IUH - Tiểu luận Hóa sinh thực phẩm nâng cao - TÌM HIỂU NHỮNG CÔNG CỤ TRONG PHÂN TÍCH, ĐÁNH GIÁ BẢN CHẤT HÓA SINH (CẤU TẠO, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT) CỦA CÁC ĐẠI PHÂN TỬ ĐÃ BIẾN ĐỔI VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC.

1.1 Phân tích thành phần và khối lượng phân tử Việc phân tích các thành phần và khối lượng phân tử là bước nền tảng để xác định sự biến đổi cấu trúc của các đại phân tử sinh học như protein, polysaccharide hay lipid trong quá trình chế biến. Các công cụ phân tích hiện đại không chỉ cho phép xác định kích thước phân tử mà còn cung cấp bằng chứng rõ ràng về sự phân cắt, polymer hóa, hoặc gắn nhóm chức mới do các tác động vật lý, hóa học hoặc enzyme. 1.1.1 SDS-PAGE Phân tích bằng SDS–PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis – điện di gel polyacrylamide có chứa SDS) là một phương pháp quan trọng nhằm xác định sự thay đổi về khối lượng phân tử và cấu trúc của protein sau quá trình xử lý. SDS là chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm, có khả năng gắn đều dọc theo chuỗi polypeptide và phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 và 4, giúp protein di chuyển trong gel dựa chủ yếu vào kích thước phân tử. Kỹ thuật này cho phép đánh giá hiện tượng phân cắt, polymer hóa hoặc hình thành liên kết mới giữa các chuỗi protein [12]. SDS–PAGE thường được sử dụng để theo dõi sự biến đổi của protein trong quá trình chế biến như gia nhiệt, thủy phân enzyme hay bảo quản. Khi protein bị thủy phân, phổ điện di thường xuất hiện nhiều băng có khối lượng thấp hơn, chứng tỏ sự cắt nhỏ của chuỗi polypeptide. Ngược lại, khi xảy ra phản ứng polymer hóa hoặc hình thành cầu disulfide, các băng có xu hướng dịch chuyển lên vùng khối lượng cao hoặc giảm cường độ, thể hiện quá trình kết tụ và biến tính [12]. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích protein thực phẩm như protein đậu nành, gluten, sữa và thịt – nơi mà sự thay đổi cấu trúc ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất chức năng như khả năng tạo gel, nhũ hóa và tạo bọt [13]. Việc kết hợp SDS–PAGE với kỹ thuật nhuộm Coomassie Brilliant Blue hoặc nhuộm bạc giúp tăng độ nhạy, phát hiện được các protein có nồng độ thấp, từ đó đánh giá được hiệu quả của các quá trình xử lý như tách, tinh sạch hoặc cải thiện chất lượng nguyên liệu. Ngoài ra, khi kết hợp với Western blot, SDS

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẦM

Môn học: Hóa sinh thực phẩm nâng cao TÌM HIỂU NHỮNG CÔNG CỤ TRONG PHÂN TÍCH, ĐÁNH GIÁ BẢN CHẤT HÓA SINH (CẤU TẠO, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT) CỦA CÁC ĐẠI PHÂN TỬ ĐÃ BIẾN ĐỔI VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH

MỤC LỤC

Mở đầu 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Khái quát về các đại phân tử trong thực phẩm 5

1.2 Sự biến đổi hóa sinh của các đại phân tử 6

CHƯƠNG 2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC & THÀNH PHẦN HÓA HỌC 9

2.1 Phân tích thành phần và khối lượng phân tử 9

2.1.1 SDS-PAGE 9

2.1.2 Native-PAGE 10

2.1.3 SEC/GPC 11

2.1.4 MALDI-TOF, LC–MS/MS 12

2.2 Phân tích cấu trúc bậc 2–3 13

2.2.1 FTIR, Raman 13

2.2.2 Circular Dichroism (CD) 14

2.2.3 NMR 16

2.2.4 XRD / SAXS 17

2.3 Phân tích hình thái & bề mặt 18

2.3.1 SEM / TEM / AFM 18

2.3.2 DLS / Zeta potential 19

2.4 Phân tích tính chất vật lý–hóa học 20

2.4.1 DSC / TGA 20

2.4.2 Độ tan, khả năng tạo nhũ và tạo bọt 21

CHƯƠNG 3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC 23

3.1 Phân tích định tính và định lượng 23

3.1.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và LC–MS/MS 23

3.1.2 Sắc ký khí khối phổ (GC–MS) 24

3.1.3 Phổ hấp thụ UV–Vis 25

3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học 25

3.2.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 25

3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn 28

3.2.3 Đánh giá khả năng ức chế enzyme 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

MỞ ĐẦU

Trong lĩnh vực khoa học thực phẩm, việc hiểu rõ bản chất hóa sinh của các đại phân tửnhư carbohydrate, protein, lipid và các chất có hoạt tính sinh học giữ vai trò nền tảngcho việc đánh giá chất lượng, giá trị dinh dưỡng cũng như các biến đổi xảy ra trongquá trình chế biến, bảo quản và tiêu thụ thực phẩm Các đại phân tử này không chỉquyết định cấu trúc, tính chất cảm quan và độ ổn định của thực phẩm mà còn tham giavào hàng loạt phản ứng hóa sinh phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong đặc tính vật lý –hóa học và hoạt tính sinh học của sản phẩm cuối cùng [1]

