Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập các vi sinh vật đất có khả năng kiểm soát nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây họ cà

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Phân lập các vi sinh vật đất có khả năng kiểm soát nắm gâybệnh lở cô rễ trên cây họ cà” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệThực vật — Khoa Nông

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KD

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP CAC VI SINH VAT ĐẤT CÓ KHẢ NANG

KIEM SOÁT NAM GAY BỆNH LO CÔ RẺ

PHAN LAP CÁC VI SINH VAT DAT CÓ KHẢ NĂNG KIEM

SOÁT NAM GAY BỆNH LO CÔ RE

Gửi lời cảm ơn đến bạn Lê Thị Kim Thỏa (DH18BV) là người bạn cộng sự đãđồng hành với tôi trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Xin cảm ơn các bạn làm

đề tài ở phòng thí nghiệm bệnh cây bộ môn BVTV luôn hồ trợ và giúp đỡ tôi

Gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DH18BV đã đồng hành với tôi trong 4 năm họctập ở trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

Và trên hết, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến bố mẹ cũng như là gia đìnhluôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quãng đời sinh viên của mình Không aikhác, tôi tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nỗ lực của tôi sẽ là động lựcmạnh mẽ nhất giúp tôi thành công trên con đường mà mình đã chọn

Trân trong cảm on!

Thanh pho Hồ Chi Minh, tháng 2 năm 2023

Sinh vién

V6 Nhat Duy

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập các vi sinh vật đất có khả năng kiểm soát nắm gâybệnh lở cô rễ trên cây họ cà” đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệThực vật — Khoa Nông học, Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từthang 8/2022 đến tháng 2/2023 Mục tiêu nghiên cứu: phân lập và đánh giá khả năngđối kháng của các dòng vi sinh vật trong đất với các chủng nam gây bệnh lở cổ rễ trêncây họ ca trong điều kiện phòng thí nghiệm

Phương pháp nghiên cứu: khảo sát khả năng đối kháng trong phòng thí nghiệmđược bé trí theo kiểu đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi dòng vi sinh vật là mộtnghiệm thức và một nghiệm thức đối chứng, 3 lần lặp lại

Đề tài thu được kết quả như sau:

Từ 26 mẫu cây bệnh đã phân lập được 3 chi nắm có khả năng gây bệnh lở cô rễtrên cây họ cà đó là 3 chi nam Rhizoctonia, Fusarium và Pythium từ các mẫu bệnh thuthập được với tần suất xuất hiện lần lượt là 18,27%, 52,88% và 13,46% trên tổng số

104 MPL.

Từ 6 mẫu đất đã phân lập được 24 dòng vi sinh vật Qua kiểm tra đối khángtrong điều kiện phòng thí nghiệm thu được các dòng VSV có hiệu suất đối kháng ởmức trung bình trở lên (trên 51%): 8 dòng VSV đối kháng với nam Rhizoctonia sp tạithời điểm 3 NSC, 11 dòng VSV đối kháng với nam Fusarium sp tại thời điểm 5 NSC

và 15 dòng VSV đối kháng với nam Pythium sp tại thời điểm 60 GSC Trong đó, có 5dòng VSV là CC — DT1, KT - DT4, KT - ĐDI, KT - DD2 và O - CCI đều có HSĐK

ở mức trên 51% đôi với cả 3 chủng nâm.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm đã xác định: tỉ lệ kháng bệnh của dòng

O - ĐT3 (Bacillus sp.) với nam Rhizoctonia sp khi phòng bệnh tăng 53,3% và khi trừbệnh tăng 43,3%, tỉ lệ kháng bệnh của dòng KT - ĐDI (Bacillus sp.) với namFusarium sp khi phòng bệnh tăng 46,7% và khi trừ bệnh tang 40%, tỉ lệ kháng bệnh

của dòng KT — DD4 (Pseudomonas sp.) với nam Pythium sp khi phòng bệnh tăng16,7% và khi trừ bệnh tăng 23,3%.

Danh sách chữ viết tắt - - 2-52-5255 2E921921221221221221212121212121212121212121 ee 1X

Danh:sách: CAG Wat sa senanooenoieaiiviiit3g2240950143809534511XRSSEISEGESSEĐAIES3930L3ã30/335a0i-SHaiimentagsasdl hộ

Danh sach cae With 0 XI

1.1.2 So luge vé cay khoai mm 3

1.1.3 So lược VỀ câyớtL 2-52 212212212 12212112112112212111111111111211111121212c cre 4

1.2 Tổng quan về bệnh lở cổ rễ trên cây họ Cà 2 2¿©22+22+2E£2EE+2E+2EZ+zE+zzzzex 4

1.2.1 Triệu chứng bệnh lở cô rễ trên GẦN? NÓI Cad saeseaiatsbsnEindglsrnsbitsasnsthilgatienilszrlgpsdabstotasesloaiasl 4

1.2.2 Tổng quan về nam Rhizoctonia spp gây bệnh lở cô rễ 2: 2 225222222: 5

eA Gianoli ore Ce 5

1.2.2.2 Dac diém Rhizoctonia Spp .cccccccsessessessessessessessecsessessessessessessessessessesseeseeseeseees 5

1.2.2.3 Hình thức sinh sản 2 1111111111 151155555511 1111k kg 111111 ket 6

1.2.2.4 Điều kiện phát triển và gây hại -22- 2 ©2222222E22E 2212322212212 22 22x 6

1.2.2.5 Sự tỒn lưu - + S2+22222122125221211211121121112112111111111121121112112111211211 re 7

1.2.2.6 Sự lan truyền và xâm nhiễm -2-2 22 +£SE£SE£SESE£EEEEEEEEEE2E2E2Ee2222 xe 7

1.2.3 Tổng quan về nam Fusarium spp gây bệnh lở cô rễ -2-©22255z22z+25++2 #

125.1 Wi teh phat Oat xesssasiasgtiattotndabilirBousitbfogiogiiiddioistriedssiotifoopsgiipbo4biiobibdpstidadee 7

1.2.3.2 Đặc điểm của nắm Fusarium spp 5-oc-S7SScccccecrerrrrrrrrrrrrrrrrrreee #

2-3/3 Hình thitesinhy Gant s.r sáng teti 01105818 NghgHhEBhAililigAiDGiBaidftgssEbigoigsrdanisgbigegsss §

1.2.3.4 Điều kiện phát triển và gây hại 2-2252 22222222122212212211221221211221 212 xe 9

ly er 9

1.3.3.6 Sự lan truyền và sâm: nhiỂHi xe He Ha HH H5 c 10964000 0180600 0 10

1.2.4 Tổng quan về nắm Pythivm spp .-. -5:-22-522©5222222222E22E222222EE22E2EE2ESzErcrxez 10

I SA 20:09 0.0 10

5 9825100102277.) 88m 10

12.4.3) Hin Chiesa SAN suasseerisnveisoroi111056801255009051535G363531588S5550EERSSGELESBSSESEU38853831.488đ5e II

1.2.4.4 Điều kiện phát triển và gây hại eee 522222E22E2E2E2212212122122121221221 212 c0 12

ee 12

1.2.4.6 Sự lan truyền va xâm mhi6m oo ccceccsseesessessessessessessessessessessesseseessesseeneeaees 13

1.3 Tổng quan về vi sinh vat đối khang cece ccc cceeseeeeeeseseesseseetsesseseeesesenssesseeeees 13

1.3.1 /03002 //1010)0/êẽaiŸaảả434 ẢẢ 13

1:3.1⁄1 Water PWG 108 sen senesnasevroioiseoBdnglialfELog342050.3080x2812.0380-l50g08008/1.ndngSL138100200/809u200118 13

1.3.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus sp cccccccccssessessesseesessesseesesseesessesseeseesesseeseeees 13

1.3.1.3 Tinh đối kháng của Bacillus sp .csscccccsscesessesssessessesseeseesseesesstessesstesseeseensees 14

I¿j8:2,1 Vir trí phẩn ÌOllsesss-ssssseseeetxts144054827510025E8100382008880468P140/2LSSIECLEAB.GI402186180)58188866550 15

1.3.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas Sp .- -2-©5:©5255255255255222c>5z5522 15

LOB 7Xu khuẩn Strep sesossenoetekiniioLCELELS.EELL2DGHEES2EL43035tH21230302380800003010880 17

1.3.3.1 2000 ố na e 17

1.3.3.2 Đặc điểm của vi khuẩn Streptomyces - cccccccessessessessessessessessessessecsessecseeseeees 17

1.3.3.3 Tính đối kháng của Š/7€//Ø/n/C€S 2 22-©22+2222222222222E22222223222E2E2crrvee 17Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 19

2.1 NOt co ái) CUU 1 19

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2¿©-2+222+222+2EE+EE222EE22E2272222222222222-e 19

2.3 Vial WOW CHỈ 1S ATCO aesessssssoesebosntibnsetgiobEHGS40930105580G00Đ3G0190SĐ05SHESS2S0.USDNSGUEUGEHESH.G.SNGSIES01038 19

2.3.1 Dung cu, thiét bi Ay OC eee ee 19

2.3.2 Môi trường, hóa chất dùng dé nuôi cấy và phân lập nam -2 20

2:4 Phươñg pháp nghiÊf GỮU:;::-:-:::::::ssscccsis61126121100817516310363315014 13 S6<G513.54k43833 E313 S88 28356 20

2.4.1 Thu thập và phân lập các mẫu nam gây bệnh lở cô rễ trên cây họ cà 20

2.4.1.1 Thu thập mẫu cây bệnh ¿2 2-52 2222E2E22E2EE2EE2E22152123212122121 21222222 xe 20

2.4.1.2 Plan Lap mu nan ắ51 21

2.4.2 Định danh mẫu nam bang đặc điểm hình thai cece ecceeetescteeeteeeeeeeeees 222.4.3 Thu thập va phân lập mẫu vi sinh vật có ích trong đất -. -2 22255: 23

