Vai trò của multiplex real – time pcr trong chẩn Đoán và Định hướng Điều trị viêm phổi bệnh viện và viêm phổi liên quan Đến thở máy

Đối với những ca viêm phổi nặng việc định hướng tác nhân gây bệnh ảnh hưởng không nhỏ đến kết quả điều trị, nếu sử dụng kháng sinh không phù hợp có thể kéo dài thời gian điều trị, thậm c

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Mô tả cắt ngang, hồi cứu hồ sơ.

Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân mắc viêm phổi bệnh viện và/hoặc viêm phổi thở máy điều trị tại Bệnh viện ĐHYD, TP HCM thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu trong giai đoạn từ tháng 06/2023 đến tháng 01/2025

- Được chẩn đoán VPBV và/hoặc VPLQTM theo CDC [41] Hoa Kỳ 2019 bao gồm Ít nhất 1 triệu chứng:

• Bạch cầu máu ≤ 4000/mm3 hay ≥ 12000/mm3

• Đối với người lớn ≥ 70 tuổi, tình trạng tâm thần bị thay đổi mà không có nguyên nhân nào khác được công nhận

Và ít nhất 2 trong những dấu hiệu sau:

• Xuất hiện đàm mủ mới hay thay đổi tính chất đàm, tăng số lượng đàm hoặc phải tăng số lần hút đàm

• Khó thở, nhịp nhanh hay ho mới khởi phát hoặc ho nặng hơn

• Ran ở phổi hoặc khí phế quản

• Khí máu xấu đi, giảm độ bão hòa oxy máu (PaO2/FiO2 ≤ 240), tăng nhu cầu oxy, tăng thông số máy thở (PEEP, FiO2)

Tổn thương trên phim phổi (X-quang, chụp cắt lớp vi tính): tổn thương mới xuất hiện hoặc tổn thương tiến triển trên phim phổi và không mất đi nhanh Các tổn thương trên phim phổi có thể gặp như thâm nhiễm, đông đặc, tạo hang

- Hồ sơ có đầy đủ kết quả vi sinh được thực hiện bằng phương pháp cấy truyền thống tại Bệnh viện ĐHYD, TP HCM và Multiplex Real-time PCR tại Nam Khoa, các mẫu được lấy cùng một ngày

- Bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi

- Bệnh nhân xuất viện hoặc tử vong trước khi có kết quả multiplex real- time PCR

- Bệnh nhân xuất viện trong vòng 72 giờ sau khi thay đổi điều trị dựa trên kết quả multiplex real-time PCR

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thu thập mẫu từ tháng 10/2024 đến tháng 5/2025

- Các mẫu hồi cứu trong thời gian từ tháng 6/2023 đến tháng 1/2025

- Địa điểm lấy mẫu tại khoa Hô hấp, Bệnh viện ĐHYD, TP HCM

Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu được tính theo công thức:

- Z: trị số từ phân phối chuẩn ( 1.96 với khoảng tin cậy 95%)

- a: xác suất sai lầm loại 1: khi bác bỏ giả thuyết Ho Chọn a= 0.05, ta có được Z = 1.96

- d: sai số cho phép, chọn d là 10%

Cỡ mẫu được tính theo 2 mục tiêu:

Mục tiêu 2 : Tỷ lệ tương đồng về tác nhân gây bệnh theo Đặng Quốc

Tuấn và cộng sự [56] là 68% Cỡ mẫu tối thiểu cần cho mục tiêu 2 là 84 ca

Mục tiêu 3 : Tỷ lệ thay đổi điều trị sau khi có kết quả Mutiplex Real Time

PCR theo nghiên cứu của Lee và cộng sự [57] là 40,6% Kết quả tính được N

Vậy cỡ mẫu cần tối thiểu cho cả hai mục tiêu là 92 ca.

Xác định các biến độc lập và phụ thuộc

Biến số Định nghĩa biến số

Bệnh lý nền: WHO thì bệnh mạn tính được định nghĩa là bệnh tiến triển kéo dài và/hoặc hay tái phát, thời gian bị bệnh thường rất lâu, không thể ngừa bằng vaccin, không thể chữa khỏi hoàn toàn và cũng không tự biến mất Các bệnh lý mãn tính được ghi nhận trong hồ sơ và đã được chẩn đoán bởi bác sĩ chuyên khoa, qua hồ sơ khám bệnh

Bệnh tim mạch: Suy tim,bệnh mạch vành, THA

Tai biến mạch máu não Bệnh phổi mãn tính: Hen, COPD, giãn phế quản

Xơ gan Đái tháo đường Bệnh thận mạn Ung thư

Sử dụng thuốc ức chế miễn dịch: methotrexate, cyclophosphamite…

Ngoại khoa Có can thiệp ngoại khoa trong quá trình nằm viện

Viêm phổi bệnh viện Tình trạng viêm phổi xuất hiện sau 48 giờ nhập viện (CDC)

Viêm phổi liên quan thở máy Tình trạng viêm phổi xuất hiện sau 48 giờ thở máy (CDC) Tác nhân cấy truyền thống Tên tác nhân dựa vào kết quả cấy

Tác nhân PCR Tên tác nhân dựa kết quả PCR

Kháng sinh đồ cấy truyền thống Nhạy , Kháng, Trung gian

Gen kháng thuốc PCR Tên gen kháng thuốc

Thay đổi điều trị theo PCR Thay đổi

Biến số Định nghĩa biến số

Thay đổi điều trị theo cấy Thay đổi

Kết cục Tử vong chung + xuất nặng: là những bệnh nhân tử vong tại viện hoặc được giải thích bệnh năng xin về trong diễn biên hồ sơ bệnh án

Không tử vong: là những bệnh nhân không nằm trong tử vong chung và xuất nặng

Tuổi Số năm nhập viện trừ năm sinh

Kết quả định lượng mầm bệnh theo

Dựa trên kết quả PCR

Vi khuẩn, vi nấm: số lượng > 100.000/ml

Burkholderia, virus, Pneumocystis có hiện diện trong đàm, dịch hút nội khí quản, dịch phế quản

Kết quả định lượng mầm bệnh cấy truyền thống

Dựa trên kết quả cấy

>10.000/mL đối với đàm/dịch hút nội khí quản/canuyn mở khí quản

CRP Dựa trên kết quả xét nghiệm tại thời điểm làm PCR và sau khi thay đổi kháng sinh theo PCR từ 3-7 ngày

PCT Dựa trên kết quả xét nghiệm tại thời điểm làm PCR và sau khi thay đổi kháng sinh theo PCR từ 3-7 ngày Đàm, Ho, Khó thở Dựa trên mô tả diễn tiến khám bệnh tại thời điểm làm PCR và sau khi thay đổi kháng sinh theo PCR từ 3-7 ngày

Nhiệt độ Dựa trên kết quả ghi nhận trong phiếu chăm sóc trong ngày tại thời điểm làm PCR và sau khi thay đổi kháng sinh theo

Biến số Định nghĩa biến số

PCR từ 3-7 ngày (nhiệt độ cao nhất sẽ được ghi nhận) Độ bão hòa oxy Dựa trên kết quả ghi nhận trong phiếu chăm sóc trong ngày tại thời điểm làm PCR và sau khi thay đổi kháng sinh theo PCR từ 3-7 ngày

Các quy ước trong nghiên cứu Tính tương đồng:

Về nồng độ vi khuẩn: tương đồng âm, tương đồng dương

Tương đồng âm khi cả cấy và PCR đều âm

Tương đồng dương dựa vào CFU/mL của cấy truyền thống [57,62]

Về đặc tính kháng thuốc

Với men kháng thuốc AmpC, ESBL: Nếu RT PCR phát hiện ra gen kháng thuốc tiết ra loại men kháng thuốc tương tự thì tương đồng Nếu là men carbapenamase: trên kết quả PCR trả về có gen tiết men kháng thuốc, và trên kết quả cấy truyền thống ghi nhận kháng hay trung gian với 1 trong 2 kháng sinh meropenem hay imipenem → nhất quán (tương đồng), ngược lại là không.

Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu

2.6.1 Phương pháp thu thập số liệu

Bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới: viêm phổi bệnh viện, viêm phổi liên quan máy thở, được lấy mẫu đàm, dịch rửa phế quản và được thực hiện đồng thời 2 xét nghiệm:

Phát hiện các trường hợp nhiễm khuẩn thứ phát bằng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn tự động trên hệ thống Vitek 2 compact định danh ≥ 151 loài vi khuẩn Gram âm và ≥120 loài vi khuẩn Gram dương (hệ thống định danh – kháng sinh đồ tự đọng VITEKR2-compact systerm của hãng Biomerieux)

Thông qua máy định danh và kháng sinh đồ tự động giúp đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm dựa trên giá trị của nồng độ ức chế tối thiểu – MIC Giá trị của MIC sẽ được phiên giải ra phân loại

S (sensitive – nhạy cảm), I ( intermediate – trung gian), hoặc R (resistant – đề kháng) nhờ hệ thống tự động [63]

Qui trình multiplex real-time PCR phát hiện các tác nhân vi sinh hiện diện trong các mẫu đàm hay bệnh phẩm có đàm tại phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa

Kỹ thuật này vừa có thể phát hiện, vừa có thể định lượng được 81 tác nhân vi sinh hiện diện trong mẫu đàm và các bệnh phẩm có đàm lấy từ bệnh nhân viêm phổi

Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR

Trong qua trình thực hiện chúng tôi quan sát quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng thông qua một biểu đồ khuếch đại Biểu đồ này có trục túng là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhân ánh sáng kích thích, trục hoành là các chu kỳ nhiệt

Hình 2.1 Đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống nhận được ánh sáng kích thích sau mỗi chu kỳ nhiệt

Nguồn: Công ty Nam Khoa

Mỗi chu kỳ khuếch đại gồm 3 gian đoạn:

Giai đoạn ủ: số lượng DNA đích nhân bản thành bản sao chưa đủ để chất phát quang nhận được ánh sáng kích thích, do đó ánh sáng huỳnh quang phát ra không đủ cường độ để máy ghi nhận

Giai đoạn lũy thừa: cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ

Giai đoạn bình nguyên: mức tăng cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase nên các bản sao DNA đích sẽ không còn tăng số lượng theo cấp số nhân 2 nữa

Sau khi hoàn tất chu kỳ nhiệt sẽ có một thông số hết sức quan trọng đi kèm với nó là chu kỳ ngưỡng ct (Threshold cycle )

Thiết bị real-time PCR ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng ở một số chu kỳ đầu gọi là chu kỳ nền Lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền Đường cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền được gọi là đường nền (base line ) Chu kỳ ngưỡng là trị số được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diễn khuếch đại

Kỹ thuật real-time sử dụng Tagman probe làm chất phát huỳnh quang Thành phần cho một phản ứng real-time PCR cơ bản gồm : cặp mồi, Tag polymerase có hoạt tính 5’-3’ exnuclease, dNTP, PCR buffer, MgCl2, chất phát quang và DNA đích

Kỹ thuật chính trong phương pháp real-time PCR là chất huỳnh quang được thêm vào real-time PCR mix

Chất phát huỳnh quang (chất nhuộm): khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang Chất phát huỳnh quang được dùng là Ethidium bromide

Probe đặc hiệu có gắn chất huỳnh quang (Tagman probe)

Probe là những đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại Khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng nhờ nhận được nguồn sáng kích thích Sau đây là cơ chế hoạt động của Tagman probe trong real-time PCR

Hình 2.2 Tóm tắc cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong real-time PCR[64]

Quy trình kỹ thuật Multiplex real-time PCR

Phòng xét nghiệm của Công ty Nam Khoa (ISO 15189, ISO 17025, ISO 13485) đang áp dụng quy trình multiplex real-time PCR phát hiện và định lượng được

81 tác nhân vi sinh hiện diện trong mẫu đàm, dịch hút nội khí quản và dịch rửa phế quản lấy từ bệnh nhân nhiễm trùng hô hấp dưới

Quy trình bao gồm 3 bước:

(1) Trước hết mẫu được làm thuần nhất bằng một thể tích dung dịch thuần nhất đàm có chứa NALC (N-Acetyl L-Cysteine)

(2) Sau đó mẫu được tách chiết nucleic acid trên máy tách chiết tự động KingFisher FLEX của hãng Thermo với bộ thuốc thử NKRNADNAprep- MAGBEAD của công ty Nam Khoa, bộ thuốc thử này đã được thẩm định bằng cách so sánh với phương pháp BOOM tách chiết nucleic acid, phương pháp sử dụng Trizol-LS tách chiết RNA và phương pháp tách chiết nucleic acid dùng hệ thống kín MagnaPure của Roche

Hình 2.3 Máy tách chiết RNA/DNA

Nguồn: Phòng xét nghiệm Công ty Nam Khoa

(3) Các tách chiết nucleic acid từ các mẫu đàm được đưa vào thực hiện multiplex real-time PCR sử dụng các mồi và taqman probe đặc hiệu để phát hiện và định lượng các tác nhân vi sinh muốn tìm rồi cho vào máy real-time PCR (CFX96 của Biorad) để chạy chương trình real-time PCR bao gồm đầu tiên là 53 0 C trong 10 phút để tổng hợp cDNA từ nucleic acid đích là RNA, sau đó 95 0 C trong 10 phút để kích hoạt hot-start polymerase, sau đó là 40 chu kỳ với mỗi chu kỳ gồm 2 bước nhiệt độ 95 0 C trong 30 giây rồi 60 0 C trong 1 phút Các kết quả sẽ được hiển thị ngay trong quá trình PCR và từ đó sẽ phân tích để phát hiện và định lượng các tác nhân vi sinh phát hiện được

Toàn bộ quy trình được thực hiện trong khoảng 3 giờ, bao gồm 1 giờ chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA/RNA và khoảng 2 giờ để chạy real-time PCR cũng như phân tích kết quả

Hình 2.4 Máy multiplex real-time PCR

Nguồn: Phòng xét nghiệm Công ty Nam Khoa

Toàn bộ quy trình được thực hiện trong khoảng 3 giờ

Tóm tắt toàn bộ quy trình:

Hình 2.5 Quy trình multiplex real-time PCR phát hiện 75 tác nhân vi sinh gây bệnh có thể hiện diện trong mẫu đàm

Nguồn: Phòng xét nghiệm Công ty Nam Khoa

Kết quả multiplex real-time PCR được ghi nhận như sau:

Quy trình nghiên cứu

Thông qua danh sách bệnh nhân được thực hiện xét nghiệm Multiplex real-time PCR tại công ty Nam khoa, tiến hành tìm kiếm bệnh nhân trên bệnh án điện tử

Tìm và lọc các bệnh nhân được chẩn đoán viêm phổi bệnh viện, viêm phổi liên quan thở máy

Các bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn nhận mẫu được chọn vào nghiên cứu sẽ được ghi nhận lại thông tin: mã bệnh nhân, mã nhập viện

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

Multiplex Real time PCR của công ty Nam Khoa 3-7 ngày, ghi nhận đầy đủ số ngày điều trị, kết cục lâm sàng

Hình 2.6 Quy trình nghiên cứu

Phương pháp phân tích dữ liệu

Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS 20, Exel 2020

Đạo đức trong nghiên cứu

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

94 bệnh nhân được chẩn đoán (+) HAP/VAP theo CDC 2019 Xét nghiệm PCR + Cấy

Có Đánh giá nhất quán nguyên nhân và gen kháng thuốc

Nhất quán Không nhất quán

Không thay đổi điều trị Thay đổi điều trị theo PCR Kết cục

Không tử vong Tử vong

KẾT QUẢ

Đặc điểm dân số nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm nhân chủng học

Bảng 3.1 Đặc điểm nhân chủng học của bệnh nhân Đặc điểm Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared

3.1.2 Đặc điểm bệnh lý nền

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ các bệnh lý nền của bệnh nhân trong nghiên cứu

Nhận xét: Bệnh tim mạch (71,3%) là bệnh lý nền phổ biến nhất trong dân số nghiên cứu, kế đến bao gồm đái tháo đường (35,1%) và ung thư (33,0%) Các bệnh lý khác như bệnh thận (22,1%) và bệnh gan (12,8%) chiếm tỷ lệ thấp

Bảng 3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân

Triệu chứng Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

Nhận xét: Ran phổi là triệu chứng lâm sàng ghi nhận ở phần lớn bệnh nhân

(97,9%), kế đến là các triệu chứng thường gặp khác như đàm (77,7%), ho (71,3%) và khó thở (64,9%) Sốt (28,7%) và khò khè (20,2%) xuất hiện với tỷ lệ thấp hơn đáng kể so với các triệu chứng khác