Sự biến đổi hóa sinh của các đại phân tử là quá trình tất yếu diễn ra trong suốt vòngđời của thực phẩm – từ nguyên liệu đến sản phẩm chế biến Những biến đổi này có thểmang tính tích cực, như làm tăng khả năng tiêu hóa hoặc tạo hương vị đặc trưng,nhưng cũng có thể gây ảnh hưởng tiêu cực như mất hoạt tính sinh học, giảm giá trịdinh dưỡng hoặc hình thành các sản phẩm không mong muốn [2] Do đó, việc phântích và đánh giá chính xác cấu trúc, tính chất và các thay đổi của đại phân tử sau biếnđổi là yêu cầu cấp thiết trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ thực phẩm hiện đại

Sự phát triển của các công cụ và kỹ thuật phân tích hóa sinh học – bao gồm phổ học(spectroscopy), sắc ký (chromatography), điện di (electrophoresis), hiển vi điện tử(electron microscopy), và các phương pháp phân tích cấu trúc phân tử tiên tiến nhưNMR hay XRD – đã mở ra khả năng nhận diện và mô tả chi tiết hơn về cấu trúc cũngnhư sự biến đổi của các đại phân tử trong thực phẩm (Moreira et al., 2008) Nhữngcông cụ này cho phép các nhà khoa học không chỉ xác định thành phần và cấu trúc màcòn theo dõi được sự thay đổi động học của các phản ứng hóa sinh diễn ra ở mức phân

tử, từ đó tối ưu hóa quy trình chế biến, nâng cao chất lượng và giá trị sinh học của sảnphẩm thực phẩm

Vì vậy, tiểu luận này được thực hiện với mục tiêu tổng hợp, hệ thống hóa các kiếnthức về đại phân tử trong thực phẩm, các dạng biến đổi hóa sinh thường gặp, cùngnhững công cụ hiện đại trong việc phân tích, đánh giá cấu tạo, cấu trúc và tính chất củachúng Kết quả nghiên cứu này góp phần củng cố nền tảng lý thuyết cho sinh viên

chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, đồng thời cung cấp góc nhìn tổng quan về vai trò

và ứng dụng của các công cụ phân tích trong lĩnh vực hóa sinh thực phẩm hiện nay

1.1 Khái quát về các đại phân tử trong thực phẩm

Đại phân tử (macromolecules) trong thực phẩm chủ yếu bao gồm: glucid(carbohydrate), protein, lipid, và các phân tử hoạt tính sinh học như enzyme, vitamin,polyphenol, axit nucleic Các đại phân tử này đóng vai trò cấu trúc, dinh dưỡng, sinhhọc và ảnh hưởng đến tính chất công nghệ của thực phẩm [1]

Carbohydrate (glucid): gồm monosaccharide (ví dụ: glucose, fructose), disaccharide(sucrose, lactose), oligosaccharide và polysaccharide (như tinh bột, cellulose, pectin).Trong thực phẩm, tinh bột là thành phần lớn và cung cấp năng lượng chủ yếu [2].Protein (prôtêin, protid): gồm các chuỗi acid amin nối bằng liên kết peptide Proteintrong thực phẩm có vai trò kết cấu (ví dụ cấu trúc mạng gluten trong bột mì), chứcnăng dinh dưỡng (cung cấp amino acid thiết yếu), và đôi khi chức năng enzyme haysinh học nếu không bị biến tính [3]

Lipid (chất béo, dầu mỡ): là hợp chất không tan trong nước, tan trong dung môi hữucơ; trong thực phẩm, lipid có nhiệm vụ cung cấp năng lượng (khoảng 9 kcal/g), mangcác vitamin tan trong dầu (A, D, E, K), tạo cấu trúc, cảm giác béo ngậy và ảnh hưởngtính chất cảm quan (mùi, vị) [4]

Phân tử hoạt tính sinh học: gồm enzyme, các chất chống oxy hóa (polyphenol,flavonoid), các hợp chất sinh học khác như vitamin, axit nucleic (DNA/RNA còn lạitrong thực phẩm) Những phân tử này, mặc dù không phải là thành phần chính về khốilượng, nhưng có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, ôxy hoá, ổn định thực phẩm và chứcnăng sinh học [3]

Cấu trúc và liên kết trong đại phân tử

 Đại phân tử được cấu tạo từ các đơn phân (monomer) nối với nhau qua liên kếthóa học (peptide, glycosidic, ester, phosphodiester )

 Các bậc cấu trúc không gian (đặc biệt với protein: bậc 1, 2, 3, 4) quyết địnhhình dạng và chức năng.

 Các tương tác không cộng hóa trị (liên kết hydrogen, tương tác kỵ nước, lựcvan der Waals, liên kết ion) giữ vai trò quan trọng trong ổn định cấu hình khônggian

Vai trò trong thực phẩm và công nghệ thực phẩm [5]

 Là nguồn cung năng lượng và dưỡng chất cho con người

 Ảnh hưởng đặc tính vật lý – hóa học của thực phẩm: độ nhớt, kết cấu, độ hòatan, khả năng giữ nước

 Ảnh hưởng chất lượng cảm quan: hương vị, màu sắc, cảm giác miệng

 Ảnh hưởng tính ổn định, thời hạn bảo quản: ví dụ lipid dễ bị oxi hoá gây ôi,protein dễ biến tính khi đun nóng, enzyme nội sinh có thể xúc tác phản ứng bấtlợi

 Trong công nghệ chế biến: enzyme được dùng để biến đổi (ví dụ amylase,protease) nhằm cải thiện tính chất sản phẩm

1.2 Sự biến đổi hóa sinh của các đại phân tử

Trong quá trình chế biến, bảo quản hoặc trong quá trình tiếp xúc với các yếu tố môitrường (nhiệt độ, pH, oxy, enzyme, ánh sáng…), các đại phân tử có thể trải qua biếnđổi hóa sinh (biochemical modifications) làm thay đổi cấu trúc, tính chất và hoạt tínhsinh học

