Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

Hứa Ngọc Phúc BỘ CÂU HỎI BÁO CÁO THU HOẠCH Bài 1: Hoạt hóa giống, kiểm tra giống và chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men 1.. - Tên khoa học: Saccharomyces-cervisiae - Tên thương mại của

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH

-o0o KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO : THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

HỌC THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: HỨA NGỌC PHÚC

Họ tên sv: Lớp: MSSV: Nhóm: Buổi, học tiết: Phòng:

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HỒ CHÍ MINH

-o0o KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO : THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

HỌC THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn: HỨA NGỌC PHÚC

Họ tên sv: Lớp: MSSV: Nhóm: Buổi, học tiết: Phòng:

HP: THÍ NGHIỆM VI SINH HỌC THỰC PHẨM

GV: TS Hứa Ngọc Phúc

BỘ CÂU HỎI BÁO CÁO THU HOẠCH

Bài 1: Hoạt hóa giống, kiểm tra giống và chuẩn bị môi trường nuôi cấy

nấm men

1 Giống nấm men Nhóm/Tổ đã sử dụng là chủng nào? Nêu tên khoa học

và tên thương mại.

- Nhóm/Tổ đã sử dụng chủng mấn men Saccharomyces-cervisiae Là chủng nấm men được biết nhiều nhất và sử dụng rộng rãi trong quá trình lên men bánh mì, rượu, bia

- Tên khoa học: Saccharomyces-cervisiae

- Tên thương mại của nấm men Saccharomyces-cerevisiae có thể khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng

+ Lên men rượu :

+ Lên men rượu vang: BV818

+ Lên men bia: RV002, Sac22

2 a) Trình bày các bước trong qui trình hoạt hóa giống nấm men?

B1: Điều chế 2 ống môi trường Hasen lỏng (5ml/ống), nút bông, ghi nhãn, để

cấy nấm men từ thạch nghiêng

- Điều chế 2 bình môi trường hoạt hóa (50ml môi trường Hansen/bình), nút bông, ghi nhãn, dùng nuôi hoạt hóa cấp 1

- Hấp tiệt trùng ống Hansen hoạt hóa ở 121 độ C, 15 phút

- Hoạt hóa nấm men - Saccharomyces cerevisae ( Ống thạch nghiêng) và nhân giống cấp 1 (5ml môi trường Hansen vô trùng→ ống giống thạch nghiêng để thu tế bào nấm→ 50ml môi trường Hansen để tiến hành hoạt hoaas cấp 1 (2-3 ngày ở nhiệt độ phòng, tiến hành lắc (không lắc)

b) Nêu các loại dụng cụ, hóa chất, thiết bị cần thiệt để thực hành qui trình hoạt hóa giống nấm men?

- Dụng cụ: Ống nghiệm, hộp petri, bình tam giác, pipet, ống nghiệm có nắp, ống hút nhỏ giọt, đầu típ, lame kính, lamen, giấy lau kính, bình tam giác nút gài, bình tia, đèn cồn, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, găng tay, giấy nhôm, giá đựng ống nghiệm

- Thiết bị: Cân điện tử, máy khuấy từ, nồi tiệt trùng, máy vô trùng

- Hóa chất: Glucose, peptone, K2SO4, MgSO4, H2O, agar, Nacl, cồn

3 a) Trình bày các bước trong qui trình cấy chuyền giống nấm men? Bước 1: Chuẩn bị môi trường cấy

- Môi trường cấy 3 ống thạch nghiêng đã được hấp triệt trùng 121 độ C trong 15 phút sau đó lấy ra để nguội trong 5 phút để ống nghiệm nghiêng khoảng 45 độ để có nhiều môi trường nuôi cấy nấm

Bước 2: Chuẩn bị dụng cụ

- Sử dụng ống nghiệm, bình tam giác, que cấy đã được tiết trùng trước bằng nhiệt

- Làm việc trong tủ cấy vô trùng, gần ngọn đèn cồn tránh nhiễm khuẩn

Bước 3: Thu nhập giống nấm men

- Đeo bao tay dùng que cấy hơ qua đèn cồn, hơ xung quanh bình tam giác nắp đậy tránh nhiễm khuẩn:

+ Lấy một phần giống nấm men từ bình chứa giống bằng que cấy vô trùng

+ Đảm bảo giống thu thập không bị nhiễm tạp chất

Bước 4: Cấy chuyền

- Dùng que cấy để chuyển giống nấm men sang môi trường mới

- Đối với môi trường thạch: di nhẹ trên bề mặt thạch bằng que cấy có giống nấm men để giống phát triển, theo đường xích xắc

Bước 5: Ủ và nuôi cấy

Đặt ống nghiệm hoặc bình chứa vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợp (28 -30°C)

- Quan sát sự phát triển của nấm men trong vài ngày

b) Nêu các loại dụng cụ, hóa chất, thiết bị cần thiết để thực hành qui trình cấy chuyền giống nấm men?

