00060000719 nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới Ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư

00060000719 nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới Ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

của exosome tiết từ các tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư

Mã số đề tài: QG 18.09

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội, 2021

1

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư

1.2 Mã số: QG 18.09

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 Hoàng Thị Mỹ Nhung Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, ĐHQG

Hà Nội

Chủ nhiệm đề tài Điều hành chung, tham gia thực hiện các nội dung đề tài

2 Bùi Thị Vân Khánh Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, ĐHQG

Hà Nội

Thư ký đề tài Tham gia nội dung 2, 3, 4, 5, 6, 7

3 Bùi Việt Anh Viện nghiên cứu Tế bào

gốc và Công nghệ gen

Vinmec

Thành viên chính Tham gia nội dung 1

4 Thân Thị Trang Uyên Viện nghiên cứu Tế bào

gốc và Công nghệ gen

Vinmec

Thành viên chính Tham gia các nội dung 2, 3, 4, 5,6,

6 Nguyễn Lai Thành Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, ĐHQG

Hà Nội

Thành viên Tham gia các nội dung 2

7 Hoàng Thị Mỹ Hạnh Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, ĐHQG

Hà Nội

Thành viên Tham gia các nội dung 2, 3,4, 5

1.4 Đơn vị chủ trì:

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 12 năm 2019

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 1 năm 2021

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 1 năm 2018 đến tháng 1 năm 2021

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Không

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý

kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 450 triệu đồng

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:

1 Đặt vấn đề

2

Tế bào tua (dendritic cells – DC) là tế bào trình diện kháng nguyên hữu hiệu nhất trong cơ thể chúng ta Khi được cảm ứng với các kháng nguyên, các tế bào tua sẽ hoạt hóa cả tế tế bào T hỗ trợ và tế bào T gây chết cũng như các tế bào B Trong những thập kỷ gần đây, vắc xin dựa trên tế bào tua đã và đang trở thành một chiến lược quan trọng trong liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư [1] Mục đích của DC vắc xin là kích hoạt lại hệ thống miễn dịch vốn bị bất hoạt bởi tế bào ung thư bằng cách cung cấp các tế bào DC đã được huấn luyện bên ngoài cơ thể Các tế bào DC này được hoạt hóa và cảm ứng với kháng nguyên ung thư nên có thể thúc đẩy các đáp ứng miễn dịch chống ung thư của tế bào T một cách hiệu quả

Nhiều thử nghiệm lâm sàng pha I và II sử dụng liệu pháp miễn dịch dựa trên tế bào tua để điều trị nhiều loại ung thư đã được công bố với kết quả là làm tăng khả năng sống và giảm các tác dụng phụ thường có ở vắc xin [1,2] Tuy nhiên các liệu pháp dựa trên tế bào tua cũng tồn tại một số nhược điểm Ví dụ, các thành phần phân tử của tế bào tua có thể thay đổi và rất khó để xác định [3] Các tế bào ung thư có thể tiết một số cytokine ức chế miễn dịch làm chuyển đổi các tế bào tua trưởng thành thành các tế bào tua dung nạp và có thể dẫn đến sự hoạt hóa các tế bào T điều hòa, ngăn chặn các đáp ứng miễn dịch [4] Các tế bào tua sống thường khó để lưu trữ và phải đòi hỏi quá trình thu nhận phức tạp cũng như cần nhiều kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào [3]

Để khắc phục những khó khăn trên, các exosome tiết từ tế bào tua được phát triển để sử dụng như là một cách thay thế trong liệu pháp vắc xin Exosome là các túi tiết của tế bào được giải phóng vào môi trường ngoại bào Những túi tiết này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 khi nghiên cứu các tế bào hồng cầu non Chúng đóng vai trò quan trọng trong sự giao tiếp giữa các tế bào [5] Sự giao tiếp giữa các tế bào trong cơ thể thông qua các túi tiết là một trong những quá trình sinh lý cực kỳ quan trọng của cả tế bào lành lẫn tế bào ung thư Sự giao tiếp này có thể liên quan đến các exosome – là các túi tiết nhỏ có kích thước từ 30 – 140 nm được tiết ra từ rất nhiều loại tế bào và được tìm thấy nhiều trong các dịch của cơ thể như máu, nước bọt, nước tiểu và sữa mẹ Các exosome có chứa các phân tử lipid, protein, mRNA, các RNA không mã hóa và ADN kể cả khi tiết

ra khỏi tế bào Những túi tiết này sau đó sẽ được các tế bào khác thu nhận Bằng các này các exosome sẽ truyền thông tin sinh học sang các tế bào lân cận Quá trình này không chỉ đóng vai trò như một chức năng sinh lý trong giao tiếp giữa các tế bào mà còn liên quan đến sự phát sinh cũng như duy trì bệnh lý ung thư hay các bệnh lý về thần kinh Giao tiếp thông qua exosom có thể được thực hiện giữa các tế bào cùng loại hoặc khác loại Năm 1996, người ta đã xác định được các tế bào

B tiết các exosome mang kháng nguyên có khả năng kích thích đáp ứng của tế bào T đặc hiệu với MHC lớp II [6] Sau đó, Zitvogel và cộng sự đã chỉ ra rằng các tế bào tua cũng tiết các exosome trình diện kháng nguyên [7] Cả tế bào tua non và trưởng thành đều có thể giải phóng exosome (gọi tắt là Dex) Các Dex mang rất nhiều phân tử cần thiết cho sự trình diện kháng nguyên, như MHC lớp I, MHC lớp II, và các phân tử đồng kích thích cũng như các phân tử liên kết [8] Dex có khả năng hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và mắc phải [9] Các Dex đã cảm ứng với các peptide ung thư có khả năng hoạt hóa các tế bào T gây độc (cytotoxic T lymphocyte – CTL) in vitro

và ngăn chăn sự phát triển của khối u theo cách phụ thuộc MHC và tế bào CTL Mặt khác, các exosome tiết từ tế bào tua lại có tác dụng tốt hơn chính các tế bào tua khi sử dụng trong liệu pháp miễn dịch [7] Dex có thể thu được lượng lớn và có thể sử dụng được cho vài lần vắc xin Thêm vào

đó Dex rất ổn định và có thể bảo quản lạnh trong vòng 6 tháng tại -80oC mà không ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng Sự ổn định này là một lợi thế của Dex so với bản thân các tế bào tua Nhiều thử nghiệm phase I đã tiến hành trên các loại ung thư khác nhau như ung thư da [2,10], ung thư phổi không tế bào nhỏ [11], ung thư đại trực tràng [12] đều chứng minh tính an toàn của liệu pháp với rất ít tác dụng phụ và đều ở mức thấp

Trong một thử nghiệm pha II gần đây nhất đã được đăng trên tạp chí Oncoimmunology [13], Besse và cộng sự đã sử dụng Dex như là một liệu pháp miễn dịch kết hợp với hóa trị để điều trị bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Kết quả cho thấy Dex hoạt hóa khả năng giết tế bào ung thư của các tế bào diệt tự nhiên (natural killer cell – NK) Cũng trong nghiên cứu này, họ đã chuẩn

bị Dex thế hệ hai bằng cách biệt hóa tế bào monocyte của bệnh nhân thành các tế bào tua non, tiếp

đó cảm ứng tế bào tua non bằng INF gamma và kháng nguyên ung thư INF gamma đã được chứng

3

minh là có khả năng kích thích sự biểu hiện các phân tử đồng kích hoạt và ICAMs trên tế bào DC [14,15] So với Dex thế hệ đầu (không cảm ứng bằng IFN), các túi tiết thế hệ hai biểu hiện các kiểu hình của các túi tiết trưởng thành, với sự tăng biểu hiện MHC lớp II, tetraspanin, CD40, CD86 và ICAM-1/CD54 Những kết quả này chứng tỏ việc cảm ứng với INF gamma có khả năng cải thiện chức năng trình diện kháng nguyên của Dex và hoạt hóa tế bào T [13]

Thử nghiệm pha II này có mục đích kiểm tra xem liệu các Dex cảm ứng bằng IFN gamma

có khả năng cải thiện được tỷ lệ sống còn không tiến triển (PFS – progression-free survival) sau 4 tháng hóa trị [13] Nghiên cứu này đã triển khai trên 22 bệnh nhân mắc ung thư phổi không tế bào nhỏ tiến triển, tất cả đều đã nhận 4 chu kỳ hóa trị bằng platinum Kết quả cho thấy 32% có tình trạng bệnh ổn định sau 9 lần tiêm Dex Tỷ lệ PFS tại 4 tháng sau hóa trị là 32% và giá trị PFS trung bình của 22 bênh nhân là 2,2 tháng Thời gian sống trung bình của tất cả bệnh nhân là 15 tháng với

tỷ lệ sống ở tháng thứ 6 là 86%, không có bệnh nhân chết liên quan đến liệu pháp sử dụng Chức năng của tế bào NK cũng tăng rõ rệt trên những bệnh nhân sử dụng Dex Một điều quan trọng là mức độ biểu hiện của MHC lớp II của Dex tương quan thuận với mức biểu hiện của phối tử BAG6 của thụ thể NKp30 - một thụ thể hoạt hóa của NK NK được hoạt hóa sẽ dẫn đến giá trị PFS tăng Tuy nhiên thử nghiệm này không phát hiện được các đáp ứng của tế bào T khi sử dụng Dex thế hệ hai Hiệu quả điều trị cũng không được như kỳ vọng Điều này có thể do một số nguyên nhân như: lượng kháng nguyên ung thư sử dụng chưa đủ liều lượng cho lâm sàng; IFN gamma sử dụng để tạo Dex có thể kích hoạt tế bào DC chết theo chương trình [14]; và lí do quan trọng hơn cả là thiếu các đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc [1,4,15,16] Nghiên cứu của Besse và cộng sự là thử nghiệm pha II đầu tiên sử dụng Dex Mặc dù còn có một số hạn chế và thách thức, Dex vẫn là một liệu pháp nhiều tiềm năng trong miễn dịch trị liệu ung thư Cần phải có những nghiên cứu cơ bản cũng như các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo để khắc phục các hạn chế trên và sớm đưa liệu pháp vào ứng dụng trong điều trị ung thư

Như đã trình bày ở trên, liệu pháp vắc xin sử dụng exosome từ tế bào tua đã và đang được nghiên cứu trong các thử nghiệm lâm sàng Tuy nhiên liệu pháp này vẫn còn một số nhược điểm như việc sử dụng các peptide thương mại không bao quát được hết các kháng nguyên ung thư cũng như không hoạt hóa được các tế bào miễn dịch T và B [17,18]; liều IFN gamma cần phải được tối

ưu để tránh gây chết tế bào tua trong quá trình cảm ứng Đồng thời, những nghiên cứu này chủ yếu

sử dụng các dexosome tự thân Việc phân lập các dexosome tự thân đòi hỏi phải lấy một lượng máu

từ chính cơ thể người bệnh Hơn nữa các vắcxin tự thân dù là sử dụng tế bào tua hay các exosome tiết từ tế bào tua có thể không phát huy được hết khả năng của các tế bào miễn dịch do các cơ chế lẩn trốn miễn dịch của các tế bào ung thư trên cơ thể người bệnh Để khắc phục nhược điểm này, trong những năm gần đây liệu pháp ghép tế bào tua đồng loại được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tính an toàn cũng như hiệu quả của vaccin chống ung thư [19-22] So với việc sử dụng DC tự thân, DC đồng loại tỏ ra ưu việt hơn trong việc thúc đẩy đáp ứng miễn dịch chống ung thư do chúng có khả năng hoạt hóa tế bào T CD8+

đặc hiệu khối u cũng như các tế bào T đồng loại tốt hơn [22] Thêm vào đó, các DC đồng loại có thể được sản xuất với lượng lớn cho người bệnh, đảm bảo được tính ổn định cũng như đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng của vaccine Đặc biệt, một thử nghiệm pha I của Loosdrecht và cs đã chứng minh rằng sử dụng dòng tế bào DC (có tên thương mại là DCP-001) trên các bệnh nhân ung thư máu cấp dòng tủy (AML) lớn tuổi là an toàn và hiệu quả, kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể [22] Tế bào máu dây rốn chính là một nguồn thay thế đầy tiềm năng để cung cấp các tế bào miễn dịch trong liệu pháp ghép tế bào miễn dịch đồng loài điều trị ung thư Sử dụng các exosome phân lập từ các tế bào tua tăng sinh từ máu dây rốn làm vắc xin phòng chống ung thư chính là một liệu pháp khắc phục được các nhược điểm trên đồng thời còn sở hữu một số đặc tính ưu việt: không ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống bệnh nhân, dễ dàng thu nhận, không gây nên tác dụng phụ, và có thể sử dụng trong ghép đồng loài

mà không cần phải tìm kiếm người cho phù hợp

Nghiên cứu này sẽ đánh giá khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư in vitro của các

dexosome thu nhận từ tế bào tua được phân lập và nhân nuôi từ máu dây rốn người Dòng tế bào ung thư phổi người A549 sẽ được sử dụng để kiểm tra tính kháng u Các kết quả của nghiên cứu sẽ