Trong thực phẩm, các đại phân tử như carbohydrate, protein và lipid luôn tồn tại trongtrạng thái động, chịu tác động của nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, oxy, enzyme, ánhsáng hoặc tác nhân cơ học Những yếu tố này có thể gây ra các biến đổi hóa sinh(biochemical modifications) làm thay đổi cấu trúc, tính chất vật lý – hóa học và hoạttính sinh học của phân tử Các biến đổi này có thể diễn ra tự nhiên trong quá trình bảoquản, do enzyme xúc tác, hoặc do tác động công nghệ trong chế biến [6] Tùy vào loạiđại phân tử, mức độ và hướng biến đổi có thể mang lại hiệu quả tích cực, như cải thiệnkhả năng tiêu hóa hoặc cảm quan, hoặc tiêu cực, như mất hoạt tính sinh học và giảmgiá trị dinh dưỡng [7]

Protein là nhóm đại phân tử dễ bị biến đổi nhất trong quá trình xử lý thực phẩm Dướitác động của nhiệt hoặc thay đổi pH, protein có thể bị biến tính (denaturation) – tức làmất đi cấu trúc bậc cao (bậc 2, 3, 4) mà không phá vỡ liên kết peptide trong cấu trúcbậc 1 Sự biến tính làm thay đổi tính tan, khả năng tạo gel, tạo bọt và hoạt tính enzymecủa protein [8] Trong nhiều trường hợp, biến tính có thể có lợi, như khi gia nhiệt sữa

để bất hoạt enzyme hoặc vi sinh vật, song cũng có thể bất lợi khi làm giảm giá trị sinhhọc của protein do mất khả năng hấp thu amino acid hoặc làm mất enzyme chức năng.Ngoài ra, protein còn có thể tham gia phản ứng Maillard với đường khử, hình thànhmelanoidin, tạo màu và mùi đặc trưng cho sản phẩm nướng, tuy nhiên phản ứng nàycũng làm thất thoát một số amino acid quan trọng như lysine [6]

Carbohydrate trong thực phẩm cũng có thể trải qua nhiều biến đổi hóa sinh khác nhau.Dưới tác động của enzyme như amylase hoặc glucoamylase, tinh bột bị thủy phânthành dextrin, maltose và glucose Các phản ứng này làm thay đổi tính chất vật lý củatinh bột như khả năng hút nước, độ nhớt và tính dính, ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúcthực phẩm [9] Ngoài ra, trong điều kiện nhiệt độ cao, đường khử có thể bị caramelhóa, tạo hợp chất có màu nâu và hương vị đặc trưng Trong quá trình bảo quản,carbohydrate cũng có thể bị oxi hóa nhẹ hoặc isomer hóa, làm thay đổi khả năng phảnứng và ảnh hưởng đến quá trình Maillard [8]

Đối với lipid, biến đổi hóa sinh chủ yếu là oxy hóa lipid và thủy phân Phản ứng oxyhóa diễn ra qua các giai đoạn hình thành gốc tự do, tạo hydroperoxide, aldehyde,ketone – các hợp chất gây mùi ôi và giảm giá trị dinh dưỡng do phá hủy acid béokhông no [10] Ngoài ra, lipid cũng có thể bị thủy phân bởi enzyme lipase, tạo acidbéo tự do và glycerol; quá trình này thường thấy trong các sản phẩm chứa dầu, hạt códầu hoặc sữa khi bảo quản lâu Những biến đổi này không chỉ ảnh hưởng đến chấtlượng cảm quan mà còn liên quan đến tính an toàn thực phẩm, do một số sản phẩmoxy hóa có thể gây độc hại hoặc làm giảm khả năng hấp thu lipid trong cơ thể [6].Bên cạnh ba nhóm chính, các hợp chất có hoạt tính sinh học như polyphenol, vitamin

và enzyme cũng chịu tác động mạnh của các quá trình biến đổi hóa sinh Polyphenol

có thể bị oxy hóa bởi enzyme polyphenol oxidase, tạo quinone và polymer hóa thànhmelanin, dẫn đến hiện tượng nâu hóa enzymatic thường thấy ở rau quả cắt, ép [11].Vitamin dễ bị phân hủy dưới tác dụng của nhiệt, ánh sáng hoặc oxy; ví dụ, vitamin C

bị oxy hóa nhanh chóng trong môi trường kiềm hoặc khi gia nhiệt, làm giảm giá trịdinh dưỡng của sản phẩm [8] Ngoài ra, enzyme nội sinh hoặc ngoại sinh có thể xúctác các phản ứng chuyển hóa như phosphorylation, methylation, acylation hoặcglycosylation, từ đó làm thay đổi hoạt tính sinh học hoặc tính ổn định của các đại phântử.

Nhìn chung, các biến đổi hóa sinh của đại phân tử là yếu tố trung tâm quyết định chấtlượng, giá trị cảm quan và tính ổn định của thực phẩm Hiểu rõ bản chất của các quátrình này không chỉ giúp kiểm soát các phản ứng bất lợi mà còn khai thác được cácbiến đổi có lợi, phục vụ cho mục tiêu chế biến thực phẩm hiện đại, tối ưu hóa dinhdưỡng và phát triển các sản phẩm có chức năng sinh học cao

