần môi trường

Môi trường rắn: Mỗi 1000ml môi trường có 15 - 20 agar ra hay các chất làm giá thể

Môi trường bán lỏng ( bán rắn ): Mỗi 1000ml môi trường có 3 - 5 agar hay các chất làm giá thể khác

3.Phân loại theo công dụng

Môi trường phân lập

Môi trường tăng sinh

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc

Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật

Để đảm bảo sự cân bằng để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấugiữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỉ lệ và nồng

độ các chất trong thành phần môi trường

Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chấtcủa vi sinh vật

II Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh vật

1 Tủ sấy ( vacuum oven )

Điều chỉnh nhiệt độ từ 60°C - 200°C, dùng để sấy khô, khử trường các loạidụng cụ chịu được sức nóng khử, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ nhiệt và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160 độ C trong 2 giờ hoặc 180 độ C trong 30 phút. 

               Hình 1:

Tủ sấy

Dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinhhọc ( vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh, ) hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường

4 Nồi hấp ướt ( autoclave )

Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước áp suất cao ( hơi nước bão hòa ở áp cao ) được sử dụng để hấp khử trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121°C / 1 atm trong 15 phút, 127 °C / 1 atm trong 30 phút với môi trường đất hay 117 °C / 0,8 atm trong 15 phút với môi trường chứa nhiều đường, chứa nhiều sữa,

Các bước thực hiện:

Bước 1: Trước khi hấp kiểm tra cầu dao có đang bật hay không xong kiểm tra nồi hấp ( mực nước, mở van thông hai nồi, mở van cấp nước châm nước cất nồi ngoài 1/2 hoặc 2/3 cột thủy tinh )

Bước 2: Khóa van cấp nước, van thông hai nồi và van xả

Bước 3: Chờ áp suất ngoài đạt nhiệt độ cần dùng

Bước 4:  Xếp các mẫu cần hấp vào xủng inox và cho vào nồi trong

Bước 5: Đậy kín nắp nồi ( vặn khóa theo từng cặp đối xứng)

Bước 6: Mở từ từ van thông 2 nồi để dẫn hơi nướcvào nồi trong

Bước 7: Khi áp suất nồi trong đạt nhiệt độ thích hợp mở từ từ van xả khoảng 30 °C để đẩy khí từ nồi trong ra ngoài

Bước 8: Quan sát, ghi nhận quá trình đuổi khí trong vài phút, sau đó đóng van xả

Bước 9: Khi áp suất trong nồi đạt nhiệt độ thích hợp bắt đầu tính thời gian tiệt trùng

Bước 10: Khi hết thời gian ta khóa van thông hai nồi rồi mở từ từ van

        Hình 2: Nồi hấp ướt

5 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím ( fluoc laminar )

Có không gian vô trùng, được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng

      Hình 3: Tủ cấy

6 Máy lắc ( shaker )

Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo cách chiều khác nhau ( lắc vòng và lắc ngang ) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường

7 Cân phân tích điện tử ( analytical balance )

Cân trọng lượng từ 100 uragan 200g độ chính xác 10^-4 g Cân kỹ thuật (technical balance ): Độ chính xác 10^-2 g dùng cân hóa chất môi trường Trong quá trình sử dụng không đặt trọng lượng quá  khoảng lên cân

II.Pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn và vi nấm

và chờ nhiệt độ lên đến 180°C thì bỏ các đĩa đã được quấn báo vào và

sấy trong vòng 30 phút thì lấy ra

2.2Cân đong hóa chất pha chế môi trường:

 Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tinh để cân đong các loại hóa chất Dùng keo giấy ghi lại các chất để tránh nhầm lẫn

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường cao thịt - pepton

Cao thịt: 3gPepton: 10gNacl: 5gAgar: 20g

Môi trường PGAPotato: 200gGlucose: 20gAgar: 15gNước cất: 1000ml

         Hình 5: Cân hóa chất

2.3 Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng lẻ trong nước cất ( nước khoai tây ) trước khi phối trội

Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa ( nếu có ) Phối trộn dựa trên thể tích tăng dần

Khuấy đều và nấu sôi nhẹ để agar hòa tan hoàn toàn Trong lúc đun phải khuấy liên tục để tránh bị vón cục

       Hình 6: Khuấy hỗn hợp

2.4 Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa

Chuẩn bị sẵn ống nghiệm đã được làm sạch, đặt trên giá Đổ môi

trường vào 6 ống, cách đáy ống 1- 1,5 cm và cách đầu ống 2-3cm

Trong lúc cho vào ống phái thao tác tay nhanh khi môi trường còn lỏng

và dùng keo giấy ghi môi trường

Hình 7: Đổ môi trường vào ống nghiệm

Sau khi cho môi trường vào ống nghiệm còn dư thì cho vào bình thủy tinh và dùng bông gòn và giấy buộc chặt lại, ghi chú lại môi trường dán vào bình

       Hình 8: Đem đi hấp khử trùng

2.6Làm thạch nghiêng

Sau khi khử trùng môi trường xong thì lấy ra và để nghiêng ống để làm thạch nghiêng Chuẩn bị sẵn giá đỡ có bề mặt bằng phẳng, ống nghiệm được đặt trên nghiêng trên giá đỡ cố định Phần đỉnh nghiêng phải

cách nút đậy 3- 5cm, phần đáy phải có 1 phần thạch đứng 0,5- 1cm

      Hình 9: Làm thạch nghiêng

III Kết quả và biện luận kết quả

Bình môi trường đã khử trùng hoàn toàn tốt, các vi sinh vật đã bị tiêu diệt hoàn toàn

Mẫu thạch ống nghiêng đã làm tốt đúng quy trình và kỹ thuật

      Hình 10: Ống thạch nghiêng thành công

Tuy nhiên đã có ống đã bị nhiễm tạp vi sinh vật ( xuất hiện nhiều khuẩnlạc trắng đục, rời rạc, phân bố không đều ) Nguyên nhân có thể do trongquá trình thao tác quên đóng nắp làm cho không khí lọt vào, dẫn đếnnhiễm vi sinh vật từ môi trường

Hình 11: Ống nghiệm bị nhiễm tạp vi sinh vật

BUỔI 2: CẤY PHÂN LẬP VI SINH VẬT

I Mục đích và nguyên tắc

Mục đích: Tạo ra nhiều chủng vi sinh vật riêng rẻ trong môi trường, phục vụ cho các công đoạn cấy chuyền làm thuần, quan sát hình thái đại thể, vi thể, nhuộm màu,

Nguyên tắc: Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc, sau khi ủ ở điều kiện thích hợp, các vi sinh vật  vai sẽ phân chia nhiều lần  tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc

Quá tình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:

Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vật

Tạo ra các khuẩn lạc riêng lẻ từ quần thể vi sinh vật ban đầuPhân lập vi sinh vật thuần khiết

Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc

II Các quy trình thí nghiệm

1.Chuẩn bị dung cụ.

Micropipet 100 micromet và 1000 micromet

Đèn cồn

Bình tia chứa cồn 70°

Ống nghiệm đựng nước muối sinh lý

Bật lửa hay diêm

Hộp đầu típ xanh , vang

2.Môi trường, hóa chất

Môi trường cao thịt - pepton: Nuôi cấy vi khuẩn

Mùi trường PGA: Nuôi cấy nấm men, nấm mốc

Nước rau má, nước mía , nước muối sinh lý

3.Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Đổ môi trường ra đĩa petri đã hấp tiệt trùng

Đổ đĩa thạch môi trường CT - PT và PGA với thao tác vô trùng (1 bình CTPT / 1 bình PGA chu 10-15 đĩa )

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ và bình mùi trường

Bình môi trường CTPT ( đã hấp tiệt trùng )

Bình môi trường PGA  ( đã hấp tiệt trùng )

Đĩa petri (được tiệt trùng khô trong tủ sấy )

