00060000582 Nghiên Cứu Tạo Chế Phẩm Chứa Catalase Và Các Chiết Xuất Hợp Chất Thiên Nhiên Nhằm Ứng Dụng Trong Phát Triển Dầu Dưỡng Trị Chứng Bạc Tóc Sớm.pdf

Nghiên cứu này được thực hiện để tạo chế phẩm chứa catalase và các hợp chất thiên nhiên và tạo được kiểu hình lông bạc trên động vật mô hình để thử hoạt tính, tác dụng, liều lượng phù hợ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm chứa catalase và các chiết xuất hợp chất thiên nhiên nhằm ứng dụng trong phát triển dầu dưỡng

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm chứa catalase và các chiết xuất hợp chất thiên nhiên nhằm ứng dụng trong phát triển dầu dưỡng trị chứng bạc tóc sớm

1.2 Mã số: QG.16.82

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài:

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 TS Đinh Nho Thái Phòng KH-CN, Khoa Sinh

học, PTN KLEPT, Trường ĐHKHTN

Chủ nhiệm đề tài

2 PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Khoa Sinh học và PTN

KLEPT, Trường ĐHKHTN

Thành viên

3 TS Nguyễn Thị Hồng Loan Khoa Sinh học và PTN

KLEPT, Trường ĐHKHTN

Thành viên

8 Phạm Thu Hương (HVCH) Khoa Sinh học và PTN

KLEPT, Trường ĐHKHTN

Thành viên

1.4 Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 3 năm 2018

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến hết tháng 3 năm 2019

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 3 năm 2019

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân;

Ý kiến của Cơ quan quản lý): Không

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 975 triệu đồng

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:

1 Đặt vấn đề

Tóc là một thành phần của thượng bì, chứa nhiều chất sừng và các sắc tố melanin Melanin được sản sinh ra bởi tế bào hắc tố melanocytes Màu sắc của tóc được quyết định bởi hàm lượng sắc tố melanin, trong đó eumelanin có màu nâu đậm hay đen và phaeomelanin có màu vàng hung đỏ [1-4] Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Kauser và tập thể (2006) [5], catalase biểu hiện kém ở nang tóc của người cao tuổi, do vậy lượng H2O2 dư sẽ ngăn cản các tế bào sắc

tố sản sinh ra melanin, góp phần gây ra tóc bạc Nghiên cứu của Wood và tập thể (2009) [6] cũng chỉ ra rằng ở phần nang tóc của sợi tóc bạc tích lũy đến mM H2O2, dẫn đến tóc bị tẩy trắng

từ bên trong gây ra bạc tóc Enzym catalase (EC 1.11.1.6) là enzym chịu trách nhiệm chính phân giải hydrogen peroxide trong tế bào được kiểm chứng bằng thực nghiệm bởi Gaetani và cộng sự [7] Lý thuyết về “bạc tóc do các gốc tự do” được phát triển và nghiên cứu ở mô hình động vật và các bệnh liên quan đến tóc và da ở người [6, 8, 9], mở ra hướng nghiên cứu về bệnh bạc tóc và điều trị nhằm loại bớt gốc tự do

Màu sắc của lông, tóc và da đều ảnh hưởng bởi tế bào sinh sắc tố melanin Sử dụng bệnh bạch biến (hay còn gọi là bệnh lang trắng, vitiligo) làm mô hình nghiên cứu và thử nghiệm điều trị trên người đã cho thấy kết quả khả quan [10, 11] Bằng thực nghiệm trên người tình nguyện, Schallreuter KU và cộng sự năm 2013 cho thấy có sự liên quan mật thiết enzym pseudocatalase với sự tích lũy sắc tố ở tế bào, khi enzym này được bổ sung thì phần diện tích da thiếu sắc tố bị thu hẹp lại đáng kể [12]

Catalase xúc tác cho phản ứng phân giải H2O2 thành H2O và O2, có chức năng: i) loại bỏ các phân tử gây độc H2O2 trong tế bào [13]; ii) vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản (chống oxi hoá nhanh trong quá trình chín của quả, ); Catalase thường có ở peroxisome trong

tế bào của các sinh vật sử dụng ôxi [14] Catalase được xem là một trong các enzym có hoạt độ cao nhất chuyển hoá được hàng triệu phân tử Hydrogen peroxide trong một giây Catalase có cấu trúc là một tetramer của 4 chuỗi polypeptide (mỗi monomer có khối lượng phân tử khoảng