Để hiểu rõ bản chất của các biến đổi hóa sinh này, việc sử dụng các công cụ và kỹthuật phân tích hiện đại là điều kiện tiên quyết Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier(FTIR) và phổ Raman cho phép nhận diện các nhóm chức năng và biến đổi cấu trúcthứ cấp của protein hay polysaccharide thông qua dịch chuyển dao động đặc trưng.Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và nhiễu xạ tia X (XRD) được dùng để xác định cấutrúc tinh thể, trật tự sắp xếp không gian và mức độ tương tác giữa các phân tử Trongkhi đó, kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) cung cấphình ảnh trực quan về hình thái bề mặt, kích thước hạt và mức độ liên kết mạng lướisau khi biến tính Ngoài ra, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC) và phổkhối (MS) được sử dụng để định lượng các hợp chất nhỏ sinh ra trong quá trình phảnứng, chẳng hạn như peptide, acid béo tự do hay sản phẩm oxy hóa Một số công cụphân tích nhiệt như Differential Scanning Calorimetry (DSC) hoặc ThermogravimetricAnalysis (TGA) còn giúp theo dõi sự thay đổi năng lượng và ổn định nhiệt của đạiphân tử khi chịu tác động vật lý

Nhờ sự kết hợp của các công cụ này, các nhà nghiên cứu có thể mô tả chính xác mốiliên hệ giữa cấu trúc – tính chất – hoạt tính sinh học của đại phân tử trong thực phẩm.Đây cũng là cơ sở để phát triển các công nghệ chế biến tiên tiến, tối ưu hóa chất lượngsản phẩm và khai thác hiệu quả các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nguồn nguyênliệu tự nhiên

CHƯƠNG 2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC & THÀNH PHẦN HÓA HỌC2.1 Phân tích thành phần và khối lượng phân tử

Việc phân tích các thành phần và khối lượng phân tử là bước nền tảng để xác định sựbiến đổi cấu trúc của các đại phân tử sinh học như protein, polysaccharide hay lipidtrong quá trình chế biến Các công cụ phân tích hiện đại không chỉ cho phép xác địnhkích thước phân tử mà còn cung cấp bằng chứng rõ ràng về sự phân cắt, polymer hóa,hoặc gắn nhóm chức mới do các tác động vật lý, hóa học hoặc enzyme

2.1.1 SDS-PAGE

Phân tích bằng SDS–PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide GelElectrophoresis – điện di gel polyacrylamide có chứa SDS) là một phương pháp quantrọng nhằm xác định sự thay đổi về khối lượng phân tử và cấu trúc của protein sau quátrình xử lý SDS là chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm, có khả năng gắn đều dọctheo chuỗi polypeptide và phá vỡ cấu trúc bậc 2, 3 và 4, giúp protein di chuyển tronggel dựa chủ yếu vào kích thước phân tử Kỹ thuật này cho phép đánh giá hiện tượngphân cắt, polymer hóa hoặc hình thành liên kết mới giữa các chuỗi protein [12] SDS–PAGE thường được sử dụng để theo dõi sự biến đổi của protein trong quá trình chếbiến như gia nhiệt, thủy phân enzyme hay bảo quản Khi protein bị thủy phân, phổđiện di thường xuất hiện nhiều băng có khối lượng thấp hơn, chứng tỏ sự cắt nhỏ củachuỗi polypeptide Ngược lại, khi xảy ra phản ứng polymer hóa hoặc hình thành cầudisulfide, các băng có xu hướng dịch chuyển lên vùng khối lượng cao hoặc giảmcường độ, thể hiện quá trình kết tụ và biến tính [12]

Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích protein thực phẩm như proteinđậu nành, gluten, sữa và thịt – nơi mà sự thay đổi cấu trúc ảnh hưởng trực tiếp đến tínhchất chức năng như khả năng tạo gel, nhũ hóa và tạo bọt [13] Việc kết hợp SDS–PAGE với kỹ thuật nhuộm Coomassie Brilliant Blue hoặc nhuộm bạc giúp tăng độ

nhạy, phát hiện được các protein có nồng độ thấp, từ đó đánh giá được hiệu quả củacác quá trình xử lý như tách, tinh sạch hoặc cải thiện chất lượng nguyên liệu.

Ngoài ra, khi kết hợp với Western blot, SDS–PAGE có thể xác định các biến thểprotein bị biến tính hoặc bị glycat hóa, đóng vai trò quan trọng trong đánh giá tác độngcủa nhiệt độ và phản ứng Maillard đến chất lượng sản phẩm thực phẩm Nhờ đó, SDS–PAGE không chỉ là công cụ cơ bản trong phân tích khối lượng phân tử mà còn làphương tiện then chốt giúp hiểu rõ cơ chế biến đổi cấu trúc protein trong hệ thống thựcphẩm phức tạp

2.1.2 Native-PAGE

Phân tích bằng Native–PAGE (Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis – điện digel polyacrylamide trong điều kiện tự nhiên) là kỹ thuật được sử dụng để đánh giá sựthay đổi cấu trúc và trạng thái tự nhiên của protein mà không làm phá vỡ các liên kếtkhông cộng hóa trị hoặc làm biến tính chuỗi polypeptide Khác với SDS–PAGE,phương pháp này không sử dụng chất hoạt động bề mặt SDS, nhờ đó các protein giữnguyên cấu hình bậc 2, bậc 3 và một phần bậc 4 Quá trình di chuyển trong gel đượcquyết định bởi kích thước, hình dạng không gian và điện tích bề mặt tự nhiên của phân

tử protein [14] Native–PAGE đặc biệt hữu ích khi cần phân tích các phức hợp proteinhoặc enzyme còn hoạt tính, chẳng hạn như các protein dự trữ trong ngũ cốc, proteinsữa hoặc enzyme oxy hóa–khử có vai trò trong quá trình nâu hóa thực phẩm Kỹ thuậtnày cho phép phát hiện sự thay đổi trạng thái kết hợp hoặc sự hình thành các phức hợpprotein mới trong quá trình xử lý vật lý, hóa học hoặc sinh học [15] Ví dụ, khi protein

bị biến tính nhẹ do tác động của nhiệt hoặc pH, sự thay đổi điện tích bề mặt có thể làmthay đổi tốc độ di chuyển, tạo ra các băng mờ hơn hoặc dịch chuyển trong gel, phảnánh sự thay đổi cấu trúc bậc 3 mà SDS–PAGE không thể hiện được