- Đánh giá được khả năng gây chết tế bào ung thư phổi A549 in vitro của tế bào lympho T sau

cảm ứng với exosome từ tế bào tua dây rốn và xác định liều gây chết đặc hiệu trên 80%

- Thử được độc tính trên cơ thể của liều gây chết đặc hiệu tế bào ung thư phổi A549 khi tiêm

ở chuột thí nghiệm

- Phân tích, đề xuất khả năng chế tạo vắc xin chống ung thư từ các kết quả nghiên cứu

3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình thí nghiệm của đề tài nghiên cứu được tóm tắt trong sơ đồ dưới đây (Hình 1)

Hình 1 Sơ đồ nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Mẫu máu cuống rốn

Nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng Y đức của Viện nghiên cứu Y sinh Đinh Tiên Hoàng, văn bản số IRB.009, ký ngày 20 tháng 6 năm 2018 Máu cuống rốn được cung cấp bởi Ngân hàng máu cuống rốn - Bệnh viên Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội Máu cuống rốn được thu thập trực tiếp từ tĩnh mạch dây rốn của trẻ sơ sinh ngay sau khi mẹ sinh em bé, thực hiện bởi các kỹ thuật viên của bệnh viện Trong đó, người mẹ đã được thông báo đầy đủ về mục đích của nghiên cứu và đồng ý hiến tặng mẫu dây rốn cũng như máu cuống rốn Yêu cầu người mẹ khỏe mạnh, không mắc các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV, …

3.1.2 Dòng tế bào nuôi cấy

Dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549 được mua từ Ngân hàng ATCC, Mỹ Tế bào A549 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS và 1% penicillin/

5

streptomycine với mật độ tế bào ban đầu là 375.000 tế bào/ chai nuôi cấy T75, ủ ấm trong tủ 37 oC,

và 5% CO2 Tại thời điểm thu hoạch tế bào, mật độ tế bào phải đạt 80% diện tích bề mặt chai nuôi

cấy Phân tách tế bào bám dính khỏi bề mặt chai nuôi cấy bằng dung dịch trypsin – EDTA (Gibco,

Mỹ) khi tiến hành thu hoạch tế bào

3.1.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành tại các cơ sở sau: (1) Khoa Sinh học, (2) Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; và (3) Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec, (4) Trung tâm Công nghệ cao Vinmec

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân lập tế bào đơn nhân (mononuclear cell – MNC)

Tế bào đơn nhân được phân lập bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng sử dụng Ficoll Pha loãng máu toàn phần bằng Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) (Gibco, Mỹ) theo tỉ lệ 1 : 1 về thể

tích và cho vào ống đã chứa sẵn dung dịch Ficoll theo tỉ lệ 2 : 1 về thể tích Ly tâm với tốc độ 840 ×

g trong 20 phút Sau khi ly tâm, dung dịch trong ống sẽ phân thành 4 lớp Loại bỏ huyết tương phía

trên, thu lớp tế bào đơn nhân (lớp buffy coat) ở giữa và chuyển sang ống ly tâm 50 ml Bổ sung

PBS vào lớp buffy coat để thể tích trong ống đạt 45 ml và trộn đều, ly tâm với tốc độ 270 × g trong

8 phút Cặn tế bào được đánh tan trong dung dịch PBS để đếm số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân

(mononuclear cells – MNC) bằng buồng đếm tế bào tiêu chuẩn

3.2.2 Phương pháp biệt hóa tế bào mono thành tế bào tua

3.2.2.1 Phương pháp biệt hóa tế bào mono thành tế bào tua bằng cách sử dụng GMCSF và IL-4

Các tế bào MNC từ máu dây rốn được nuôi trong môi trường nuôi tế bào lympho KBM551(Corning) tại mật độ 2×106 tế bào/mL Sau 2h nuôi trong tủ ấm 37oC và 5 % CO2, các tế bào không bám dính bị loại bỏ Các tế bào bám dính được tiếp tục nuôi trong môi trường KBM551

bổ sung 1000 U/mL yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt – đại thực bào người (GM-CSF) (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) và 500 U/mL IL-4 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) Môi trường được thay mới mỗi 3 ngày Vào ngày thứ 5 nuôi cấy, bổ sung 50 µg/mL mẫu protein toàn phần thu từ ly giải tế bào A549 và tiếp tục nuôi cấy đến ngày thứ 7 Ở ngày thứ 6 của quá trình nuôi cấy, bổ sung 500 U/mL TNF-α (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) vào cả chai nuôi cấy có hoặc không có kháng nguyên ung thư Tại ngày thứ 7 sau nuôi cấy, thu hoạch cả tế bào DC lẫn môi trường nuôi cấy DC để phân lập exosome DC tạo ra từ phương pháp này được ký hiệu là IL-4DC Những tế bào DC không cảm ứng với kháng nguyên ung thư được ký hiệu là upIL-4DC Những tế bào được cảm ứng với kháng nguyên ung thư được ký hiệu là pIL-4DC Tương ứng, các exosome phân lập từ các tế bào này sẽ được ký hiệu tương tứng là upIL4-Dex và pIL4-Dex

3.2.2.2 Phương pháp biệt hóa tế bào mono thành tế bào tua bằng cách sử dụng GMCSF và IFN-α

Các tế bào MNC máu dây rốn được nuôi trong môi trường AIM-V medium (Gibco, Tokyo, Japan) bổ sung 10% huyết tương tự thân trong 2h tại 37oC Sau khi loại bỏ các tế bào không bám dính, các tế bào còn lại được tiếp tục nuôi trong môi trường AIM-V bổ sung 5% huyết tương tự thân và DC cocktail I (Biotherapy Institute of Japan (BIJ), Tokyo, Japan) chứa 1000 U/ml GM-CSF (Primmune Inc., Kobe, Japan) và 1000 U/ ml IFN-α (INTRON, MSD K.K., Tokyo, Japan) Tại ngày 4 sau nuôi cấy, các tế bào trong môi trường AIM-V 5% huyết tương tự thân được kích thích với DC cocktail II (BIJ, Tokyo, Japan) chứa 10 ng/ml TNF-α (Peprotech Ltd., Hereford, UK), 1

mM Zoledronate (Novartis Pharmaceuticals, Switzerland), và 1000 U/ml IL-2 (Chiron Corp, Emeryville, CA, USA); và được cảm ứng với dịch ly giải toàn phần tế bào ung thư phổi A549 tại nồng độ 100µg/mL trong 24h Thiết kế một mẫu tế bào không cảm ứng với A549 Các tế bào và môi trường nuôi tế bào được thu hoạch tại ngày thứ 5 sau nuôi cấy Những tế bào cảm ứng với A549 được ký hiệu là pIFN-DC, tế bào không cảm ứng là upIFN-DC Môi trường điều kiện thu

6

nhận từ nuôi cấy tế bào DC tương ứng được ký hiệu là pIFN-DMed và up-IFNDMed Hình thái tế bào trong các điều kiện nuôi cấy được quan sát và phân tích trên hệ thống kính hiển vi soi ngược Olympus IX73 và phần mềm CellSens Standard software

Kiểu hình miễn dịch của tế bào được phân tích bằng hệ thống đếm tế bào theo dòng Các kháng thể đơn dòng kháng CD3, CD8, Vγ9TCR, CD4, CD40, CD80, CD86, HLADR, CD123, CD14, và CD11c, cũng như các isotype tương ứng được cung cấp từ hãng Beckman Coulter (Marseille, France) Các kháng thể được gắn với các thuốc nhuộm huỳnh quang Pacific Blue, fluorescein isothiocyanate (FITC), APC Vio, PC7, và Allophycocyanin- Alexa Flour 750 (APC-Alexa Flour 750) Tế bào được phân tích trên hệ thống Navios flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA), và số liệu được xử lý bằng phần mềm Navios software, version 3.2 (Beckman Coulter, Miami, FL, USA)

3.2.3 Phương pháp thu nhận exsosome

Exosome được phân lập bằng phương pháp siêu ly tâm [23] Môi trường nuôi cấy DC được thu nhận và ly tâm tại 300× g trong 10 phút ở 4oC, sau đó phần dịch nổi được thu nhận Dịch nổi được tiếp tục ly tâm tại 2000× g trong 10 phút, 4oC trước khi được chuyển sang một ống mới và tiếp tục ly tâm trong 30 phút tại tốc độ 10,000× g Tiếp tục thu hồi dịch nổi vào một ống ly tâm mới

và ly tâm tại tốc độ 100,000× g trong 70 phút trên hệ thống siêu ly tâm Optima XPN-100 Ultracentrifuge, Beckman Coulter, Brea, CA, USA Cặn ly tâm chứa các exosome được hòa loãng trong PBS và tiếp tục ly tâm tại tốc độ 100,000× g trong 70 phút, 4oC để thu nhận các exosome sạch Exosome sau phân lập được để trong 50 µL PBS và có thể bảo quản trong -80oC cho các lần

sử dụng tiếp theo

3.2.4 Phương pháp phân tích hình thái và các protein chỉ thị của exosome

3.2.4.1 Phương pháp phân tích bằng hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Các exosome được cố định với 4% paraformaldehyde, nhỏ 5-µL exosome lên lam lưới phủ Formvar-carbon (TED PELLA, Inc., Redding, CA, USA) và để khô tự nhiên trong 20 phút Rửa mẫu với PBS và ủ trong 1% glutaraldehyde trong 5 phút trước khi rửa 8 lần × 2 phút với nước cất Sau đó mẫu được nhuộm với uranyl-oxalate (pH 7) trong 5 phút tại nhiệt độ phòng, rồi chuyển vào dung dịch methyl cellulose-uranyl acetate trong 10 phút trên đá khô và để khô tự nhiên tại nhiệt độ phòng Cuối cùng, các exosome được quan sát dưới kính hiển vi điện tử JEM1010 (JEOL, Tokyo, Japan)

3.2.4.2 Wesstern Blot

5 µg protein tổng số từ ly giải exosome được cho vào mỗi giếng và chạy trên gel 4–12% polyacrylamide SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad Buck, UK) tại 200 V trong 35 phút, 4oC Proteins được chuyển qua màng PVDF (GE Healthcare Life Science, Freiburg, Germany) tại 200

mA trong 2 h, 4◦C Màng sau đó được ủ với kháng thể (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) kháng CD63 và CD9 (phát hiện dấu ấn của exosome), CD86 (dấu ấn của DC) (Beckman Counter, Marseille, France), và GAPDH (protein chuẩn), rồi ủ tiếp với kháng thể kháng chuột gắn horseradish peroxidase-conjugated (AmershamTM, Freiburg, Germany) Các protein được phát hiện bằng cơ chất quang hóa (AmershamTM), ảnh băng protein được thu nhận bằng camera ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Germany)

3.2.5 Phương pháp thu nhận và xác định nồng độ protein tổng số

3.2.5.1 Phương pháp tách chiết protein toàn phần từ dòng tế bào ung thư phổi A549

Chuẩn bị 1 × 107

– 2 × 107 tế bào A549 trong 1 ml dung dịch PBS Làm đông lạnh khối tế bào trong nito lỏng (5 phút) và rã đông hoàn toàn trong bể ổn nhiệt 37 o

C, lặp lại chu kì làm đông –

rã đông này 8 – 10 lần Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào sao cho vào chu kì cuối cùng tỷ lệ sống

của tế bào đạt 0% Sau đó ly tâm dịch tế bào đã chết hoặc vỡ tại 2000 × g trong 10 phút Dịch nổi

được thu lại và lọc qua màng lọc 0,2 μm, dịch thu được có chứa protein toàn phần được bảo quản ở

7

- 80 oC và sử dụng cho các mục đích cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành Nồng

độ protein trong dung dịch được xác định theo phương pháp Bradford

3.2.5.2 Phương pháp tách chiết protein toàn phần từ exsosome

Exosome được bảo quản trong PBS 1X sẽ được hòa tan cùng với một lượng đệm ly giải (RIPA buffer) tương ứng về thể tích, trộn đều hỗn hợp này trong vòng 15 phút, sau đó tiến hành ly

tâm tại 14.000 × g, 15 phút, 4oC Cuối cùng hút dịch nổi chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới (có thể bảo quản ở -20oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo) Nồng độ protein trong dung dịch đã được tách chiết trên được xác định bằng cách sử dụng kit Pierce™ BCA Protein Assay Từ lượng protein toàn phần thu được, có thể tính số lượng hạt exosome tương ứng theo công thức của Sverdlov ED: 1µg protein toàn phần thu được từ exosome tương đương với 2×109 hạt exosome [24]

3.2.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của DC lên sự tăng sinh tế bào lympho đồng loại

3.2.6.1 Phương pháp phân lập tế bào lympho T từ máu ngoại vi

Các tế bào lympho T CD3+ từ máu ngoại vi người khỏe mạnh được phân lập bằng cách sử dụng kit CD3 Microbeads Human Kit (MACS, Miltenyi Biotec Inc., Cologne, Germany) CD3 microbeads được ủ với dung dịch chứa tế bào MNC trong 15 phút tại 4oC để gắn với các tế bào T CD3+ Rửa tế bào bằng PBS và hòa loãng lại bằng PBS (pH 7.4, Gibco, Marseille, France) chứa 0.5% bovine serum albumin (Gibco), cho hỗn hợp chạy qua cột đặt trên hệ máy từ (MACS, Miltenyi Biotec Inc., Cologne, Germany) Dịch tế bào chảy vảo ống thu nhận sẽ chứa những tế bào chưa gắn bead Cột được tách khỏi máy từ và được thôi bằng đệm Các tế bào thu nhận sau bước này là những tế bào lympho T CD3+