60 kDa) và bốn nhân hem porphyrin (sắt) ở trung tâm giúp cho enzym chuyển hóa hydrogen peroxide, hoạt động của enzym catalase trong dải pH rộng (pH 4 - 11) và nhiệt độ thích hợp [13, 15]

Dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phần dưới đơn vị cấu tạo nên enzyme và có hay không có nhân heme chúng được chia ra làm ba loại khác nhau [16] Nhóm một là các catalase đơn chức năng có chứa nhân heme, được tìm thấy nhiều nhất ở trong tự nhiên Nhóm thứ hai là catalase hai chức năng, có chứa nhân heme, ít phổ biến hơn, có mối liên quan chặt chẽ đến các peroxidase ở thực vật về cấu trúc và trình tự amino acid Cuối cùng là nhóm manganese catalase (pseudo catalase), không chứa nhân heme, tìm thấy ở các vi khuẩn có khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường [17]

Hiện nay trên thị trường thế giới có một số sản phẩm thực phẩm chức năng có chứa catalase, ví dụ viên thuốc dạng uống có chứa enzym catalase (tên thương mại là Go Away Gray hoặc Anti-Gray Hair) phát triển sớm nhất bởi công ty trách nhiệm hữu hạn Rise-N-Shine [18] Tuy nhiên các loại thuốc dạng uống chứa enzym với bản chất là protein (đạm) nên catalase sẽ bị phân hủy trong quá tiêu hóa bởi các loại dịch vị trong dạ dày, đường ruột; ngoài việc có thể làm

đen tóc thì cũng có thể làm đen da hay không là vấn đề còn chưa được nghiên cứu Bên cạnh đó chưa có sản phẩm nào được sản xuất tại Việt Nam có sử dụng catalase tinh sạch đủ để sử dụng như dầu dưỡng hay thuốc bôi ngoài da Mặt khác Việt Nam là nước nhiệt đới đa dạng về thực vật có giá trị dược liệu, đặc biệt là các thảo dược tự nhiên như Hà thủ ô đỏ, bồ kết, ngũ bội tử,

cỏ mần trầu, các loại tinh dầu, có tác dụng nhất định đến chữa bệnh bạc tóc theo kinh nghiệm dân gian Trong số các hợp chất chiết xuất kể trên thì Hà thủ ô đỏ được biết nhiều nhất và có tác dụng tích cực đến việc chữa bạc tóc, chống lão hóa hiệu quả, song còn thiếu các minh chứng khoa học chuyên sâu và các thí nghiệm trên mô hình động vật để khẳng định kết quả Ngoài ra,

sử dụng Bồ kết vào việc tăng cường mượt tóc và đen tóc cũng là bài thuốc dân gian hiệu quả Nghiên cứu của Vũ Mạnh Hùng và cộng sự đã phát hiện hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất

BK01 tách chiết từ là bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) tại Việt Nam [19], song việc nghiên

cứu tăng sinh và tiềm năng chữa bạc tóc của dịch chiết bồ kết trên mô hình tế bào, động vật còn thiếu, rất cần được nghiên cứu và bổ sung thêm dữ liệu Trên thế giới có một số công bố đã tạo được mô hình thực nghiệm chuột lông bạc thành công, ví dụ như:

+ Năm 2004, nghiên cứu của Emerit và các cộng sự cho thấy đã tạo được mô hình bằng cách nhổ lông ở diện tích 6 x 2.5 cm trên da chuột đen và chứng minh được hiệu quả bảo vệ của Superoxide Dismutase (SOD, có chức năng giảm gốc ô xy hóa trong tế bào) chống lại bạc lông

ở chuột [20]

+ Năm 2014, sử dụng lặp đi lặp lại việc nhổ hoặc cạo lông, Mariko Endou và nhóm nghiên cứu đã tạo được mô hình lông bạc ở chuột đen, dòng C57BL/6 và đã chứng minh được rằng tóc bạc có thể được ngăn ngừa bằng các nhân tố kích thích tăng trưởng và biệt hóa tế bào melanocyte [21]

+ Năm 2015, nghiên cứu của Shahnaz Begum và các cộng sự sử dụng mô hình chuột nude dòng BALB/c đã chỉ ra ràng một số chiết xuất thực vật có thể tăng khả năng sinh trưởng

của lông, như chiết xuất của Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) hay từ cây họ Cúc (Chrysanthemum zawadskii var latilobum) [22]