Native–PAGE cũng thường được kết hợp với kỹ thuật nhuộm hoạt tính enzyme(zymography) để đánh giá mức độ duy trì hoạt tính sinh học của protein sau xử lý.Trong các nghiên cứu về enzyme thực phẩm như peroxidase, polyphenol oxidase haylipoxygenase, zymogram cho thấy rõ các băng enzyme vẫn còn hoạt tính, qua đóchứng minh khả năng bảo toàn cấu trúc hoạt động (active conformation) sau các quátrình gia nhiệt hoặc sấy khô [16] Đây là công cụ mạnh mẽ giúp nhà nghiên cứu hóa

sinh thực phẩm quan sát trực tiếp sự thay đổi trạng thái kết hợp và điện tích tự nhiêncủa protein mà không làm biến tính, hỗ trợ đánh giá mối liên hệ giữa cấu trúc bậc cao

và hoạt tính sinh học – yếu tố cốt lõi trong thiết kế và cải tiến sản phẩm thực phẩm cónguồn gốc sinh học

2.1.3 SEC/GPC

SEC/GPC (Size Exclusion Chromatography / Gel Permeation Chromatography – sắc

ký loại trừ kích thước) là một trong những công cụ trọng yếu trong hóa sinh thực phẩmdùng để xác định phân bố khối lượng phân tử, mức độ polymer hóa hoặc sự phân cắtmạch của các đại phân tử như polysaccharide, protein, hoặc polyphenol liên kết.Nguyên lý của phương pháp dựa trên khả năng phân tách các phân tử theo kích thướchydrodynamic khi đi qua cột sắc ký chứa gel có kích thước lỗ xốp xác định: các phân

tử lớn không thấm sâu vào gel sẽ ra trước, trong khi các phân tử nhỏ hơn thấm sâu hơnnên ra sau [17] SEC/GPC đặc biệt hữu ích để đánh giá mức độ biến đổi phân tử docác quá trình xử lý vật lý hoặc hóa học Khi protein hoặc polysaccharide bị thủy phân,các phân tử có kích thước nhỏ hơn xuất hiện, thể hiện qua sự dịch chuyển của đỉnh sắc

ký về thời gian lưu dài hơn Ngược lại, khi xảy ra phản ứng polymer hóa hoặc liên kếtchéo (cross-linking), các đỉnh phân tử cao hơn sẽ chiếm ưu thế, chứng tỏ sự hình thànhcác phức hợp có khối lượng lớn

Đối với protein thực phẩm, SEC giúp phân biệt giữa các dạng monomer, dimer vàoligomer, từ đó đánh giá mức độ kết tụ hoặc biến tính trong quá trình chế biến như gianhiệt, chiếu xạ hoặc xử lý bằng áp suất cao Ví dụ, trong protein đậu nành hoặc whey,việc xử lý nhiệt thường dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ oligomer và giảm các phân tử đơn lẻ,thể hiện sự biến tính và tái cấu trúc không thuận nghịch [18] Phương pháp này cũngđược ứng dụng trong việc nghiên cứu polysaccharide, đặc biệt là tinh bột và dẫn xuấtcủa nó để theo dõi quá trình cắt mạch bằng enzyme hoặc nhiệt khô

Khi kết hợp với các đầu dò đa góc tán xạ laser (MALS – Multi-Angle LightScattering) hoặc khúc xạ kế vi sai (Differential Refractometer), SEC có thể xác địnhchính xác khối lượng phân tử tuyệt đối, bán kính quán tính (radius of gyration) và mức

độ phân tán (polydispersity index) Các thông số này giúp chứng minh sự thay đổi cấu

trúc chuỗi, mức độ phân nhánh hoặc sự hình thành liên kết mới, cung cấp thông tin chitiết về bản chất hóa sinh của các đại phân tử sau biến đổi.

SEC/GPC còn được sử dụng để phân tích các chất có hoạt tính sinh học như peptidehoặc oligosaccharide chức năng, giúp xác định mối liên hệ giữa phân bố khối lượngphân tử và khả năng chống oxy hóa, tạo vị hoặc cải thiện chức năng sinh lý [19] Nhờ

đó, phương pháp này không chỉ là công cụ phân tích cấu trúc mà còn là cơ sở địnhlượng mối tương quan giữa biến đổi phân tử và hoạt tính sinh học – yếu tố trung tâmtrong thiết kế sản phẩm thực phẩm chức năng và cải tiến công nghệ chế biến

2.1.4 MALDI-TOF, LC–MS/MS

MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight MassSpectrometry) đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm để lập hồ sơ cácphân tử sinh học như protein, peptide và các phân tử đánh dấu (marker compounds)trong sản phẩm thực phẩm và đồ uống [20] Phương pháp này có ưu điểm là xử lý mẫuđơn giản, độ nhạy cao, khả năng tự động hóa và độ dung nạp muối tốt, khiến nó trởthành lựa chọn ưu tiên để phân tích nhanh các thành phần phân tử trong ma trận thựcphẩm phức tạp [9] MALDI-TOF được dùng để phát hiện sự xuất hiện hoặc biến dịchcủa các phân tử protein sau xử lý nhiệt, phản ứng Maillard, hoặc gắn nhóm chức mới