đã được làm giàu Đếm và xác định tỷ lệ sống của tế bào sau phân lập Kiểu hình miễn dịch của tế bào sau phân lập được phân tích trên hệ thống đếm tế bào theo dòng

3.2.6.2 Phương pháp đánh giá tăng sinh tế bào

Các tế bào sau phân lập được ly tâm và rửa bằng PBS, hòa loãng đến mật độ 6 × 105

tế bào/100 µL Các tế bào được ủ với CFSE (green fluorescence carboxyfluorescein succinimidyl ester) (Thermo Scientific, Eugene, OR, USA) Sau đó các tế bào đánh dấu với CFSE được gieo lên đĩa 12 giếng Ủ tế bào DC hoặc Dex với tế bào T đã đánh dấu theo tỷ lệ 1 DC:4 T, hoặc 1DC:10MNC trong 1 mL môi trường trên một giếng, và nuôi cấy trong 7 ngày tại 37oC và 5% CO2 Lượng Dex ủ với T tương đương với số lượng tế bào mẹ DC ủ với T theo tỷ lệ như trên Sau khi ủ, mật độ huỳnh quang của CFSE sẽ được đo bằng hệ thống đếm tế bào theo dòng và phân tích bằng phần mềm Navios để xác định sự phân chia của quần thể tế bào T Ngày tiến hành đồng nuôi cấy đầu tiên được gọi là ngày D0, những ngày tiếp theo sẽ ký hiệu là D1 đến D7 tương ứng

Để đánh giá sự tăng sinh của các quần thể tế bào T khác nhau, ủ các tế bào T với DC hoặc Dex tại tỷ lệ 1: 4 như trên Sau khi ủ 4 ngày, các tế bào trôi nổi được thu nhận Đây chính là các tế bào lympho Quần thể tế bào trôi nổi này được ủ với các kháng thể kháng CD3, CD8, Vγ9TCR, và CD4 gắn Pacific Blue, FITC, APC Vio, và PC7 (Beckman Coulter, Marseille, France) Tế bào được phân tích trên hệ thống BD FACScanto II, và số liệu được xử lý bằng phần mềm BD FACSDivaTM software (San Jose, CA, USA)

3.2.7 Phương pháp cảm ứng tế bào ung thư A549 với exosome phân lập từ tế bào tua

Các tế bào ung thư phổi A549 sẽ được ủ với exosome phân lập từ tế bào tua trưởng thành sau cảm ứng với kháng nguyên ung thư (gọi tắt là pExo) tại ba nồng độ: 1ug pExo (pExo 1), 2 ug (pExo 2), và 3 ug (pExo 3) ủ với 1×106

tế bào A549 trong môi trường RPMI 10% FBS Các tế bào được theo dõi trong 8 giờ, sau đó được thu nhận để đánh giá biểu hiện dấu ấn miễn dịch bề mặt bằng phương pháp đếm tế bào theo dòng Các kháng nguyên bề mặt được xác định bao gồm CD40, CD80, CD86, HLA-DR Dựa trên kết quả phân tích theo dòng chảy, các tế bào ung thư phổi A549

sẽ được cảm ứng với pDC tại nồng độ kích thích biểu hiện dấu ấn miễn dịch của tế bào tua cao nhất,

8

trong môi trường RPMI 10% FBS Các tế bào được theo dõi trong 8 giờ Sau đó tế bào A549 được thu hoạch để dùng cho thí nghiệm đánh giá độc tính

3.2.8 Phương pháp đánh giá độc tính của tế bào

Các tế bào MNC hoặc T sau khi được kích hoạt bởi DC và Dex (mục 3.2.6.2 và 3.2.6.3) sẽ được sử dụng như là các tế bào hiệu ứng E (effector cells) Tế bào ung thư A549 được sử dụng như

là các tế bào đích T (target cells) Các tế bào A549 này được ủ với Calcein-AM (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan) trong 30 phút, tại 37oC, sau đó rửa với PBS Gieo các tế bào A549 được đánh dấu vào đĩa 96 giếng tại mật độ 3 × 103

tế bào/giếng trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS Các tế bào E được bổ sung vào giếng sao cho đạt mật độ E:T là 12.5:1, 25:1, và 50:1 Đĩa 96 được ly tâm ở tốc độ 50× g trong 2 phút để các tế bào lắng xuống đáy đĩa, đo mật độ huỳnh quang (FI) bằng hệ thống Terascan VPC2 (Japan) Để tạo đối chứng phân giải

tế bào tối đa, sau khi đo FI lần 1, bổ sung alkaline reagent DCN90 giếng tương ứng Ủ đĩa tế bào trong tủ ấm trong 2 h Sau đó, ly tâm đĩa trong 2 phút tại 50× g, loại bỏ 80 µL dịch nổi và bổ sung

80 µL fresh RPMI vào mỗi giếng Ly tâm đĩa trong 2 phút tại 50× g, đo FI lần 2 trên hệ thống Terascan VPC2 counter Tỷ lệ gây độc tế bào (cytotoxicity (%)) được tính bằng phần mềm của hệ thống Tera Scan

3.2.9 Phương pháp đánh giá độc tính của liều gây chết đặc hiệu tế bào ung thư khi tiêm ở chuột thí nghiệm

Phương pháp này nhằm xác định khả năng gây độc lên cơ thể chuột thí nghiệm của exosome tế bào tua dây rốn ở liều gây chết đặc hiệu tế bào ung thư phổi A549 Chuột nhắt trắng Swiss đực có trọng lượng trung bình 20 – 22 gr cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con Ở lô đối chứng sinh học, chuột được nuôi trong điều kiện chăm sóc thông thường Ở lô đối chứng dung môi, chuột được tiêm dung môi pha exsome với liều xác định tương đương lô điều trị Ở lô thí nghiệm, chuột được tiêm dung dịch exosome tại liều xác định (dựa trên các kết quả nghiên cứu của nội dung 5) Các lô thí nghiệm được thiết kế thành các lô sử dụng một liều tiêm duy nhất Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng được duy trì ở 28 oC

± 0,5, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng được tự động điều khiển bật lúc 7h00, tắt lúc 19h00 Thức ăn do Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương cung cấp và nước uống đun sôi để nguội trước khi sử dụng Theo dõi trọng lượng của chuột mỗi 4 ngày Quan sát và ghi lại tình trạng chuột hàng ngày Theo dõi

trong thời gian 1 tháng

3.2.10 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu được phân tích bằng phần mềm Stata 12.0 để xác định giá trị p Giá trị p < 0.05 được coi là khác biệt có ý nghĩa

4 Tổng kết kết quả nghiên cứu

4.1 Kết quả biệt hóa tạo tế bào tua từ tế bào mono máu dây rốn

4.1.1 Hình thái và kiểu hình miễn dịch của các tế bào sau biệt hóa

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai phương pháp biệt hóa tế bào mono thành tế bào tua, bao gồm: biệt hóa bằng phối hợp GMCSF với IL-4 hoặc INF-α Tế bào khi biệt hóa bằng hai tổ hợp cytokine nêu trên đều có sự thay đổi hình thái theo thời gian (Hình 2A, 3A) Từ hình thái tròn đặc trưng của tế bào mono, các tế bào tăng lên về kích thước và dần phát triển các tua nhánh bao xung quanh, đây là hình thái đặc trưng của tế bào tua Bên cạnh đó, phân tích kiểu hình miễn dịch cho thấy phần lớn các tế bào trong quần thể biểu hiện cao các dấu ấn đặc trưng của tế bào tua (Hình 2B, 3B) So sánh với các tế bào sau cảm ứng với kháng nguyên ung thư (p-DC) với các tế bào không cảm ứng kháng nguyên (up-DC) và các tế bào mono cho thấy sự tăng biểu hiện rõ rệt

(p<0.05) của các dấu ấn này (Hình 2C, 3C) Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Nidea

khi thực hiện trên các tế bào mono máu ngoại vi [25,26]

9

Hình 2 Các tế bào DC biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn sử dụng IL-4 (A) Hình thái tế bào

DC sau khi biệt hóa không cảm ứng (Aa) hoặc cảm ứng (Ab) với kháng nguyên ung thư A549 (B)

Tỷ lệ (%) các tế bào biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của tế bào tua trong quần thể tế bào DC cảm ứng hoặc không cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549 (C) So sánh mức độ biểu hiện các dấu

ấn của tế bào DC trên hai quần thể upIL-4DC và pIL-4DC Các số liệu được thể hiện tại giá trị

trung bình ±SD trong 4 lần lặp lại thí nghiệm (*: p<0,05) D0: tế bào tại ngày nuôi cấy biệt hóa đầu

tiên; u4DC: tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 không cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549; 4DC: tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549

pIL-Hình 3 Các tế bào DC biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn sử dụng IFN-α (A) pIL-Hình thái tế

bào DC tại ngày nuôi cấy đầu tiên D0 và D5 sau khi biệt hóa không cảm ứng (upIFN-DC) hoặc cảm ứng (pIFN-DC) với kháng nguyên ung thư A549 (B) Tỷ lệ (%) các tế bào biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của tế bào tua trong quần thể tế bào DC cảm ứng hoặc không cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549 (C) So sánh mức độ biểu hiện các dấu ấn của tế bào DC trên hai quần thể upIFN-DC và

10

pIFN-DC Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 5 lần lặp lại thí nghiệm (*:

p<0,05)

4.1.2 Hiệu suất thu nhận tế bào tua từ tế bào mono máu dây rốn

Để tính hiệu suất thu nhận tế bào tua, đầu tiên chúng tôi xác định số lượng tế bào mono thu nhận từ 3 mẫu máu dây rốn sử dụng phương pháp bám dính Kết quả thu được thể hiện như trong Bảng 1 và cụ thể thu được số lượng tế bào bám dính trung bình của 3 mẫu là 14,2 ± 4,003 × 106

tế bào

Bảng 1: Số lượng tế bào MNC bám dính sau khi thay môi trường

Mẫu Số lượng tế bào bám

GTTB: giá trị trung bình, ĐLC: độ lệch chuẩn

Dựa trên kết quả phân tích đếm tế bào theo dòng, chúng tôi xác định được hiệu suất phân lập

tế bào bạch cầu mono là 81,09 ± 6,58% Sau 7 ngày nuôi cấy, từ số lượng tế bào bạch cầu mono trung bình của 3 mẫu là 14,2 ± 4,003 × 106 tế bào đã thu hoạch được 5,93 ± 2,26 × 106 tế bào DC

Tỷ lệ biệt hóa và trưởng thành tế bào DC từ tế bào bạch cầu mono đạt 41,19 ± 5,8 % (Bảng 2)

Bảng 2: Hiệu suất thu nhận tế bào DC từ tế bào mono máu dây rốn

Mẫu Số lượng tế bào bám

GTTB: giá trị trung bình, ĐLC: độ lệch chuẩn

4.2 Kết quả phân lập và đánh giá đặc điểm của exosome tế bào tua máu dây rốn

Đề phân tích kiểu hình của các exosome từ tế bào tua máu dây rốn (gọi tắt là Dex), chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm âm và quan sát dưới hệ thống kính hiển vi điện tử truyền qua Hình ảnh cho thấy các Dex thu nhận từ môi trường nuôi cấy tế bào DC có hình dạng cốc đặc trưng với kích thước trung bình ở mức độ nanomet, dao động từ 50 – 200nm đường kính Thêm vào đó, kết quả phân tích western blot cho thấy các Dex biểu hiện CD9 và CD63, đây là các dấu ấn đặc trưng của exsosome Đặc biệt, chúng tôi còn nhận thấy các Dex biểu hiện cả CD86 là dấu ấn của các tế bào DC Mặc dù mức độ biểu hiện CD86 ở exsosome còn yếu hơn so với mẫu tế bào DC, nhưng những kết quả này cũng chứng tỏ rằng các Dex thu được mang đặc điểm của các tế bào DC (Chi tiết kết quả xem phần phụ lục SP 1.3)

4.3 Kết quả định lượng protein tổng số thu được

Sau khi phân lập, Dex được pha loãng và bảo quản trong PBS ở - 80o cho các thí nghiệm đánh giá đặc tính (đánh giá hình thái, đánh giá chất chỉ thị) Protein toàn phần trong Dex được tách chiết, sau đó sử dụng kit Pierce TM BCA Protein Assay – Thermo SciencetificTM và phương pháp

đo mật độ quang ở bước sóng 562 nm để thiệt lập đường chuẩn và tính toán hàm lượng protein tổng

số trong Dex Kết quả hàm lượng protein tổng số trong Dex được tóm tắt trong Bảng 3

Bảng 3: Kết quả định lượng protein tổng số thu được từ pIL-4Dex

(µg)

Số lượng exosome quy đổi (hạt) [30]

CD8+ T (Bảng 4) Các tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 có xu hướng kích thích tăng sinh cả hai loại tế bào lmpho