- Dụng cụ: que cấy, đèn cồn, bao tay, bao gói, ống nghiệm có nút đậy giấy bạc, bình tam giác, giá đựng ống nghiệm, ghi nhãn ống nghiệm

- Thiết bị: tủ cấy vô trùng

- Hóa chất: Pepton, NaCl, Agar, Glusose, MgSO4/H2O, K2PO4, nước

4 Kết quả thực hành bài 1

a) Việc chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, thiết bị để kiểm tra giống nấm men sau khi cấy chuyền giống nấm?

- Dụng cụ: Que cấy vô trùng, đèn cồn, ống nghiệm có môi trường thạch

nghiêng, pipet, lame kính, lamen, que gắp

- Hóa chất: Thuốc nhuộm methylen blue, cồn 70%, môi trường nuôi cấy

- Thiết bị: Kính hiển vi, tủ cấy vô trùng, máy đo quang phổ, máy đo độ đục

b) Kết quả thực hành của tổ đã thu thập được và giải thích:

- Nhóm có 3 ống nhưng chỉ có 1 ống đủ điều kiện cấy vào vì 2 ống còn lại môi

trường bên trong ống không đặc, chảy nước, nên không thể cấy chuyền được ( do khi rót môi trường vào ống nghiệm các hóa chất được hòa tan và không lắc đều)

- Giống nấm men lên trong thạch nghiêng: Nấm không lạc nhiều, mọc thành

cụm, đều, thuần chủng

- Hình thái tế bào nấm men trong ống giống quan sát được: Tế bào hình cầu, thuần chủng, số chuỗi tế bào phân nhánh sinh trưởng nhiều

- Giống có thế dùng để nhân lên cấp 1, cấp 2 được Vì giống đã thuần chủng, không nhiễm tạp khuẩn nên giữ nguyên được đặc tính và có thể nhân giống mà không bị biến đổi nhưng với điều kiện môi trường phải phù hợp, nhiệt độ thích hợp và thao tác kỹ thuật đúng

Bài 2: Nhân sinh khối giống nấm men - Đánh giá sinh trưởng và hoạt độ

của giống

1 a) Vì sao phải nhân giống nấm men lên cấp 1, cấp 2 trước khi lên men?

- Tăng sinh khối nấm men: Mục tiêu chính là gia tăng số lượng nấm men để đạt

đủ mật độ cần thiết cho quá trình lên men chính Các cấp nhân giống giúp nấm men phát triển một cách mạnh mẽ, chuẩn bị cho việc lên men hiệu quả

- Đảm bảo sức khỏe và sức sống của nấm men: Trong các giai đoạn nhân

giống, nấm men có cơ hội phát triển trong môi trường tối ưu về dinh dưỡng, pH

và nhiệt độ Điều này giúp đảm bảo nấm men có sức khỏe tốt và khả năng lên men cao

- Hạn chế vi sinh vật không mong muốn: Quá trình nhân giống nấm men trong

điều kiện vô trùng và kiểm soát chặt chẽ giúp giảm thiểu rủi ro nhiễm vi sinh vật không mong muốn, đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng

- Điều chỉnh môi trường thích hợp: Khi nhân giống qua các cấp, người làm có

thể điều chỉnh môi trường phù hợp với từng giai đoạn phát triển của nấm men,

từ đó tối ưu hóa quá trình lên men sau này

b) Hoạt độ giống nấm men của Tổ như thế nào? Xác định qua chỉ thị nào?

- Hoạt độ giống nấm men lên tốt

- Xác định qua chỉ thị : Sinh khối nấm men dùng lên men cider được kiểm tra

số lượng tế bào nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi, dịch sinh khối nhân cấp 1,2 được xác định số lượng bằng phương pháp đo OD thông qua đường chuẩn sinh khối

2 a) Xác định mật độ nấm men theo mấy cách? Vì sao phải xác định đường chuẩn độ đục OD600 của dung dịch sinh khối giống?