Ví dụ, sự xuất hiện đỉnh m/z mới hoặc dịch chuyển đỉnh trong phổ MALDI có thể chothấy một phân tử peptide hoặc protein đã gắn thêm nhóm carbonyl hoặc bị oxy hóa —bằng chứng cho biến đổi hóa học phân tử trong quá trình chế biến [20] Ngoài ra,phương pháp này còn được sử dụng để phân biệt các mẫu thực phẩm có nguồn gốchoặc quy trình chế biến khác nhau dựa trên “hồ sơ phân tử” ví dụ phân biệt xúc xíchtheo hình thức sản xuất [21]

LC–MS/MS (Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry) là kỹ thuật kếthợp sắc ký lỏng để tách mẫu theo các thành phần đơn lẻ, sau đó dùng khối phổ haitầng (MS/MS) để phân mảnh ion và xác định trình tự peptide, vị trí gắn nhóm chứcmới (phosphorylation, glycosylation, oxidation, v.v.) Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích đểđịnh vị chính xác biến đổi post-translational trên protein thực phẩm và peptidebioactive Khi một peptide được gắn thêm đường khử (glycation), khối lượng sẽ tăng

lên (ví dụ +162 Da với gắn glucose), và LC–MS/MS có thể phân tích mảnh ion để xácđịnh vị trí gắn [22].

Cả hai kỹ thuật đều có ưu điểm và hạn chế nhất định: MALDI-TOF cho tốc độ và tínhđơn giản cao, nhưng trong mẫu thực phẩm phức tạp có thể gặp nhiễu; LC–MS/MScung cấp độ phân giải và khả năng định vị biến đổi rất cao, nhưng đòi hỏi bước xử lýmẫu và điều kiện phân tách tỉ mỉ Khi được sử dụng phối hợp hoặc hỗ trợ lẫn nhau,chúng cho phép xây dựng hệ thống bằng chứng mạnh mẽ cho các biến đổi hóa sinhcủa đại phân tử trong thực phẩm — từ việc phát hiện khối lượng mới, gắn nhóm chứcđến xác định trình tự peptide và kết nối với hoạt tính sinh học hoặc tính chất thựcphẩm

2.2 Phân tích cấu trúc bậc 2–3

Các đại phân tử sinh học như protein và polysaccharide không chỉ có thành phần phân

tử quan trọng mà còn có cấu trúc bậc 2 (secondary structure) và bậc 3 (tertiarystructure) đóng vai trò quyết định tính chất chức năng, khả năng hòa tan, và hoạt tínhsinh học Việc xác định và theo dõi sự thay đổi các cấu trúc này sau xử lý nhiệt,enzyme, hoặc phản ứng hóa học (như Maillard) là rất quan trọng trong nghiên cứu hóasinh thực phẩm Các công cụ phổ biến bao gồm FTIR, Raman, Circular Dichroism(CD), NMR, và XRD/SAXS, giúp chứng minh mức độ biến tính hoặc tái sắp xếp cấutrúc không gian của đại phân tử

2.2.1 FTIR, Raman

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy – FTIR) vàphổ Raman là hai kỹ thuật phổ học quan trọng thường được ứng dụng trong nghiêncứu cấu trúc bậc 2–3 của protein thực phẩm Cả hai phương pháp đều dựa trên nguyên

lý hấp thụ hoặc tán xạ của bức xạ điện từ khi tương tác với dao động nội phân tử, từ đócung cấp thông tin về loại liên kết hóa học, nhóm chức, và sự sắp xếp không gian củachuỗi polypeptit [22]

Trong FTIR, vùng phổ dao động 1600–1700 cm ¹, được gọi là vùng ⁻ Amide I, có ý

nghĩa đặc biệt vì phản ánh dao động kéo giãn của liên kết C=O trong nhóm amide –vốn nhạy cảm với sự thay đổi trong cấu trúc bậc 2 của protein như α-helix, β-sheet haycấu trúc ngẫu nhiên [23] Thông qua việc phân tích tỉ lệ diện tích các dải hấp thụ trong

vùng này, có thể định lượng tương đối phần trăm của từng loại cấu trúc thứ cấp Chẳnghạn, sự gia tăng tỉ lệ β-sheet thường gắn liền với quá trình biến tính nhiệt hoặc sự hìnhthành mạng polymer do oxy hóa liên kết disulfide trong protein thực phẩm [24] Ngoài

ra, vùng Amide II (1480–1575 cm ¹) và ⁻ Amide III (1220–1330 cm ¹) cũng cung cấp⁻thông tin hỗ trợ về liên kết N–H và C–N, giúp đánh giá mức độ tương tác hydrogen và

sự thay đổi môi trường vi mô của gốc amino acid [25]

Phổ Raman, phản ánh sự thay đổi năng lượng tán xạ không đàn hồi của ánh sáng khitương tác với dao động phân tử Ưu điểm nổi bật của Raman so với FTIR là khả năngkhảo sát mẫu ở trạng thái ướt hoặc phức tạp như dung dịch protein, gel hoặc huyềnphù, mà không bị ảnh hưởng mạnh bởi nước – vốn là chất hấp thụ hồng ngoại mạnh[26] Raman cho phép phát hiện các biến đổi trong cấu trúc α-helix hoặc β-sheet thôngqua các dải đặc trưng ở khoảng 1650 và 1670 cm ¹, tương ứng với vùng dao động⁻Amide I Ngoài ra, sự thay đổi cường độ các đỉnh ở 1000–1100 cm ¹ có thể phản ánh⁻

sự oxy hóa hoặc biến đổi của các nhóm sulfhydryl (–SH) và disulfide (–S–S–), là yếu

tố then chốt ảnh hưởng đến độ bền cấu trúc và khả năng tạo gel của protein thực phẩm[27]