3.1.4 Đặc điểm cận lâm sàng

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hóa – huyết học của bệnh nhân tại thời điểm chẩn đoán

Sinh hóa – huyết học Khoảng tham chiếu

WBC, trung bình (± SD) 4 – 10 (G/L) 12,66 (± 5,96) NEU, trung vị (IQR) 45 – 75 (%) 80,85 (70,78 – 87,17) CRP, trung vị (IQR) < 5 mg/L 72,30 (18,20 – 128,00) PCT, trung vị (IQR) < 0.5 (ng/mL) 0,38 (0,15 – 1,12)

Nhận xét: Các chỉ dấu nhiễm trùng không đặc hiệu như bạch cầu (WBC), bạch cầu trung tính (NEU) và C-reactive protein (CRP) thường tăng cao trên bệnh nhân mắc VPBV và/hoặc VPLQTM Tuy nhiên, chỉ số procalcitonin (PCT) tăng không đáng kể với 0,38 ng/mL (0,15 – 1,12) trong dân số nghiên cứu

Bảng 3.3 Đặc điểm X-quang của bệnh nhân tại thời điểm chẩn đoán Đặc điểm tổn thương phổi Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

Nhận xét: Đối với chẩn đoán hình ảnh, tổn thương phổi trên X-quang ngực là dấu hiệu cận lâm sàng thường gặp nhất, chiếm 89,8% trường hợp, trong đó tổn thương dạng thâm nhiễm và dạng đông đặc ghi nhận tỷ lệ cao lần lượt là 60,2% và 55,9%

3.1.5 Tác nhân phát hiện bằng phương pháp Multiplex real-time PCR

Bảng 3.4 Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn

STT Tác nhân vi khuẩn Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

5 Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) 25 26,6

STT Tác nhân vi khuẩn Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

11 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 9 9,6

12 MRSA chứa độc tố Panton-Valentine leukocidin (PVL) 1 1,1

16 Methicillin-Susceptible Staphylococcus epidermidis (MSSE) 2 2,1

21 Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) 1 1,1

Nhận xét: Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát hiện được nhiều tác nhân khác nhau gây VPBV và/hoặc VPLQTM, trong đó nhóm vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ cao như S maltophilia (46,8%), K pneumoniae (41,5%), A baumannii (39,4%) và E coli (34,0%),… Trong nhóm vi khuẩn Gram dương MRSA (9,6%), và ghi nhận 1 trường hợp (1,1%) MRSA có chứa độc tố PVL

Bảng 3.5 Tỷ lệ tác nhân virus

STT Tác nhân virus Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

STT Tác nhân virus Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

Nhận xét: Trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân, EBV và CMV là hai chủng virus thường gặp nhất EBV (43,6%), CMV (24,5%) và các chủng virus còn lại như rhinovirus (7,4%), influenza A (6,4%), influenza B (1,1%) và SARS-CoV-2 (2,1%),…

Bảng 3.6 Tỷ lệ tác nhân vi nấm

STT Tác nhân vi nấm Tần suất

Nhận xét: Candida spp là tác nhân phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm Một nửa số mẫu ghi nhận nấm C albican, tiếp theo là C tropicalis (27,7%) và C glabrata (23,4%) Bên cạnh đó, tỷ lệ nấm PJP thường gây viêm phổi trên nhóm bệnh nhân suy giảm miễn dịch được ghi nhận với tỷ lệ đáng chú ý (7,4%) trong dân số nghiên cứu

Bảng 3.7 Tỷ lệ các loại men/gen kháng thuốc

Tỷ lệ (%) Phân loại gene kháng thuốc theo phân loại của Ambler

Serine Lớp A blaCTX 31 33,0 60,6 blaTEM 21 22,3 blaSHV 3 3,2 blaKPC 2 2,1

Nhận xét: Tỷ lệ gene kháng thuốc thuộc phân lớp A chiếm tỷ lệ cao nhất

(60,6%), tiếp theo đó là phân lớp D (57,4%), lớp B (28,7%) và lớp C (15,9 %) Trong phân lớp A, gene kháng thuốc chiếm tỷ lệ cao nhất được phát hiện là gene blaCTX (32,98%) và blaTEM (22,3%) Với phân lớp B, gene blaNDM-1 chiếm (26,6%) và phân lớp D gene blaOXA-48 chiếm (25,5 %) Tỷ lệ này cao gấp khoảng 2-3 lần gene kháng thuốc của lớp C trong các trường hợp nghiên cứu

3.1.6 Tác nhân vi sinh phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Bảng 3.8 Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn

STT Tác nhân vi khuẩn Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

Nhận xét: Với phương pháp nuôi cấy truyền thống, kết quả ghi nhận chủ yếu là vi khuẩn Gram âm thường gặp gây VPBV và/hoặc VPLQTM như K pneumoniae (18,1%), A baumannii (17,0%) và P aeruginosa (10,6%) Đồng thời, nghiên cứu ghi nhận một số tác nhân khác ít phổ biến hơn bao gồm E aerogenes (8,5%), S maltophilia (5,3%) hoặc E coli (4,3%),…

3.1.7 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn trong mẫu cấy vi sinh

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của K pneumoniae (n = 17)

Nhận xét: Phần lớn vi khuẩn K pneumoniae phân lập được trong dân số nghiên cứu kháng với nhiều nhóm kháng sinh với tỷ lệ cao (> 80%) bao gồm kháng piperacillin/tazobactam (88,2%), kháng nhóm quinolon (88,2%), ceftazidime (80%), kháng meropenem và ertapenem (tương tự 76,5%), imipenem (72,7%) Với một số kháng sinh khác, vi khuẩn chỉ còn nhạy cảm với tỷ lệ thấp như amikacin (35,3%), gentamicin (50%) hoặc TMP/SMX (42,9%), ceftazidime (20,0%) Đáng chú ý, kết quả ghi nhận 6/17 chủng (35,2%) K pneumoniae kháng hoàn toàn với kháng sinh aztreonam và các mẫu phân lập kháng ceftazidime với tỷ lệ cao (80%)

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của A baumannii (n = 16)

Nhận xét: A baumannii trong mẫu nghiên cứu kháng với hầu hết các kháng sinh thử nghiệm với tỷ lệ rất cao (> 80%) bao gồm kháng meropenem (93,8%), ampicillin/sulbactam (92,3%), ceftazidime (92,9%), imipenem (84,6%) và kháng ciprofloxacin (87,5%),… Vi khuẩn nhạy cảm tương đối với minocycline (46,7%); và kháng hoàn toàn với gentamicin và doxycycline

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa (n = 10)

Nhận xét: P aeruginosa kháng các kháng sinh đầu tay với tỷ lệ tương đối cao như kháng ceftazidim (77,8%), aztreonam (75%), meropenem (70%), cefepim (70%), imipenem (66,7%) hoặc kháng với nhóm quinolon như levofloxacin hoặc ciprofloxacin (tương tự 70%) Tuy nhiên, trong số các kháng sinh khảo sát, P aeruginosa từ mẫu phân lập còn nhạy cảm cao nhất (55,6%) với piperacillin/tazobactam hoặc nhạy cảm tương đối với amikacin (33,3%) Ngoài ra, kết quả nghiên cứu ghi nhận một trường hợp Pseudomonas kháng hoàn toàn (100%) với kháng sinh mới ceftolozane/tazobactam có phổ diệt khuẩn tốt trên

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của E aerogenes (n = 8) Nhận xét: E aerogenes được phân lập trong mẫu bệnh phẩm kháng với phần lớn các kháng sinh thử nghiệm với tỷ lệ rất cao (> 80%) như nhóm kháng sinh carbapenem hoặc nhóm quinolon (tương tự 87,5%), piperacillin/tazobactam (85,7%), cefepime hoặc ceftazidime (tương tự 85,7%) Đối với nhóm aminoglycoside, E aerogenes kháng hoàn toàn với gentamicin nhưng còn nhạy cảm tương đối với amikacin (62,5%) Ngoài ra, kết quả nghiên cứu ghi nhận 3/8 (37,5%) mẫu cấy E aerogenes kháng hoàn toàn với aztreonam

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của S maltophilia (n = 5)