2.4.3.1 Thu thập mẫu đất - 2-2 s+S1+S12EE2EE92192122121217121212121121121212122Xe5 23

2.4.3.2 Phân lập các vi sinh vật trong đất -©2+©22222222+22222E22E122222222Ezrrcrev 24

2.4.4 Định danh vi sinh vật phân lập trong đất -22©2222+22++2zz2z++zxzzzzzzxeex 24

2.4.4.1 Xác định gram bằng dung dịch KOH 3% 222 22222+2E+2Ez+2xtzxzzrxeex 24

2.4.4.2 NWUGM gra oo 25

DAA NHUỘM Bão LT cncnsercns een ren eraereeneer ener Ee EEE 25

2.4.4.4 Định danh các dòng vi sinh vật bang các phan ứng sinh hóa - 26

2.4.4.5 Khả năng phát triển của vi sinh vật trong điều kiện ky khí - 26

2.4.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các đòng vi sinh vật phân lập đối với nắm gây

2.4.6 Kiém chứng độc tính của 3 dòng vi sinh vat có hiệu suất đối kháng cao nhất trên

3 loai nam gay bémh 16 1 11 28

2.4.7 Đánh giá khả năng đối kháng của các dong vi sinh vật đối kháng mạnh với namgây bệnh trên hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm 2-22 22552 29

2.5 XU Ly 8 30

Chương 3 KET QUA VA THẢO LUẬN -2©225522222zczzczzezsezszrszsze-e- 3Ï

3.1 Kết quả xác định các loại nam gây bệnh lở cổ rễ trên cây họ cả dựa vào đặc điểm

HINH THiất, Oar ec ce rer ree ree ere renee ec 31

3.1.1 Kết quả phân lập mẫu bệnh -2 2222222£2EzEzzxzxzzrxrzszrxzrsrzre-sc- 3 ]

3.1.2 Định danh nam gây bệnh trên cây họ cà dựa vào đặc điểm hình thái 31

3.2 Kết quả phân lập va kiểm tra kha năng đối kháng của các dòng vi sinh vat phân lậpđược trong dat đối với các loại nam gây bệnh lở cổ rễ trong điều kiện phòng thi

NS can nh ae eee no Ta acc 37

3.2.1 Kết quả phân lập vi sinh vật trong đất -2-55255222scSscscsezsrererseeeeec 37

3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các đòng vi sinh vật phân lập đượctrong đất đối với nam gây bệnh lở cô rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm 41

3.2.2.1 Khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật phân lập được trong đất đối với

3.4 Kết quả kiểm chứng độc tính của các dòng vi sinh vật có hiệu suất đối kháng caonhất trên 3 loại nam gây bệnh lở cô rễ trong điều kiện phòng thí nghiệm 49

KẾT TUHN Y-x ĐỀ | 55

a 63

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

BKTN Bán kính tản nắm

Ctv Cộng tác viên

FAO Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Luong thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc)

GSC Giờ sau cấy

HSĐK Hiệu suất đối kháng

KBA Môi trường King’ B Agar

LB Môi trường Luria Broth

PCA Môi trường Potato Carrot Agar

PGA Môi trường Potato Glucose Agar

VSV Vi sinh vat

WA Môi trường Water Agar

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 2.1 Mẫu bệnh lở cô rễ thu thập trên cây họ cả 2-22©52©52222222222222522 21

Bang 2.2 Mẫu dat thu thập được trên ruộng cây ho cà có triệu chứng bệnh lở cổ rễ 23

Bảng 3.1 Ty lệ bệnh của cây cả chua (7 ngày sau thí nghiệm) - - 5-5555 32

Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh của cây ớt (7 ngày sau thí nghiệm) -<<-< < <-313

Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh của cây khoai tây (7 ngày sau thí nghiệm) 33

Bang 3.4 Danh sách các chi nắm đã phân lập -2-22522 5222+2S22z£zz2zzzzzse2 34

Bang 3.5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường KBA - 37

Bảng 3.6 Bán kính tản nắm và hiệu suất đối kháng của 24 dòng vi sinh vật đối vớinam Rhizoctonia sp trong điều kiện phòng thí nghiệm - 22- 5525525522: 41

Bang 3.7 Bán kính tan nam và hiệu suất đối kháng của 24 dòng vi sinh vật đối vớinam Fusarium sp trong điều kiện phòng thí nghiệm 2 22 5222222222z22522 45

Bảng 3.8 Bán kính tản nắm và hiệu suất đối kháng của 24 dòng vi sinh vật đối vớinam Pythium sp trong điều kiện phòng thí nghiệm 2-22 ©2252225222z+22z22zz2+2 47

Bảng 3.9 Kết quả định danh các dòng vi sinh vật phân lập từ đất 49

Bảng 3.10 Tỷ lệ bệnh của hat cà chua sau (7 ngày sau thí nghiệm) 50

Bảng 3.11 Hiệu lực phòng trừ bệnh của các dòng vi sinh vật với 3 chủng nam gâybệnh lở C6 rỄ 22-52 +SSE9SE2E2EE9212521221212212212112121211211121121111121112112111212212 re 52

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Du động bào tử Pythium được giải phóng qua bọc gia trong quá trình sinh

Sân: XỔ: TƯ HisntsretonbsbttyStiSgbtsDiBbitiatsboiabsSuaikoikeggiie3SESS3SS38833)88938ãgxk3k88G8tuxðngsbss5ixqsgbsyiiidiassirie 11

Hình 1.2 Quá trình sinh san hữu tinh ở Pythium, liên quan tới sự tiếp xúc giữa túi đực

và túi noãn dé tạo ra bào tử tTỨng -©2¿©2¿+s2S22E22E2122112121212121121121212121 2xe2 11

Hình 2.1 Bồ trí vi sinh vat đối kháng với nam trên dia petri -2 2-2552 27

Hình 3.1 Kha năng gay bệnh của nắm Rhizoctonia spp., nam Fusarium spp và

Pythium spp trên cây con cà chua: R1 (A), R2 (B), F1 (C), F2 (D), F3 (F), F4 (ŒF), F5

(G), F6 (H), F7 (1), F8 (J), PI (K), P2 (L), P3 (M) và Đối chứng (N) - - 32

Hình 3.2 Khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật đất đối với nắm Ñjizocfonia

sp theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 3 NSC) -2¿222z+2z2zzzzzzze2 43

Hình 3.3 Khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật đất đối với nắm Ƒsariưm sp

theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 5 NSC) -2: 2¿22222222E222EczEzzxrrev 46

Hình 3.4 Kha năng đối kháng của các dòng vi sinh vật đất đối với nắm Pythium sp.theo trình tự từ mạnh đến yếu (thời điểm 60 GSC) 2 2¿2s+2E+2E+2E+ZE2zzzzzzez 48

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các dòng vi sinh vật lên hạt cà chua 7 ngày sau thí nghiệm(Lan 1) O - DT3 (A), CC - DTI (B), KT - DT4 (C), O - CC4 (D), KT - DD4 (E), O

—GGI fFJ, KT - ĐI 0G), Đôi chủng [TÚ caseaesiosesdsoirbnenbinbkesbigidkasiegioigsisgglissieasei 50

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các dòng vi sinh vật lên hạt cà chua 7 ngày sau thí nghiệm(Lan 2) O - ĐT3 (A), CC - DTI (B), KT - DT4 (C), O - CC4 (D), KT - DD4 (E), O

—CC3 (F), KT - ĐDI (G), Đối chứng (H) -2-22-©22222222E+222+2EEz2EEerxrerxrrrer 51

Hình 3.7 Ảnh hưởng của các dòng vi sinh vật lên hạt cà chua 7 ngay sau thí nghiệm

(Lần 3) O - ĐT3 (A), CC - DTI (B), KT - ĐT4 (C), O - CC4 (D), KT - ÐĐD4 (E), O

—CC3 (F), KT - ĐDI (G), Đối chứng (H]) -. 2 2-©2222++22+2E22EE+EE2Exzrxrrrrerxee 51

Hình 3.8 Kha năng đối kháng của 3 dong vi sinh vat với 3 loại nam gây bệnh lở cỗ rễ

ở cây họ cà trên hạt cà chua 7 ngày sau thí nghiệm 5 2255-5222 2S22£+2<<+£+sc<ss 53

GIỚI THIEU

Đặt vần đề

Cây họ cà (Solanaceae) giữ một vị trí quan trọng trong việc cung cấp rau củ,làm cảnh, làm thuốc ở Việt Nam Nhiều loài cây họ cà như ớt, cà chua, cà tím, khoaitây, thuốc lá được trồng và sử dụng phô biến Do sự gia tăng về dân số dự kiến sẽ đạt 9

tỷ người vào năm 2050 (Godfray và ctv, 2010), điều này sẽ tạo thêm áp lực đối với sảnxuất lương thực Đặc biệt, những vấn đề liên quan đến rau củ quả nhóm thực phẩm

chứa niều chất xơ và vitamin luôn được quan tâm Tuy nhiên, việc sản xuất còn gặp

nhiều hạn chế, một trong những nguyên nhân chính là ảnh hưởng của các loại bệnhhại Trên cây họ cà nam và vi khuan gây hại làm xuất hiện nhiều bệnh như héo xanh,sương mai, thán thư, héo rũ Do tính chất thâm canh qua nhiều năm, tại các vùng sảnxuất nông nghiệp Việt Nam, sự tích lũy, lan truyền của các tác nhân gây bệnh trongnước tưới, cây giống không sạch bệnh và khí hậu nhiệt đới là những yếu tố tạo điềukiện thuận lợi cho sự phát triển của bệnh lở cô rễ, gây ra bởi các loại nam có phổ kýchủ rộng như Pythium sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp (Burgess va ctv, 2009).