Nghiên cứu này được thực hiện để tạo chế phẩm chứa catalase và các hợp chất thiên nhiên và tạo được kiểu hình lông bạc trên động vật mô hình để thử hoạt tính, tác dụng, liều lượng phù hợp của chế phẩm cũng như độc tính của chúng ảnh hưởng lên da của động vật, tiềm năng ứng dụng trong thực tế nhằm tạo ra dầu dưỡng có khả năng làm giảm bạc tóc

2 Mục tiêu

Tạo được chế phẩm chứa catalase và các chiết xuất hợp chất thiên nhiên và tìm được mô hình thử nghiệm chế phẩm trên động vật nhằm ứng dụng trong phát triển dầu dưỡng trị chứng bạc tóc sớm

 Tạo được chế phẩm catalase có độ tinh sạch theo tiêu chuẩn thực phẩm

 Tạo được một số chế phẩm dịch chiết thảo dược có khả năng tác động lên quá trình giảm bạc tóc (với chỉ tiêu hóa phân tích dịch chiết của hà thủ ô, bồ kết, ngũ bội tử)

 Bước đầu tạo được dầu dưỡng có tiềm năng chữa bạc tóc bằng cách phối trộn catalase với các dịch chiết thảo dược

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 là quà tặng của GS Simon Cutting Đại học

Hoàng Gia Holoway London, Vương quốc Anh

Dòng tế bào da thường Melanocyte được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection), Hoa Kỳ Tế bào được nuôi cấy và lưu trữ trong Nitơ lỏng, tại Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Chuột nhắt trắng chủng Swiss (chuột bạch) trưởng thành, khỏe mạnh, da nguyên vẹn có trọng lượng trung bình 25-30g và thức ăn tổng hợp cho chuột bạch được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Số 1 Yec Xanh, Hai Bà Trưng, Hà Nội, ) 120 con chuột cái được sử dụng cho nghiên cứu độc tính và kích ứng da theo hướng dẫn của OECD 402 (cho kiểm tra hóa chất, độc tính cấp qua da, phiên bản thông qua ngày 9/10/2017) [23]

Chuột hamster và thức ăn cho hamster được mua tại Cửa hàng Hamster Luna (64 Trần Xuân Soạn, Hai Bà Trưng, Hà Nội) Dòng hamster bear được lựa chọn vì chúng có kích thức vừa phải và hiền lành, 60 con chuột được lựa chọn là các cá thể chuột trưởng thành, khỏe mạnh

và đã được tiêm phòng Lựa chọn chuột có màu lông đen để nghiên cứu tạo kiểu hình lông bạc thực nghiệm và kiểm tra khả năng phục hồi lông đen của chế phẩm

Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora) được định danh bởi chuyên gia và thu hái củ cây tự nhiên 2-3 năm tuổi tại Đồng Văn, Hà Giang; quả Bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) của cây lâu năm được định danh và thu hái tại Quản Bạ, Hà Giang; Ngũ bội tử (Galla chinensis) được

định danh và thu thập tại Hà Quảng, Cao Bằng Các vật liệu tươi được sấy khô, cắt lát trước khi

sử dụng trong thí nghiệm tách chiết các hợp chất tự nhiên

Thang chuẩn protein của Thermo (Mỹ); gel Q-Sepharose và CM-Sepharose được mua từ

GE Healthcare (Mỹ); H2O2 được mua từ hãng Sigma Aldrich (Mỹ) Các hóa chất còn lại đều được mua từ các hãng tin cậy và đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

3.2 Máy móc và trang thiết bị

Các máy móc và các trang thiết bị dùng trong nghiên cứu bao gồm: tủ ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Biobase), máy ly tâm Sigma 3K (Sartorius), thiết bị điện di đứng (Bio-rad) và máy quang phổ khả kiến DU800 (Beckman coulter), tủ an toàn sinh học, hệ thống nuôi tế bào, phòng nuôi động vật và các thiết bị phụ trợ nuôi;…

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của Khoa Sinh học và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

Các thí nghiệm phân tích hóa học được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) và Viện Dược liệu Trung ương

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn và thu nhận dịch chiết protein:

Vi khuẩn Bacillus subtilis từ môi trường thạch được cấy vào môi trường lỏng LB

(Tryptone 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 1%) nuôi cấy lắc 200 vòng/phút tại 37oC Sau 14-16 giờ, trẻ hoá tế bào trong 1 lít môi trường sao cho mật độ tế bào A600 =0,05 và cảm ứng vi khuẩn

sinh catalase bằng cách bổ sung các nồng độ khác nhau của H2O2 (cảm ứng 4 lần, mỗi lần cách nhau 10 phút) trong pha sinh trưởng Thu nhận lại tế bào vi khuẩn sau 0,5 - 3 giờ cảm ứng bằng cách ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút Dịch chiết tế bào đã được thu nhận bằng cách hoà tan vi khuẩn trong 50 ml đệm phosphat 50 mM, pH 7,0 (đệm A); siêu âm phá tế bào (4 lần, mỗi lần 30 giây) tại 4oC trong đệm A Dịch siêu âm sau đó được ly tâm ở 4oC, tốc độ

12000 vòng/phút trong 30 phút để loại bỏ cặn tế bào và thu dịch nổi cho nghiên cứu tiếp theo

3.3.2 Tinh sạch enzym catalase từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis

Catalase bước đầu được tinh sạch từ dịch chiết vi khuẩn B subtilis bằng kết tủa với

(NH4)2SO4 bão hòa ở các nồng độ khác nhau 30 - 60% Sau khi ủ ở 4oC trong 3 giờ, tiến hành loại dịch nổi và thu lấy tủa bằng ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4oC trong 30 phút, hòa tan phần tủa trong đệm A Phần lớn catalase đã được tìm thấy trong phân đoạn tủa 50 và 60% ammonium sulfate Dịch hoà tủa 50% được thẩm tích loại muối qua đêm ở 4oC trong đệm Tris-HCl 20 mM,

pH 8,0 (đệm B) và được sử dụng cho các bước tinh sạch tiếp theo Sau đó, dịch thẩm tích được cho lên cột Q-sepharose (2,5x4 cm) đã được cân bằng với đệm B, tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút Sau khi rửa các phân đoạn protein không gắn cột bằng đệm B, các phân đoạn protein gắn cột đã được rửa chiết bằng gradient NaCl (0-0,7 M) trong đệm B Các phân đoạn thu nhận (1 ml) sau

đó được xác định hoạt tính của catalase và định lượng protein bằng đo độ hấp thụ tại A280 nm Các phân đoạn có hoạt tính của catalase sẽ được dồn lại, cô đặc bằng amplicon 10 kDa (Mllipore) và thẩm tích ở 4oC qua đêm trong đệm CH3COONa 20 mM, pH 4,8 (đệm C) Dịch

cô và thẩm tích cho lên cột CM-sepharose (1x2 cm) đã được cân bằng bằng đệm C Sau khi rửa các protein không gắn hoặc gắn không đặc hiệu, protein gắn cột sẽ được rửa chiết bằng đệm C

có lần lượt 0,1 M, 0,3 M và 0,5 M NaCl Các phân đoạn có hoạt tính của catalase được dồn lại với nhau và thẩm tích loại muối ở 4oC trong đệm A và bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3.3 Xác định hoạt độ của catalase và động học của catalase tinh sạch

Hoạt độ của catalase được xác định dựa trên khả năng phân giải cơ chất H2O2 ở nhiệt độ

37oC sử dụng máy quang phổ khả biến ở bước sóng 240 nm [24] Lượng H2O2 phân giải trong mỗi phút được tính bằng cách sử dụng định luật Lambert Beer với hệ số hấp thụ của H2O2 ở bước sóng 240 nm là 43,6 M-1cm-1 Một đơn vị hoạt độ của catalase phân giải 1 µmol của

H2O2 trong một phút ở 37oC tại pH 7,0 [25]

Hằng số động học Km và Vmax của catalase tinh sạch từ gan bò được xác định dựa trên tương quan tốc độ thuỷ phân H2O2 của catalase và nồng độ cơ chất theo phương trình Lineweaver-Burk Nồng độ H2O2 được sử dụng trong thí nghiệm là khoảng từ 6–20 mM