Trong lĩnh vực hóa sinh thực phẩm, FTIR và Raman thường được sử dụng song song

để đánh giá biến tính protein trong các quá trình xử lý nhiệt, pH, enzyme hoặc áp suấtcao Khi xử lý protein đậu nành ở 90 °C trong 30 phút, tỷ lệ β-sheet tăng đáng kể trongkhi α-helix giảm, chứng tỏ sự tái sắp xếp cấu trúc thứ cấp dẫn đến hiện tượng kết tụ[28] Kết quả tương tự cũng được quan sát khi gia nhiệt gluten hoặc protein đậu HàLan, cho thấy mối tương quan giữa mức độ biến tính và khả năng giữ nước, tạo gelhoặc nhũ hóa của protein

FTIR và Raman là hai công cụ bổ trợ mạnh mẽ trong việc theo dõi biến đổi cấu trúccủa protein thực phẩm ở cấp độ phân tử Sự kết hợp giữa hai kỹ thuật này không chỉcho phép định lượng chính xác tỷ lệ cấu trúc bậc 2 mà còn giúp lý giải cơ chế biến tính

và tương tác phân tử trong quá trình chế biến thực phẩm, từ đó hỗ trợ thiết kế điều kiện

xử lý tối ưu nhằm duy trì hoặc cải thiện tính chất chức năng của protein

sự biến tính hoặc tái cấu trúc của protein thực phẩm Ví dụ, khi gia nhiệt, tín hiệu helix suy giảm đồng thời β-sheet hoặc cấu trúc ngẫu nhiên tăng, phản ánh quá trìnhduỗi xoắn chuỗi polypeptit và hình thành cấu trúc kết tụ thông qua liên kết disulfidehoặc tương tác kỵ nước [31].

α-Vùng tử ngoại gần (near-UV, 250–320 nm) cung cấp thông tin về cấu trúc bậc 3 thôngqua các tín hiệu từ các amino acid thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine.Các thay đổi trong vùng này phản ánh sự thay đổi môi trường vi mô của các gốc thơm– tức là sự dịch chuyển hoặc phơi bày ra ngoài của các phần tử kỵ nước khi protein bịbiến tính [32] Đây là công cụ quan trọng giúp đánh giá sự ổn định không gian củaprotein và hiệu ứng của các điều kiện chế biến thực phẩm như nhiệt, pH hay áp suấtcao

CD được ứng dụng rộng rãi để phân tích sự biến tính protein trong quá trình chế biến,giúp liên hệ giữa biến đổi cấu trúc và tính chất chức năng Chẳng hạn khi đun nónghỗn hợp whey–casein ở 90 °C, phổ CD cho thấy sự suy giảm α-helix và gia tăng β-sheet, tương ứng với hiện tượng tạo gel và tăng độ nhớt [33] CD cũng là công cụmạnh mẽ trong đánh giá ảnh hưởng của quá trình oxy hóa hoặc biến đổi hóa học nhưglycation, phosphorylation đến cấu trúc protein Đây là công cụ then chốt trong nghiêncứu hóa sinh thực phẩm, giúp định lượng trực tiếp sự thay đổi cấu trúc bậc 2–3 củaprotein dưới tác động của các yếu tố công nghệ Sự kết hợp CD với các phương pháp

khác như FTIR hoặc DSC giúp xây dựng bức tranh toàn diện hơn về cơ chế biến tính,

từ đó định hướng thiết kế sản phẩm thực phẩm có cấu trúc và chức năng mong muốn

2.2.3 NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR) là một công cụ mạnh

mẽ trong phân tích cấu trúc bậc 2–3 của đại phân tử sinh học, đặc biệt là protein vàpolysaccharide Nguyên lý của NMR dựa trên hiện tượng các hạt nhân nguyên tử cómoment từ (như ¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P) hấp thụ năng lượng vi sóng khi đặt trong từ trườngmạnh, gây ra sự đảo chiều spin từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích Tín hiệuthu được sau đó được biến đổi Fourier để thu phổ NMR, phản ánh môi trường hóa học

và tương tác không gian giữa các nguyên tử trong phân tử [34] NMR không chỉ chophép nhận diện cấu trúc phân tử ở mức nguyên tử mà còn theo dõi sự thay đổi cấu trúckhông gian của protein trong điều kiện chế biến khác nhau như nhiệt, pH, áp suất,hoặc trong quá trình tương tác với lipid, polysaccharide hay polyphenol ¹H-NMRcung cấp thông tin về các proton trong chuỗi peptide, trong khi ¹³C-NMR được sửdụng để xác định môi trường liên kết của các carbon trong khung xương phân tử.NMR hai chiều (2D-NMR) như COSY (COrrelation SpectroscopY), HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence) hoặc NOESY (Nuclear Overhauser EffectSpectroscopY) cho phép xác định khoảng cách không gian giữa các nguyên tử và từ đódựng lại cấu trúc bậc 3 của protein [35] Về mặt ứng dụng trong thực phẩm, NMR đặcbiệt hữu ích trong nghiên cứu biến tính protein và cấu trúc chức năng Khi protein bịbiến tính do nhiệt hoặc tương tác hóa học, sự thay đổi trong tín hiệu hóa học (chemicalshift) và cường độ đỉnh phổ NMR phản ánh sự phá vỡ các liên kết hydrogen, tương tác

kỵ nước hoặc thay đổi trong mức độ linh động của chuỗi polypeptit Trong nghiên cứuprotein sữa, khi β-lactoglobulin được gia nhiệt, các tín hiệu liên quan đến proton củagốc tryptophan và tyrosine bị dịch chuyển, cho thấy sự phơi bày các gốc thơm ra môitrường dung môi – một bằng chứng cho sự mất ổn định cấu trúc bậc 3 [36]

Ngoài ra, NMR cũng cho phép đánh giá tương tác giữa protein và các phân tử hoạttính sinh học Trong hệ protein–polyphenol hoặc protein–carbohydrate, sự thay đổihóa học δ (delta) và sự giảm cường độ tín hiệu proton cho thấy sự hình thành phứchoặc liên kết không cộng hóa trị, có thể ảnh hưởng đến tính chất chức năng như khảnăng tạo bọt, nhũ hóa hoặc tạo gel [37] Ứng dụng này đặc biệt quan trọng trong việc

phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng, nơi protein đóng vai trò là chất mang(carrier) cho hợp chất hoạt tính sinh học.

