IUH - BÀI TẬP VỀ NHÀ - KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ

MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM



KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

BÀI TẬP VỀ NHÀ

Giảng viên hướng dẫn: LÊ TRẦM NGHĨA THƯ

Lớp: DHSHYD18A

Nhóm 9

Danh sách thành viên nhóm

Phạm Thị Hồng Phụng 22660941

Trương Trọng Phúc 22657791

Đinh Diệp Phi 22658581

Lê Thanh Tân 22687861

Đỗ Thiên Bảo 22667791

CÁC PHƯƠNG PHÁP TẠO DÒNG TẾ BÀO

1.Phương pháp tạo dòng FACS

Khái niệm:

FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) là một kỹ thuật thuộc flow cytometry (tế bào dòng chảy), được sử dụng để phân tích và tách riêng các tế bào trong một quần thể dựa trên những đặc tính vật lý và huỳnh quang của chúng

Nguyên lý cơ bản:

Các tế bào được đưa vào máy FACS trong dạng huyền dịch đơn bào

Mỗi tế bào đi qua một luồng chất lỏng hẹp, rồi lần lượt đi qua chùm tia laser

Khi tia laser chiếu vào, các tín hiệu tán xạ ánh sáng (forward scatter, side scatter) và tín hiệu huỳnh quang (nếu tế bào đã được gắn kháng thể/marker huỳnh quang) sẽ được thu nhận

Hệ thống điện tích sẽ phân loại từng tế bào theo đặc tính mong muốn và “hất” tế bào đó vào ống thu riêng biệt

Khi áp dụng cho mục đích tạo dòng, kỹ thuật này cho phép tách một tế bào đơn lẻ vào từng giếng trong đĩa nuôi cấy.Từ đó, mỗi tế bào đơn sẽ nhân lên, hình thành dòng tế bào đơn dòng (monoclonal cell line)

Ưu điểm :

Độ chính xác và tính đặc hiệu cao: Có thể lựa chọn chính xác những tế bào mang marker huỳnh quang đặc hiệu

Đảm bảo dòng tế bào thu được đúng với tiêu chí (ví dụ: tế bào biểu hiện một loại protein nhất định)

Khả năng phân loại đa tiêu chí: FACS không chỉ dựa vào một thông số mà có thể phân loại dựa trên nhiều yếu tố cùng lúc: kích thước, độ phức tạp bên trong tế bào, mức độ phát huỳnh quang từ nhiều màu khác nhau

Nhờ vậy, có thể chọn lọc các tế bào có tính chất rất đặc thù, thậm chí những tế bào hiếm trong quần thể

Tốc độ xử lý nhanh: Hệ thống FACS có thể phân tích và phân loại hàng chục nghìn tế bào mỗi giây

Điều này giúp tiết kiệm thời gian và phù hợp khi cần tạo dòng

từ quần thể tế bào lớn

Khả năng thu nhận tế bào hiếm: Rất hữu ích trong nghiên cứu các tế bào gốc, tế bào miễn dịch đặc hiệu, hoặc tế bào ung thư hiếm gặp trong quần thể

Tạo dòng ổn định và tin cậy: Vì có thể tách từng tế bào đơn vào giếng riêng biệt, nên việc chứng minh dòng tế bào là

“monoclonal” (xuất phát từ một tế bào duy nhất) rất rõ ràng và đáng tin cậy

Đây là yêu cầu quan trọng trong sản xuất sinh phẩm (ví dụ: kháng thể đơn dòng, protein tái tổ hợp)

Nhược điểm:

Chi phí đầu tư và vận hành cao

Máy FACS có giá thành rất đắt, chi phí bảo trì và tiêu hao

(laser, kháng thể huỳnh quang, chất lỏng…) cũng tốn kém

Đòi hỏi phòng thí nghiệm hiện đại mới có thể triển khai

Yêu cầu về mẫu tế bào

Tế bào cần ở dạng huyền dịch đơn bào, không được vón cục hoặc dính kết

Với những tế bào khó tách rời (ví dụ: tế bào bám dính mạnh), cần có bước xử lý bổ sung để đưa về dạng đơn bào, đôi khi làm giảm tính toàn vẹn hoặc khả năng sống sót của tế bào

Ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào

Trong quá trình đi qua dòng chảy hẹp, chịu tác động của áp lực thủy động lực, điện tích và chiếu tia laser, một số tế bào có thể bị tổn thương hoặc giảm khả năng tăng trưởng

Điều này làm cho hiệu suất hình thành dòng đơn đôi khi không cao

Đòi hỏi kỹ thuật viên có tay nghề cao

Vận hành và thiết lập thí nghiệm bằng FACS phức tạp, cần người được đào tạo bài bản

Các bước chuẩn bị mẫu, chọn marker huỳnh quang, phân tích

dữ liệu cũng yêu cầu kiến thức chuyên sâu

Phụ thuộc vào marker huỳnh quang

Nếu không có kháng thể hay chất đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho loại tế bào cần chọn, sẽ khó áp dụng