3.3.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot

Kiểm tra độ biểu hiện đặc hiệu của các protein bằng điện di SDS-PAGE và Western blot được thực hiện theo Towbin và cộng sự [26] Gel polyacrylamide gồm 2 lớp, trong đó lớp gel

cô 5% và gel tách 12% được chuẩn bị trước khi điện di Mẫu protein được trộn đều với đệm mẫu nồng độ 5X theo tỷ lệ 4:1, xử lý mẫu ở 95oC trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá trước khi tra mẫu Hàm lượng protein được tra khoảng 60 μg/giếng với mẫu protein tổng số và 7 μg/giếng với protein tinh sạch Đệm chạy điện di: Tris–Glycine pH 8,3 có chứa SDS 1%, quá trình điện

di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 150 V trong khoảng 1 giờ Gel được nhuộm bằng dung dịch Coomassie Brilliant Blue (CBB) 2,5 % pha trong hỗn hợp methanol:acetic acid:H2O với tỷ lệ thể tích là 4:1:5 trong khoảng 20-30 phút, màu thuốc nhuộm được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng

Protein sau khi được tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF (Polyvinylidene fluoride) bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có 10% methanol Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng vẫn giữ nguyên Màng được cố định bằng BSA 1% trong đệm PBS pH 7,4 bằng cách lắc nhẹ 45 phút ở nhiệt độ phòng, BSA được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1x, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1% Màng sau đó được ủ với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách tráng rửa 3 lần trong đệm PBS 1x, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1% Tiếp theo, màng được ủ với kháng thể thứ cấp có gắn AP Các băng protein được hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất NBT và BCIP pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM và NaCl 0,1% Phản ứng được làm ngừng trong đệm PBS 1x, pH 7,4 có chứa EDTA 20 mM khi các băng protein hiện rõ

3.3.5 Phương pháp đánh giá độc tính của dịch chiết lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy

Đề tài sử dụng bộ kit CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, sử dụng theo khuyến cáo của hãng Promega (gọi tắt là phương pháp MTT) Theo đó, đầu tiên tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng với nồng độ 5.000 tế bào/180 µl môi trường nuôi cấy, sau đó ủ trong 37o

C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h trước khi tiến hành thử thuốc Ủ với thuốc thử: Bổ sung 20µl thuốc thử tương ứng để đạt nồng độ thuốc cần thiết

Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 48h ở trong tủ ấm 37o

C, 5% CO2 Sau 48h, hút bỏ 100 μl môi trường ở mỗi giếng và bổ sung vào 20 μl dung dịch nhuộm Gõ nhẹ đĩa

và ủ trong 4h ở 37oC Ở bước này, dung dịch cần được bọc kín để tránh ánh sáng Bổ sung vào giếng 100 μl hỗn hợp dung dịch hòa tan/dừng phản ứng, gõ nhẹ đĩa và ủ trong 1h Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bước sóng 490 nm Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định được % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá được độ độc đối với tế bào của chế phẩm A được tính theo công thức:

A(%) = (T/VH) x 100

VH: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc

T: giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc

Nếu A = 50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây chết 50% tế bào, ký hiệu là IC50 Đây là giá trị

để đánh giá độc tính của thuốc đối với tế bào

3.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của tế bào

Tiến hành nạp tế bào vào trong các giếng của đĩa nuôi cấy 06 giếng với nồng độ 5x105 tế bào/1800µl môi trường nuôi cấy, sau đó ủ trong 37o

C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24h Ủ

tế bào với chế phẩm thử nghiệm: Bổ sung 200µl thuốc thử tương ứng để đạt nồng độ cần thiết

Gõ nhẹ vào thành đĩa cho thuốc phân bố đều rồi ủ trong 72h ở trong tủ ấm 37o

C, 5% CO2 Sau 72h ủ, thu môi trường nuôi cấy, đo mật độ quang học ở bước sóng 430nm để định lượng nồng động Melanin ngoại bào trong môi trường Rửa tế bào bằng PBS, bóc tách tế bào bằng enzym Trypsin EDTA, ly tâm 1500 vòng trong 5 phút, thu cặn tế bào Sau đó ủ cặn tế bào thu được với 200µl NaOH 1M ở điều kiện 80o

C trong 30 phút, ty tâm thu huyền dịch tế bào và Đo mật độ quang học ở bước sóng 430nm để định lượng Melanin nội bào so sánh với lượng sinh ra ở tế bào đối chứng tinh được tỉ lệ % so với đối chứng [27]