T nêu trên, trong khi đó các tế bào DC biệt hóa bởi IFN-α lại kích thích sự tăng sinh chủ yếu của tế bào gamma delta T (Bảng 4)

Bảng 4 Tỷ lệ (%) của các quần thể tế bào T trong quần thể tế bào lympho sau khi đồng nuôi

cấy với DC và các sản phẩm của DC biệt hóa từ tế bào tua máu dây rốn (*p ˂ 0.05)

(a) Ảnh hưởng của các tế bào IL-4DC và Il-4Dex đến tỷ lệ (%) các thành phần trong quần

(b) Ảnh hưởng của các tế bào IFN-DC và IFN-DMed đến tỷ lệ (%) các thành phần trong

quần thể tế bào lympho (* p ˂ 0.05)

pIL-12

thống đếm tế bào theo dòng (B) Tỷ lệ phần trăm trung bình các kháng nguyên bề mặt trên tế bào A549 sau khi cảm ứng với exsosome phân lập từ tế bào pIL-4DC

4.5 Kết quả cảm ứng tế bào ung thư A549 với IL4-Dex

Trong nghiên cứu này chúng tôi muốn đánh giá khả năng cảm ứng của exosome từ tế bào tua lên sự biểu hiện kiểu hình miễn dịch của các té bào ung thư phổi A549 Các nghiên cứu về exosome

đã chỉ ra rằng các túi tiết này có thể được thu nhận bởi các tế bào khác, bao gồm cả các tế bào ung thư Do vậy chúng tôi kỳ vọng rằng exosome từ tế bào tua máu dây rốn sau khi ủ với tế bào A549

sẽ được thâm nhập vào các tế bào này và biến đổi kiểu hình của tế bào Sau 8 giờ ủ với pExo và upExo, các tế bào A549 ở các điều kiện khác nhau được nhuộm các kháng thể đặc trưng cho tế bào

DC và phân tích trên hệ thống đếm tế bào theo dòng chảy Kết quả cho thấy có sự thay đổi biểu hiện của các marker HLA-DR trên bề mặt tế bào A549 khi ủ với các exosome phân lập từ tế bào tua

dây rốn (Hình 4A) Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p˃0.05) Từ kết quả thu

được, sự biểu hiện các kháng nguyên bề mặt được tóm tắt trong biểu đồ dưới đây (Hình 4B)

4.6 Khả năng gây độc tế vào ung thư A549 của các tế bào bạch cầu đơn nhân kích hoạt bởi

Hình 5 Độc tính của các tế bào MNC và lympho T được kích thích bởi DC và sản phẩm của

DC (A) Độc tính (%) đối với tế bào A549 của các tế bào lympho T ở các điều kiện đồng nuôi cấy

với IL-4DC và IL-4Dex (C) Độc tính (%) đối với tế bào A549 của các tế bào MNC ở các điều kiện nuôi cấy với IL-4DC và IL-4Dex (C) Độc tính của các tế bào MNC trên tế bào A549 sau khi các tế bào này được cảm ứng với pIL-4Dex (D) Độc tính (%) đối với tế bào A549 của các tế bào lympho

T ở các điều kiện đồng nuôi cấy với IFN-DC và IFN-DMed Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 3 lần lặp lại thí nghiệm đối với (A), (D) và hai lần với (B), (C) IL-DC: tế bào tua được biệt hóa bởi tổ hợp GMCSF và IL-4; IL-4Dex: các exosome phân lập từ tế bào IL-4DC; IFN-DC: tế bào tua được biệt hóa bởi tổ hợp GMCSF và IFN-α; IFN-DMed: môi trường điều kiện sau nuôi cấy các tế bào tua IFN-DC

Sự trình diện kháng nguyên của tế bào DC đến tế bào lympho T ngoài kích thích tăng sinh còn hoạt hóa khả năng gây độc của các tế bào này Do vậy, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá ảnh hưởng của DC và sản phẩm của DC lên độc tính của tế bào MNC và tế bào lympho T trên dòng tế

13

bào ung thư phổi A549 Kết quả cho thấy các tế bào lympho sau khi đồng nuôi cấy với DC và Dex

đã cảm ứng với kháng nguyên ung thư đều tăng khả năng tiêu diệt các tế bào A549 so với các tế bào lympho đồng nuôi cấy với DC và Dex không cảm ứng và các tế bào lympho không đồng nuôi cấy Các tế bào IL-4DC thể hiện khả năng kích thích mạnh nhất, với tỷ lệ tế bào ung thư bị tiêu diệt là lớn nhất ở tất cả các tỷ lệ đồng nuôi cấy đã thử nghiệm (Hình 5)

4.6.2 Độc tính của liệu gây chết đặc hiệu tế bào ung thư phổi A549 khi tiêm ở chuột thí nghiệm

Sau khi xác định được liều gây chết 80% tế bào ung thư A549, chúng tôi tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của liều dexosome trên chuột nhắt trắng Swiss Chuột được chia thành 3 lô: lô đối chứng không điều trị (ĐCSH); lô đối chứng dung môi, tiêm tĩnh mạch đuôi 100 µl PBS; và lô thí nghiệm, tiêm tĩnh mạch đuôi 100 µl dịch dexosome pha trong PBS, tiêm một liều duy nhất Chuột được cân trọng lượng 4 ngày một lần, theo dõi trong 1 tháng Kết quả cho thấy chuột ở cả ba lô đều tăng trọng bình thường, không có sự khác biệt Quan sát thấy sự vận động, hình thái bên ngoài của chuột

ở các lô đều không có sự khác biệt (Bảng 5) Như vậy, bước đầu có thể kết luận pIL-Dex không gây ảnh hưởng tiêu cực lên trọng lượng cũng như hình thái bên ngoài của chuột thí nghiệm

Bảng 5 Sự tăng trọng lượng chuột ở các lô thí nghiệm

ĐCSH 24.7±2.6 28.5±2.9 29.7±4.0 33.3±4.1 38.0±1.1 40.0±1.2 42.0±2.7 44.4±3.4

ĐCDM 24.8±4.5 27.7±2.9 29.0±4.8 36.0±4.6 37.5±4.2 38.7±2.0 42.9±4.1 43.8±2.5

pIL-4Dex 24.5±2.6 27.9±4.9 29.0±3.2 34.6±2.8 37.0±2.5 40.8±2.7 42.1±3.4 45.2±2.1

5 Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

5.1 Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã biệt hóa tế bào mono máu dây rốn thành các tế bào DC bằng hai phương pháp phối hợp các cytokine là GMCSF với IL4 và GMCSF với IFN-α Các tế bào sau biệt hóa có hình thái điển hình của tế bào tua với sự xuất hiện các tua nhánh dài xung quanh tế bào Và đặc biệt các tế bào biệt hóa đều biểu hiện mạnh các dấu ấn đặc trưng của tế bào tua bao gồm CD80, CD86, CD40, HLA-DR, và CD123 Bên cạnh đó, các tế bào tua sau khi được kích hoạt bới các kháng nguyên từ dòng tế bào ung thư phổi A549 còn có khả năng kích thích tăng sinh các tế bào lympho T CD3+Vγ9 và CD3+

CD8+ Các tế bào IL-4DC chủ yếu kích thích tăng sinh quần thể tế bào T CD3+CD8+, trong khi đó các tế bào IFN-DC lại hướng đến sự tăng sinh của quần thể tế bào T CD3+Vγ9 Đây chính là những tế bào lympho đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư Điều này thể hiện rõ ở thí nghiệm đánh giá độc tính của các tế bào bạch cấu đơn nhân đồng loại đối với tế bào ung thư phổi A549 sau khi kích thích bởi các tế bào tua máu dây rốn Các tế bào MNC phân lập từ máu ngoại vi có khả năng tiêu diệt hơn 80% tế bào ung thư A549 tại tỷ lệ ủ E/T là 50/1 sau khi được kích hoạt bởi các tế bào tua đã cảm ứng, so với hơn 20% ở các tế bào MNC không được kích hoạt Những kết quả này cho thấy chúng tôi không chỉ biệt hóa thành công các tế bào tua từ tế bào mono máu dây rốn, mà còn chứng minh rằng các tế bào tua này có khả

năng kích thích miễn dịch chống ung thư in vitro Bên cạnh các tế bào tua, chúng tôi cũng tiến hành

thu nhận và đánh giá hoạt tính của các exosome phân lập từ các tế bào tua Il-4DC Kết quả cho thấy các exosome phân lập từ các tế bào tua trưởng thành được kích hoạt bởi kháng nguyên ung thư A549 cũng có khả năng kích thích tăng sinh quần thể tế bào lympho T tương tự như chính các tế

bào mẹ (p ˃ 0,05) Đồng thời các Dex cũng có khả năng kích thích độc tính của các tế bào MNC và

tế bào lympho T đồng loại đối với tế bào ung thư phổi A549 Khả năng này của các Dex phân lập từ

tế bào tua cảm ứng với kháng nguyên ung thư còn cao hơn cả bản thân tế bào tua không cảm ứng với kháng nguyên ung thư Những kết quả trên cho thấy Dex có khả năng trình diện kháng nguyên đến tế bào lympho T và kích thích các tế bào này tăng sinh cũng như nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư A549, tương tự như bản thân các tế bào tua

14

Nghiên cứu này của chúng tôi cũng vẫn còn một số hạn chế như chưa đánh giá được khả năng kích thích miễn dịch của các Dex sau bảo quản lạnh, chưa trực tiếp so sánh hoạt tính của Dex trên các tế bào MNC tự thân và đồng loại, chưa đánh giá được hoạt tính của Dex trên động vật thực nghiệm Mặc dù vậy, nghiên cứu này này của chúng tôi đã đánh giá được khả năng kích thích miễn

dịch chống ung thư in vitro của các dexosome thu nhận từ tế bào tua được biệt hóa từ tế bào mono

máu dây rốn người Các kết quả của nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc phát triển liệu pháp vắc xin chống ung thư sử dụng dexosome từ tế bào tua máu dây rốn

5.2 Tài liệu tham khảo

1 Bol KF, Schreibelt G, Gerritsen WR, et al Dendritic Cell Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond Clin Cancer Res 2016;22:1897-906

2 Bol KF, Mensink HW, Aarntzen EH, et al Long overall survival after dendritic cell vaccination in metastatic uveal melanoma patients Am J Ophthalmol 2014;158:939-47

3 Pitt JM, André F, Amigorena S, et al Dendritic cellderived exosomes for cancer therapy J Clin Invest 2016;126:1224-32

4 Palucka K, Banchereau J Cancer immunotherapy via dendritic cells Nat Rev Cancer 2012;12:265-77

5 Johnstone RM, Adam M, Hammond JR, et al Vesicle formation during reticulocyte maturation Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes) J Biol Chem 1987;262:9412-20

6 Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, et al B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles J Exp Med 1996;183:1161-72

7 Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, et al Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes Nat Med 1998;4:594-600

8 Mignot G, Roux S, Thery C, et al Prospects for exosomes in immunotherapy of cancer J Cell Mol Med 2006;10:376-88

9 Thery C, Duban L, Segura E, Veron P, et al Indirect activation of naive CD4+ T cells by dendritic derived exosomes Nat Immunol 2002;3:1156–62

cell-10 Escudier B, Dorval T, Chaput N, et al Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial J Transl Med 2005;3:10

11 Morse MA, Garst J, Osada T, et al A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced nonsmall cell lung cancer J Transl Med 2005;3:9

12 Dai S, Wei D, Wu Z, et al Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exosomes combined with GMCSF for colorectal cancer Mol Ther 2008;16:782-90

13 Besse B, Charrier M, Lapierre V, et al Dendritic cell derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC Oncoimmunology

14 Viaud S, Ploix S, Lapierre V, et al Updated technology to produce highly immunogenic dendritic derived exosomes of clinical grade: a critical role of interferon-γ J Immunother 2011;34:65-75

cell-15 Schreiner B, Mitsdoerffer M, Kieseier BC, et al Interferon-beta enhances monocyte and dendritic cell expression of B7-H1 (PD-L1), a strong inhibitor of autologous T-cell activation: relevance for the immune modulatory effect in multiple sclerosis J Neuroimmunol 2004;155:172-82

16 Näslund TI, Gehrmann U, Qazi KR, et al Dendritic cellderived exosomes need to activate both T and B cells to induce antitumor immunity J Immunol 2013;190:2712-9

17 Bobisse S, Foukas PG, Coukos G, et al Neoantigen-based cancer immunotherapy Ann Transl Med 2016;4:262

18 de Gruijl TD, van den Eertwegh AJ, Pinedo HM, et al Whole-cell cancer vaccination: From autologous

to allogeneic tumor- and dendritic cell-based vaccines Cancer Immunol Immunother 2008, 57, 1569–

21 de Gruijl T, Santegoeds S, van Wetering S, et al Allogeneic dendritic cell (DC) vaccination as an ―off the shelf‖ treatment to prevent or delay relapse in elderly acute myeloid leukemia patients: Results of Phase I/IIa safety and feasibility study J Immunother Cancer 2013, 1 (Suppl 1), 205

22 van de Loosdrecht AA, van Wetering S, Santegoets SJAM, et al A novel allogeneic off-the-shelf