Việc sử dụng thuốc hóa học liên tục dé phòng bệnh sẽ làm mam bệnh dễ hình

thành tính kháng, dễ phát sinh chủng mới và dư lượng thuốc hóa học tồn dư gây ônhiễm môi trường (Trần Văn Hai, 2009) Mặt khác, việc sử dụng thuốc hóa học cònlàm mất cân bằng hệ sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người, động vật va các visinh vật có ích Ngày nay, việc sử dụng các chế phẩm như phân bón, chất kích thíchsinh trưởng thực vật và tác nhân kiểm soát mầm bệnh có nguồn gốc sinh học cùng vớicác biện pháp quản lý cây trồng phù hợp là một lựa chọn hấp dẫn trong các hoạt độngnông nghiệp bền vững vì bản chất thân thiện với môi trường hoặc khả năng giảm thiểucác tác hai của hóa chất nông nghiệp (A desemoye va ctv, 2009; Carvalho, 2006)

Có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng vi sinh vật dé phòng trừ các bệnh hại donam gây ra Một số nghiên cứu đã ghi nhận được xạ khuẩn có khả năng ức chế một sốmam bệnh như: Fusarium oxysporum va Pseudomonas solanacearum (El-Abyad,1996), Phytophthora citricola (Haesler, 2008), Rhizoctonia solani (Sadeghi, 2012),

Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter,

Burkholderia, Bacillus va Serratia được su dụng rộng rai lam tac nhân kiém soat sinhhọc và thúc đây tăng trưởng thực vat (Joseph và ctv, 2007; Kumar và ctv, 2016.) Hiệnnay đã có một số sản phẩm thương mại như chế phẩm sinh học SH-BVI (Nguyễn ThịChúc Quỳnh và ctv, 2014), chế phẩm Nitragin, Azotobacterin, Photphobacterin (LêĐức Lâm, 2018) Nhưng trên đối tượng cây họ cà còn có những hạn chế nhất định và

cân được tiép tục nghiên cứu.

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Phân lập các vi sinh vật đất có khả năngkiểm soát nắm gây bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà” đã được thực hiện

Giới hạn đề tài

Định danh các mẫu nắm phân lập được qua quan sát bang đặc điểm hình thái

tan nam và bao tử

Định danh so bộ các dòng VSV phân lập được từ các đặc điểm hình thái và

phản ứng sinh hóa.

Đề tài được thực hiện với quy mô và điều kiện trong phòng thí nghiệm

Thực hiện khảo sát khả năng năng đối kháng của các dòng vi sinh vật trong đất

với nâm gây bệnh lở cô rễ trên hạt cà chua.

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Giới thiệu tổng quan về cây họ cà

Cây họ cả có tên danh pháp khoa học là Solanaceae, là một loại thực vật có hoa.

Tén khoa học của họ nay có nguôn gôc từ tiêng Latinh Solanum, nghĩa là “cây cà dược”.

Ở Việt Nam, họ Cà gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ, phân bé rộng khắp canước Một số loài được trồng dùng làm tực phẩm (cà tím, cà pháo, cà chua, khoai tây),gia vị (ớt), cây công nghiệp (thuốc lá) hoặc cây dược liệu

1.1.1 Sơ lược về cây cà chua

Cây cả chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ Ca

(Solanaceae) là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ Theo Somraj và ctv(2017) cùng với Nalla và ctv (2016) thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phôbiến và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cậnnhiệt đới và ôn đới.

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO), năm 2020 diện tích trồng cả chua trênthé giới vào khoảng 5.051.983 ha với sản lượng 186.821.216 tan La cây rau có giá trị,

có sản lượng chiếm 1/6 tổng sản lượng rau hàng năm trên thế giới và luôn đứng ở vị trí

số 1 về sản lượng Cà chua có tầm quan trọng chi sau khoai tây ở nhiều quốc gia vàđứng thứ nhất về rau được bảo quản, chế biến và cả mục đích sử dụng tươi

1.1.2 Sơ lược về cây khoai tây

Khoai tay có tên khoa học là Solanum tuberosum L., thuộc ho Ca (Solanaceae)

có nguồn gốc xuất xứ ở dãy Andes Khoai tây được trồng lâu đời ở Nam Mỹ va đượcđưa vào châu Âu từ thế kỉ 16 Sau đó, khoai tây được trồng ở nhiều nơi và dần trởthành cây lương thực chủ đạo Ở nước ta, khoai tây được du nhập vào từ người Pháp từ

Theo tô chức nông lương thế giới (FAO) năm 2020 diện tích trồng khoai tâytrên thế giới vào khoảng 16.494.810 ha với sản lượng 359.071.403 tan.

1.1.3 Sơ lược về cây ớt

Cây ớt (Capsicum annuum L.) có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu

Mỹ Cây ớt có mặt ở nước ta được du nhập từ Trung Quốc, Ấn Độ Diện tích phân bốkhá rộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt cònphân tán.

Theo tô chức nông lương thế giới (FAO) cây ớt được xem là một trong nhữngcây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới Năm 2020, diện tích trồng ớt thế giới vàokhoảng 2.069.990 ha cho mục đích lay quả tươi với sản lượng 36.136.996 tan

1.2 Tong quan về bệnh lở cỗ rễ trên cây họ Cà

Bệnh lở cô rễ cây họ cà do nắm Rhizoctonia solani gây ra là chủ yếu Tuynhiên, tùy điều kiện thời tiết, chế độ canh tác có thê do nhiều loại nắm có trong đất gây

ra như Pythium, Fusarium (Burgess va ctv, 2009)

1.2.1 Triệu chứng bệnh lở cô rễ trên cây họ Cà

Bệnh phát triển gây hại làm ảnh hưởng lớn đến số cây trên diện tích gieo trồng,đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Một số triệu chứng bệnh hại do bệnh lở cô rễ

đôi với cây họ cà như: chêt rạp cây con, thôi rễ, thôi gốc, thối thân, thối quả

Chết rạp cây con: cây con có thé bị hại trước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất.Trước khi nảy mầm, bệnh gây chết đỉnh sinh trưởng Sau khi nảy mam, nam gây ra cácvết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, phần thân non bịthat lai, trở nên mém, cây con bi đô gục và chết.

Cây lớn cũng bị hại nhưng chủ yếu chỉ bị hại ở phần vỏ Bệnh có thê xuất hiệngây hại ở cả cây trưởng thành gây hiện tượng thối rễ hoặc thối gốc thân khi điều kiệnngoại cảnh thích hợp cho nam phát triển Ở gốc cây, triệu chứng ban dau là vết lõmmàu nâu hoặc hơi nâu đỏ sát mặt đất, vết bệnh có thê lan rộng quanh gốc thân và lanxuống rễ, gốc thân bị lở loét

Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cô rễ, phần gốc sát mặt đất Khi mới xuất hiện,nếu quan sát kỹ có thé thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phan vỏ này bịrộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cô rễ hoặc gốc cây Dần dần phần vỏnày khô teo lại, khi gặp trời mưa hoặc độ 4m cao sẽ bị thối nhũn, bong ra, trơ lại phầnlõi gỗ của cây có màu thâm đen, cây sẽ héo đần và chết.

1.2.2 Tống quan về nắm Rhizoctonia spp gây bệnh lở cỗ rễ

1.2.2.1 Vị trí phần loại

Chi Rhizoctonia thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes,

bộ Cantharellales, ho Ceratobasidiaceae (Theo Sneh va ctv, 1991)

1.2.2.2 Dac diém Rhizoctonia spp

Theo Đỗ Tan Dũng (2013) nam Rhizoctonia spp có đặc điểm chung là: tan namphat triển ban đầu có màu vàng nâu, nâu vàng nhạt, về sau chuyển sang nâu sam Tannắm phát triển với tốc độ nhanh, mịn áp sát bề mặt môi trường hoặc xốp Ở giai đoạn

vô tính, nam phát triển ở dạng sợi, tạo hạch Sợi nam khi còn non không màu, khi giảchuyền sang mau nâu do sự tích lũy sắc tố nâu Soi nam da bào phân nhánh xiên tạogóc 45” — 90° tại vị trí phân nhánh có vách ngăn và hơi thắt lại (Papavizas và ctv,1975) Theo Van Bruggen và Arneson (1986) đã xác định: vách của sợi nam có màutrang đến nâu, chiều rộng của sợi nam là từ 4 — 5 um và phân nhánh ở góc phải Trên

mô kí chủ hoặc vách ống nghiệm nuôi cây, sợi nắm đôi khi mọc ra những tế bào ngắn,

phình to và phân nhiều nhánh Các tế bào đó có thể liên quan đến quá trình gây bệnhhoặc tới giai đoạn sinh sản bào tử (Ou, 1985) Rhizoctonia solani có 3 loại soi nam: sợinam bò (runner hyphae), sợi nam phân nhánh (lobate hyphae) và các tế bào dạng chuỗi(moniloid cells) (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch Hạch nắm khi còn non có màutrắng nhưng khi về gia có thể có màu nâu, nâu đen, nâu sám, trên vỏ có lông Hạchnam có hình dang phức tap, có khi hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồilõm (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Đường kính hạch nam nhỏ hơn 1 mm đến vài em(Menzies, 1970) Những hạch màu tối được sinh ra nhiều trên bộ phận cây bị nhiễmbệnh, cấu trúc hạch được hình thành từ sợi nấm và là nguồn bệnh cho vụ sau (Van

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nam Theo Masumoto và ctv(1933), nhiệt độ tối thích với sự phát triển của nam là 28 -31”C, ngưỡng pH tối thiểu

là 2, tối thích là 5 — 7 và tối đa là 8 Theo Thomas (1925), Richter và Schneider (1953)

các mau Rhizoctonia solani phân lập từ các khu vực có nhiệt độ cao hoặc các mẫu

phân lập từ nhà lưới có mức nhiệt độ sống tối thích cao hon so với các mẫu R solani từcác vùng đất lạnh Nắm R solani sống tốt trên 3 loại đất: thịt pha cát, đất thịt min và đấtsét pha cát Trong đất, nam có thé tồn tại ở nhiệt độ từ 5 — 42°C (Parmeter, 1970)

Trong phòng thí nghiệm, nam R solani có thé mọc tốt trên nhiều loại môitrường khác nhau như PGA, PDA, PGB Trên môi trường PDA nam sinh trưởng ratnhanh, sau 7 ngày nuôi cấy, đường kính tan nam lên đến 8,12 cm (Võ Thị Dung vàctv, 2017).