3.3.7 Phương pháp đánh giá kích ứng da ở động vật

Dung dịch cần thử được bôi đồng đều lên phần da đã được làm sạch và tiến hành theo dõi, quan sát ngay sau khi bôi ít nhất một lần trong vòng 30 phút đầu tiên, định kỳ trong 24 giờ đầu tiên và chú ý đặc biệt trong 2 đến 6 giờ đầu sau khi bắt đầu thời gian phơi nhiễm, và hàng ngày sau đó, tổng cộng trong 14 ngày Ở thí nghiệm này, trạng thái của chuột ở thời điểm chưa tiếp xúc với dung dịch thử (thời điểm trước 0h) được lấy làm đối chứng cho các thời điểm kế tiếp (0h, 30 phút, 2 tiếng, 6 tiếng, hằng ngày sau khi tiếp xúc dung dịch) Tuy nhiên, thời gian quan sát không phải là cố định nhưng phải xác định được thời điểm bắt đầu dấu hiệu lâm sàng

và thời gian hồi phục Ghi nhận thời điểm mà dấu hiệu độc tính xuất hiện và biến mất Cần quan sát kỹ bao gồm: Sự thay đổi da, lông, mắt và niêm mạc, và hệ hô hấp, hệ tuần hoàn và hệ thần

kinh trung ương, hoạt động của động vật và mô hình hành vi (nếu có) Ngoài ra, vùng da điều

trị có thể được quan sát trong 24, 48 và 72 giờ sau khi loại bỏ các dung dịch trên da Trọng lượng của các con chuột được xác định vào ngay trước khi thử dung dịch và 1 tuần sau đó Ở ngày thứ 14 các động vật được cân và đánh giá mức độ gây kích ứng da của dung dịch thử

4 Tổng kết kết quả nghiên cứu

4.1 Tinh sạch và đánh giá hoạt độ của catalase từ các nguồn tự nhiên

Đề tài đã tiến hành nghiên cứu tài liệu tổng quan các công bố về nguồn gốc tự nhiên có

nhiều catalase, đã phát hiện được 02 nguồn tự nhiên có nhiều catalase là từ vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 và từ gan bò (bò vàng, giống bò lai giữa Bos taurus và Bos indicus)

Tiến hành thử nghiệm các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B.subtilis PY79 đã chọn được điều

kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn này: môi trường nuôi cấy là LB lỏng, nhiệt độ ở

37oC, cảm ứng tế bào 4 lần với H2O2 nồng độ 0,1 mM tại thời điểm giữa pha sinh trưởng của tế bào và tiến hành thu sinh khối sau 2 giờ cảm ứng Catalase từ dịch protein tổng số ở các tế bào

vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 có hoạt độ riêng đạt 213 U/mg Sau đó, enzym catalase được

tinh sạch bằng kết tủa chọn lọc với (NH4)2SO4 50%, sắc ký cột trao đổi anion Q-Sepharose và trao đổi cation CM-Sepharose

SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch catalase từ vi khuẩn cho thấy sau tinh sạch có một băng protein kích thước khoảng 60 kDa trên gel SDS-PAGE với hoạt độ riêng phân giải H2O2 là 30.717,2 U/mg, độ tinh sạch tăng 144 lần so với dịch chiết ban đầu (băng 5, Hình 1)

Hình 1 SDS-PAGE các phân đoạn tinh sạch catalase qua cột Q-sepharose và CM-sepharose

1 Thang chuẩn protein, 2 Protein tổng số trong dịch chiết B subtilis, 3 Dịch hòa tan tủa 50% (NH 4 ) 2 SO 4 , 4 Protein tổng số lên cột Q-Sepharose, 5 Phân đoạn gắn cột Q-Sepharose và lên cột CM-Sepharose, 6 Phân đoạn tinh sạch qua cột CM-Sepharose

Enzym catalase từ dịch protein tổng số từ gan bò có hoạt độ riêng đạt 1.352,43 U/mg Catalase đã được tinh sạch từ gan bò bằng kết tủa thuận nghịch bằng acetone, sắc ký cột trao đổi anion DEAE-Sepharose và trao đổi cation CM-Sepharose đã thu được catalase tinh sạch với hoạt độ riêng là 79.227 U/mg, có độ tinh sạch gấp 58,62 lần so với dịch chiết ban đầu Dẫn liệu

về độ tinh sạch của catalase từ gan bò được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và lai Western (Hình 2)