26 Nidea M, Terunuma H, Eiraku Y, et al Effectively induction of melanoma-antigen-specific CD8þ T cells via Vg9gd T cell expansion by CD56(highþ) interferon-a-induced dendritic cells Exp Dermatol 2015;24(1):35-41 doi:10.1111/exd.12581 Epub 2014 Dec 8

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Tóm tắt

Vắc-xin sử dụng tế bào tua tự thân đã và đang được ứng dụng trong điều trị ung thư Tuy nhiên hiệu quả điều trị cũng như một số điểm bất lợi của liệu pháp vẫn còn cần phải được khắc phục Vắc-xin sử dụng tế bào tua đồng loại cũng như sử dụng exosome tiết từ tế bào tua được cho là

có thể khắc phục được những hạn chế của liệu pháp tế bào tua tự thân Máu dây rốn, vốn được coi

là rác thải y tế, có thể được sử dụng như là một nguồn cung cấp tế bào tua đồng loại đầy tiềm năng Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ đánh giá khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư của các tế bào tua biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn (gọi tắt là DC) và của các exsosome tiết từ các tế bào tua này (gọi tắt là Dex) Để thực hiện được mục tiêu trên chúng tôi sử dụng hai phương pháp biệt hóa tế bào tua, trong đó phương pháp truyền trống là sử dụng GMCSF phối hợp với IL-4; và phương pháp mới được phát triển trong khoảng 10 năm trở lại đây là sử dụng phối hợp GMCSF với IFN-α Các exsosme từ tế bào tua được thu nhận bằng phương pháp siêu li tâm Để đánh giá khả năng kích thích miễn dịch đồng loại của DC và Dex, chúng tôi sử dụng các tế bào lympho phân lập

từ máu ngoại vi của người trưởng thành khỏe mạnh Kết quả cho thấy các DC và Dex có khả năng kích thích tăng sinh của các tế bào lympho T đồng loại, đặc biệt là tế bào lympho T CD3+Vγ9 Đồng thời, các tế bào lympho hoặc tế bào bạch cầu đơn nhân cảm ứng với DC đã được kích hoạt bằng kháng nguyên ung thư A549 và các Dex thu nhận từ các tế bào DC này có khả năng tiêu diệt

tế bào ung thư phổi A549 hiệu quả hơn các tế bào cảm ứng với DC và Dex không kích thích với kháng nguyên ung thư Những kết quả này cho thấy tế bào DC biệt hóa từ tế bào tua máu dây rốn và các exsosome tiết từ các tế bào tua này có khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư in vitro, và chúng có thể phát triển thành vaccin chống ung thư

Abstract

Autologous dendritic cell (DC) vaccination has shown outstanding achievements in cancer treatment, although it still has some adverse side effects Vaccination with allogeneic DC and DC-derived exosomes has been thought to overcome the side effects of the parental DCs In this study,

we aimed to evaluate the immunogenicity of alloDCs differentiated from cord blood monocytes and their isolated exosomes We performed the experiments to check the ability of DCs and their exosomes to prime allogeneic T cell proliferation and allogeneic peripheral blood mononuclear cell (alloPBMCs), and/or lymphocyte (alloLym) cytotoxicity against A549 lung cancer cells We found that both lung tumor cell lysate-pulsed DCs and their exosomes could induce allogeneic T cell proliferation Moreover, alloPBMCs and alloLym primed with tumor cell lysate-pulsed DCs and their exosomes have a greater cytotoxic activity against A549 cells compared to unprimed cells and cells primed with unpulsed DCs and their exosomes Our study indicated that tumor cell lysate-pulsed DCs and their exosomes should be considered to develop into a novel immunotherapeutic strategy—e.g., vaccines—for patients with lung cancer Our results also suggested that cryo umbilical cord blood mononuclear cells source, which is a readily and available source, is effective for generation of allogeneic DCs and their exosomes will be material for vaccinating against cancer

16

PHẦN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

Đăng ký Đạt được

1 Quy trình phân lập, nhân nuôi

tế bào tua máu dây rốn và cảm

ứng tế bào tua non thành tế

bào tua trưởng thành với dịch

chiết của tế bào ung thư phổi

A549

- Hiệu suất phân lập ≥70%

- Các tế bào tua non thu được biểu hiện các dấu ấn đặc trưng: CD14-, CD11c+, CD80low, CD40low

- Các tế bào tua sau cảm ứng biểu hiện các marker đặc trưng của tế bào trưởng thành với tỷ lệ biểu hiện là

≥ 80% CD40high, CD80high, CD86high

- Quy trình ổn định, có khả năng lặp lại

- Hiệu suất phân lập đạt 81,09 ± 6,58%

- Các tế bào tua non thu được biểu hiện các dấu ấn đặc trưng: CD14-, CD11c+, CD80low, CD40low

- Các tế bào tua sau cảm ứng biểu hiện các marker đặc trưng của tế bào trưởng thành với tỷ lệ biểu hiện là ≥ 80% CD40high, CD80high, CD86high

- Quy trình ổn định sau 3 - 4

lần lặp lại

2 Số liệu đánh giá khả năng tiêu

diệt tế bào ung thư phổi của tế

bào T được cảm ứng với

exosome từ tế bào tua dây rốn

- Tỷ lệ gây chết tế bào ung thư phổi của tế bào T cảm ứng với exosome tăng so với tế bào T không cảm ứng

- Tỷ lệ gây chết tế bào ung thư phổi của tế bào T cảm ứng với exosome tăng 2,67 lần so với tế bào T không cảm ứng với exosome tại tỷ

lệ E:T là 50:1

3 Số liệu đánh giá độc tính của

liều tiêm exosome gây chết tế

bào ung thư phổi A549 trên

chuột thí nghiệm

- Không ảnh hưởng đến sự tăng trọng lượng chuột

- Không ảnh hưởng đến hình thái và hành vi của chuột qua quan sát trực tiếp

- Không ảnh hưởng đến sự tăng trọng lượng chuột

- Không ảnh hưởng đến hình thái và hành vi của

chuột qua quan sát trực tiếp

- Có khả năng kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho

T đạt ≥ 30%

- Chế phẩm exosome có nồng độ đạt ≥ 1011

hạt/ml

- Có khả năng kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho

T gấp 2,3 lần (≥ 30%) sau 7

ngày đồng nuôi cấy

5 Báo cáo về khả năng chế tạo

vắc xin chống ung thư từ các

kết quả nghiên cứu

- Khả năng chế tạo vắc xin chống ung thư từ các kết quả của đề tài

- Các tế bào tua và exosome

từ tế bào tua biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn có khả năng phát triển thành vắc xin chống ung thư

Ghi địa chỉ

và cảm ơn

sự tài trợ của

Đánh giá chung

(Đạt, không

17

nhận SHTT/ xác nhận sử dụng sản phẩm) ĐHQGHN đúng quy

định

đạt)

1 Công trình công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus 02

1.1 Uyen Thi Trang Than, Huyen Thi

Le, Diem Huong Hoang,

Xuan-Hung Nguyen, Cuong Thi Pham,

Khanh Thi Van Bui, Hue Thi

Hong Bui, Phong Van Nguyen, Tu

Dac Nguyen, Thu Thi Hoai Do,

Thao Thi Chu, Anh Viet Bui, Liem

Thanh Nguyen, Nhung Thi My

Hoang Induction of Antitumor

Immunity by Exosomes Isolated

from Cryopreserved Cord Blood

1.2 Anh B.V., Thao C.T., Cuong P.T.,

Thuy N.T.T., Diem H.H., Van

Khanh B.T., Hue B.T.H., Uyen

2 Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

3 Đăng ký sở hữu trí tuệ 01

3.1 Quy trình phân lập exosome từ

môi trường nuôi cấy tế bào tua

máu dây rốn

Đã Chấp nhận đơn, Quyết định Chấp nhận đơn hợp lệ

số 45717/QĐ-SHTT của Cục Sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên

ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

01

5.1 Thân Thị Trang Uyên, Tô Thanh

Thúy, Phạm Thị Cường, Hoàng

Hương Diễm, Bùi Thị Hồng Huế,

18

Hoàng Thị Mỹ Nhung Phân lập

exosome từ tế bào tua biệt hóa từ

tế bào mono máu dây rốn cảm ứng

với interferon-α Tạp chí Y học

thực hành tháng 12 năm 2020,

2(497): 273-277

6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng của đơn vị sử dụng

7 Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở

ứng dụng KH&CN

Ghi chú:

- Cột sản phẩm khoa học công nghệ: Liệt kê các thông tin các sản phẩm KHCN theo thứ tự

<tên tác giả, tên công trình, tên tạp chí/nhà xuất bản, số phát hành, năm phát hành, trang đăng công trình, mã công trình đăng tạp chí/sách chuyên khảo (DOI), loại tạp chí ISI/Scopus>

- Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp nhận nếu

có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn tài trợ của ĐHQGHN theo đúng quy định

- Bản phô tô toàn văn các ấn phẩm này phải đưa vào phụ lục các minh chứng của báo cáo Riêng sách chuyên khảo cần có bản phô tô bìa, trang đầu và trang cuối có ghi thông tin mã số xuất bản

3.3 Kết quả đào tạo

1 Lê Thị Huyền 6 tháng/10.829.000 đ Luận văn: Nghiên cứu khả năng

kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông

Đã bảo vệ

2 Hoàng

Hương Diễm

3 tháng /3.900.000 đ Luận văn cao học: Đặc điểm

exosomes tiết từ tế bào gốc trung

mô dây rốn và tế bào tua biệt hóa

từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn

Đã có quyết định bảo vệ

1 Bài báo công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống

ISI/Scopus

2 Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản 0

4 Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus 0

5 Số lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp

chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học

đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng

của đơn vị sử dụng

0

7 Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định

chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

(triệu đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu đồng)

Ghi chú

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con 254,018 254,018

PHẦN VI PHỤ LỤC (minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

- Phụ lục 1: Sản phẩm báo cáo khoa học

SP 1.1: Quy trình phân lập, nhân nuôi tế bào tua máu dây rốn và cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành với dịch chiết của tế bào ung thư phổi A549

SP 1.2: Số liệu đánh giá khả năng tiêu diệt tế bào ung thư phổi của tế bào T được cảm ứng với exosome từ tế bào tua dây rốn

SP 1.3: Số liệu đánh giá độc tính của liều tiêm exosome gây chết tế bào ung thư phổi A549 trên chuột thí nghiệm

- Phụ lục 3: Minh chứng đào tạo

SP 3.1: Quyết định hướng dẫn và Bằng Thạc sỹ của học viên 1

SP 3.2: Quyết định hướng dẫn và Quyết định Hội đồng bảo vệ Thạc sỹ của học viên 2

- Phụ lục 4: Sở hữu trí tuệ - Giải pháp hữu ích

SP 4.1: Quyết định

SP 4.2: Thuyết minh về ―Quy trình thu nhận dexosome từ các tế bào tua trưởng thành được cảm ứng từ các tế bào tua non biệt hóa từ máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư‖

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

PHỤ LỤC 1 SẢN PHẨM BÁO CÁO KHOA HỌC

1 SP 1.1 Quy trình phân lập, nhân nuôi tế bào tua máu dây rốn và cảm

ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành với dịch chiết của tế bào ung thư phổi A549

2 SP 1.2 Số liệu đánh giá khả năng tiêu diệt tế bào ung thư phổi của tế bào

T được cảm ứng với exosome từ tế bào tua dây rốn

3 SP 1.3 Số liệu đánh giá độc tính của liều tiêm exosome gây chết tế bào

ung thư phổi A549 trên chuột thí nghiệm

4 SP 1.4 Chế phẩm exosome tinh sạch từ tế bào tua máu dây rốn có khả

năng kích thích sự tăng sinh của lympho T

5 SP 1.5 Báo cáo về khả năng chế tạo vắc xin chống ung thư từ các kết

quả nghiên cứu

1

SẢN PHẨM KHOA HỌC 1.1 Quy trình phân lập, nhân nuôi tế bào tua máu dây rốn và cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành với dịch chiết của tế bào ung thư

phổi A549

MỤC ĐÍCH

1 Hướng dẫn cho các chuyên viên, nhà nghiên cứu, kỹ thuật viên thực hiện quy trình phân lập, nhân nuôi tế bào tua máu dây rốn và cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành với dịch chiết của tế bào ung thư phổi A549

2 Theo dõi và kiểm tra các chuyên viên, nhà nghiên cứu, kỹ thuật viên có thực hiện theo đúng quy trình đã đề ra

VIẾT TẮT

- Tế bào bạch cầu đơn nhân: MNC (mononuclear cells)

- Đệm muối photphat: PBS (Phosphate Buffered Saline)

QUY TRÌNH THỰC HIỆN

1 Nguyên tắc an toàn

1.1 Tuân thủ quy định về kiểm soát nhiễm khuẩn, và chất thải độc hại theo hướng dẫn của phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào

1.2 Tuân thủ các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm

1.3 Xử lý rác thải theo quy định của phòng thí nghiệm

1.4 Tuân thủ đúng và chính xác các bước thực hiện được nêu trong SOP này

2 Quy trình thực hiện chính:

Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa ở Hình 1

Diễn giải chi tiết các bước của quy trình được thể hiện ở các phần tiếp theo

2

Hình 1 Quy trình phân lập, biệt hóa và cảm ứng tạo tế bào tua từ tế bào mono máu dây

rốn

2.1 Phân lập tế bào đơn nhân

- Pha loãng máu cuống rốn toàn phần bằng PBS (Gibco, Mỹ) chứa 20% FBS (Gibco, Mỹ) theo

tỉ lệ 1 : 1 về thể tích

- Ly tâm ở 840×g trong 20 phút, tăng tốc chậm, không phanh Sau ly tâm, dung dịch trong ống

sẽ phân thành 4 lớp như Hình 2

- Lớp trên cùng màu vàng nhạt: PBS và huyết tương

- Lớp thứ hai màu trắng đục là Buffy coat chứa tế bào đơn nhân gồm tế bào mono và lympho

- Lớp tiếp theo màu hồng nhạt hoặc trắn, đó là dung dịch Ficoll

- Lớp cuối cùng là các tế bào hồng cầu bám dưới đáy ống

- Thu lớp tế bào đơn nhân: Sử dụng pipet hút lớp tế bào đơn nhân vào ống mới Lưu ý hút vòng

quanh và chậm để lấy được toàn bộ lớp tế bào đơn nhân, tránh sục với lớp Ficoll phía dưới

Hình 2 Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll

- Rửa tế bào đơn nhân: Bổ sung PBS vào ống chứa tế bào đơn nhân đã thu để đạt thể tích 45ml

mỗi ống và ly tâm 640×g trong 10 phút

3

- Sau ly tâm loại bỏ dịch nổi, bổ sung PBS để đạt thể tích 40 ml mỗi ống, lấy 50 uL dịch tế bào

để xác định mật độ tế bào đơn nhân, tế bào còn lại trong ống được ly tâm với tốc độ 270×g

trong 8 phút, thu tế bào dưới đáy ống

- Xác định số tế bào đơn nhân: Nhuộm tế bào thu được với thuốc nhuộm Turck theo tỉ lệ 1:1 về

thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào Số lượng tế bào được tính như sau:

MNC = 2 Thể tích (ml)

2.2 Phân lập tế bào bạch cầu mono bằng phương pháp bám dính

- Bổ sung 5 mL môi trường KBM 551 (Corning, Mỹ) để tái phân bố tế bào trong dung dịch

- Gieo tế bào vào các chai nuôi cấy có sẵn môi trường KBM 551 (Corning, Mỹ) với nồng độ

2 × 106 tế bào/ ml môi trường, ủ ấm trong tủ 37 oC và 5% CO2 trong vòng 2 giờ

- Quan sát tế bào dưới kính hiển vi để đánh giá tình trạng bám dính cảu tế bào

- Loại bỏ toàn bộ các tế bào không bám dính bằng cánh dùng pipet nhẹ nhàng hút toàn bộ dịch nuôi cấy Các tế bào không bám dính sẽ bị hút cùng dung dịch

- Bổ sung môi trường nuôi cấy mới theo bước 2.3 dưới đây

2.3 Nuôi cấy biệt hóa tế bào mono thành tế bào tua chưa trưởng thành

- Các tế bào bám dính còn lại trong chai tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường KBM 551

có bổ sung các cytokine GM-CSF (1000 U/ ml) và IL-4 (500 U/ ml) để kích thích sự biệt hóa của tế bào bạch cầu mono thành tế bào tua chưa trưởng thành

- Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy sẽ thay mới môi trường như sau: 50% thể tích môi trường nuôi cấy tế bào sẽ được thay thế bằng thể tích tương đương với môi trường nuôi cấy mới Cách tiến hành như sau: Dùng pipet nhẹ nhàng hút toàn bộ dịch môi trường nuôi cấy cho vào ống li tâm Li tâm tại

tốc độ 270 × g trong 8 phút Dùng pipet hút 50% lượng dịch nổi và trải lại vào chai nuôi cấy chứa

tế bào Bổ sung một lượng thể tích tương đương môi trường nuôi cấy mới

- Tiếp tục nuôi cấy đến ngày thứ 5 kể từ khi bắt đầu nuôi cấy

2.4 Phương pháp cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành

Tại ngày nuôi cấy thứ 5, các tế bào sẽ được cảm ứng với protein toàn phần thu nhận từ dòng

tế bào ung thư phổi A549:

- Thay 50% môi trường như bước 2.3, tuy nhiên môi trường mới sẽ bổ sung protein tổng số của tế bào A549 với nồng độ là 100 μg/ ml

- Tại ngày nuôi cấy thứ 6, bổ sung TNF-α để đạt nồng độ 500 U/ ml

- Thu hoạch tế bào vào ngày nuôi cấy thứ 7 để kiểm tra chất lượng hoặc tiến hành các thí nghiệm cần thiết khác

2.5 Phương pháp thu hoạch tế bào tua

- Loại bỏ môi trường nuôi cấy bằng pipet hút nhả

- Rửa chai nuôi cấy với các tế bào bám dính bằng PBS 2 lần để loại bỏ hoàn toàn môi trường Lưu ý sử dụng pipet nhả từ từ môi trường vào thành chai để tránh làm bong tế bào

- Thu toàn bộ tế bào ra các ống ly tâm mới, thu 50 ul vào một ống li tâm 1,5 ml để xác định số lượng tế bào, phần còn lại ly tâm tại 270×g trong 8 phút để loại dịch nổi, thu tế bào

- Đếm tế bào: Nhuộm 50 ul tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo tỉ lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào Số lượng tế bào được tính như sau:

Số lượng tế bào DC = 2 Thể tích (ml)

- Kiểu hình miễn dịch của các tế bào tua được đánh giá bằng các dấu ấn sau: CD14, CD40, CD56, CD80, CD86, HLA-DR

3 Minh chứng về tính ổn định của quy trình

3.1 Số lượng tế bào mono thu nhận sau 3 lần phân lập:

Chúng tôi xác định số lượng tế bào mono thu nhận từ 3 mẫu máu dây rốn sử dụng phương pháp bám dính Kết quả thu được thể hiện như trong Bảng 1 và cụ thể thu được số lượng tế bào bám dính trung bình của 3 mẫu là 14,2 ± 4,003 × 106 tế bào

Bảng 1 Số lượng tế bào MNC bám dính sau khi thay môi trường

Mẫu Số lượng tế bào bám

GTTB: giá trị trung bình, ĐLC: độ lệch chuẩn

Từ số lượng tế bào mono thu được, chúng tôi tính toán hiệu suất phân lập tế bào mono máu dây rốn là 81,09 ± 6,58% (bảng 2)

Bảng 2 Tỷ lệ tế bào bạch cầu mono qua quá trình phân lập vào ngày 0 dựa trên phân tích

bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng Mẫu Tỷ lệ tế bào bạch cầu

mono trước khi phân

lập (%)

Tỷ lệ tế bào bạch cầu mono sau khi phân lập (%)

Hiệu suất phân lập monocytes (%)

5

3.2 Hiệu suất biệt hóa tạo tế bào tua

Sau 7 ngày nuôi cấy, từ số lượng tế bào bạch cầu mono trung bình của 3 mẫu là 14,2 ± 4,003 × 106 tế bào đã thu hoạch được 5,93 ± 2,26 × 106 tế bào tua Tỷ lệ biệt hóa và trưởng thành tế bào DC từ tế bào bạch cầu mono đạt 41,19 ± 5,8 % (Bảng 3)

Bảng 2: Hiệu suất thu nhận tế bào DC từ tế bào mono máu dây rốn

Mẫu Số lượng tế bào bám

GTTB: giá trị trung bình, ĐLC: độ lệch chuẩn

3.3 Cảm ứng tế bào tua non thành tế bào tua trưởng thành

Các kết quả dưới đây thu nhận từ 4 lần lặp lại quy trình đã được mô tả trong phần 2.

Tế bào khi biệt hóa bằng tổ hợp cytokine GMCSF và IL-4 có sự thay đổi hình thái theo thời gian (Hình 3A) Từ hình thái tròn đặc trưng của tế bào mono, các tế bào tăng lên về kích thước và dần phát triển các tua nhánh bao xung quanh, đây là hình thái đặc trưng của tế bào tua Bên cạnh

đó, phân tích kiểu hình miễn dịch cho thấy phần lớn các tế bào trong quần thể biểu hiện cao các dấu

ấn đặc trưng của tế bào tua (Hình 3B) So sánh với các tế bào sau cảm ứng với kháng nguyên ung thư (p-DC) với các tế bào không cảm ứng kháng nguyên (up-DC) và các tế bào mono cho thấy sự

tăng biểu hiện rõ rệt (p<0.05) của các dấu ấn này (Hình 3C)

Hình 3 Các tế bào DC biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn sử dụng IL-4 (A) Hình thái tế bào

DC sau khi biệt hóa không cảm ứng (Aa) hoặc cảm ứng (Ab) với kháng nguyên ung thư A549 (B)

Tỷ lệ (%) các tế bào biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của tế bào tua trong quần thể tế bào DC cảm ứng hoặc không cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549 (C) So sánh mức độ biểu hiện các dấu

ấn của tế bào DC trên hai quần thể upIL-4DC và pIL-4DC Các số liệu được thể hiện tại giá trị

6

trung bình ±SD trong 4 lần lặp lại thí nghiệm (*: p<0,05) D0: tế bào tại ngày nuôi cấy biệt hóa

đầu tiên; upIL-4DC: tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 không cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549; pIL-4DC: tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Guidebook for the application of immune cell therapy and related products Corning

2 Uyen Thi Trang Than, Huyen Thi Le, Diem Huong Hoang, Xuan-Hung Nguyen, Cuong Thi Pham, Khanh Thi Van Bui, Hue Thi Hong Bui, Phong Van Nguyen, Tu Dac Nguyen, Thu Thi Hoai

Do, Thao Thi Chu, Anh Viet Bui, Liem Thanh Nguyen, Nhung Thi My Hoang Induction of Antitumor Immunity by Exosomes Isolated from Cryopreserved Cord Blood Monocyte-Derived Dendritic Cells Int J Mol Sci 2020 Mar 6;21(5):1834 doi: 10.390/ijms21051834

SẢN PHẨM BÁO CÁO KHOA HỌC 1.2

Số liệu đánh giá khả năng tiêu diệt tế bào ung thư phổi của tế bào T được cảm ứng với exosome

từ tế bào tua dây rốn

Sự trình diện kháng nguyên của tế bào DC đến tế bào lympho T ngoài kích thích tăng sinh còn hoạt hóa khả năng gây độc của các tế bào này Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của DC và sản phẩm của DC lên độc tính của tế bào đơn nhân (MNC) và tế bào lympho T đồng loại trên dòng tế bào ung thư phổi A549 Dưới đây là số liệu liên quan đến hai loại tế bào DC được biệt hóa từ tế bào mono máu dây rốn theo hai tổ hợp cytokine là GMCSF với IL-4 (IL-4DC) và GMCSF

với IFN-α (IFN-DC) và các sản phẩm tương ứng của hai loại tế bào này

1 Khả năng gây độc tế vào ung thư A549 của các tế bào MNC và lympho T kích hoạt bởi 4DC và IL4-Dex

IL-1.1 Độc tính của tế bào MNC và tế bào lympho T kích hoạt bởi IL-4DC và IL4-Dex trên tế bào A549

Để đánh giá độc tính của các tế bào MNC và tế bào lympho T sau khi được kích thích bởi

DC hoặc Dex/Dmed, chúng tôi sử dụng dòng tế bào ung thư phổi A549 đánh dấu huỳnh quang với calcein-acetyoxymethyl (calcein-AM), và phân tích trên hệ thống Tera Scan VPC2 (Minervatech, Japan) Các tế bào MNC và lympho T là các tế bào hiệu ứng (effector cells – ký hiệu là E), và các tế bào A459 là tế bào đích (terget cells – ký hiệu là T) Kết quả cho thấy, sau 2h ủ với tế bào hiệu ứng , có sự suy giảm đáng kể tín hiệu huỳnh quang tại các giếng chứa tế bào A549 ủ với các tế bào miễn dịch đã cảm ứng với tế bào DC hoặc sản phẩm của tế bào DC so với những tế bào không được cảm

ứng (p < 0.05), (Hình 1A) Những tế bào MNC hoặc T cảm ứng với pIL-4DC có độc tính lớn nhất

tại tất cả các tỷ lệ ủ của E:T Tại tỷ lệ E;T là 50:1, các tế bào MNC hoặc T cảm ứng với pIL-DC có khả năng tiêu diệt tương ứng là 87% và 80% tế bào A549 (Hình 1B) Thêm vào đó, các tế bào MNC và T cảm ứng bởi pIL-4Dex có độc tính với tế bào ung thư A549 mạnh hơn 2 và 2,4 lần so với các tế bào cảm ứng bởi upIL-4DC (Hình 1B) Các exosome phân lập từ upIL-4DC không có ảnh hưởng đến độc tính của tế bào T, nhưng lại có khả năng kích thích độc tính của tế bào MNC tiêu diệt tế bào A459 hiệu quả hơn 1,4 lần so với bản thân các tế bào upIL-4DC tại tỷ lệ ủ 50E:1T (Hình 1B) Nói tóm lại, các kết quả này cho thấy các tế bào MNC khi được cảm ứng với pIL-4DC

và pIL-4Dex sẽ tăng được khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư phổi A549