Một số trường hợp, marker huỳnh quang khi gắn vào có thể làm thay đổi tính chất sinh học của tế bào

2.Phương pháp pha loãng tới hạn:

Khái niệm:

Phương pháp pha loãng tới hạn (limiting dilution) là kỹ thuật tách dòng tế bào/vi sinh vật dựa trên nguyên lý xác suất: khi mẫu được pha loãng dần, số tế bào/vi sinh vật trong một thể tích nhỏ sẽ giảm

Ở mức pha loãng tối ưu (tới hạn), phần lớn các giếng sẽ không

có tế bào, một số giếng sẽ có một tế bào duy nhất, và một tỷ lệ nhỏ có thể có nhiều hơn một tế bào

Các giếng chỉ chứa một tế bào sau khi nuôi cấy sẽ phát triển thành dòng thuần khiết

Đây là kỹ thuật cổ điển, thường dùng trước khi có công nghệ hiện đại như FACS

Ưu điểm

Đơn giản, dễ thực hiện: không cần thiết bị phức tạp

Chi phí thấp: chỉ cần dụng cụ pha loãng, pipet, đĩa vi cấy, môi trường nuôi

Nguyên lý rõ ràng: dễ hiểu, dễ áp dụng trong điều kiện cơ bản Tạo được dòng đơn thuần khiết: nếu thành công, chắc chắn giếng đó có nguồn gốc từ một tế bào duy nhất

Ứng dụng đa dạng:

Trong vi sinh: phân lập vi khuẩn, virus.

Trong nuôi cấy tế bào động vật: chọn lọc tế bào đơn dòng, nhất

là hybridoma sản xuất kháng thể đơn dòng

Không cần kỹ năng thao tác quá cao so với các phương pháp phức tạp (ví dụ như dòng chảy tế bào – FACS)

Nhược điểm:

Tốn thời gian: nhiều vòng pha loãng và nuôi cấy, kết quả chậm Hiệu suất thấp:

Nhiều giếng không có tế bào → không thu được kết quả

Một số giếng chứa nhiều tế bào → dòng không thuần khiết Khó kiểm soát độ chính xác: phụ thuộc tay nghề, kỹ năng pha loãng, chất lượng pipet

Không thích hợp cho tế bào khó sống độc lập: một số tế bào cần sự hỗ trợ từ cộng đồng hoặc môi trường đặc biệt mới phát triển

Khó mở rộng quy mô: nếu cần số lượng lớn dòng đơn, sẽ phải chuẩn bị và nuôi cấy rất nhiều giếng

Tính lặp lại thấp: do kết quả phụ thuộc nhiều vào yếu tố ngẫu nhiên của xác suất

3.Phương pháp sử dụng Bơm Syringe

Khái niệm:

Bơm syringe (syringe pump) là một thiết bị dùng để cung cấp, kiểm soát và điều chỉnh dòng chảy chất lỏng với độ chính xác cao thông qua việc đẩy hoặc hút pittông của ống tiêm

(syringe).Trong nghiên cứu sinh học, bơm syringe thường được ứng dụng trong hệ vi lưu (microfluidics), phân tích tế bào,

dòng chảy trong FACS, ELISA, PCR chip, và các thí nghiệm cần lượng thể tích rất nhỏ (μL – nL).Thiết bị này cho phép điều chỉnh chính xác tốc độ dòng chảy, thể tích phân phối, đồng thời duy trì sự ổn định trong suốt quá trình thí nghiệm

Ưu điểm:

Độ chính xác và ổn định cao: Có thể bơm hoặc hút chất lỏng với thể tích cực nhỏ (μL – nL) mà vẫn giữ được tốc độ ổn định Điều chỉnh linh hoạt: Cho phép cài đặt chính xác tốc độ dòng chảy, thể tích, thời gian theo yêu cầu

Phù hợp cho hệ vi lưu: Rất hữu ích trong nghiên cứu lab-on-a-chip và phân tích tế bào đơn

Tính lặp lại cao: Các phép đo/tiêm lặp lại đảm bảo độ tin cậy trong nghiên cứu

Ứng dụng rộng: Dùng trong hóa sinh, dược học, y sinh, phân tích môi trường, phân phối thuốc, nghiên cứu động học phản ứng

Nhược điểm:

Giới hạn thể tích: Phụ thuộc vào kích thước syringe → khó áp dụng cho thể tích lớn

Dễ gây áp suất cao: Nếu tốc độ dòng quá nhanh hoặc dung dịch có độ nhớt cao, có thể tạo áp suất làm hỏng chip vi lưu hoặc tế bào

Thiết lập phức tạp: Cần hiệu chỉnh chính xác, tránh hiện tượng

rò khí hoặc bong bóng khí ảnh hưởng đến kết quả

Chi phí đầu tư tương đối cao: Bơm syringe chất lượng cao thường đắt

Không thích hợp cho dòng chảy dao động: Chủ yếu chỉ tạo dòng ổn định khó tái hiện các mô hình dòng phức tạp