Kết quả điện di các phân đoạn tinh sạch trên SDS-PAGE (Hình 2.A) cho thấy sự có mặt của một băng protein duy nhất rõ nét có KLPT khoảng 60 kDa theo tính toán lý thuyết là của catalase Băng protein này cũng liên kết đặc hiệu với kháng thể đa dòng kháng catalase trên thẩm tách miễn dịch Western Blotting (Hình 2.B) Do hoạt độ riêng của catalase sau khi tinh sạch thu được từ gan bò (79.227 U/mg) lớn hơn nhiều so với catalase tinh sạch từ vi khuẩn (30.717,2 U/mg) và có độ tinh sạch đạt yêu cầu nên đề tài đã chọn nguồn sinh catalase tự nhiên lấy từ gan bò để sản xuất quy mô phòng thí nghiệm

4.2 Xây dựng quy trình và tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm enzym catalase

Đề tài đã thiết lập được quy trình tinh sạch enzym catalase gồm 18 bước như sau:

1 Sử dụng 65 g gan của bò, cắt nhỏ đến kích thước viên nhỏ 3cm x 3cm

2 Bổ sung 100 ml đệm A (kali phosphat 20 mM, pH 7,5)

3 Nghiền nhỏ gan bằng máy xay sinh tố đến khi đồng nhất (xay 5 lần, mỗi lần 30 giây; đảm bảo mẫu ở 4oC),

4 Tiến hành ly tâm hỗn hợp đồng nhất 13.000 vòng, 30 phút, 4oC,

5 Thu 105 ml dịch nổi, loại bỏ tủa,

6 Bổ sung 35 ml aceton 100% vào dịch nổi để đạt nồng độ cuối cùng 25%, giữ ở 4oC trong vòng 1-2 giờ,

7 Ly tâm 13.000 rpm/20 phút, 4oC,

8 Thu 100 ml dịch nổi và loại bỏ kết tủa,

9 Tiếp tục bổ sung 150 ml aceton 100% để nồng độ cuối cùng đạt 70%, giữ ở 4oC trong vòng 1-2 giờ nhằm thu được nhiều nhất protein bị kết tủa,

10 Ly tâm 13.000 rpm/20 phút, 4oC,

11 Thu tủa protein có catalase, loại bỏ dịch nổi,

12 Hoà tan kết tủa tan hoàn toàn trong 150 ml đệm B Bước này nhằm loại một số amino acid và protein không mong muốn,

13 Thẩm tích dịch hoà tủa trong 1 lit đệm B, thay đệm 3 lần, mỗi lần 2 giờ, lần cuối để qua đêm nhằm loại bỏ acetone Kết quả từ 65 g gan bò đã thu nhận được tổng số 2.086 g protein tổng số với nồng độ 14,9 mg/ml Protein tổng số có hoạt tính phân giải H2O2 với hoạt độ riêng 2030,9 U/mg,

14 Gắn dịch thẩm tích lên cột DEAE-sepharose đã được nhồi với thể tích 130 ml trên cột XK 26/40 và cân bằng với đệm B Toàn bộ quá trình tinh sạch tiến hành trên máy AKTAprime (GE) Tốc độ dòng chảy ở tất cả các bước cân bằng, rửa và rửa chiết đều là 2 ml/phút; trừ bước gắn mẫu, tốc độ là 1 ml/phút Sau bước gắn 140 ml dung dịch gan bò lên cột, các protein gắn không đặc hiệu hoặc không gắn với cột

sẽ được rửa đến khi độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng A280 nm < 0,05 Các protein gắn trên cột được rửa chiết bằng 1,5 l gradient của đệm B với nồng độ NaCl từ 0 - 0.3 M Tiến hành điện di SDS-PAGE và xác định hoạt tính tất cả các phân đoạn gắn và không cột DEAE-sepharose,

15 Các phân đoạn có hoạt tính của catalase (10-147) với tổng thể tích 700 ml được thu lại, nồng độ protein 0,6 mg/ml; cô đặc mẫu 5 lần bằng hệ thống máy lọc tiếp tuyến AKTA flux (GE, Mỹ), thẩm tích qua đêm trong đệm C (Natri acetate 10 mM pH 4.5),

16 150 ml dịch lọc sau đó tiếp tục được cho lên cột XK 16/20 có 30 ml gel sepharose đã được cân bằng với đệm C Các protein gắn trên cột sẽ được rửa chiết trong 360 ml đệm C với gradient NaCl từ 0-0.7 M Tiến hành điện di SDS-PAGE