Để xác định mật độ nấm men, theo 2 cách

- Phương pháp đếm trực tiếp:

+ Dùng kính hiển vi và đếm số lượng nấm men trên một đơn vị thể tích Cách này cho kết quả trực tiếp nhưng có thể tốn thời gian và công sức

- Phương pháp đo mật độ quang học (OD600):

+ Đo độ đục của dung dịch nấm men tại bước sóng 600 nm Phương pháp này nhanh và tiện lợi, tuy nhiên cần phải xác định đường chuẩn độ đục (OD600) để chuyển đổi giá trị độ đục sang mật độ tế bào

- Việc xác định đường chuẩn độ đục OD600 của dung dịch sinh khối giống là rất quan trọng vì những lý do sau:

+ Đảm bảo độ chính xác: Đường chuẩn giúp chuyển đổi giá trị đo độ đục (OD600) sang mật độ tế bào, từ đó cho kết quả chính xác hơn

+ Hiệu chỉnh sai số: Đo độ đục có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như kích thước tế bào, hình dạng tế bào, hoặc các hạt khác trong dung dịch Đường chuẩn giúp hiệu chỉnh các sai số này

+ Chuẩn hoá kết quả: Đường chuẩn đảm bảo rằng các kết quả đo độ đục của các mẫu khác nhau có thể so sánh với nhau một cách đáng tin cậy

b) Trình bày các bước thực hành đếm tế bào nấm men bàng buồng đếm tế bào dưới kính hiển vi

Bước 1: Tiến hành pha loãng mẫu sao cho tế bào trong buồng đếm từ 30-80 tế

bào trong một ô lớn Pha loãng dịch lên men với nước cất vô trùng theo tỉ lệ thích hợp: 1/2, 1/4, ,1/100,1/1000

Bước 2: Hút 0.5ml dịch lên men đã được pha loãng cho vào ống nghiệm có

chứa 0.5ml xanh metylen 0.01% (pha loãng 2 lần), lắc đều

Bước 3: Đặt lamelle lên buồng đếm, dùng pipette pasteur cho mẫu dịch lên

men đã nhuộm màu vào cạnh của lamelle sao cho mẫu tự dẫn vào buồng đếm (dịch men phải loang đều trong buồng đếm)

Bước 4: Đặt buồng đếm lên kinh hiển vi, điều chỉnh kính quan sát ở vật kính x

40 cho đến khi nhìn thấy rõ các tế bào men trong buồng đếm

Bước 5: Đếm tổng số tế bào nấm men, tổng số tế bào nấm men chết, tỷ lệ tế

bào men chổi

- Đếm tổng số tế bào có trong 5 ô lớn bao gồm: 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa buồng đếm hoặc đếm theo đường chéo Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ, tổng cộng 80 ô nhỏ

- Đối với tế bào nằm hoàn toàn bên trong ô, đếm theo đường zikzak để tránh sai sót

- Đối với tế bào nằm trên các cạnh của ô: Nếu đếm tất cả tế bào tiếp xúc với cạnh ngoài cùng bên trái và cạnh ngoài cùng bên dưới thì không đếm các tế bào tiếp xúc với cạnh trong cùng của bên phải và cạnh trong cùng bên trên

- Đếm tổng số tế bào nấm men chồi trong 5 ô, cách đếm tương tự

- Đếm tổng số tế bào chết trong 5 ô ( chỉ đếm những tế bào bắt màu xanh), cách đếm tương tự

Bước 6: Tính kết quả

c) Công thức tính toán mật độ tế bào/ml là gì? Giống nấm men cấp 1 của

Tổ đếm được mật độ bao nhiêu?

Mật độ tế bào/ml trong dung dịch có thể được tính theo công thức sau:

tế bào C(tb/ml)=X*25*10000*100 = 147*25*10000*100 = 3.675*106 tb/ml Ô1 : 352 tế bào

Ô2 : 113 tế bào

Ô3 : 98 tế bào

Ô4: 131 tế bào

Ô5 : 37 tế bào

Trong đó : C: mật độ nấm men là tổng số tế bào có trong 1ml dịch men

X: số lượng nấm men trung bình của mỗi ô

df: hệ số pha loãng

1 a) Kết quả đo độ đục dãy mật độ giống nấm men của Tổ là bao nhiêu?