1.2.2.3 Hình thức sinh sản

Bào tử hậu ít gặp, chỉ phát sinh khi có độ âm cao Sinh sản hữu tính tạo đảm đơnbao, không mau, hình bầu dục, có từ 2 — 4 bào tử đảm, hình trứng hoặc hình bầu dục đẹp

Ở nước ta chưa thay dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998)

1.2.2.4 Điều kiện phát triển và gây hại

Nhiệt độ cho sự xâm nhiễm của nam có thé xảy ra là 23°C — 25°C, nhưng lytưởng nhất là 30°C — 32°C, am độ từ 96% — 97% Ở 32°C nam xâm nhiễm vào trongvòng 18 giờ (Võ Thanh Hoàng, 1993) Ở nhiệt độ thấp hơn 10°C và cao hon 38°C sợinam ngừng phát triển

Theo Nguyễn Công Thuật (1995), nhiệt độ và độ âm là điều kiện cho bệnh phát

triển và lây lan Biên độ nhiệt ngày đêm lên cao cũng có lợi cho bệnh phát triển

Theo Võ Thanh Hoàng (1993), bệnh xảy ra nặng ở ruộng bón nhiều phân đạm.Bón phân lân cao cũng làm tăng bệnh, trong khi bón nhiều kali sẽ giảm bệnh Natri cóđặc tính ức chế sự phát triển của nam Do đó vùng bị nhiễm mặn, có hàm lượng natritrong đất cao, ít bị bệnh hơn so với vùng nước ngọt (Phạm Văn Kim, 2015)

thé sống 7 tháng hoặc khi thiếu thành phần dinh dưỡng hay hóa chất độc hai (Võ

Thanh Hoang, 1993; Ghaffar, 1993) Nắm Rhizoctonia sp có thé sống sót qua thờigian dài trong trường hợp không có cây ký chủ bằng nguồn dinh dưỡng từ các chất

hữu cơ đang phân hủy.

1.2.2.6 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Nắm có khả năng lan truyền theo 2 chiều: thắng đứng hoặc ngang Lan truyềntheo chiều thăng đứng chủ yếu là sợi nam, vết bệnh phát triển dần lên lá, chồi và các

bộ phận khác Bệnh lan truyền theo chiều ngang từ nơi này sang nơi khác bằng hạchnam và sợi nam, sự lan truyền chủ yếu nhờ dòng nước, hạch nam bị nước cuốn đi gặp

kí chủ thích hợp sẽ bám vào hay do nước mưa (Tô Thị Thùy Hương, 1993) Nắm đượclan truyền chủ yếu thông qua hạch nam, vết bệnh thực vật hoặc trong đất Khi hạchnam bám vào be lá sẽ nảy mam ra sợi nam rất nhỏ, sợi nam có thé xâm nhập trực tiếpqua biểu bì hay khí không Nó được lây lan bởi gió, nước hoặc thông qua các hoạtđộng nông nghiệp như làm đất và vận chuyền hạt giống (Kareem và ctv, 2018)

Sự xâm nhiễm của R solani bắt đầu khi sợi nắm hay tản nam từ một hạch nắmnảy man bắt đầu phát triển hướng về ky chủ phù hợp như là sự thu hút của các hóachất được tiết ra ở rễ, amino acids, đường, acids hữu cơ và phenol của cây trồng

1.2.3 Tông quan về nam Fusarium spp gây bệnh lở cỗ rễ

Fusarium spp là chi lớn nhật trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ky

sinh trên nhiêu cây trong, cây ăn trái và rau Fusarium spp cũng sản xuât một so chat

độc tiết vào mạch dẫn có thể làm cây chủ gây héo rũ Có hệ sợi nâm phân nhánh, có

vách ngăn, sợi nam thường không mau, chuyên mau nâu khi gia.

Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, vách ngăn có lỗthủng đơn giản ở giữa Trong một tế bao có một nhân hoặc nhiều nhân Vách tế bàobằng chitin, glucan Nam sống hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vat, gặp phổ biến trongđất, cũng gặp trên các vật liệu cellulose (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1982).

Nam Fusarium spp phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA ở nhiệt độ25°C và hình thành tản nam có hình thé tơi xốp như bông hoặc bằng phẳng hoặc lanrộng trên môi trường nuôi cay Mat trén cua tan nắm có thé có mau trắng, kem, vàng,vàng cam, đỏ, tím hồng hoặc tím Mặt đưới nó có thê không màu, vàng cam, màu đỏ,

mau tia sam, hay mau nau (Seifert, 1996).

1.2.3.3 Hình thức sinh sản

Fusarium có 2 hình thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính Do

thiếu giai đoạn sinh sản hữu tinh trong vòng đời nên người ta gọi chung là nam khônghoàn chỉnh hay nam bat toàn (Nguyễn Văn Ba va ctv, 2005)

Sinh sản sinh dưỡng

Soi nam: Từ 1 sợi nam riêng rẽ, khi gặp điêu kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và

phân nhánh thành hệ sợi nam.

Bao tử hau (bao tử mang day, bao tử áo: Bảo tử hậu là những tế bao hơi tròn, có tếbao chất được cô đặc lại (Lin và Heitman, 2005), có màng dày bao bọc (Lê Xuân Phương,2001), thính thoảng có bào tử hậu với vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố (Seifert, 1996)

Bảo tử hậu có thể nằm ở giữa SỢI nam hoặc ở đầu tận cùng của nó (Lin vàHeitman, 2005; Lê Xuân Phương, 2001); có thể ở dạng đơn lẻ, dạng cặp đôi, dạngchuỗi hay dang cụm Ở các loài như F solani và F oxysporum, bao tử hậu thường ởdạng đơn, đôi, thỉnh thoảng dạng ba và ít khi có dạng cụm Một số loài Fusarium có tạobao tử hậu như F chlamydosporum, F napiforme, F oxysporum, F semitectum, F.

solani, F sporotrichoides, F equiseti, F tricinctum (Gagkaeva, 2008; Seifert, 1996).

Sinh sản vô tính

Nấm Fusarium sản sinh ra 3 loại bào tử vô tính: bào tử đính lớn(Macroconidia), bao tử đính nhỏ (Microconidia) và bao tử vách dày (hậu bào tử -

Chlamydospores) (Cao Ngọc Điệp va ctv, 2009).

Bào tử đính lớn (bào tử lớn): Bảo tử trong suốt, được hình thành từ thể bìnhtrên cành bào tử có nhánh hay không có nhánh (Burgess và ctv, 2009) Bào tử lớn có

kích thước 3 — 8 x 11 — 70 um Dai bào tử có hình bán nguyệt, hình lưỡi liềm Hầu hếtcác loài Fusarium có bào tử lớn từ 3 — 7 vách ngăn,

Bao tử đính nhỏ (bao tử nhỏ): Kích thước 2 — 4x 4— 8 um, bao tử có 0 — 1 vách

ngăn (đặc biệt có loài có 2 — 3 vách ngăn) Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như:hình cầu, hình gần cầu, oval, hình cầu với một đầu nhọn, hình thoi, hình quả thận, hìnhhạt chanh, hình liềm, hình trứng, hình trứng ngược, hình chùy (Gagkaeva, 2008)

Các bảo tử vách dày thường có dạng hình tròn, có thành bào tử dày do các sợi

nắm tạo thành loại bào tử này thường có 3 đến 5 ngăn, chúng được sinh ra trong cácdai bao tử hoặc xen g1ữa các sợi nam gia

1.2.3.4 Điều kiện phát triển và gây hai

Fusarium có thê tồn tại trong đất dưới dạng bào tử áo qua thời gian dai, bào tử

áo có thé lưu tồn trong đất từ 15 — 20 ngày Nhiệt độ thích hợp cho nam phát triển là

25 — 30°C Bệnh lây lan qua thân rễ, dat bị nhiễm bệnh và truyền qua giống, ngoài sựlây lan thứ cấp của bệnh có thé được thực hiện qua nguồn nước và cơ gIới Fusariumthường tan công cây trồng dé dang khi bị thiếu ánh sáng

1.2.3.5 Sự tồn lưu

Các tác nhân gây bệnh héo Fusarium tồn tại đưới dang bảo tử hậu trong đất quathời gian dai Bao tử hậu có hình tròn, là các bao tử một tế bao với vách tế bào day và

có sức chống chịu cao, được hình thành trong mô bệnh Các tác nhân gây bệnh héo

Fusarium cũng có thê có mặt ở vỏ rễ một số cây không phải là ký chủ, ké cả cỏ dai vàcây trồng Bào tử hậu hình thành trong vỏ rễ khi cây chết (Burgess và ctv, 2009)

1.2.3.6 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Sợi nắm và bào tử vô tính nảy mầm trong tàn dư cây bệnh và đất xâm nhiễmvào rễ con còn non và lan dần vào các mạch xylem Nắm bệnh sau đó sẽ phát triểntrong mạch xylem và lan lên hệ thống mạch dẫn trong thân Quá trình này gây phảnứng của cây, tạo ra các hợp chất phenol và thể sần có màu nâu Những hợp chất nàygây hiện tượng hóa nâu của mạch dẫn, một dấu hiệu dé nhận thấy của bệnh héo khi cắtngang thân Hiện tượng tắc mach xylem làm giảm lượng nước di chuyền lên cây,khiến cho cây bệnh bị héo rồi chết (Burgess và ctv, 2009)

Pythium không còn được coi là nam thực, thay vào đó, chúng được phát hiện có

quan hệ họ hàng gan với tảo hon (Kageyama và ctv, 2014) Phần lớn Pythium sốngtrong đất, một vài loài liên quan tới nắm rễ, hiện điện trong nước như những thực vật

hoại sinh và một số loài có thể sống ký sinh trên thực vật hay động vật sống dưới

nước Pythium hiện diện thông thường trong đất canh tác hơn là ở đất tự nhiên, nhất làcây con trong vườn ươm mát hay vườn rau Pythium có phé ký chủ rộng, có loài gâyhại trên nhiều loại cây trồng và cũng có loài chỉ gây hại trên một loại ký chủ nhưPythium buismaniae (Plaats và Niterink, 1981).