Nhận xét: Phương pháp cấy truyền thống ghi nhận năm mẫu cấy dương với S maltophilia có tỷ lệ nhạy cảm cao với levofloxacin (80%), 3/5 mẫu (60%) nhạy hoàn toàn với minocycline Tuy nhiên, đối với TMP/SMX là một kháng sinh quan trọng trong điều S maltophilia, vi khuẩn có xu hướng giảm nhạy cảm và ghi nhận chỉ nhạy 50% trong các mẫu phân lập được

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ nhạy cảm kháng sinh của E coli (n = 4)

Nhận xét: E coli còn nhạy cảm cao (> 80%) với piperacillin/tazobactam

So sánh kỹ thuật Multiplex Real-time PCR và nuôi cấy truyền thống

Bảng 3.9 Tác nhân gây bệnh giữa PCR và cấy

Tác nhân gây bệnh Cấy (+) Cấy (-) Kappa

Tác nhân gây bệnh Cấy (+) Cấy (-) Kappa

Nhận xét: Mức độ tương đồng giữa PCR và nuôi cấy thay đổi đáng kể tùy theo tác nhân gây bệnh Kết quả phân tích ghi nhận các tác nhân như E aerogenes và P aeruginosa với Kappa (KTC 95%) lần lượt là 0,82 (0,63 – 1,00) và 0,72 (0,50 – 0,93) và p < 0,05 cho thấy mức độ tương đồng cao có ý nghĩa thống kê giữa PCR và cấy truyền thống A baumannii có mức độ tương đồng ở mức trung bình với chỉ số Kappa 0,41 (0,22 – 0,60), S aureus có Kappa âm cho thấy gần như không có sự tương đồng giữa hai kỹ thuật Các vi khuẩn còn lại có mức tương đồng thấp giữa 2 phương pháp PCR và cấy truyền thống với chỉ số Kappa 0,10 – 0,33

3.2.2 Sự tương quan về nồng độ vi khuẩn giữa PCR và cấy truyền thống

Bảng 3.10 Mối tương quan về nồng độ vi khuẩn

Nhận xét: Mức độ tương đồng giữa PCR và cấy truyền thống thay đổi đáng kể theo nồng độ vi khuẩn Tỷ lệ tương đồng cao nhất ghi nhận trong các trường hợp mẫu âm tính (PCR không phát hiện vi khuẩn/cấy không mọc) với 84,8% Đối với những trường hợp dương tính, tỷ lệ tương đồng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn từ 29,2% đối với 10 4 CFU/mL, 36,0% đối với 10 5 CFU/mL và lên đến 80,0% đối với > 10 5 CFU/mL Kết quả cho thấy hai kỹ thuật có sự tương đồng cao khi vi khuẩn vắng mặt hoặc hiện diện với mật độ cao

3.2.3 Sự tương đồng về đặc tính kháng thuốc

Bảng 3.11 Sự tương đồng về đặc tính kháng thuốc

Nhận xét: Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng về đặc tính kháng thuốc giữa kỹ thuật PCR và nuôi cấy truyền thống khác nhau đáng kể tùy theo nhóm men kháng thuốc Đối với AmpC, phân tích cho thấy gần như không có sự đồng nhất giữa hai kỹ thuật với chỉ số Kappa thấp (0,029; KTC 95%: -0,165 – 0,223) và không có ý nghĩa thống kê (p = 0,371) Tương tự trong nhóm ESBL, Kappa đạt 0,191 (KTC 95%: 0,075 – 0,308) với ý nghĩa thống kê (p = 0,001) phản ánh sự tương đồng yếu Tuy nhiên, với men carbapenemase, Kappa đạt 0,565 (KTC 95%: 0,399 – 0,731) và p < 0,001 cho thấy mức độ đồng nhất trung bình-khá và là nhóm có sự tương đồng cao nhất

Men kháng thuốc Cấy (+) Cấy (-) Kappa

Bảng 3.12 Sự tương đồng về đặc tính kháng thuốc khi PCR và cấy ra duy nhất một tác nhân gây bệnh

BN Gene AmpC ESBL Amikacin Ampicilli n Ampi/Su l Aztr eonam Cefepime Cefotaxime Ceftazidim e Ceftriaxon e Cefoxitin Cipr oflox acin Ertapene m Gentamici n Imipenem Levofloxac in Mer opene m Minocycli ne Ppiperacil lin tazobacta m TMP/ SM X

10: P aeruginosa; 18: K pneumoniae; 57: A baumannii; Ampi/Sul: ampicillin/sulbactam

Nhận xét: Mức độ tương đồng rất cao về đặc điểm gen kháng thuốc và kháng sinh đồ ghi nhận trong các ca bệnh có kết quả PCR và cấy truyền thống cùng phát hiện một tác nhân duy nhất Ba chủng vi khuẩn được phát hiện bao gồm

P aeruginosa mang gen blaIMP, K pneumoniae mang gen blaNDM-1, blaTEM, blaCTX và A baumannii mang gen blaNDM-1, blaOXA-51, blaOXA-23, blaTEM kháng với nhiều nhóm kháng sinh như kháng sinh nhóm penicillin, cephalosporin và carbapenem.

Đánh giá giá trị chẩn đoán, định hướng và kết cục điều trị dựa trên PCR và cấy

3.3.1 Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh giữa mPCR và cấy truyền thống

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh giữa mPCR và cấy Nhận xét: Trong 94 bệnh nhân nghiên cứu, xét nghiệm PCR lồng đa tác nhân cho kết quả 69 bệnh nhân dương tính (73,6%), 25 bệnh nhân âm tính (26,4%) Nuôi cấy thường quy cho kết quả 40 bệnh nhân dương tính (42,6%), 54 bệnh nhân âm tính (57,4%)

3.3.2 Đặc điểm về chiến lược điều trị dựa trên mPCR

Bảng 3.13 Tỷ lệ thay đổi phác đồ điều trị dựa trên kết quả PCR

Chiến lược điều trị Tần suất (n) Tỷ lệ (%)

Không thay đổi điều trị 48 51,1

Thay đổi điều trị theo kết quả PCR 44 46,8

Thay đổi điều trị theo kết quả cấy 2 2,1

Nhận xét: Một nửa số bệnh nhân (51,1%) trong dân số nghiên cứu không thay đổi phác đồ điều trị sau khi có kết quả PCR Tuy nhiên, đối với nhóm bệnh có thay đổi phác đồ điều trị, quyết định dựa trên kết quả PCR chiếm tỷ lệ cao

(46,8%), trong khi đó chiến lược điều trị thay đổi theo kết quả cấy chiếm tỷ lệ rất thấp (2,1%)

Bảng 3.14 Tỷ lệ bệnh nhân thay đổi điều trị dựa trên CFU/mL Định hướng điều trị < 10 4 > 10 4 Kappa (KTC 95%) Trị số p

Không thay đổi điều trị 18 32

Kỹ thuật nuôi cấy truyền thống

Không thay đổi điều trị 54 38

Nhận xét: Kỹ thuật Real-time PCR có mối liên quan đáng kể hơn so với nuôi cấy truyền thống giữa nồng độ vi khuẩn và quyết định thay đổi điều trị kháng sinh Với PCR, nhóm bệnh nhân có nồng độ vi khuẩn > 10⁴ CFU/mL ghi nhận tỷ lệ thay đổi điều trị cao (37 trường hợp) so với nhóm < 10⁴ CFU/mL (7 trường hợp), chỉ số Kappa đạt 0,194 (KTC 95%: 0,026 – 0,362; p = 0,014) phản ánh mức đồng thuận yếu nhưng có ý nghĩa thống kê Trong khi đó, kết quả từ nuôi cấy truyền thống cho thấy mối liên quan rất hạn chế (Kappa = 0,057; KTC 95%: -0,020 – 0,134; p = 0,048) và không có đồng thuận giữa nồng độ vi khuẩn và quyết định thay đổi điều trị Tuy nhiên, kết quả ghi nhận có 7/44 trường hợp thay đổi điều trị theo PCR mặc dù nồng độ vi khuẩn < 10⁴ CFU/mL

Bảng 3.15 Hồi quy logistic Đặc điểm Tử vong Không tử vong OR KTC 95% Trị số p Sốt

Không giảm 9 43 ΔPCT (ng/mL)

Không 1 26 Đặc điểm Tử vong Không tử vong OR KTC 95% Trị số p ĐTĐ tuýp 2

Thay đổi điều trị theo PCR

Nhận xét: Đàm giảm: OR = 0,11 (95% CI: 0,01–0,88; p = 0,037) Điều này cho thấy bệnh nhân có cải thiện tình trạng đàm có nguy cơ tử vong giảm rõ rệt

(giảm khoảng 89%) so với nhóm không cải thiện Đây là một chỉ dấu lâm sàng quan trọng Δ PCT (lần 1 – lần 2): OR = 0,70 (95% CI: 0,50–0,97; p = 0,030)

Mỗi đơn vị giảm của PCT làm giảm nguy cơ tử vong khoảng 30% Điều này củng cố vai trò của theo dõi động học PCT trong tiên lượng bệnh nhân nhiễm khuẩn Thay đổi điều trị theo PCR: OR = 6,17 (95% CI: 1,26–30,35; p = 0,025)

Kết quả này cho thấy nhóm được thay đổi điều trị theo kết quả PCR có nguy cơ tử vong cao gấp khoảng 6 lần so với nhóm không thay đổi.