Hình 1 Độc tính của các tế bào MNC và lympho T được kích thích bởi IL-4DC và IL-4Dex

(A) Các tế bào A549 được đánh dấu huỳnh quang bởi Calcein-AM thể hiện bằng các điểm phát ánh sáng màu xanh lá Tín hiệu huỳnh quang bị giảm rõ rệt ở các giếng ủ với tế bào MNC cảm ứng với pIL-4DC, pIL-4Dex và upIL-4Dex (tại tỷ lệ E:T là 50:1) Ngược lại, không quan sát thấy sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang ở các giếng đối chứng hoặc ủ với upIL-4DC (B) Độc tính (%) đối với tế bào A549 của các tế bào MNC ở các điều kiện đồng nuôi cấy khác nhau (C) Độc tính (%) đối với

tế bào A549 của các tế bào lympho T ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau Các số liệu được thể hiện

tại giá trị trung bình ±SD trong 3 lần lặp lại thí nghiệm đối với (B) và hai lần với (C)

1.2 Độc tính của tế bào MNC kích hoạt bởi IL-4DC và IL4-Dex trên tế bào A549 đã cảm ứng với dexosome

Các tế bào ung thư A549 được nhuộm với Calcein trước khi ủ với MNC đã được cảm ứng, chụp ảnh dõi tại 0 giờ và 2 giờ sau khi ủ Kết quả cho thấy, sau 2 giờ cường độ tín hiệu huỳnh

quang của các tế bào A549/pExo thay đổi tương tự như các tế bào A549 không cảm ứng với pExo khi ủ với MNC tại các điều kiện khác nhau Tỷ lệ tế bào A549/pExo bị tiêu diệt cao nhất tại quần thể MNC cảm ứng với pDC, với 78,3 ± 5.1 %, 68.4 ± 3.4%, và 45.2 ± 7.4% tế bào bị chết tại tỷ lệ E/T tương ứng là 50/1; 25/1; và 12.5/1 Hoạt tính của tế bào miễn dịch thấp nhất tại quần thể MNC cảm ứng với upExo, trong đó tại tỷ lệ E/T là 50/1, tỷ lệ tế bào ung thư bị tiêu diệt là 18.2 ± 5.8 % (Hình 2) Khi so sánh giữa A549 bình thường và A549 đã cảm ứng với exosome phân lập từ tế bào pDC, chúng tôi không phát hiện thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê Điều đó chứng tỏ các tế bào ung thư cảm ứng với dexosome có thể chưa làm thay đổi kiểu hình của tế bào theo hướng trở thành đích nhận diện tốt hơn cho các tế bào miễn dịch Cần phải có thêm các thí nghiệm kiểm chứng ở các nồng độ exososme cũng như thời gian cảm ứng với exosome khác nhau của tế bào A549 để dẫn tới sự thay đổi của tế bào ung thư và làm cho chúng trở nên nhạy với các tế bào miễn dịch

Hình 2: Tế bào A549 đã cảm ứng với pIL-4Dex đồng nuôi cấy với các tế bào MNC đã được kích thích với IL-4DC và IL-4Dex Tỷ lệ phần trăm tế bào A549 đã cảm ứng bị tiêu diệt lớn

nhất ở IL-4DC và IL-4Dex

2 Ảnh hưởng của các nồng độ dexosome khác nhau lên độc tính của tế bào lympho T

Các tế bào lympho T được ủ với IL-4Dex tại các nồng độ tương ứng với tỷ lệ ủ của T: DC là: 1:1; 2:1; 4:1; và 8:1 Sau đó các tế bào ung thư A549 đã được ủ với Calcein AM được đồng nuôi cấy với các tế bào lympho T đã được cảm ứng bởi dexosome tại các nồng độ khác nhau Tỷ lệ giữa

tế bào T (E) và tế bào A549 (T) được giữ cố định là 25:1 Theo dõi và chụp ảnh tại 0 giờ và 2 giờ sau khi đồng nuôi cấy Kết quả cho thấy, sau 2 giờ cường độ tín hiệu huỳnh quang của các tế bào A549 quan sát được bị giảm, và ở nồng độ dexosome càng cao thì tín hiệu càng giảm mạnh, chứng

tỏ hiệu quả tiêu diệt càng cao (Hình 3A) Tại hai nồng độ tế bào lympho T cảm ứng với pIL-4Dex lớn nhất, mật độ tín hiệu huỳnh quang thu được là thấp nhất So sánh hiệu quả gây độc tế bào của các tế bào lympho T ngoại vi được cảm ứng với các điều kiện khác nhau thấy rằng các tế bào lympho T được cảm ứng với IL-4Dex có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mạnh hơn so với các tế bào lympho T không được cảm ứng Bên cạnh đó, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy tại tỷ lệ tương tác giữa E/T là 25:1, các tế bào lympho T cảm ứng với exososme thu nhận từ pIL-4DC có khả năng giết tế bào ung thư đạt 81.1 ± 5.4% tại nồng độ exosome tương ứng với tỷ lệ ủ lympho T/DC là 2/1

Ở nồng độ cao hơn, tương ứng với tỷ lệ lympho T/DC là 1/1, độc tính với tế bào ung thư cũng chỉ đạt 79.2 ± 8.7% (Hình 3B) Như vậy có thể thấy nồng độ exosome cảm ứng sẽ ảnh hưởng đến khả năng tiêu diệt tế bào ung thư của các tế bào miễn dịch Và trong nghiên cứu này, nồng độ giết hơn 80% tế bào ung thư là nồng độ exosome tương ứng với tỷ lệ lympho T/DC là 2/1

3 Độc tính của tế bào MNC cảm ứng với IFN-DC và IFN-DMed

Tương tự như với tế bào IL-4DC, các tế bào IFN-DC cũng có khả năng kích thích độc tính của các tế bào lympho đối với tế bào ung thư phổi A549 pIFN-DC kích thích tế bào lympho tốt nhất, với khả năng tiêu diệt các tế bào A549 là 40%, 61,5% và 71%, tại 3 tỷ lệ ủ E:T là 12,5:1; 25:1;

và 50:1 Độc tính của các tế bào lympho cảm ứng với upIFN-DCs và upIFN-DMed thấp hơn đáng

kể so với các tế bào cảm ứng với pIFN-DCs (p < 0.05), với tỷ lệ tiêu diệt tế bào ung thư tại tỷ lệ

50:1 tương ứng là 23 ± 4,7% và 17,5 ± 7,4% so với 71 ± 3.4 Đáng chú ý, độc tính của các tế bào

lympho cảm ứng với pIFN-DMed đối với tế bào A549 cao hơn cả tế bào cảm ứng bởi upIFN-DC (p

< 0.05), với tỷ lệ gây chết 57 ± 9,7% tại E: T là 50:1 (Hình 4)

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ dexosome khác nhau lên độc tính của tế bào lympho T (A)

Tế bào A549 lúc 2h sau khi ủ với lympho T đã cảm ứng với pIL-Dex tại các nồng độ khác nhau (B) Tỷ lệ phần trăm độc tính của tế bào lympho T cảm ứng với exosome tại các nồng độ khác nhau

Hình 4 Độc tính trên tế bào A549 của các tế bào lympho cảm ứng với IFN-DC và IFN-DMed

(A) Hình ảnh các tế bào A59 đánh dấu huỳnh quang thể hiện bằng các điểm màu xanh lá tại tỷ lệ E:T là 50:1 ở các điều kiện đồng nuôi cấy khác nhau (B) Tỷ lệ (%) tế bào ung thư A549 bị tiêu diệt bởi các tế bào lympho cảm ứng với IFN-DC và IFN-DMed Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 3 lần lặp lại thí nghiệm

4 Kết luận

Những kết quả trên cho thấy các tế bào lympho sau khi đồng nuôi cấy với DC và Dex đã cảm ứng với kháng nguyên ung thư đều tăng khả năng tiêu diệt các tế bào A549 so với các tế bào lympho đồng nuôi cấy với DC và Dex không cảm ứng và các tế bào lympho không đồng nuôi cấy Các tế bào IL-4DC thể hiện khả năng kích thích mạnh nhất, với tỷ lệ tế bào ung thư bị tiêu diệt là

lớn nhất ở tất cả các tỷ lệ đồng nuôi cấy đã thử nghiệm

SẢN PHẨM BÁO CÁO KHOA HỌC 1.3

Chế phẩm exosome tinh sạch từ tế bào tua máu dây rốn có khả năng kích thích sự tăng sinh của

lympho T

Các tế bào tua khi trình diện kháng nguyên đến tế bào lympho T sẽ kích thích các tế bào lympho T tăng sinh Trong nghiên cứu này, chúng tôi kiểm tra các tế bào tua và sản phẩm của tế bào tua biệt hóa từ các tế bào mono máu dây rốn bằng hai tổ hợp cytokine là GMCSF với IL-4 và GMCSF với IFN-α lên sự tăng sinh của các tế bào lympho T đồng loài, phân lập từ máu ngoại vi người khỏe mạnh Kết quả thu được xin trình bày ở phần dưới đây

1 Ảnh hưởng của IL-4DC và IL4-Dex

Chúng tôi tiến hành phân lập exosome từ môi trường đã nuôi cấy tế bào tua (Dex) bằng phương pháp siêu ly tâm sử dụng các tốc độ ly tâm khác nhau Sau khi thu nhận, để phân tích kiểu hình của các Dex, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm âm và quan sát dưới hệ thống kính hiển

vi điện tử truyền qua Hình ảnh cho thấy các Dex thu nhận từ môi trường nuôi cấy tế bào DC có hình dạng cốc đặc trưng với kích thước trung bình ở mức độ nanomet, dao động từ 50 – 200nm đường kính (Hình 1A) Thêm vào đó, kết quả phân tích western blot cho thấy các Dex biểu hiện CD9 và CD63, đây là các dấu ấn đặc trưng của exsosome Đặc biệt, chúng tôi còn nhận thấy các Dex biểu hiện cả CD86 là dấu ấn của các tế bào DC Mặc dù mức độ biểu hiện CD86 ở exsosome còn yếu hơn so với mẫu tế bào DC, nhưng những kết quả này cũng chứng tỏ rằng các Dex thu được mang đặc điểm của các tế bào DC (Hình 1B)

Các tế bào lympho T sau khi được tinh sạch từ máu ngoại vi bằng cách sử dụng CD3 microbeads cho thấy mức độ đồng nhất cao với 98.7 ± 1.2% quần thể tế bào thu được dương tính với CD3 Các tế bào này sau đó được đánh dấu huỳnh quang với CFSE và được sử dụng để đánh giá khả năng kích thích tăng sinh của IL-4DC và IL-4Dex Kết quả cho thấy các tế bào lympho T sau khi ủ với pIL-4DC mọc thành từng cụm tế bào lớn – đây là kiểu hình đặc trưng cho các tế bào lympho khi tăng trưởng ở pha log (Hình 1C) Dựa trên mật độ huỳnh quang của CFSE (Hình 1D),

có thể thấy rõ các tế bào lympho T dưới sự kích thích của IL-4DC đã tăng số lượng lên gấp 3 lần tại ngày nuôi cấy thứ 7 so với các tế bào T không được kích thích Ở quần thể tế bào T được kích thích với upIL-4DC, mức độ tăng sinh có giảm hơn so với pIL-4DC Điều thú vị là các IL-4Dex cũng có khả năng kích thích các tế bào T tăng sinh với số lượng tăng gấp 2,3 lần sau 7 ngày, trong khi đó không quan sát thấy sự phân chia tế bào ở quần thể T kích thích với upIL-4Dex (Hình 1E)

Trong số các quần thể tế bào T phụ, các tế bào CD3+Vγ9 T là những tế bào có đáp ứng mạnh nhất với sự kích thích của tế bào IL-4DC Tỷ lệ nhóm tế bào này trong quần thể tế bào T tăng lên từ 5,2 ± 1,7% (D0) đến 31,2 ± 3,1%, 35,7 ± 7,4%, và 32,1 ± 8,3% (D7) tương ứng với kích thích

từ upIL-4DC, pIL-4DC, và pIL-4Dex (Hình 2, Bảng 1) Thêm vào đó, tỷ lệ tế bào CD3+

CD8+ T cũng tăng lên từ 25,8 ± 4,2% (D0) đến 55,3 ± 2,4%, 52,7 ± 5,1%, và 58,9 ± 4,6%, tương ứng với kích thích từ upIL-4DC, pIL-4DC, và pIL-4Dex (Hình 2, Bảng 1) Do vậy, số lượng tế bào tăng trung bình ở quần thể tế bào CD3+Vγ9 T và CD3+