Pythium so với lớp nam that có nhiều đặc điểm hình thai và chu kỳ sống tương

tự nhau, tuy nhiên về mặt di truyền học và cơ chế sinh sản thì khác nhau (Erwin vàRibero, 1996) Việc sắp xếp Pythium vào giới Chromista (Cavalier và Smith, 1986) đãchứng minh bằng rất nhiều đặc trưng bao gồm sự biến đổi trong con đường tiến hóa

(Hendrix, 1973), hình thành động bào tử có lông roi không đều, sự chiếm ưu thế của

giai đoạn lưỡng bội trong chu kỳ sống (Erwin và Ribero, 1996) và sự hiện điện của glucans tốt hơn chitin trong vách tế bào Ngoài ra Pythium sp còn có các lông roi

B-được sinh ra từ bọc bào tử qua sinh sản vô tính và sinh bao tử trứng qua sinh sản hữu

tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007).

Các loài Pythium spp thường tao ra rất nhiều sợi nam bông xốp màu trắng trênmôi trường PDA Một số loài Pythium mọc rất nhanh, và có thé che kín một đĩa PDA

đường kính 90 mm trong vòng dưới 2 ngày (Burgess và ctv, 2009).

1.2.4.3 Hình thức sinh sản

Sinh sản vô tính

Hình 1.1 Du động bào tử Pythium được giải phóng qua bọc gia trong quá trình sinh

sản vô tính (Nguôn: Burgess, 2009)

Theo Burgess va ctv (2009), Pythium sinh sản vô tính tạo thành các cau trúc gọi

là bào tử động, nơi hình thành và giải phóng du động bào tử Các bọc bảo tử động của

Pythium được hình thành ở đỉnh hoặc đoạn giữa các sợi nam, hình tròn (hình cầu) hoặchình sợi (như sợi nam phinh ra)

Sinh san hữu tính

túi đực

noãn cầu (bên «sees dh — \

trong tui noãn) Ạ —

Hình 1.2 Quá trình sinh sản hữu tính ở Pythium, liên quan tới sự tiếp xúc giữa túi đực

va túi noãn dé tạo ra bào tử trứng (Burgess, 2009)

Pythium sinh san hữu tính có sự hình thành các túi noãn và túi đực (Burgess va

ctv, 2009) Túi noãn chứa noãn cầu và mỗi noãn cau chứa một nhân Túi đực chứa đầy

từ nhiều sợi nam khác nhau, chúng ngăn cách với phan còn lại bằng một vách ngăn.Túi tinh hình trụ và túi noãn hình cầu Từ túi tinh mọc ra những mẫu nhỏ nối với túinoãn, từ đó dồn nội nhũ vào túi noãn dé thụ tinh và hình thành hợp tử noãn (Oospore).Hợp tử noãn nghỉ trong một thời gian, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm cho rasợi nắm ngắn và sau đó phát triển thành bào tử vô tính (Võ Thị Thu Oanh, 2007).

1.2.4.4 Điều kiện phát triển và gây hại

Bao tử là cấu trúc cơ bản dé sinh tồn của hầu hết các loài Pythium Các loàiPythium thường sản sinh bọc bào tử và du động bảo tử trên môi trường thạch nước cất

(WA) hoặc PCA sau khi đồ nước ngập môi trường Trạng thái sốc với nhiệt độ thấp (5

— 10°C trong khoảng 2 giờ) có thể giúp cho việc sản sinh bọc bào tử ở Pythium(Burgess va ctv, 2009).

Hon 330 loài Pythium đã được xác định cho đến nay trong đó có nhiều loài gâybệnh cho cây trồng, bao gồm bệnh chết cây, thối rễ, thối cổ rễ, thối mềm và thối thântrong các hệ thống sản xuất khác nhau như vườn ươm, nhà kính và ruộng nông nghiệp(Redekar và ctv, 2019; Weiland và ctv, 2020; Sharma và ctv, 2020).

Pythium có thé gây chết cây con, nhưng hiếm khi gây chết cây trưởng thành.Tuy nhiên, chúng có thể gây thối rễ con trầm trọng và cản trở quá trình hấp thu chấtdinh dưỡng, khiến cây còi cọc, hơi vàng và giảm năng suất (Burgess và ctv, 2009)

Khi cây dang ở giai đoạn hạt hoặc cây con, sự lây nhiễm của các loài Pythium gây ra

hiện tượng chết héo trước và sau khi mọc, làm thối hỏng hạt và cây con trước khi mọc

và sau khi cây mọc lên khỏi bề mặt đất Ngoài ra, các cây trưởng thành bị nhiễm bệnhcũng được phát hiện có các triệu chứng thối rễ Pythium spp chủ yếu anh hưởng đếncác mô còn non, chưa phát triển bất kỳ lớp bảo vệ nào Do đó, sự lây nhiễm chỉ giớihạn ở hạt giống, cây con và rễ non Cây con sau khi bị nhiễm bệnh thường đi kèm với

các triệu chứng như giảm sinh trưởng, héo, di màu đen hoặc nâu, và thối rễ.

1.2.4.6 Sự lan truyền và xâm nhiễm

Pythium spp sản sinh ra các bao tử di chuyển được, hay còn gọi là du động bào

tử, có vai trò rất quan trọng Đây cũng là đặc điểm để phân biệt những nắm này với

nam thực trong giới Nam Du động bao tử vô tính tạo điều kiện cho những nam nàylan truyền trong đất ướt và nước tưới (Burgess và ctv, 2009)

Trong dat ướt, du động bào tử được thu hút tới đầu rễ con, ở đó chúng tao ra

các ống mam (sợi nam còn non) xâm nhập qua đầu rễ con và khởi đầu quá trình làm

thối rễ (Burgess và ctv, 2009)

1.3 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng

1.3.1 Vi khuẩn Bacillus sp

1.3.1.1 Vị trí phan loại

Chi Bacillus thuộc giới Bacteria, ngành Fimicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ

Bacillaceae (Theo Ferdinand Cohn, 1872)

1.3.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus sp

Bacillus sp có hình thái đa dang bao gồm: Hình cầu, hình trụ hoặc elip, phổbiến 14 hình que Vi khuẩn Gram dương có khả năng di chuyển nhờ tiêm mao Kíchthước cơ thé từ 1,0 — 1,2 um x 3,0 — 5,0 um (Gordon va ctv, 1973) Bacillus sp có khanăng sinh bào tử, nhờ đó nó có thé tồn tại trong thời gian dài dưới các điều kiện khác nhau(Vos và ctv, 2009) Qua kính hiển vi Bacillus sp đơn lẻ có hình dạng như chiếc que, cóbao nhay (giác mạc) cấu tạo bởi polypeptit (Trần Thị Thu Hiền, 2010) Phần lớn tế bàonày có bảo tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc có dạng hình tròn, không đềuhay phân tán, đường kính khuẩn lạc từ 3 — 5 mm, màu vàng xám, ria có răng cưa, sau |

— 4 ngày khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu Tuy nhiên dạng khuẩn lạc này tùy thuộcvào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, độ âm, nhiệt độ, không khí

(Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).

Bacillus phân bố rộng rai trong các hệ sinh thái tự nhiên Nhóm Bacillus sp.thường được tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều

kiện hiếu khí hoặc ky khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khitrao đổi khí trong quá trình trao đổi chat.

1.3.1.3 Tính đối kháng của Bacillus sp

Nhiều loài hoặc chủng Bacillus sp được chứng minh là sản sinh kháng sinhhoặc enzyme, với hơn 60 dạng chất kháng sinh khác nhau đã được xác định (Compant

và ctv, 2005).

Theo Intana và ctv (2008), nhiều kết quả nguyên cứu cho thay vi khuẩn Bacillus

sp có khả năng sản xuất một lượng lớn các chất kháng sinh như: gramicidin S,polymyxin, tyrotricidin, bacilysin, chlotetaine, 1turin A, mycobacillin, fungistatin va

subsporin có thê kiêm soát các bệnh cây trông.

Các hoạt chất kháng nắm bệnh của vi khuẩn Bacillus được sản sinh bởi Bacilluspumilus có khả năng hạn chế nắm bệnh Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum

và Sclerotium rolfsii (Melo va ctv, 2009), surfactin và fengycin lipopeptide của

Bacillus subtilis có tac dụng như một chất tăng khả năng kháng bệnh hệ thống cho câytrồng (Ongena và ctv, 2007)

Thuốc sinh học nguồn gốc từ Bacillus sp có thể phòng trừ nhiều loại bệnh nhưsương mai hại nho, cà chua; phấn trang, đốm vàng hại dưa chuột; than thư hại xoài;đạo ôn, lem lép hạt lúa; héo vàng, chết cây con lạc (Nguyễn Mạnh Chinh, 2010)

Trong nước, một số nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus sp trong phòng trừsinh học bệnh cây trồng: Bacillus amyloliquefaciens có hiệu quả đối với bệnh thối củsừng do vi khuẩn R solanacearum (Trần Văn Nhã, 2011) Vi khuẩn B brevis có hiệu quakiểm soát bệnh vàng lá thối củ gừng do nắm Fusarium spp (Trần Thị Thúy Ai, 2011)

Theo nghiên cứu của Solanki và ctv (2012), đã tim ra 2 chủng Bacillus (B.

amyloliquefaciens MB101 và B subtilis MB14) được xác định là đối kháng mạnh (thinghiệm trên nam Rhizoctonia solani) giảm tỉ lệ bệnh tương ứng 55,7% và 41,74% có

thé được sử dụng dé quản lý bệnh lỡ cô rễ trên cả chua

Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Thành Trung và ctv (2013), vi khuẩnBacillus với chủng Bacillus amyloliquefaciens sub sp plantarum sp 1901 phân lập tại

rừng Quôc gia Hoàng Liên là chủng có tiêm năng trong sản xuât chê phâm sinh học đê

thương mại với hiệu quả cao.