BÀN LUẬN

Đặc điểm chung của bệnh nhân

Nghiên cứu ghi nhận 94 bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu Tuổi trung bình của bệnh nhân là 71,0 (± 14,6) và 71,3% là nam giới Kết quả của chúng tôi tương đồng với các nghiên cứu khác trong khu vực phía Nam (Việt Nam) như nghiên cứu của N H Huy [65] tại bệnh viện ĐHYD, TP HCM hoặc V P

M Thư [66] tại khoa HSTC, bệnh viện Đa khoa Cần Thơ cho thấy tình trạng VPBV và/hoặc VPLQTM thường gặp trên đối tượng bệnh nhân lớn tuổi (≥ 65 tuổi) Tỷ lệ nam giới cao hơn nữ giới do phần lớn các bệnh nhân nam giới thường ghi nhận tình trạng hút thuốc lá và tăng nguy cơ bệnh lý mạn tính trên hô hấp

Bệnh nền là yếu tố nguy cơ quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc, đáp ứng điều trị và tiên lượng trong viêm phổi [12] Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ bệnh nền đa dạng và tương đối cao, đặc biệt ở nhóm bệnh lý tim mạch (71,3%) như tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, suy tim, đái tháo đường (35,1%), ung thư (33,0%) và suy thận mạn (22,1%) Kết quả của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ bệnh lý nền cao hơn gấp đôi so với nghiên cứu của Đ Q Tuấn và cộng sự

[56] ở bệnh lý tim mạch 34% và đái tháo đường là 18% điều này có thể lý giải do dân số nghiên cứu của chúng tôi có độ tuổi trung bình cao hơn (71,0 so với 57,2) Đối với bệnh lý nền ác tính như ung thư, nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ 33% cao hơn đáng kể so với kết quả trong các nghiên cứu của Đ T

T Hương [55] có tỷ lệ bệnh ung thư chỉ chiếm 2,5% Sự khác biệt có thể được giải thích do nhóm bệnh nhân tại cơ sở nghiên cứu (bệnh viện ĐHYD, TP HCM) là một trong những đơn vị tuyến cuối đa chuyên khoa thường xuyên tiếp nhận những bệnh nhân có tình trạng bệnh nặng kèm đa bệnh nền phức tạp trong đó có ung thư

Về đặc điểm lâm sàng

Các biểu hiện thường gặp nhất của bệnh nhân trong nghiên cứu bao gồm ran phổi (97,9%), đàm (77,7%), ho (71,3%) và khó thở (64,9%), sốt (28,7%) Triệu chứng sốt trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ ghi nhận ở khoảng 1/3 dân số nghiên cứu Kết quả có sự tương đồng với nghiên cứu của Đ T T Hương

[55] là 17,8% và khác biệt đáng kể với nghiên cứu của H V Tiến [67] ghi nhận tỷ lệ sốt 87,9% Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của CDC, sốt là một trong nhiều tiêu chuẩn chẩn đoán và không phải là tiêu chuẩn bắt buộc trong chẩn đoán VPBV hoặc VPLQTM [41] Sự khác biệt trên có thể là do nghiên cứu của chúng tôi bao gồm nhóm bệnh nhân lớn tuổi (trung bình 71 tuổi so với 52), mắc kèm nhiều bệnh nền và đã được sử dụng kháng sinh từ tuyến trước Bệnh nhân ngoại khoa và bệnh nhân ung thư có thể dùng các nhóm thuốc giảm đau có tác dụng hạ sốt và các yếu tố này có thể ảnh hưởng và/hoặc che lấp dấu hiệu về tình trạng sốt của bệnh nhân

Về đặc điểm cận lâm sàng

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các chỉ dấu tình trạng nhiễm trùng được ghi nhận tại thời điểm chẩn đoán bao gồm chỉ số WBC là 12,66 (± 5,96) G/L, CRP là 72,30 (18,20 – 128,00) mg/L Kết quả WBC khá tương đồng với nghiên cứu của T H Linh [68] với 12,31(± 5,2) G/L và thấp hơn so với nghiên cứu của Đ T T Hương [55] ghi nhận là 15,26 (± 7,27) G/L Sự khác biệt trên có thể được giải thích do đối tượng nghiên cứu và đặc điểm bệnh nền khác nhau của nhóm dân số giữa các nghiên cứu Chỉ số PCT là 0,38 (0,15 – 1,12) ng/mL trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn nghiên cứu của Trần Hoài Linh [68] là 1,47 ng/mL Bên cạnh đó, trong Hướng dẫn của ATS 2016 nêu rõ các tiêu chí gồm PCT và CRP không có giá trị trong việc chẩn đoán VPBV/VPLQTM và đưa ra quyết định khởi động kháng sinh Các tiêu chí này chỉ có giá trị theo dõi điều trị khi kết hợp cùng với đáp ứng lâm sàng [11]

X-quang phổi là một trong những tiêu chuẩn quan trọng để chẩn đoán VPBV/VPTM Tổn thương mới xuất hiện trên phim phổi trong nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận chủ yếu là thâm nhiễm (60,2%) và đông đặc (55,9%) Kết quả trên khá tương đồng với nghiên cứu của T H Linh [68] gồm thâm nhiễm (59,5%) và đông đặc (40,5%) Sự khác biệt trong nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận đối với tổn thương tạo hang (chiếm 2,2%) trong khi các nghiên cứu khác của T H Linh [68] và Đ T T Hương [55] đều không ghi nhận hình ảnh tạo hang Điều này có thể giải thích bởi sự khác biệt về đặc điểm dịch tễ học và vi sinh của mỗi vùng miền, khu vực có thể không giống nhau.

Khảo sát tác nhân vi sinh tác nhân vi sinh bằng kỹ thuật Multiplex Real-

Tác nhân vi sinh phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR

Trong tổng số 94 bệnh nhân mà chúng tôi đưa vào nghiên cứu cho kết quả tác nhân vi sinh khảo sát bằng PCR bao gồm S.maltophilia (46,8%), K pneumonia (41,5%), A baumannii (39,4%), E coli (34%), P aeruginosa

(17.0%), E faecium (14.9%), S aureus (10.6%) Tỷ lệ các tác nhân này cao hơn so với nghiên cứu của Đ Q Tuấn và cộng sự [56] ghi nhận K pneumoniae (31,7%), A baumannii (22,2%), P aeruginosa (12,7%), S aureus (11,1%) và

E coli (6,3%) So sánh với nghiên cứu của Chen và cộng sự [61] cho thấy A baumannii (45,7%), P aeruginosa (37,8%), K pneumonia (35,3%), E coli

(16,3%), E faecium (15,0%), S aureus (13,0%) Có sự khác biệt lớn khi ghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ nhiễm S maltophilia cao đáng kể (46,8%) và

E faecium (14,9%) Tại Việt Nam, chúng tôi chưa ghi nhận nghiên cứu báo cáo về tỷ lệ nhiễm S maltophilia trong VPBV/VPLQTM do trong các Panel PCR đang lưu hành không phân lập S maltophilia Tuy nhiên, theo thống kê về

“Báo cáo giám sát kháng sinh tại Việt Nam” của Bộ y tế cho thấy vi khuẩn này vẫn nằm trong 10 vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn đường hô hấp