CM-và xác định hoạt tính tất cả các phân đoạn gắn CM-và không cột CM-sepharose

17 Các phân đoạn có hoạt tính của catalase (49 - 72) được thu lại, cô đặc mẫu 5 lần bằng hệ thống máy lọc tiếp tuyến AKTA flux (GE, Mỹ), thẩm tích qua đêm trong đệm A Xác định độ tinh sạch và hoạt tính của chế phẩm catalase

18 Bảo quản chế phẩm catalase trong đệm A có DTT 1 mM và glycerol 5% tại -20o

C cho đến khi sử dụng

Thực hiện Quy trình trên, chúng tôi đã thu nhận được chế phẩm catalase khối lượng phân tử (KLPT) khoảng 60 kDa có độ sạch trên 96% bằng SDS-PAGE như Hình 3, cũng như

có hoạt tính phân giải H202 với hoạt độ riêng 75.232,8 U/mg

Hình 3 Kết quả điện di chế phẩm catalase tinh sạch từ gan bò trên SDS-PAGE

1 Thang chuẩn protein; 2 Phân đoạn protein trước khi tinh sạch lần 2 bằng cột

DEAE-sepharose; 3 Phân đoạn catalase sau tinh sạch

Các chất glycerol, DTT, BSA có khả năng làm bền hoạt tính của các enzym nên thường được bổ sung trong đệm bảo quản các enzym [28] Trong nghiên cứu này, glycerol, DTT và BSA đã được bổ sung vào đệm bảo quản enzym để thử nghiệm khả năng bảo quản (Hình 4) Cụ thể, chúng tôi đã sử dụng glycerol 10%, DTT 1 mM và BSA 0,1% chia làm từng nhóm nhỏ để thử bảo quản catalase trong vòng 6 tháng tại -20˚C

Kết quả ở Hình 4 cho thấy: chế phẩm catalase khi không có thêm chất bảo quản sau 6 tháng hoạt độ còn lại là 60% Trong khi đó, catalase có chứa chất bảo quản với chỉ glycerol 10% hoặc hỗn hợp glycerol 10% và DTT 1 mM, hoặc glycerol 10%, DTT 1 mM và BSA 0,1% vẫn ổn định hoạt tính trong 6 tháng bảo quản tại -20˚C Kết quả này cũng cho thấy vai trò làm bền hoạt tính enzym catalase của glycerol

Hình 4 Kết quả đo hoạt tính của catalase bảo quản trong thời gian 6 tháng tại -20˚C

Đệm P: Kali phosphat 20 mM, pH=7; Đệm P+Glycerol: Kali phosphat 20 mM, pH=7 và 10% glycerol; Đệm P + Glycerol + DTT: Kali phosphat 20 mM, pH=7 và 10% glycerol, DTT 1 mM; Đệm P + Glycerol + DTT+ BSA: Kali phosphat 20 mM, pH=7 và 10% glycerol, DTT 1 mM và

4.3 Tạo các dịch chiết hợp chất thảo dược thiên nhiên và xây dựng một số tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm dịch chiết thảo dược thiên nhiên

4.3.1 Thu mẫu các mẫu thảo dược thiên nhiên và nghiên cứu quy trình tạo các dịch chiết ở quy

mô phòng thí nghiệm

Dựa vào tài liệu về phân bố của các cây thảo dược của Viện Dược liệu Trung ương [29],

đề tài quyết định lựa chọn Hà Giang là địa điểm thu mẫu Hà thủ ô đỏ (HTO) và Bồ kết (BK); Cao Bằng là địa điểm thu mẫu Ngũ bội tử (NBT) Mẫu sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm sạch một lần nữa bằng cồn, để khô và sấy ở 50-600C đến khi khô hoàn toàn, được khoảng 5-6 kg/mẫu khô Dưới sự hỗ trợ của các chuyên gia thuộc Bộ môn Thực vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã định danh cho 3 mẫu thu được Các mẫu thảo dược được cắt lát, phơi khô, và nghiền thành bột mỗi loại thảo dược được đựng trong các lọ khoảng 0.5-1 kg Từ 100g bột nguyên liệu ban đầu được chiết xuất bằng các loại dung môi theo quy trình như sau:

1 Cắt nhỏ mẫu các mẫu tươi theo kích thước hạt: 0,5cm x 1 cm

2 Phơi khô trong 3 ngày đến khi trọng lượng không đổi