Theo Thái Thị Huyền và ctv (2014), vi khuân Bacillus sp chủng S20D12 làmtăng tỉ lệ mọc 10,8% tại thời điểm 2 tuần sau gieo Tat cả các vi khuẩn lây nhiễm đềulàm tăng chiều cao cây Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng vi khuan Bacillus sp chủngS20DI12 là vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng cây cà chua và hạn chế bệnhhại tốt nhất, đây là chủng tiềm năng trong sử dụng kích thích sinh trưởng và hạn chếbệnh lở cô rê, thôi trắng thân cà chua.

Chế pham từ vi khuẩn Bacillus trừ bệnh hại cây trồng như nam Rhizotonia

solani, Fusarium sp., Pyricularia oryzae (Kumar va ctv, 2017).

Trong nghiên cứu của Jangir va ctv (2018), chủng vi khuẩn Bacillus sp (B44)được phát hiện là nguồn tiềm năng tăng hoạt tinh sinh học có thé được thực hiện chohoạt động đối khang của nó đối với nam Fusarium oxysporum ƒ sp lycopersici (hiệulực 35,9%) Ngoai ra, nó có thể thúc day tăng trưởng thực vật kích thích sự phát triểncủa cây ca chua.

1.3.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp

1.3.2.1 Vị trí phần loại

Chi Pseudomonas thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Grammaproteobacteri, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadaceae (Theo Migula, 1894).

1.3.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas sp

Vi khuẩn gram âm, hình que, lông roi thường ở một đầu, kích thước 0,5 — 0,8

um x 1,5 — 3,0 um Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của Pseudomonas là từ 35°C —30°C va chúng có thé phát triển ở pH 4 — 10 Một đặc tính phé biến của Pseudomonasspp là khả năng phát sáng dưới điều kiện của tia UV Mật độ và tính đa dạng củaPseudomonas spp trong đất phụ thuộc vào thành phan và cấu trúc đất, nhiệt độ đất, độ

âm và sự cạnh tranh của các vi khuân khác trong đất (Nguyễn Thị Ngọc Ánh, 2015)

1.3.2.3 Tính đối kháng của Pseudomonas sp.

Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas florescens, Pseudomonasputida đều thuộc chi vi khuẩn phát huỳnh quang (Fluorescent pseudomonas) và lànhóm vi khuan đối kháng với các mầm bệnh quan trọng trong đất (Palleroni, 1984)

Pseudomonas spp là những vi khuẩn cộng sinh tốt ở rễ cây trồng và là nhữngtác nhân phòng trừ sinh học Pseudomonas sản xuất kháng sinh ( O’Sullivan vàO’Gara, 1992 ) và chất hoạt dich (biosurfactant) Pseudomonas chủ yêu sống trong rễ

và thân ngầm của cây trồng Chúng được ghi nhận là có khả năng kiểm soát các bệnh

do nam, vi khuẩn, virút có nguồn gốc từ đất, hạt giống và không khí

Chi vi khuẩn Pseudomonas sống ở vùng rễ bao gồm Pseudomonas fluorescens,Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia và Pseudomonas aureofaciens, có tac

dụng phòng trị hầu hết các tác nhân gây bệnh trong dat như nam Pythium,Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia và Gaeumannomyces Khi ap dụng trên hạt

giống và tưới rễ thì giúp hạn chế được bệnh chết héo cây, thối nhũn đồng thời giúp câytăng trưởng và tăng năng suất cho các mùa trồng (Agrios, 1997)

Pseudomonas fluorescens 94/96 tạo ra Visosinamid là một Lypopetid vòng có

khả năng kiểm soát Pythium ultimum (Phạm Mỹ Liên, 2004)

Pseudomonas fluorescens có thé ức chế sự phát triển khuẩn ty nam

Phytophthora capsici gây bệnh thối rễ ở tiêu đến 72% Các chất kháng sinh do

Pseudomonas fluorescens tiết ra còn có tác dụng ức chế sự nảy mam của bao tử nắmPhytophthora capsici đến 90% (Nguyễn Trọng Thể, 2004)

Khi mam bệnh xuất hiện, Pseudomonas fluorescens làm tăng chiều dai của cây,trọng lượng khô của chỗi và rễ Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng CW2 phân lập cókhả năng ức chế Pythium ultimum va Rhizoctonia solani Kuhn trong ông nghiệm vàtrong điều kiện nhà kính (Salman, 2010)

Theo nghiên cứu của Alsudani (2020) đã sử dung Pseudomonas fluorescens đề

ức chế Rhizoctonia solani va Fusarium solani với tỷ lệ phần trăm ức chế nằm trongkhoảng 72,9 — 77,1%va 69,5 — 70,3% đối với R solani va F solani tương ứng sau 7ngày ủ Tác dung của dịch lọc P fluorescens được tăng lên va cũng làm tăng kha nang

ức chế sự phát triển của nam đang nghiên cứu, dịch lọc P fluorescens với ty lệ phầntrăm ức chế dao động trong khoảng 86 — 87% và 83 — 83,5% đối với R solani và F.solani tương ứng ở nồng độ dịch lọc 20% Tỷ lệ hạt nảy mam dat 80% ở nghiệm thức

P fluorescens.

1.3.3 Xa khuẩn Streptomyces

1.3.3.1 Vi tri phan loai

Chi Streptomyces thuộc ngành Actinobacteria, lớp Streptomycetaceae, bộ Actinomycetales, ho Streptomycetaceae.

1.3.3.2 Đặc điểm của vi khuẩn Streptomyces

Streptomyces bao gồm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình sợi, tạo ra các sợinam sinh dưỡng phát triển tốt (đường kính từ 0,5 — 2,0 pm) với các nhánh Chúng taothành một chất nền phức tạp hỗ trợ việc loại bỏ các hợp chất hữu cơ từ chất nền củachúng Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của Streptomyces từ 25°C — 30°C và chúng

có thé phát triển ở pH 6,5 - 8

1.3.3.3 Tính đối kháng của Streptomyces

Các chủng Streptomyces đã được sử dụng rộng rãi trong việc ngăn chan va

kiểm soát các mam bệnh gây hại cây trồng như: chủng S hygroscopicus đôi kháng với

R solani gây bệnh thôi rễ cây đậu (Rothrock va Gottlieb, 1984)

Vai trò của các chủng xạ khuẩn Streptomyces trong việc kiểm soát các nambệnh có nguồn gốc từ dat đã được nghiên cứu và chứng minh trên các nam Fusarium

spp (Gopalakrishnan và ctv, 2011), Phytophthora spp (Shahidi Bonjar va ctv, 2005),

Rhizoctonia spp (Sadeghi va ctv, 2012).

Trong diéu kién In vitro, chung xa khuẩn Streptomyces olivaceus — 115 có hoạttinh ức chế sự phát triển của nam R solani và phương pháp khuếch tan trên dia petricho thấy chủng xạ khuẩn trên có khả năng sản xuất các chất chuyền hóa kháng namngoại bao ức chế hoàn toàn sự phát triển của R solani (Shahidi Bonjar và ctv, 2005)

Một sô nghiên cứu khác cũng chứng minh Streptomyces có tiêm năng đôi kháng

voi Fusarium oxysporum trong cả điêu kiện nhà kính va đông ruộng (Gopalakrishnan

và ctv, 2011).

Kết quả nghiên cứu của Passari va ctv, (2015) cho thay chủng xạ khuanStreptomyces sp PTL2 tạo ra hợp chất HCN ức chế sự phát triển của nam R solani

Theo Singh và ctv (2016) đã báo cáo các chủng S coelicolar, S girseus, S.

albus, S antibiotics và S champavatii có khả năng đối kháng với nam R solani gâybệnh trên cây cà chua.

Thử nghiệm nhà kính chi ra rằng việc xử lý hạt giống bằng chiết xuất etylaxetat (AEA) của Steptomyces spp., làm giảm đáng kế mức độ nghiêm trọng của bệnh

và thúc đây tăng trưởng của cây cà chua từ 72,6 — 83,0% so với đối chứng bị nhiễmbệnh (63,4%) và thuốc diệt nấm hóa học (76,2%) Theo đó, chủng Steptomycescarpaticus EGY-S7 cho hiệu quả phòng trừ cao hơn (83,0%) cũng như tăng đáng kểsinh khối của cây giống cà chua (chiều cao cây, số lá, trọng lượng tươi và khô) so vớiđối chứng dương (với đất bị nhiễm bệnh) Ngoài ra, nó vượt trội so với các chủngkhác, trong đó tổng số polyphenol, polyphenoloxidase và enzyme peroxidase đượctăng cường đáng kể trong cây giống cà chua so với đối chứng không bị nhiễm bệnh

(Abdel — Aziz và ctv, 2021).

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Thu thập, phân lập và định danh bằng đặc điểm hình thái các mẫu nấm gây

bệnh lở cô rễ trên cây họ cà.

Thu thập, phân lập và định danh sơ bộ mẫu VSV có khả năng đối kháng phânlập từ trong đất (trên những ruộng có xuất hiện bệnh lở cổ rễ do nam gây ra)

Đánh giá tính đối kháng của các dòng VSV phân lập đối với nắm bệnh trongđiều kiện phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng VSV đối kháng mạnh với nam bệnhtrên hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2022 đến tháng 01 năm 2023

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật,khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP HCM.

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc

Dụng cụ: dia petri (đường kính 80 mm), ống eppendorf, bình lắc, ống nghiệm,

Pipet (GLISON, FRANCE), thước đo, dung cụ cấy

Các thiết bị gồm: tủ cấy khử trùng (2AC2 — 6E8, Esco, Singapore), Microwave,nồi hấp vô trùng autoclave, cân điện tử, bếp điện, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), tu say khử trùng (MC40L, ALP, Japan), may lắc, Máy Nanovue.