[24,69] Nghiên cứu của Morimoto S và cộng sự [70] thực hiện trong thời kỳ đại dịch COVID-19 trên những bệnh nhân viêm phổi nặng liên quan đến COVID-19 Kết quả cho thấy S maltophilia là vi khuẩn được phân lập nhiều nhất và phần lớn bệnh nhân đã sử dụng carbapenem trước đó Tình trạng nhiễm

S maltophilia liên quan đến tăng tử suất trên nhóm bệnh nhân điều trị tại khoa

HSTC [71] Năm 2024, IDSA đưa ra hướng dẫn điều trị có đề cập đến vi khuẩn

S maltophilia nhằm nhấn mạnh về khả năng kháng thuốc và nguy cơ gây bệnh suất và tử suất đáng kể, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân ung thư máu do S maltophilia có nguy cơ gây viêm phổi xuất huyết [46]

Tác nhân vi sinh phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống Đối với phương pháp cấy truyền thống, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ cấy dương tính với K pneumoniae (18,1%), A baumannii (17,0%),

P aeruginosa (10,6%), E aerogenes (8,5%), S maltophilia (5,3%), E coli (4,3%) và S aureus (2,1%) Kết quả của chúng tôi thấp hơn so với nghiên cứu của Đ Q Tuấn và cộng sự [56] ghi nhận K pneumoniae (33,3%), A baumannii (20,0%), P aeruginosa (16,7%), E aerogenes (6,7%), E coli (6,7%) và S aureus (6,7%) Khi so với nghiên cứu của Chen và cộng sự [61] vào năm 2024 cho thấy K pneumoniae (14%), A baumannii (23,0%) P aeruginosa (18%),

Tỷ lệ cấy dương tính với S matophilia thấp hơn đáng kể so với Multiflex Real- time PCR (5% so với 46,8%) Sự khác biệt trên có thể được lý giải do bệnh nhân có thể đã được sử dụng kháng sinh trước đó

Tình hình đề kháng kháng sinh trong nghiên cứu của chúng tôi có xu hướng gia tăng khi so sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây Tỷ lệ vi khuẩn

A baumannii kháng với kháng sinh nhóm carbapenem ghi nhận hơn 80%, trong đó kháng meropenem (93,8%), kháng imipenem (84,6%), kháng ampicillin/sulbactam (92,3%) và kháng minocycline (26,7%) Kết quả trên tương đồng với báo cáo của Bộ Y Tế [24] khảo sát vào năm 2020 cho thấy A baumannii kháng với nhóm carbapenem > 90%, kháng ampicillin/sulbactam

K pneumoniae kháng với kháng sinh nhóm carbapenem hơn 70%, trong đó vi khuẩn kháng meropenem (76,5%), kháng imipenem (72,7%), kháng amikacin (29,4%) và kháng gentamicin (40%) Kết quả về tỷ lệ đề kháng kháng sinh của K pneumoniae trong nghiên cứu của chúng tôi kháng với nhóm carbapenem cao hơn báo cáo của Bộ Y Tế [24] năm 2020 ghi nhận kháng meropenem (53,3%), imipenem (52.7%) và gần tương đồng với tỷ lệ kháng amikacin (22,6%) và gentamicin (44,4%)

P aeruginosa có tỷ lệ kháng cao với ceftazidime (77,8%), cefepime (70,0%), kháng meropenem (70,0%), kháng imipenem (66,7%) Đối với kháng sinh nhóm quinolon, P aeruginosa kháng ciprofloxacin (70,0%), levofloxacin (70,0%) và kháng piperacillin/tazobactam (33,3%) Kết quả từ nghiên cứu của chúng tôi so với báo cáo ghi nhận của Bộ Y Tế [24] cho thấy tỷ lệ P aeruginosa kháng kháng sinh nhóm carbapenem và quinolon trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn Kết quả gợi ý piperacillin/tazobactam có thể được cân nhắc là lựa chọn tối ưu hơn do P aeruginosa còn nhạy cảm trung bình (66,7%) với piperacillin/tazobactam

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các gene kháng thuốc được phân loại theo các phân lớp của Ambler, kết quả cho thấy lớp A và D chiếm tỷ lệ cao lần lượt là 60,6% và 57,4 % Gene kháng thuốc CTX chiếm tỷ lệ cao (33,0%) trong phân lớp A và OXA-48 (25,5%) trong phân lớp D Kết quả trên gần tương đồng với nghiên cứu của Bay và cộng sự [72] ghi nhận CTX (37%) Bên cạnh đó, đáng chú ý là sự có mặt của gene kháng thuốc NDM-1 chiếm tỷ lệ 26,6% trong phân lớp B Vi khuẩn mang gene NDM-1 có xu hướng kháng với nhiều nhóm kháng sinh phổ rộng hiện có dẫn đến thu hẹp các lựa chọn điều trị [46] Theo Hướng dẫn điều trị các chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng của IDSA [46] năm

2024 khuyến cáo đối với các vi khuẩn Gram âm mang gene NDM-1, lựa chọn kháng sinh ưu tiên phối hợp giữa ceftazidim/avibactam và aztreonam Mặc dù, ceftazidim/avibactam là một kháng sinh mới nhóm betalactam/beta-lactamase hiện có tại Việt Nam Tuy nhiên, việc tiếp cận đối với các phác đồ trên còn nhiều hạn chế do chưa được bảo hiểm y tế chi trả và có thể tạo nên gánh nặng điều trị đối với bệnh nhân và/hoặc người nhà bệnh nhân và cơ sở điều trị Do đó, việc phát hiện sớm tác nhân mang gene kháng thuốc mở rộng bằng kỹ thuật PCR, theo dõi và hạn chế nguy cơ đề kháng kháng sinh là một trong những yếu tố quan trọng góp phần điều trị tăng khả năng điều trị trúng đích, kiểm soát nguy cơ lây lan và cải thiện hiệu quả điều trị [46] Kết quả khảo sát về kiểu gene kháng thuốc trên vi khuẩn Gram âm trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt so với tỷ lệ ghi nhận tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức [73] như CTX (55,1%), TEM (32,1%), SHV (12,8%), NDM-1 (21,6%), OXA-48 (7,8%) Sự khác biệt này có thể do đặc điểm dịch tễ và vi sinh khác nhau theo từng vị trí địa lý, mô hình bệnh tật về các bệnh lý nhiễm khuẩn và khác biệt đáng kể giữa vi sinh cơ sở giữa các bệnh viện cũng như từng khoa điều trị

Bên cạnh hiệu quả trong việc phát hiện vi khuẩn, nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận tỷ lệ phát hiện virus bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR đạt 55% Tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với các nghiên cứu trước đó của H N B

Mi và cộng sự [63] ghi nhận tỷ lệ phát hiện virus tương đối thấp (18,3%) và nghiên cứu của Buchan và cộng sự [64] ghi nhận là 17,7%

Khảo sát sự tương đồng giữa hai phương pháp Multiplex Real-time PCR và cấy truyền thống

4.3.1 Khảo sát sự tương đồng về tác nhân gây bệnh

Trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt về mức độ tương đồng đáng kể giữa 2 phương pháp Multiflex Real-time PCR và cấy truyền thống trong việc phát hiện tác nhân gây VPBV/VPLQTM Mức độ tương đồng thay đổi tùy theo loại tác nhân trong đó E aerogenes và P aeruginosa có mức độ tương đồng tương đối cao với chỉ số Kappa lần lượt là 0,825 và 0,715 (p < 0,05) Kết quả cho thấy sự thống nhất cao giữa 2 phương pháp sẽ hỗ trợ tốt cho quá trình quyết định điều trị trên lâm sàng Với A baumannii và K.pneumonia, kết quả nghiên cứu đạt mức độ tương đồng từ thấp đến trung bình với chỉ số Kappa lần lượt là 0.413 và 0,330 Trường hợp này Multiflex Real-time PCR phát hiện được nhiều vi khuẩn mà phương pháp cấy truyền thống không phát hiện ra được có thể do tình trạng sử dụng kháng sinh phổ rộng trước đó Đáng chú ý là sự tương đồn tương đối kém cho thấy gần như không có ở vi khuẩn S maltophilia với chỉ số Kappa = 0,104 Sự ghi nhận này có thể giải thích do việc sử dụng kháng sinh trước gây nên tình trạng Multiflex Real-time PCR phát hiện xác vi khuẩn Sự không nhất quán về kết quả giữa 2 phương pháp có thể gây khó khăn cho việc đưa ra quyết định điều trị và lựa chọn thuốc trên thực tế lâm sàng Khi so sánh mức độ tương đồng giữa về vi khuẩn giữa 2 phương pháp Multiflex Real-time PCR và cấy truyền thống, kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Đ T T Hương [55] cho thấy sự đồng thuận cao của 2 phương pháp trong việc phát hiện vi khuẩn P aeruginosa và đạt được sự đồng thuận kém với vi khuẩn K pneumoniae Trong nghiên cứu của Hou và cộng sự [44] cho thấy sự tương đồng chung giữa hai kỹ thuật là 50%, trong đó nuôi cấy truyền thống dương tương đồng với Multiflex Real- time PCR là 100%, nuôi cấy thường quy âm tính tương đồng với Multiflex