CD8+ T là 11,8 ± 1,5 và 6,0 ± 1,6-lần, so với tế bào đối chứng (Hình 2B) Tuy vậy, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa mức độ tăng số lượng tế

bào T ở ba quần thể kích thích bởi upIL-4DC, pIL-4DC, và pIL-4Dex (Hình 2B, p > 0.05) Ngược

lại với hai quần thể tế bào CD3+Vγ9 T và CD3+

CD8+ T, quần thể CD3+CD4+ T không có sự gia tăng số lượng ở tất cả các điều kiện kích thích Bên cạnh đó, upIL-4Dex cũng không có ảnh hưởng

rõ rệt đến sự tăng sinh của tế bào T (Hình 2, Bảng 1) Những số liệu trên cho thấy u4DC, 4DC, và pIL-4Dex có vai trò quan trọng trong sự thúc đẩy tăng sinh tế bào T, và sự đáp ứng của tế bào T là khác biệt đối với từng quần thể phụ của nhóm tế bào này

pIL-Hình 1 Tế bào IL-4DC và IL-4Dex thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào lympho T (A) pIL-Hình dạng

cốc của các exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử (B) Các tế bào pIL-Dex biểu hiện các dấu ấn miễn dịch CD9, CD63 và CD86 (C) Các tế bào lympho T mọc thành cụm khi đồng nuôi cấy với các tế bào pIL-4DC (D) Các tế bào lympho T đánh dấu với CSFE tăng sinh sau 7 ngày đồng nuôi cấy với pIl-4DC, upIL-4DC và pIL-4Dex, thể hiện bằng sự xuất hiện các đỉnh với cường độ huỳnh quang khác nhau Các tế bào T không đồng nuôi cấy và tế bào T đồng nuôi cấy với upIL-4Dex không thể hiện sự phân chia (E) Số lượng các tế bào lympho T tăng mạnh nhất khi xử lý với pIL-4DC, sau đó là pILL-4Dex và upIL-4DC upIL-4Dex không có ảnh hưởng đến sự tăng số lượng tế bào T Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung

bình ±SD trong 4 lần lặp lại thí nghiệm (*: p<0,05) Exo 1, 2, 3 tương ứng với pIL-4Dex thu từ mẫu

1, 2, và 3; DC lysate: dịch ly giải tế bào pIL-4DC

Hình 2 Các tế bào IL-4DC và IL-4Dex kích thích tăng sinh tế bào lympho T (A) Sau khi đồng

nuôi cấy với pIL-4DC, upIL-4DC và pIL-4Dex, các quần thể tế bào CD3+Vγ9 T và CD3+

CD8+ T đều tăng số lượng so với các tế bào T không đồng nuôi cấy (đối chứng) (B) Mức độ tăng số lượng

tế bào ở 3 quần thể tế bào T phụ là CD3+Vγ9 T, CD3+

CD8+ T, và CD3+CD4+ T ở các điều kiện đồng nuôi cấy khác nhau Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 4 lần lặp lại thí

2 Ảnh hưởng của IFN-DC and IFN-DMed

Chúng tôi cũng tiến hành đánh giá ảnh hưởng của IFN-DC và IFN-DMed lên sự tăng sinh của các tế bào lympho đồng loại Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thu nhận các tế bào lympho là phân đoạn tế bào không bám dính và cho đồng nuôi cấy với tế bào IFN-DC và IFN-DMed Tại ngày thứ 4 sau khi đồng nuôi cấy, chúng tôi cũng quan sát được hình ảnh các cụm tế bào trôi nổi – là kiểu hình của giai đoạn nuôi cấy ở pha tăng trưởng (Hình 3A) Số lượng của các tế bào

lympho tăng đáng kể ở các điều kiện đồng nuôi cấy so với đối chứng không đồng nuôi cấy (p-value

< 0.05), và so với tại thời điểm D0 (p-value < 0.05), (Hình 3B) Số lượng tế bào lympho kích thích

với upIFN-DCs và pIFN-DCs tăng tương ứng là 1,4 ± 0,2 và 2,2 ± 0,3 lần, so với đối chứng sau ngày đồng nuôi cấy (Hình 3B) Sau 7 ngày đồng nuôi cấy, các tế bào lympho ủ với pIFN-DCs tăng 2,7 ± 0,2 lần so với mức tăng của tế bào lympho khi ủ với upIFN-DCs là 1,7 ± 0,3 lần, và pIFN-

DMed là 2,2 ± 0,4 lần, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p-value>0.05) (Hình 3B)

Hình 6 Các tế bào lympho được kích thích tăng sinh bởi IFN-DC và IFN-DMed (A) Các tế

bào lympho mọc thành cụm khi được đồng nuôi cấy với IFN-DC và IFN-DMEd nhưng không quan sát thấy hình ảnh này ở tế bào đối chứng (B) Số lần tăng về số lượng tế bào lympho tại các điều kiện đồng nuôi cấy khác nhau Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 3 lần lặp

lại thí nghiệm (*: p<0,05)

Chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của IFN-DC lên sự tăng sinh của quần thể tế bào CD3+Vγ9 T (Hình 4A) Quần thể tế bào này được xác định bằng hai dấu ấn kết hợp là CD3 và Vɣ9TCR tại ngày D0 và D7 sau khi đồng nuôi cấy Kết quả cho thấy tỷ lệ của quần thể tế bào CD3+Vγ9 T trong quần thể lympho tăng rõ rệt từ dưới 10% tại ngày D0 lên 85,4 ± 8,6% và 81,4 ± 9,2% tại D7 khi kích thích bởi pIFN-DC và upIFN-DC (Hình 4B, Bảng 2) Thêm vào đó, pIFN-DMed và upIFN-Dmed cũng có khả năng kích thích tăng tỷ lệ của quần thể tế bào CD3+Vγ9 T lên 78,9 ± 7,9% và 74,5 ± 2,9% (Hình 4B, Bảng 2) Mức tăng số lượng tế bào CD3+Vγ9 T đạt cao nhất khi ủ với pIFN-DCs (gấp 46,1 ± 9,3 lần), sau đó là pIFN-DMed (34,7 ± 11,3 lần), upIFN-DCs (27,7

±10,4), và upIFN-DMed (22,4 ± 7,5 lần) so với số lượng tế bào tại ngày D0 (p-value < 0.05) (Hình

4C)

Hình 4 Sự tăng sinh của tế bào CD3 + Vγ9 T khi kích thích bởi IFN-DC và IFN-DMed (A) Tỷ

lệ (%) của quần thể tế bào CD3+Vγ9 T trong quần thể tế bào lympho sau khi đồng nuôi cấy với IFN-DC và IFN-DMed (B) So sánh tỷ lệ (%) trung bình của tế bào CD3+Vγ9 T khi xử lý với các điều kiện khác nhau (C) Số lần tăng trung bình số lượng tế bào CD3+Vγ9 T tại các điều kiện đồng nuôi cấy khác nhau Các số liệu được thể hiện tại giá trị trung bình ±SD trong 3 lần lặp lại thí

nghiệm (*: p<0,05).

Bảng 2 Tỷ lệ (%) của các quần thể tế bào T trong quần thể tế bào lympho sau khi đồng nuôi

cấy với IFN-DC và IFN-DMed (*p ˂ 0.05)

CD8+ T Các tế bào DC biệt hóa bởi IL-4 có xu hướng kích thích tăng sinh cả hai loại tế bào lmpho T nêu trên, trong khi đó các tế bào DC biệt hóa bởi IFN-α lại kích thích sự tăng sinh chủ yếu của tế bào gamma delta T

SẢN PHẨM BÁO CÁO KHOA HỌC 1.4

Số liệu đánh giá độc tính của liều tiêm exosome gây chết tế bào ung thư phổi A549 trên chuột thí

nghiệm

1 Độc tính của liệu gây chết đặc hiệu tế bào ung thư phổi A549 khi tiêm ở chuột thí nghiệm

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các dexosome phân lập từ tế bào tua máu dây rốn có khả năng kích thích tăng sinh và độc tính của tế bào lympho T Đây là những kết quả tiền đề quan trọng cho việc phát triển các Dex thành vắc-xin chống ung thư Tuy nhiên, để làm được điều

đó, các Dex phải chứng minh không có khả năng gây độc cho cơ thể Vì vậy, trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu thử nghiệm độc tính của liều Dex gây chết 80% tế bào ung thư A549 trên động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng dòng Swiss khỏe mạnh

Sau khi xác định được liều gây chết 80% tế bào ung thư A549, chúng tôi tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của liều dexosome trên chuột nhắt trắng Swiss Chuột được chia thành 3 lô: lô đối chứng không điều trị (ĐCSH); lô đối chứng dung môi, tiêm tĩnh mạch đuôi 100 µl PBS; và lô thí nghiệm, tiêm tĩnh mạch đuôi 100 µl dịch dexosome pha trong PBS, tiêm một liều duy nhất Dexosome được phân lập từ môi trường nuôi cất tế bào tua IL-4DC đã được cảm ứng với kháng nguyên ung thư A549 Chúng tôi lựa chọn pIL-4Dex vì có hoạt tính mạnh hơn so với upIL-Dex trong việc kích thích độc tính của tế bào MNC và lympho T

Chuột được cân trọng lượng 4 ngày một lần, theo dõi trong 1 tháng Quan sát thấy sự vận động, hình thái bên ngoài của chuột ở các lô đều không có sự khác biệt (Hình 1) Kết quả về trọng lượng cho thấy cho thấy chuột ở cả ba lô đều tăng trọng bình thường, không có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (p˃0,05) (Bảng 6)

Hình 1 Hình ảnh chuột nhắt trắng Swiss ở các lô thí nghiệm tại ngày thứ 30 kể từ khi tiêm tĩnh mạch đuôi 100µl pIL-Dex (lô pIL-4Dex), hoặc 100µl PBS (lô ĐCDM) so với chuột đối chứng (lô ĐCSH)

Bảng 6 Sự tăng trọng lượng chuột ở các lô thí nghiệm

1

SẢN PHẨM KHOA HỌC 1.5 Báo cáo về khả năng chế tạo vắc xin chống ung

thư từ các kết quả nghiên cứu

1 Tổng quan

Vắc xin được coi là một trong những phương pháp hoạt hóa hệ thống miễn dịch hữu hiệu nhất để ngăn chặn một loại bệnh xác định một cách chủ động Có rất nhiều các vắc xin điều trị ung thư hiện đang được nghiên cứu và thử nghiệm Một trong những điểm chung của các thử nghiệm này là sự tập trung nghiên cứu một bước quan trọng của phương pháp vắc xin: đó là sự trình diện kháng nguyên ung thư đến các tế bào T Các tế bào tua, gọi tắt là DC, là các tế bào trình diện kháng nguyên hữu hiệu nhất và đem lại hiệu quả cao nhất trong liệu pháp vắc xin Nếu tìm kiếm trên trang thử nghiệm lâm sàng http://www.clinicaltrials.gov với từ khóa “cancer vaccine” sẽ cho ra gần 1900 thử nghiệm (tính đến tháng 3 năm 2017) trong đó thử nghiệm liên quan đến DC chiếm 81 trong tổng số 505 thử nghiệm ở pha III, và 216 trong tổng số 1010 thử nghiệm ở pha II Điều này cho thấy tế bào tua đang thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực sử dụng tế bào miễn dịch để điều trị ung thư

Tuy nhiên số lượng các tế bào tua trong cơ thể chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ dẫn đến sự thiếu hiệu quả trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ để chống lại ung thư Sự phát triển các phương pháp biệt hóa tạo tế bào DC từ các tế bào mono máu ngoại vi đã đem lại ứng dụng to lớn trong việc phát triển liệu pháp vắc xin sử dụng tế bào tua tự thân hoặc đồng loại [2-8] Đặc biệt, trong những năm gần đây liệu pháp sử dụng vắc xin tế bào tua đồng loại cho thấy có một số ưu việt hơn tế bào tua tự thân như không can thiệp vào cơ thể người bệnh (vốn đã suy kiệt vì ung thư), tế bào tua có khả năng trình diện đến tế bào T tốt hơn, hiệu quả kích thích miễn dịch cao hơn [9-13] Chính vì vậy, việc tìm kiếm một nguồn cung cấp tế bào tua sẵn có, khả thi là thực sự cần thiết Máu dây rốn được chứng minh là tương tự như máu ngoại vi về thành phần các tế bào bạch cầu Bên cạnh đó việc truyền các thành phần tế bào trong máu dây rốn cũng được cho là có tỷ lệ và mức độ GVHD (mảnh ghép chống vật chủ) thấp do tính cạnh tranh về kháng nguyên bạch cầu (HLA) giữa người cho và người nhận thấp [14] Vì vậy máu dây rốn sẽ là một nguồn cung cấp tế bào tua đầy tiềm năng cho liệu pháp vắc xin tế bào tua đồng loại

2 Phân tích các kết quả đã đạt được

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã biệt hóa thành công các tế bào tua từ tế bào mono máu dây rốn bằng hai phương pháp sử dụng phối hợp GMCSF với IL- 4 hoặc IFN-α Các tế bào sau khi biệt hóa đều biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của các tế bào tua như CD80, CD86, CD40, HLA-DR, CD11c Mức độ biểu hiện các dấu ấn này tăng cao khi các tế bào tua được kích thích với kháng nguyên ung thư A549 Không chỉ có hình thái và kiểu hình miễn dịch của tế bào tua, các tế bào biệt

hóa theo hai phương pháp nêu trên còn có khả năng thúc đẩy miễn dịch chống ung thư in vitro Khi

đồng nuôi cấy với tế bào lympho đồng loại, các tế bào tua máu dây rốn kích thích các tế bào lympho T tăng sinh, đặc biệt là các tế bào lympho T CD3+Vγ9 Đây là những tế bào lympho mới