2.3.2 Môi trường, hóa chất dùng để nuôi cấy và phân lập nam

Hóa chất sử dụng: cồn 90%, Natri hypochlorite 1%, KOH 3%, dung dịch lụcMalachite 5%, HO, Peptone, Cao nắm men, Glycerol, K,HPO, khan, MgSO¿.7H;O,MgSO, 1,2%, Agar, bộ hóa chất nhuộm gram Cty Nam Khoa (Crystal violet, Lugol,Safranine, Alcohol).

Môi trường WA (Water Agar medium): Thanh phan môi trường gồm nước cất(1000 ml), Agar (20 g) Phương pháp điều chế: Hap khử trùng ở 121°C, trong 25 phút

Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar) Đây là môi trường dùng dé nuôicấy làm thuần nam Thành phần môi trường: Khoai tây (200 g), Agar (20 g), ĐườngGlucose (20 g), Nước cất (1000 ml) Hap khử trùng ở 121°C trong 25 phút

Môi trường PCA (Potato Carrot Agar): Dùng dé tăng hình thành bọc bào tử củaPythium Thanh phần môi trường: khoai tây (20 g), cà rốt (20 g), agar (20 g), nước cất(1000 ml) Hap khử trùng ở 121°C trong 25 phút

Môi trường KBA (King’B Agar): Thành phần môi trường: Peptone (20 g),Glycerol (10 g), K;HPO¿ khan (1,5 g), MgSO¿.7H;O (1,5 g), Agar (15 g), nước cat(1000 ml) Hap khử trùng ở 121°C trong 25 phút

Môi trường lỏng LB: peptone (10g), cao nấm men (5g), Nacl (10g), nước cat(1000 ml) Hap khử trùng ở 121°C trong 25 phút

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu thập và phân lập các mẫu nam gây bệnh lở cỗ rễ trên cây họ cà

2.4.1.1 Thu thập mẫu cây bệnh

Đối với mẫu cây bệnh: Thu thập 3 — 5 mẫu bệnh/ vườn có triệu chứng điểnhình của bệnh lở cổ rễ do nam gây ra trên cây họ cà tại 2 tỉnh Lâm Đồng và TP HồChí Minh (được ghi nhận là vùng thường xuyên xuất hiện bệnh lở cô rễ, đặc biệt vàomùa mưa) ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh (nam bệnh vẫn còn hoạt động) Thu

thập và bảo quản mẫu bệnh theo phương pháp của Roger và Dean (2005).

Sử dụng túi giấy dé giữ mẫu bệnh Đóng gói mẫu can thận tránh va đập và hơinước ngưng tụ Viết tên nhãn cho từng mẫu Quy ước đặt tên mẫu: được mã hóa theo

tên cây trồng, địa điểm thu thập (huyện) và số thứ tự mẫu Ví dụ: mẫu cây số 1 bệnh lở

cô ré trên cà chua thu thập tại vườn thuộc huyện Đức Trọng (CCDT1)

Đối với mẫu đất: Đất quanh gốc cây họ Cà bị nhễm bệnh tiến hành chọn 4điểm ngẫu nhiên ở độ sâu từ 5 — 10 em, mỗi điểm thu 200 g, sau đó trộn đều 4 điểmrồi thu 200 g Mẫu dat này dùng dé phân lập các loại nắm trong dat

Mẫu thu thập vào năm 2022, bảo quản trong điều kiện 4°C và sử dụng đề phân

lập trong thời gian 3 ngày.

Bảng 2.1 Mẫu bệnh lở cô rễ thu thập trên cây họ cà

Tete: Tường Số lượng Địa điểm thu mẫu

mau bénh (Xã, Huyện, Tỉnh/Thành phô)

ODT Ot 5 N’thol Ha, Đức Trọng, Lam Đồng

CCĐT Cà chua 5 Tân Hội, Đức Trọng, Lâm Đồng

KTDT Khoai tay 3 Lién Nghia, Duc Trong, Lam Đồng

CCĐD Ca chua 5 Thạnh Mỹ, Đơn Dương, Lâm Đồng

KTDD Khoaitây 4 Đạ Ròn, Đơn Dương, Lâm Đồng

OCC Ot 4 Trung Lap Thuong, Cu Chi, TP HCM

Ghi chú: Tên mẫu: (Tên cây trong) (Huyén lay mau)

2.4.1.2 Phân lập mẫu nắm

Các bước phân lập nắm bệnh như sau:

Đối với mẫu cây bệnh: rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ đất và bụi bân Rửamẫu bằng Ethanol 70% để loại bỏ các vi sinh vật hoại sinh trên bề mặt vết bệnh Cắt

mô vết bệnh thành mẫu nhỏ khoảng 2 x 2 mm tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô

khỏe, chọn mô bệnh còn mới Nhúng mô bệnh vào dung dịch Natri hypochlorite 1%

trong cồn ethanol 10% khoảng 5 — 10 giây dé khử trùng bề mặt Lay mau ra khỏi dungdịch khử trùng bề mặt và rửa lại bằng nước cất, sau đó làm khô mẫu bằng cách đặtmẫu lên giấy lọc đã tiệt trùng Dùng cây gấp vô trùng gắp miếng cấy đặt lên đĩa Petrichứa môi trường WA Sau khi cấy xong, đặt ngược dia Petri dé tránh động hơi nướctrên bê mặt môi trường cây.

Đối với mẫu đất: mỗi mẫu cân 100 g đất cho vào hộp nhựa và thêm nước cấtvào sau cho ngập khoảng từ 5 — 10 cm Sau đó dùng cánh hoa hồng đã được khử trùngbằng Ethanol 70%, trong 15 giây làm vật liệu bẫy, đặt các hộp nhựa ở nguyên vị trítrong điều kiện phòng Sau 2 — 4 ngày, trên cánh hoa hồng xuất hiện màu nâu, cắt mẫuthành những mảnh nhỏ với kích thước 0,3 — 0,5 cm, đặt trên môi trường WA, sau khi

xuất hiện tản sợi tiễn hành cấy truyền và làm thuần trên môi trường PGA

2.4.2 Định danh mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái

Khảo sát tính gây bệnh của các chủng nắm gây bệnh lở cỗ rễ đã phân lập đượctrong điều kiện phòng thí nghiệm

Chuẩn bị

Nam gây bệnh được nuôi cấy trên môi trường PGA

Sử dụng hạt giống cà chua gốc ghép Hawwaii 02 (Công ty TNHH Hạt giống và

nông san Phù sa), hạt giống ớt chỉ thiên PN — 400 của Công ty Phú Nông Củ giốngkhoai tây nông sản Dũng Hà.

Hạt giống được rửa bằng etanol 70% trong 30 giây Ủ hạt trên giấy thấm vôtrùng được làm âm đặt trong đĩa petri, giữ ở nhiệt độ phòng đến khi hạt nứt mầmkhoảng 2 mm.

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yếu tố được bồ trí hoàn toàn ngẫu nhiên,mỗi chủng nam là một NT và một NT đối chứng, mỗi NT đặt 5 hạt giống cà chua (ớt)trên 1 đĩa petri, với 3 LLL, Dùng giấy bạc bọc một nửa dia petri dé ngăn ánh sángchiếu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60° Các dia petri được dé trong nhiệt độ phòng thinghiệm (nhiệt độ 28 + 2°C, 12h sáng, 12h tối) Đối với củ giống khoai tây: mỗi nghiệm

thức cố định 1 mầm khoai tây, với 3 lần lặp lại được đặt trong 1 chậu

Phương pháp lây nhiễm

Sau khi hạt cà chua nứt mầm được ngâm trong dịch nam (chi Fusarium vàPythium: nồng độ 10° bào tử/ml, chi Rhizoctonia: dịch nắm chứa 2% sợi nắm) trong 30phút Vớt hạt ra khỏi dịch nắm và đặt trên giấy thấm vô trùng, đề hạt khô rồi đặt trênmột đường thắng với khoảng cách bằng nhau trên bề mặt thạch môi trường WA Đối

với khoai tây đã được ủ mọc mầm, đặt củ giống vào chậu có giá thé Chung bệnh bằngphương pháp đắp thạch không tạo vết thương trên cây (Burgess và ctv, 2009).

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%) được đánh giá 1 lần tại thời điểm 7 ngay sau

thí nghiệm theo công thức:

Tỉ lệ bệnh (%) = (A/B) x 100%

Trong đó: A là số cây bệnh

B là tổng số cây theo dõi

Việc xác định các giống nắm khác nhau dựa trên các đặc điểm hình thái của loàiđang phát triển như được mô tả bởi Lacap và ctv (2003), Ainsworth và ctv (1973) vàBurgess va ctv (2009).

Phương pháp tiến hành: Dé đạt được mẫu thuần, không lẫn tạp có thé dùngphương pháp cấy truyền sợi nam Cay mỗi khoanh nắm (đường kính 5 mm) lên đĩapetri chứa môi trường PGA.

Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận mau sac tan nam và đặc diém của sợi nam Quan

sát hình thái bào tử nâm: hình dạng, sô vách ngăn và kích thước của bào tử (mỗi mẫu

nam đo kích thước 30 bao tử và tính trung bình)

2.4.3 Thu thập và phân lập mẫu vi sinh vật có ích trong đất

2.4.3.1 Thu thập mẫu đất

Mau dat được thu thập trên những ruộng có triệu chứng bệnh Lay mau dat ở 4

vi trí khác nhau (50 g/ vi tri) xung quanh cây bị bệnh ở vườn ở bán kính 50 cm, độ sâu

0 — 20 cm Sau đó, trộn lẫn vào nhau và lay mẫu đại diện (200 g/ vườn thu mẫu) Mẫu

đất nên được giữ trong túi nilon và viết tên nhãn cho từng mẫu

Quy ước đặt tên mẫu: được mã hóa theo tên ruộng cây trồng, địa điểm thu thập(huyện) Vi dụ: mẫu dat thu thập dưới cây bệnh thứ 1 tại ruộng cà chua của huyện ĐứcTrọng (Ð — CCĐTI) Sau đó VSV phân lập từ đất được quy ước đặt tên mẫu: Tênruộng cây trồng, địa điểm thu mẫu (huyện), thứ tự phân lập được trong mẫu đất Ví dụ:mẫu vi sinh vật phân lập từ mẫu đất tại ruộng cà chua của huyện Đức Trọng (CC — DT1)

Bang 2.2 Mẫu dat thu thập được trên ruộng cây họ cà có triệu chứng bệnh lở cổ rễ

Tên mẫu oo Dia diém thu mau

Ruộng cay

dat (Xã, Huyện, Tỉnh/Thành phó)

Đ—-ODT Ớt N’thol Hạ, Đức Trọng, Lâm Đồng

Đ-CCĐT Ca chua Tân Hội, Đức Trọng, Lâm Đồng

D—KTDT Khoai tay Liên Nghia, Đức Trọng, Lam Đồng

Đ-CCĐD Ca chua Đạ Ròn, Đơn Dương, Lâm Đồng

D—KTDD Khoai tay Da Ron, Don Duong, Lam Đồng

Đ—OCC Ớt Trung Lập Thượng, Củ Chi, TP HCM

Ghi chú: Tên mâu: D — (Tên cây trong) (Huyén lay mau)

2.4.3.2 Phân lập các vi sinh vật trong dat

Cho mẫu đất, rễ nhỏ (10 g) lay ở xung quanh vùng rễ cây bị bệnh được loại bỏ

rác, nghiền nhỏ trong cối chày sứ vô trùng, b6 xung 90 ml nước cat vô trùng và chuyền

sang bình nón, lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong vòng 20 phút Lay 1 ml dung dịchchyén sang ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, và tiếp tục pha loãng tới

10*,10 4, 10° Từ các ống nghiệm có độ pha loãng khác nhau (10Ỷ, 10 *, 10 Ÿ), cấy

trải 100 yl trên môi trường KBA Sau 1 - 2 ngày quan sát sự phát triển của các khuẩn

lạc (Nguyễn Thị Kim Cúc và ctv, 2014).

2.4.4 Định danh vi sinh vật phân lập trong đất

Tiến hành phương pháp định danh vi sinh vật theo Gogoi (2017)

2.4.4.1 Xác định gram bằng dung dịch KOH 3%

Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo sợi) giữ sinh khối của VSV với

dung dịch KOH 3% Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của VSV

gram âm sẽ bi phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhay (dịch nhay), còn VSV

gram dương không có kéo soi.

Cách thực hiện: dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trườngKBA trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều càngquan sát rõ) Ghi nhận kha năng kéo sợi của các dòng VSV.

2.4.4.2 Nhuộm gram

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu trữ pham mau Crystal violet trên thành tế

bào VSV sau khi rửa bằng cồn VSV gram (+) có lớp vỏ tế bào day tao peptidoglycan,

nhờ đó mà màu tím của Crystal violet được gắn chắc vào tế bao (nhờ iodine) nênkhông bị khử bởi cồn, còn VSV gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng (do có ítpeptidoglycan) nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bịhòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bảo không màu lại bắt màu hồng

đỏ của thuôc nhuộm Safranine.

Cách thực hiện: Dùng que cấy thu mẫu VSV từ môi trường KBA dàn đều lêngiọt nước trên lam kính sạch, cô định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn Nhuộmmẫu bằng dung dịch Crystal violet trong 30 giây, rửa lại bằng nước, để khô Nhuộm tiếpbằng dung dich Lugol dé có định màu trong 30 giây và rửa sạch bằng nước Tay bằngcồn 90° trong 30 giây sau đó rửa sạch Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Safraninetrong 30 giây, rửa lại bằng nước Quan sát dưới kính hiển vi với thấu kính 40X và 100X

Đánh giá kết quả: VSV gram âm có màu đỏ hồng, VSV gram dương có xanh tím

2.4.4.3 Nhuộm bào tử

Nguyên tắc: Bào tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng Nhưng khi đã bắtmàu rồi thì màu sẽ bám rat chặt và khó bị trôi đi Khi ding thuốc nhuộm có hoạt tínhmạnh như thuốc lục malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vaonội bao tử và làm chúng nhuộm màu lục Khi rửa vết bôi bằng nước các tế bao sinhdưỡng sẽ bị mat màu còn bào tử vẫn giữ lại màu lục Khi nhuộm bổ sung bang đỏSafranine sẽ làm tế bào sinh dưỡng bắt màu đỏ hồng

Cách thực hiện: Sử dụng phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến theo cácbước: Dùng que cấy thu mẫu VSV từ môi trường KBA dàn đều lên giọt nước trên lamkính sạch, cố định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn côn Đặt tiêu bản lên trên giá

do, giá dé đặt trên cốc thủy tính có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C — 90°C)

trên bếp Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi Nhỏ 2 — 3 giọt dung dịch luc Malachite

5% lên vét bôi và tiến hành ho trên nước nóng từ 5 — 10 phút Nếu thấy thuốc nhuộm

miếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 — 3 giọt Safranine trong 1 phút Rửa lam kínhvới nước cất và dé khô Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với thấy kính 100X.

Đánh giá kết quả: Mẫu VSV có màu lục thì có cấu tạo bào tử Mẫu VSV cómau đỏ hồng thì VSV không có cấu tạo bào tử

2.4.4.4 Định danh các dong vi sinh vật bằng các phản ứng sinh hóa

Khảo sát hoạt tính Catalase

Nguyên tắc: phần lớn các VSV hiếu khí và ki khí tùy ý chứa chuỗi điện tích cócytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tốn thương bởi cácdẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy Các VSV này có khả năng biến đôi năng lượngtheo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng trong chuỗi điện từ tạoHạO;¿ Catalase thủy phân HO; thành H,O và giải phóng O», gây hiện tượng sti bọt khí.

Cách thực hiện: Nhỏ vài giọt HạO; lên dòng VSV phân lập Quan sát và ghi

nhận hiện tượng sủi bọt.

Đánh giá kết quả: vi khuan có enzyme catalase xuất hiện hiện tượng sui bọt

Khảo sát hoạt tính oxidase

Nguyên tắc: Các loại enzyme hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase Thànhviên quan trọng nhất của hệ thông này là cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện

tử của hô hấp hiếu khí với O; là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong cácloài VSV vật hiếu khí hay ky khí tùy ý Enzyme này phản ứng với tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride được tâm trong đĩa giấy làm đĩa giấy chuyền sangmầu xanh tím.

Cách thực hiện: Tam giấy lọc với thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride 1% Sau đó cấy VSV lên miếng giấy lọc đã tâm thuốc Quan sát kếtquả trong 10 giây đầu tiên

Đánh giá kết quả: Nếu VSV có màu xanh tím thì phản ứng dương tính, ngược

lai VSV không đổi màu thi phản ứng âm tính

2.4.4.5 Khả năng phát triển của vi sinh vật trong điều kiện ky khí

Thực hiện: Cấy đâm sâu VSV vào ống nghiệm chứa môi trường PGA đã đượcchuẩn bị trước, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 — 4 ngày Quan sát sự phát triển của VSV

và ghi nhận kết quả

Đánh giá kết quả: Nếu VSV phát triển lan ra khỏi đường cấy, không phát triểntrên bề mặt môi trường thì đó là VSV ky khí Ngược lại, nếu VSV chỉ phát triển trên

bề mặt môi trường, không phát triển lan ra khỏi đường cấy thì đó là VSV hiếu khí

2.4.5 Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi sinh vật phân lập đối với namgây bệnh lở cỗ rễ trên đĩa petri

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toànmẫu nhiên với mỗi dòng VSV phân lập được là 1 nghiệm thức (NT) và 1 NT đốichứng, mỗi NT 3 lần lặp lại (LLL)

Cách tiến hành

Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira va ctv, 1991): Sửdụng que cấy ria, cấy VSV thành 2 đường thắng song song và cách vị trí đặt thạch nắm2,5 cm vào đĩa petri có săn PGA Sau đó, tiến hành cấy thạch nắm (đường kính 5 mm)

đã được nuôi trong 7 ngày trên môi trường PGA vào tâm dia petri.

rị, 1: Bán kính đo từ tâm đến phan tản nắm phân bố theo hướng VSV.

Do bán kính tan nam và tính hiệu suất đối kháng (HSDK) theo công thức củaMoayedi và ctv (2009): AE (%) = (C-T)/Cx 100

Trong đó:

AE: Hiệu suất đối kháng (%)

C: Bán kính tản nam tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)

T: BKTN tương ứng ở nghiệm thức có chủng VSV đối kháng (mm)

Đánh giá hiệu suất đối kháng: theo thang đánh giá của Soytong (1988)

Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng rất cao

Hiệu suất đối kháng từ 61% đến 75%: có khả năng đối kháng cao

Hiệu suất đối kháng từ 51% đến 60%: có khả năng đối kháng trung bình

Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp

2.4.6 Kiểm chứng độc tính của 3 dòng vi sinh vật có hiệu suất đối kháng cao nhất

trên 3 loại nam gây bệnh lở cô rễ

Chuẩn bị

Hạt giống cà chua chuẩn bị tương tự thí nghiệm mục 2.4.3

Các dòng VSV đối kháng được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng sau 2 ngày

Bố trí thí nghiệm :Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên,mỗi dòng VSV là một NT và một NT đối chứng, mỗi NT đặt 10 hạt giống cà chuathang hàng trên 1 đĩa petri, với 3 LLL

Tiến hành thí nghiệm

Phương pháp lây nhiễm: Khi hạt được ủ nứt mầm khoảng 2 mm, ngâm hạt vàodịch VSV đối kháng (mật số 10° CFU/ml) trong 20 phút Hạt trên một đường thangvới khoảng cách bằng nhau trên bề mặt thạch môi trường WA Dùng giấy bạc bọc mộtnửa đĩa petri để ngăn ánh sáng chiếu vào rễ và đặt nghiêng một góc 60°C Các đĩa petriđược để trong nhiệt độ phòng thí nghiệm (nhiệt độ 28 + 2C, 12 giờ sáng, 12 giờ tối)