Real-time PCR là 19% Ngoài ra, nghiên cứu của Hou và cộng sự [44] ghi nhận một trường hợp cho kết quả nuôi cấy dương tính nhưng PCR âm tính Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kết quả cấy dương tính

2 trường hợp nhưng PCR âm tính Sự tương đồng này có thể được giải thích bằng việc tương tác giữa các vi khuẩn có thể gây ảnh hưởng kết quả Để hạn chế tỷ lệ bỏ sót vi khuẩn, trên thế giới hiện nay đã tạo ra nhiều bộ kít PCR riêng cho các cơ quan khác nhau và tập trung vào các nhóm bệnh khác nhau

Sự tương đồng về nồng độ vi khuẩn về mặt định lượng, mối liên quan giữa tải lượng PCR và mức độ phát triển trên cấy vi sinh thể hiện rõ ràng Trong nghiên cứu của chúng tôi, nhóm bệnh phẩm có kết quả PCR âm tính và không mọc vi khuẩn trên cấy truyền thống chiếm 84,8% Kết quả trên tương đồng với báo cáo của Buchan và cộng sự với 98,1% và Lee và cộng sự với 86,3% phản ánh mức tương đồng âm tính rất cao tại mức ≥ 10⁶ copies/mL Tỷ lệ phù hợp đạt 80% tương đồng với báo cáo Đ Q Tuấn (84,6%) hoặc Buchan và cộng sự trong đó tất cả mẫu có ≥10⁷ copies/mL đều tương ứng với nuôi cấy ≥ 10⁵ CFU/mL (100% tương đồng) và của Lee và cộng sự [57] trong mẫu có ≥ 10⁷ copies/mL đều tương ứng với nuôi cấy (100%) Ở các mức thấp hơn như 10³ hoặc 10⁴, tỷ lệ phù hợp chỉ còn tương ứng 11,1% và 37,5% Điều này nhấn mạnh vai trò của định lượng PCR trong việc phân biệt tình trạng nhiễm khuẩn thực sự với hiện tượng tạp nhiễm

Bảng 4.1 Bảng so sánh mức độ tương đồng

Lee và cộng sự (N = 59) 86,3% 100% Đối với tải lượng vi khuẩn > 10 5 thì sự tương đồng gần như 100% ở các nghiên cứu khác đều cao hơn so với nghiên cứu của chúng tôi

4.3.2 Sự tương đồng về đặc tính kháng thuốc

Một trong những hạn chế lớn của multiplex real-time PCR là không thể gán chính xác gene kháng thuốc phát hiện được cho một loài vi khuẩn cụ thể trong mẫu bệnh phẩm có nhiều vi sinh vật Điều này đặc biệt gặp trong các mẫu đường hô hấp, nơi vi khuẩn gây bệnh thường đồng hiện diện với vi khuẩn thường trú Khi phát hiện đồng thời blaCTX-M với E coli và Klebsiella pneumoniae không thể xác định gene ESBL đó thuộc về loài nào, ảnh hưởng đến quyết định điều trị Kết quả phân tích độ tương đồng giữa multiplex real- time PCR và nuôi cấy vi sinh trong phát hiện các men kháng thuốc cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm gene Thông qua hệ số Kappa và trị số p, chúng tôi đánh giá được mức độ phù hợp thực tế giữa hai phương pháp chẩn đoán Đối với nhóm carbapenemase, hệ số Kappa đạt 0,565 (95% CI: 0,399– 0,731; p < 0,001), cho thấy mức độ tương đồng trung bình–cao và có ý nghĩa thống kê Điều này chứng minh rằng PCR là công cụ đáng tin cậy trong phát hiện các gene blaKPC, blaNDM hoặc, bla OXA-48, đặc biệt trong bối cảnh cần phát hiện nhanh các chủng kháng carbapenem để đưa ra quyết định điều trị sớm và kiểm soát nhiễm khuẩn

Trong nhóm ESBL, sự tương đồng giảm đáng kể với hệ số Kappa chỉ 0,191 (95% CI: 0,075–0,308; p = 0,001) Mặc dù có ý nghĩa thống kê, mức độ tương đồng giữa gene ESBL được phát hiện bởi PCR (như blaCTX-M, SHV, TEM) và kiểu hình kháng cephalosporin thế hệ 3 từ nuôi cấy là khá thấp Sự sai lệch có thể do các yếu tố như: vi khuẩn không sống được để nuôi cấy (PCR dương, cấy âm), gene kháng có mặt nhưng không được biểu hiện, hoặc do sai số trong phân tích kháng sinh đồ Điều này cho thấy cần thận trọng khi sử dụng đơn thuần kết quả PCR để xác định ESBL, và khuyến cáo kết hợp với kết quả nuôi cấy hoặc phân tích toàn bộ bối cảnh lâm sàng Đáng chú ý, tương đồng giữa PCR và nuôi cấy trong phát hiện AmpC là rất thấp, với Kappa chỉ 0,029 (95% CI: −0,165 đến 0,223; p = 0,371) – không có ý nghĩa thống kê Chỉ có một trường hợp PCR dương và nuôi cấy xác nhận kháng AmpC Sự sai lệch lớn này có thể bắt nguồn từ tỷ lệ mắc AmpC thấp trong quần thể nghiên cứu, hoặc do phương pháp kháng sinh đồ truyền thống chưa đủ nhạy để xác định chính xác kiểu hình đề kháng AmpC Đồng thời, việc phân biệt AmpC thật sự với ESBL hoặc các dạng kháng khác vẫn còn nhiều thách thức về mặt kỹ thuật và sinh học phân tử

Hiện tại, chúng tôi chưa ghi nhận một nghiên cứu nào trong và ngoài nước có thể hướng dẫn cụ thể cách phân bố các gen kháng thuốc tương ứng với từng loài vi khuẩn được phát hiện bằng kỹ thuật Multiplex real time PCR Do đó, nhằm thiết lập mối liên hệ giữa gen kháng thuốc và tác nhân vi sinh, chúng tôi lựa chọn phân tích các trường hợp bệnh nhân mà kỹ thuật PCR chỉ phát hiện duy nhất một loài vi khuẩn Điều này cho phép quy kết gen kháng thuốc thu được từ PCR là đặc trưng cho chính tác nhân đó Trong tổng số 94 bệnh nhân, có ba trường hợp (mã số 10, 18, và 57) đáp ứng tiêu chí này Ở bệnh nhân số 10, kết quả PCR phát hiện gen IMP, thuộc nhóm carbapenemase Kháng sinh đồ của mẫu cấy định danh cùng vi khuẩn cho thấy vi khuẩn kháng với cả imipenem và meropenem, đồng thời không phát hiện các gen AmpC hoặc ESBL Kháng sinh đồ cũng không ghi nhận hiện tượng tiết men AmpC hoặc ESBL, do đó có thể xác định sự tương đồng hoàn toàn giữa gen kháng thuốc và kiểu hình kháng kháng sinh đối với carbapenem

Tương tự, ở bệnh nhân số 18, PCR phát hiện các gen blaNDM-1

(carbapenemase), blaCTX-M9 và blaTEM (thuộc nhóm ESBL) Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn kháng toàn bộ nhóm carbapenem nhưng không ghi nhận men ESBL Do đó, có thể xác định sự tương đồng về hiện diện của gen carbapenemase, nhưng thiếu tương đồng về biểu hiện ESBL trên kháng sinh đồ

Bệnh nhân số 57 mang gen blaNDM-1, blaOXA-23, blaOXA-51

(carbapenemase), và blaTEM (ESBL) Tương tự trường hợp trên, vi khuẩn thể hiện kháng toàn bộ carbapenem, nhưng không có mô tả về hiện diện ESBL trong kết quả kháng sinh đồ Vì vậy, chỉ có sự tương đồng đối với nhóm gen carbapenemase, trong khi ESBL không được xác minh về mặt kiểu hình