Sử dụng may đo quang phổ để đo độ đục

Pha loãng dung

dịch(tỉ lệ)

100 (5) 10-1 (4) 10-2 (3) 10-3 (2) 10-4 (1)

Độ đục của mẫu nấm men không pha loãng (tỉ lệ 1) là 2.595 (OD 600nm)

b) Trình bày đường chuẩn thu được so với số liệu mật độ tế bào từ phương pháp đếm của Tổ?

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0.033

0.782

0.191

1.118

2.595

OD600

Y= 0,5460X + 2,0358

R2 = 0,7133

c) Giải thích kết quả

- Mẫu nấm men không pha loãng ( tỷ lệ 1) có OD = 2,595, nghĩa là dung dịch rất đục do chứa nhiều tế bào nấm men Khi pha loãng mẫu theo các mức

10-1;10-2;10-3;10-4; ta thu được OD lần lượt là 1,118; 0,191; 0,782; 0,033 OD giảm khi nồng độ tế bào giảm, phản ánh lượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc tán xạ

ít hơn khi có ít tế bào hơn trong dung dịch Ta có thể sử dụng đường chuẩn OD

để ước lượng mật độ tế bào mà không cần đếm trực tiếp, giúp xác định nhanh mật độ vi sinh vật trong nghiên cứu

Bài 3: Thực hành lên men nước táo (Apple cider)

1 Trình bày các bước thực hành lên men nước táo mà Tổ đã làm?

B1: Nhận các bình ủ

B2: Đo độ pH và độ Brix theo các mốc thời gian: 0h, 24h, 48h, 72h

2 a) Các yêu cầu về nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị để lên men táo

như thế nào?

- Nguyên liệu: Táo đỏ 3kg; đường saccharose 1kg; nước cất 5L; giống nấm

men Wine Yeast (BV 818) 3g

- Hóa chất: Na2S2O5;NaCl

- Dụng cụ, thiết bị: Máy ép nước trái cây; máy đo độ ngọt Brix; bếp điện; kính

hiển vi; cân điện tử; máy vortex; dao; thớt

b) Các điều kiện lên men táo mà Tổ đã thực hành:

- Thể tích nước táo, tỷ lệ pha: 4l/2 bình

- Độ pH: 4

- Độ Brix: 25

- Nhiệt độ: 35oC

- Sục khí: bay hơi

- Tốc độ lắc:

- Mật độ giống/ Tỷ lệ giống men ban đầu so với thể tích lên men:

16,25x10⁶ tb/ml

c) Giải thích các thông số điều kiện lên men nước táo nêu trên

Nước táo được lên men trong môi trường pH=4 (môi trường acid nhẹ), giúp ức chế vi khuẩn lạ Độ Brix 25 (~250g đường/L), nhiệt độ 35°C giúp tăng tốc độ lên men Sục khí ban đầu hỗ trợ men phát triển, sau đó duy trì lên men kỵ khí Mật độ men ban đầu 16,25 × 10⁶ tb/ml giúp khởi động lên men nhanh và hạn

chế nhiễm tạp, tối ưu hóa quá trình lên men, giúp chuyển hóa đường thành rượu hiệu quả

Bài 4: Thực hành đánh giá lên men nước táo

1 Biến thiên một số yếu tố qua 24h, 48h, 72h?

- Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ

- Nhiệt độ: 24.23± độ C 24.23± độ C 24.23± độ C

Giải thích các kết quả:

- Thời gian 24 giờ là quá trình mới khởi động nên sẽ có độ cồn rất thấp, độ pH giảm

=> Chưa đủ để chuyển hoá đáng kể lượng đường

- Thời gian 48 giờ độ pH không thay đổi, độ brix giảm nhưng rất ít , xuất hiện mùi rượu nhẹ hoặc hơi chua

=> Nấm men hoạt động mạnh hơn khi đã thích nghi với môi trường

- Thời gian 72 giờ độ cồn sẽ bắt đầu tăng lên, màu sắc có thể trở nên tối hơn hoặc có chút đục do các vi sinh vật và cặn trong quá trình lên men => Quá trình lên men táo đã bắt đầu sinh cồn và tạo ra các biến đổi về hương vị

2 Tại thời điểm kiểm tra, sau 72h mật độ tế bào tăng trưởng thế nào?

- Tại thời điểm kiểm tra, sau 72h mật độ tế bào tăng trưởng nhanh hơn

3 a) Trình bày các bước chưng cất cồn và xác định độ cồn của dịch lên men táo?