Đen cồn bật lửa hoặc diêm

Khăn sạch

Cồn 70°

Bước 2: Chuẩn bị khu vực thao tác vô trùng

Trước khi thao tác, lau sạch bề mặt bàn bằng cồn 70° để loại bỏ

vi sinh vật và bụi bẩn, lau một lần theo kiểu zích zắc

Sau khi khu vực xung quanh khô thì đặt đèn cồn ở giữa bàn, sátkhuẩn tay bằng cồn 70° rồi bật đèn cồn lên Mọi thao tác phải thựchiện gần ngọn lửa ( vùng vô trùng) , tay và dụng cụ cần giữ trongvùng vô trùng

Bước 3: Đổ thạch môi trường vào đĩa

Để bình môi trường CT - PT và PGA nguội xuống khoảng 45° - 50°

(ấm tay không quá nóng)

Cầm bình môi trường bằng tay thuận tay còn lại mở nhe nắp đĩapetri ( chỉ hé 1 bên, không mở hẳn để tránh nhiễm vi sinh vậi trongkhông khí ), quay dĩa petri xung quanh ngọn lửa đèn cồn Đưamiệng bình môi trường hơ qua ngọn đèn lửa cồn 1-2 giây trước khirót để khử trùng

  Hình 1: Hơ miệng bình để khử trùng

Rót nhẹ môi trường vào đĩa petri lượng vừa đủ để phủ kín đáy đĩa Sau khi rót xong đậy nắp đỉa lại ngay để yên trên mặt phẳng

cho môi trường đông tự nhiên

        Hình 2: Đổ môi trường vào đĩa

Thực hiện tương tự cả 2 bình môi trường cho đến khi gần hếtbình môi trường

Sau khi đổ xong để thạch động hoàn toàn ở nhiệt độ phòng

Khi thạch đã đông, lật ngược các đĩa petri (nắp ở dưới ) để tránhhơi nước ngưng tụ nhỏ xuống mặt thạch Ghi rõ tên môi trường,

ngày đỗ, tên người thực hiện

     Hình 3: Đĩa đã đông thạch

Lưu ý khi thao tác:

Phải đeo khẩu trang trong suốt quá trình, không để nắp đĩa petri

mở quá lâu, giữ môi trường nghiêng, không đặt xuống mặt bàn khiđang mở nắp

Toàn bộ quá trình phải được tiến hành trong vùng vô trùng để tránh bị nhiễm khuẩn

Thao tác phải nhanh, nhẹ nhàng và dứt khoát

Thí nghiệm 2: Pha loãng thập phân mẫu nước mía / rau má

Bước 1: Chọn nguồn mẫu phân lập

Nguồn phân lập vi khuẩn: Đất, nước, không khí, nước thải, nước ép trái cây, thực phẩm ôi thiu,

Nguồn phân lập nấm men: Có trên bề mặt trái cây, vỏ trên câymọng nước ( nho, dâu tây, hồng ), nước ép trái cây

Nguồn phân lập nấm mốc : nguồn tinh bột ( cơm, xôi, bánh mì, ) không khí, nước

Bước 2: Xử lý mẫu

Giảm mật độ vi sinh vật: Pha loãng mẫu nước rau má 1ml bằng

Lấy 1ml ống nghiệm 1 sang ống nghiệm thứ 2 tương tự như vậy tới ống nghiệm thứ 7 Trong suốt quá trình thực nghiệm phải

ở trong vùng vô trùng của đèn cồn

       Hình 4: Các thao tác xử lý mẫu

Thí nghiệm 3: Cấy trải / đổ phân lập vi sinh vật trong mẫu trên môi trường tương ứng

Cấy trải trên thạch đĩa

Bước 1: Cho môi trường vào đĩa petri sau đó dùng micropipet đầu tuyp vô trùng, hút 0,1 ml mẫu đã pha loãng ở ống nghiệm 10^-

6 lên bề mặt môi trường trong đĩa petri

Bước 2: Dùng que trải thủy tinh nhúng vào cồn và hơ qua ngọnlửa đèn cồn, để nguội