Tổng hợp lại, khi xét riêng về đặc tính kháng thuốc dựa trên biểu hiện enzym carbapenemase, kỹ thuật PCR cho thấy mức độ tương đồng 100% với kết quả kháng sinh đồ trong cả ba trường hợp Kết quả này ủng hộ vai trò của PCR trong phát hiện sớm gen kháng carbapenem – nhóm kháng sinh đóng vai trò then chốt trong điều trị các nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm Khi đem so sánh với nghiên cứu của Hou [44] cũng ghi nhận mức độ tương đồng về tình trạng kháng thuốc 100% khi có gen tiết Carbapenemase

Trong bối cảnh tỷ lệ đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn Gram âm ngày càng tăng cao, đặc biệt là với nhóm carbapenem, việc phát hiện sớm các gen kháng thuốc thông qua kỹ thuật multiplex real time PCR mang lại giá trị lâm sàng to lớn như hỗ trợ lựa chọn liệu pháp kháng sinh ban đầu phù hợp, trúng đích, và có thể góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng đa kháng

Trong tương lai, cần phát triển các nền tảng PCR thế hệ mới với khả năng không chỉ phát hiện đồng thời nhiều gen kháng thuốc mà còn có thể xác định chính xác loài vi khuẩn mang các gen đó trong mẫu bệnh phẩm Việc này sẽ giúp khắc phục hạn chế hiện tại của kỹ thuật multiplex real-time PCR – vốn chỉ cho kết quả hiện diện gen kháng mà chưa phân định được chúng thuộc về vi khuẩn nào khi có sự hiện diện đồng thời của nhiều tác nhân.

Giá trị chẩn đoán và định hướng điều trị

Trong nghiên cứu của chúng tôi việc xác định tác nhân gây bệnh dựa vào phương pháp Multiflex real-time PCR và cấy truyền thống Chúng tôi ghi nhận khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh các tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật Multiflex real time PCR cao gần gấp đôi nuôi cấy truyền thống với tỷ lệ lần lượt là 73,4% và 42,6% Cả hai kỹ thuật đều có thể phát hiện ra nhiều loại vi khuẩn trên 1 mẫu bệnh phẩm, tuy nhiên 2 kỹ thuật lại có quy trình hoàn toàn khác nhau Kỹ thuật nuôi cấy truyền thống dựa trên khả năng tăng sinh và phát triển trong điều kiện phòng thí nghiệm, kết quả nuôi cấy cho thấy sự hiện của vi khuẩn sống, tuy nhiên kết quả này vẫn có thể cho tình trạng âm tính giả do việc sử dụng kháng sinh trước đó hoặc do đặc điểm phát triển chậm và khó nuôi cấy của 1 số tác nhân ví dụ vi khuẩn không điển hình Ngược lại kỹ thuật Multiflex real-time PCR không phụ thuộc vào khả năng sống của vi khuẩn mà nó dựa vào vật liệu di truyền của con vi khuẩn đó trong mẫu bệnh phẩm không phân biệt con đó sống hay chết

So sánh kết quả về khả năng phát hiện vi khuẩn của 2 phương pháp, Multiflex Real-time PCR của chúng tôi (73,4%) cho tỷ lệ thấp hơn của Đ.T.T.Hương (89,3% ) và Đặng Quốc Tuấn (76%) Ngược lại tỷ lệ dương tính của kỹ thuật nuôi cấy của chúng tôi (42,6%) thấp hơn nghiên cứu [55,56] Đ.T.T.Hương (61,67 %), Đặng Quốc Tuấn (52%)

So sánh khả năng phát hiện vi khuẩn của tôi với nghiên cứu của Hou [44] cũng cho kết quả tương tự chúng tôi về sự chênh lệch giữa 2 phương pháp PCR và cấy truyền thống là 88,2% so với 38,2%

Bảng 4.2 Bảng so sánh khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh

Khả năng phát hiện tác nhân gây bệnh PCR(%) Cấy(%)

Mỗi kỹ thuật có những điểm mạnh và điểm yếu trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh, cho đến thời điểm hiện tại cấy truyền thống vẫn là tiêu chuẩn vàng bởi vì Multiflex real-time PCR cũng có những nhược điểm là nó chỉ phát hiện ra những vi khuẩn được chuẩn bị sẵn gene đích còn cấy truyền thống có thể định danh được nhiều loại vi khuẩn với kháng sinh đồ rõ ràng Tuy nhiên kết quả cấy thường được trả rất chậm và có thể âm tính nếu trước đó bệnh nhân đã được sử dụng kháng sinh Trong những trường hợp mà lâm sàng nặng nề, đe dọa tính mạng người bệnh thì xét nghiệm nhanh như Multiflex real-time PCR vẫn là một gợi ý có giá trị cho bác sĩ lâm sàng

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ thay đổi điều trị dựa trên kết quả Multiplex real-time PCR đạt 46,8%( 44 trường hợp) tương tự với báo cáo trước đó của Lee [57] và cs (2019) (40,6%) và thấp hơn báo cáo [61] của Chen

(2024)(58,4%) Đáng chú ý chúng tôi ghi nhận có 7/44 (15,9%) trường hợp thay đổi điều trị với kết quả PCR < 10 4 Phản ánh một thực tế quan trọng tại các cơ sở y tế tuyến cuối như bệnh viện nơi nghiên cứu được thực hiện: phần lớn bệnh nhân có nhiều bệnh lý nền phức tạp, tuổi cao, và đã được sử dụng kháng sinh phổ rộng trước khi được lấy mẫu Trong những trường hợp như vậy, ngưỡng định lượng thấp của vi khuẩn không luôn đồng nghĩa với sự hiện diện không có ý nghĩa lâm sàng, và quyết định điều trị thường dựa vào sự tổng hợp giữa dữ liệu vi sinh học, lâm sàng và yếu tố nguy cơ của từng cá nhân điều này cũng được Chen (2024) giải thích như sau: phác đồ điều trị kháng sinh vẫn không thay đổi sau khi có kết quả Mutiflex real-time PCR ở 49,9% các trường hợp vi khuẩn Gram âm và 41,6% các trường hợp vi khuẩn Gram dương, ngay cả khi không phát hiện thấy vi khuẩn hay gen kháng thuốc Một số nguyên nhân có thể giải thích cho hiện tượng này Mức độ nghiêm trọng của bệnh và sự không ổn định lâm sàng của bệnh nhân tại ICU là mối quan tâm chính Bên cạnh đó, sự thiếu hiểu biết và thiếu tự tin vào xét nghiệm, cũng như việc chưa có hướng dẫn điều trị kháng sinh phối hợp với Multiflex real-time PCR là những yếu tố liên quan Điều này làm nổi bật tầm quan trọng của việc hợp tác giữa các chuyên khoa và xây dựng các hướng dẫn điều trị kháng sinh tại địa phương dựa trên kết quả Multiflex real time PCR, nhằm hỗ trợ bác sĩ lâm sàng trong thực hành quản lý kháng sinh hợp lý theo hướng dẫn của Multiflex real time PCR [61]

Tỷ lệ tử vong chung trong nghiên cứu của chúng tôi là 11/94 ca (11,7%) thấp hơn trong nghiên cứu của Đặng Quốc Tuấn ( 26,3%) và của Đ.T.T.Hương (41,7%) điều này cũng có thể giải thích do đối tương nghiên cứu của chúng tôi bao gồm cả bệnh nhân năm ngoài khoa hồi sức nên mức độ nặng của bệnh sẽ không đạt được độ tương đồng như 2 nghiên cứu trên [55,56]

Trong nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận kết cục tử vong chung là 11 ca, chúng tôi không thể tiến hành chạy hồi quy đa biến Khi tiến hành chạy hồi quy đơn biến cho từng biến, chúng tôi ghi nhận chỉ có một vài biến có ý nghĩa thống kê như: lượng đàm giảm, sự giảm của procalcitonin, thay đổi điều trị sau khi có kết quả Multiflex real time PCR Với lượng đàm giảm chúng tôi có OR= 0,11 (KTC 95%: 0,01 – 0,88) cho thấy trong quá trình điều trị giảm lượng đàm giảm Odds từ vong 90% (p