Một lợi thế lớn của NMR trong phân tích hóa sinh thực phẩm là khả năng nghiên cứutrong môi trường gần tự nhiên mà không cần kết tinh mẫu Điều này cho phép theo dõi

sự thay đổi cấu trúc của protein trong dung dịch, gel, hoặc thậm chí trong ma trận thựcphẩm phức tạp Ứng dụng NMR trạng thái rắn (solid-state NMR) cũng mở rộng khảnăng nghiên cứu các hệ có cấu trúc giới hạn chuyển động, như protein bị biến tínhtrong sản phẩm sấy khô hoặc trong cấu trúc bột thực phẩm [38]

độ sắp xếp phân tử, khoảng cách giữa các lớp hoặc kích thước của các hạt nano cấutrúc [39] XRD được sử dụng để xác định mức độ kết tinh (crystallinity) của proteinhoặc polysaccharide, vốn ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền nhiệt, độ hòa tan và khả năngtương tác với nước Khi protein bị biến tính do nhiệt hoặc pH, các vùng có trật tự cao(như β-sheet) thường bị phá vỡ, dẫn đến giảm cường độ đỉnh nhiễu xạ đặc trưng trongphổ XRD Phổ XRD của protein đậu nành sau xử lý nhiệt cho thấy sự suy giảm đỉnh ở2θ = 9° và 20°, phản ánh sự chuyển đổi từ cấu trúc bán kết tinh sang vô định hình,tương ứng với mất liên kết hydrogen nội phân tử và tái sắp xếp mạch polypeptideSAXS cung cấp thông tin sâu hơn ở cấp độ nano (1–100 nm), giúp mô tả cấu trúc hìnhhọc, kích thước hạt, sự kết tụ hoặc hình thành mạng lưới không gian ba chiều củaprotein trong dung dịch SAXS đặc biệt hữu ích khi nghiên cứu các biến đổi cấu trúctrong môi trường nước, nơi các kỹ thuật khác như XRD hoặc SEM không thể áp dụngtrực tiếp Ví dụ, sự dịch chuyển của đỉnh tán xạ ở vùng q = 0.02–0.1 Å ¹ có thể chỉ ra⁻

sự hình thành cụm protein (protein aggregates) hoặc sự nở ra của cấu trúc cầu(globular unfolding) – một chỉ số quan trọng cho thấy mức độ biến tính và khả năngtạo gel của protein [40]

Khi áp dụng trong nghiên cứu thực phẩm, XRD và SAXS thường được kết hợp đểphân tích song song sự thay đổi cấu trúc trong các hệ protein–tinh bột, protein–polysaccharide hoặc protein–lipid Chẳng hạn, sự giảm cường độ nhiễu xạ β-sheet kèmtheo tăng tín hiệu SAXS ở vùng nhỏ có thể chứng minh rằng protein bị phá vỡ cấu trúcbậc cao nhưng đồng thời hình thành mạng liên kết mới với polysaccharide, tạo nên cấutrúc gel bền hơn Điều này rất quan trọng trong việc phát triển sản phẩm thay thế thịthoặc xúc xích chay, nơi tính đàn hồi và độ dai phụ thuộc chặt chẽ vào mức độ sắp xếpnano của chuỗi protein.

Ngoài ra, XRD còn được dùng để xác định sự tạo thành tinh thể muối, đường hoặcprotein–polyphenol complexes trong quá trình sấy hoặc bảo quản, vì các cấu trúc kếttinh này ảnh hưởng đến độ ẩm, khả năng hút nước và cảm quan của thực phẩm [42].SAXS, ngược lại, có thể theo dõi sự thay đổi động học cấu trúc theo thời gian, ví dụkhi protein đông tụ trong quá trình gia nhiệt, giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ mối quan

hệ giữa cấu trúc nano và tính chất cảm quan như độ cứng, độ nhớt hay khả năng giữnước

2.3 Phân tích hình thái & bề mặt

2.3.1 SEM / TEM / AFM

Các kỹ thuật hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy – SEM), hiển vi điện

tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy – TEM) và hiển vi lực nguyên tử(Atomic Force Microscopy – AFM) là những công cụ quan trọng trong phân tích hìnhthái và cấu trúc bề mặt của các đại phân tử sinh học như protein, polysaccharide, haycác hạt tinh bột SEM cho phép quan sát bề mặt vật liệu với độ phân giải cao, giúp xácđịnh được hình dạng, kích thước và sự kết tụ của các cấu trúc sau các quá trình xử lývật lý hoặc hóa học Trong lĩnh vực hóa sinh thực phẩm, SEM thường được sử dụng

để quan sát sự thay đổi cấu trúc bề mặt tinh bột hoặc protein sau các quá trình biếntính như sấy, gia nhiệt hoặc phản ứng Maillard (Maillard reaction), qua đó phản ánhđược mức độ phá vỡ liên kết nội phân tử và tái sắp xếp cấu trúc polymer [43]

TEM, với khả năng truyền chùm điện tử xuyên qua mẫu cực mỏng, cho phép quan sátcấu trúc bên trong ở mức độ nano Đối với các hệ protein hoặc polysaccharide, TEMgiúp làm rõ sự tạo thành mạng lưới gel, kích thước và sự kết tụ của các hạt sau xử lý