Bước 3: Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để cách đèn cồn chừng 1 - 2cm , khẽ mở nghiêng 1 bên hộp ( phần hơ lửa ) sao cho vừa đủ để que cấy vào

Bước 4: Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch đến khi thấy không còn mẫu nữa theo các kiểu sau đây

Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch

Theo những đường song song

Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc

    Hình 5: Cấy trải mẫu trên thạch

Cấy đỗ trên thạch đĩa

Bước 1: Dùng micropipet  và đầu tuýp vô trùng, hút 1 ml mẫu

đã pha loãng ở ống nghiệm 110-7 vào đĩa petri

Bước 2: Đổ môi trường khoảng 15 - 20ml đã đun chảy và để nguội khuảng 45- 50° vào đĩa petri

Bước 3: Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng

hồ vài lần để dung dịch mẫu và môi trường trộn đều vào nhau

III Kết quả và biện luận kết quả

Thí nghiệm giúp nhận biết được sự khác biệt hình thái giữa vi khuẩn

và vi nấm

 Ở đĩa cấy đổ ta thấy có những khuẩn lạc màu trắng sữa mọc xung quanh thạch đó là nấm men

Hình 6: Đĩa đã cấy đổ

Ở đĩa cấy trải ta thấy có nhiều loại khuẩn lạc khác nhau như: những đóm màu trắng sữa là nấm men, những đóm màu vàng là vi khuẩn và những khuẩn lạc màu đen mọc nổi trên bề mặt thạch

là nấm mốc

Hình 7: Đĩa đã cấy trải

Kết quả thu được từ các đĩa

      Hình 8: Kết quả cấy đổ / cấy trải

BUỔI 3 CẤY CHUYỀN LÀM THUẦN CÁC CHUẨN VI KHUẨN

VI NẤM MỤC TIÊU QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC ĐÁNH GIÁ ĐẠI THỂ VÀ VI THỂ CỦA

VI SINH VẬT

I Mục đích và nguyên tắc

1.Mục đích:

Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩmcần nghiên cứu

Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật 1 cách nhanh chống

Bảo tồn các vi sinh vật thuần khiết

Nghiên cứu các đặt tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinhvật

Duy trì tốt các điều kiên nuôi cấy ( nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, oxy, )

để vi sinh vật phát triển thuận lợi

II Các quy trình thí nghiệm

Bước3: Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que trên bề mặt thạch theokiểu zích zắc 4 đường , sau mỗi đường ria đốt khử trùng đầu que cấy và

làm nguội trước khi làm đường ria khác

2.1.2 Cấy truyền bằng que cấy đầu móc đối với nắm mốc ( cấy điểm)

Bước 1: Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồncho đến khi nóng đỏ que cấy

Bước2: Tay trái cầm đĩa petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn , sau

đó để cách đèn

cồn khoảng 1-2cm, khẻ mở nghiêng 1 bên đĩa ( phần hơ lưa) sao cho vừa

đủ để que cấy vào

Bước3: Nhẹ nhàng chấm 3 điểm hình tam giác trên bề mặt thạch hoặc gõ gõ trên nắp để vi nấm rớt xuống bề mặt

2.1.3 Kết quả và biện luận kết quả

Kết quả cấy ria làm thuần vi khuẩn, vi nấm:

Khuẩn lạc trong đĩa petri có màu vàng, khuẩn lạc mọc dày đặc Tuy nhiên do quá trình cấy ria sai nên khó xác định được hình dạng của khuẩn lạc nhưng nhìn qua thì có thể thấy có vẻ dẹt và lan rộng dọc theo đường bề mặt thạch →  chủng được làm thuần

Khuẩn lạc trong đĩa petri có màu hồng nhạt, có kích thước đồng đều ởvùng được phân lập Ở vùng riêng lẻkhuẩn lạc có dạng hình tròn và lồi lên khỏi mặt thạch, ở vùng lan rộng khuẩn lạc mọc lan rộng ở mép thạch