- Chưng cất cồn

Bước 1: Lấy bộ chưng cất, có thể dùng đèn cồn hoặc bếp ổn nhiệt.

Bước 2: Lấy 100 ml dịch lên men đã khử CO2 ở nhiệt độ 20 độ C bằng bình

định mức hoặc ống đong (tốt nhất dùng BĐM)

Bước 3: Chuyển dịch lên men vào bình cất, tráng bằng nước cất (chú ý lượng

nước tráng không quá 100% thể tích dịch lên men, thông thường tráng khoảng 40-60ml nước cất cho 100 ml dịch lên men) Cho vài viên đá bọt vào bình

Bước 4: Tiến hành chưng cất thu hồi được khoảng 80ml cồn trong bình hứng

thì tắt bếp đun (chú ý chưng cất với tốc độ cồn ngưng tụ vừa phải, không đun sôi quá mạnh) thu thêm một ít sản phẩm chưng cất (không được quá 90ml)

Bước 5: Lấy sản phẩm từ bình hứng, đem định mức thành 100ml bằng nước

cất (tốt nhất ở 20 độ C)

Bước 6: Đem mẫu cất được đi đo độ cồn bằng máy đo điểm sôi, tỉ trọng kế,

cồn kế hoặc máy đo cồn cầm tay Snap 51

- Xác định độ cồn

Bước 1: Đặt máy trên bề mặt phẳng.

Bước 2: Tráng rửa pitton bằng nước cất trước khi sử dụng: chuẩn bị cốc chứa

nước cất, nhấn nút đỏ trên máy xuống, đưa thanh pitton vào trong cốc nước và thả nhẹ tay khỏi nút đỏ để pitton bơm nước vào, sau đó nhấn nút đỏ để xả nước trong pitton ra Lặp lại 2 - 3 lần, đảm bảo pitton sạch trước khi đo mẫu

Bước 3: Tráng rửa pitton bằng chính mẫu cần xác định độ cồn: tiến hành tương

tự bước 2 nhưng thay bằng cốc hoặc ống nghiệm chứa mẫu

Bước 4: Nhấn nút nguồn để khởi động máy, chờ khoảng 3 - 5 giây để máy ổn

định

Bước 5: Đo mẫu:

- Nhấn vào nút SAVE trên máy, màn hình sẽ hiện lên dòng chữ Mesuaring…

có nền màu xanh lá cây

- Quá trình đo mẫu kết thúc khi máy hiện lên dòng chữ Mesuarment Finish

Bước 6: Nhấn giữ nút nguồn để tắt máy.

Bước 7: Vệ sinh pitton sau khi sử dụng bằng cách thực hiện lại bước 2 Vệ sinh

máy và khu vực thao tác

b) Tại thời điểm kiểm tra, sau 72h lên men, độ cồn đo được là bao nhiêu? Cao hay thấp? Vì sao?

Tại thời điểm kiểm tra, sau 72h lên men, độ cồn đo được là: 8.42 Độ cồn đo được khá cao vì quá trình lên men được kiểm soát tốt, men hoạt động hiệu quả

và có đủ nguồn nguyên liệu để tạo ra Ethanol

Bài 5: Thực hành đánh giá chất lượng sản phẩm lên men táo

1 Tại thời điểm đánh giá, nước táo lên men có các chỉ tiêu như thế nào sau đây:

- pH: 3.211

- Độ Brix: 20

- Mùi: rượu táo bình thường

- Màu sắc: màu rượu táo điển hình

- Vị: ngọt thanh

2 Đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật

a) Tổng vi sinh vật hiếu khí:

- Các bước chuẩn bị: chuẩn bị dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

( PCA 300ml)

Bước 1: chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu ( dung dịch pha loãng ban đầu)

Bước 2: Pha loãng mẫu

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Bước 4: Đếm khuẩn lạc

Bước 5: Kết quả

- Danh mục các dụng cụ, hóa chất cần thiết chuẩn bị cho việc đánh giá chỉ tiêu VSV tổng số gồm những gì?

+ Dụng cụ : Ống nghiệm, pipet, ống durhan, micropipet 1ml, đĩa petri

+ Hóa chất: PCA (150 ml)