→  chủng được làm thuần Tuy nhiên

do quá trình thao tác quá mạnh tay nên bề mặt thạch đã bị bể

Hình 4: Cấy ria vi nấm hồng

     Hình 5,6: Mặt trước và sau của cấy điểm nấm mốc

Kết quả cấy điểm làm thuần nấm mốc: Bề mặt khuẩn lạc có màu đen sẫm,mịn, dạng sợi bông và mọc lan rộng trên bề mặt thạch → chủng được làm thuần

2.2Thí nghiệm 2: Quan sát vi sinh vật

Hình 6: Kính hiển vi

2.2.1 Cấu tạo kình hiển vi gồm 2 phần

Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thịkính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc dichuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điềuchỉnh xơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp)

  Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn

2.2.2 Quan sát mẫu bằng kính hiển vi

  Bước 1: Chuẩn bị mẫu quan sát:

       Cần chuẩn bị mẫu vi sinh vật từ các đĩa  petri (nấm men,nấm mốc, vikhuẩn) 

Dụng cụ sử dụng gồm lam kính, lamen, que cấy, ống hút nhỏ giọt, đèncồn, giấy thấm và kính hiển vi quang học Tất cả dụng cụ cần được tiệttrùng cẩn thận bằng cồn hoặc nhiệt để tránh nhiễm tạp Dùng que cấy vôtrùng lấy một lượng rất nhỏ rồi hòa tan với giọt nước sinh lý để tạo hỗn dịchmỏng trên lam kính

Bước 2: Chuẩn bị tiêu bản để quan sát:

  Sau khi đã có giọt mẫu trên lam kính, dùng đầu que cấy trải đều đểmẫu phân bố thành một lớp mỏng, giúp quan sát rõ hơn.  Đặt nhẹ lamen lêngiọt mẫu, tránh tạo bọt khí Lau sạch phần dư quanh mép lamen bằng giấythấm Toàn bộ quá trình cần thực hiện cẩn thận, tránh chạm tay vào phầngiữa lam và lamen để không làm mờ tiêu bản

Bước 3 :Quan sát dưới kính hiển vi:

  Đặt tiêu bản đã chuẩn bị lên bàn kính của kính hiển vi, cố định bằnghai kẹp giữ Mở nguồn sáng, điều chỉnh tụ quang và màn chắn sáng sao choánh sáng vừa đủ, không quá chói Bắt đầu quan sát bằng vật kính nhỏ (4x)rồi đến (10×) để tìm vùng có vi sinh vật Khi đã xác định được vùng mẫu,chuyển sang vật kính lớn hơn (40×) để quan sát chi tiết về hình dạng, kíchthước và cách sắp xếp của vi sinh vật Trong quá trình quan sát, cần chú ýtránh chạm lam vào vật kính, đồng thời luôn điều chỉnh ánh sáng sao chohình ảnh có độ tương phản tốt nhất

Bước 4: Ghi nhận kết quả quan sát:

  Khi đã điều chỉnh rõ hình ảnh, tiến hành quan sát kỹ và ghi chép lạinhững đặc điểm nhận thấy Vi khuẩn thường có các dạng cơ bản như: hìnhcầu, hình que hoặc hình xoắn Nấm men có dạng bầu dục hoặc hình cầu,thường sinh sản bằng nảy chồi Nấm mốc có dạng sợi dài, phân nhánh tạothành mạng lưới

Bước 5: Kết thúc quan sát và vệ sinh dụng cụ:

  Sau khi hoàn thành việc quan sát, hạ vật kính nhỏ xuống, tắt đèn vàrút phích cắm của kính hiển vi Lam kính và lamen sau khi dùng được rửasạch bằng nước, lau khô và đặt lại đúng vị trí Các dụng cụ cấy hoặc ống hútnên ngâm trong dung dịch khử trùng để đảm bảo an toàn Cuối cùng, dọngọn bàn thực hành, cất kính hiển vi về nơi khô ráo, thoáng mát, tránh bụibẩn