Những góp ý chuyên môn quý báu và sự tận tâm trong giảng dạy của cô là nền tảng vững chắc giúp tôi hoàn thành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định một số chất có hoạt tính sinh học tro
TỔNG QUAN
Tổng quan dược liệu Bồ công anh
Bồ công anh có tên khoa học là Lactuca indica L., thuộc họ Cúc
(Asteraceae) Lá mỏng nhăn nheo, nhiều hình dạng, thường có lá hình mũi mác, gần như không có cuống, mặt trên màu nâu sẫm, mặt dưới màu nâu nhạt, mép lá khía răng cưa, to nhỏ không đều Có lá chỉ có răng thưa hay gần như nguyên Gân giữa to và nổi nhiều Vị hơi đắng Đoạn thân dài 3cm đến 5cm, tròn, thẳng, lõi xốp, đường kính khoảng 0,2cm, mặt ngoài màu nâu nhạt, lốm đốm, có mấu mang lá hoặc vết tích của cuống lá [8]
1.1.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học
- Cây Bồ công anh có thành phần chính là các sesquiterpen lacton, triterpen, flavonoid Ngoài ra còn có các hợp chất khác như: lignan, phenolic, megastigmane Các hợp chất đã được phân lập từ cây Bồ công anh như sau:
+ Hou và cộng sự trong công bố năm 2002 đã phân lập từ Bồ công anh năm hợp chất sesquiterpen, trong đó có 3 dimer lactucain A-C [9], 2 monomer 11β,13- dihydrolactucin, cichoriosid B [9,10], một lignan: lactucaside [9], cùng với sáu flavonoid khác: quercetin [9], quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside [9,11,12], rutin [9,12], apigenin [9,11], luteolin [9,11], luteolin 7-O-β-D-glucuronid [9,12]
+ Man Thanh Long và cộng sự (2019) phân lập được 4 hợp chất từ Bồ công anh Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột, trong đó 2 hợp chất nhóm flavonoid là luteolin và luteolin 7-O-β-D-glucuronid, 2 hợp chất nhóm sesquiterpen lacton là 11β,13-dihydrolactucin và cichoriosides B [13]
+ Một số phenolic khác cũng được phân lập từ Bồ công anh: protocatechuic acid, methyl p-hydroxybenzoat, p-hydroxymethyl benzoic acid, trans-cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid [11,14]
- Tác dụng sinh học: Bồ công anh có một số tác dụng sinh học chính như:
+ Chia - Chung Hou và cộng sự (2003) đã thử tác dụng chống tiểu đường của 13 hợp chất phân lập từ Bồ công anh Trên mô hình chuột tiểu đường gây bởi streptozotocin (STZ), một số hợp chất phân lập được thể hiện hoạt tính hạ đường huyết mạnh với liều 1 mM/kg [9]
+ Trong nghiên cứu của Sheng-yang Wang và cộng sự (2003), dịch chiết
Bồ công anh được tìm thấy có tác dụng quét gốc tự do đáng kể, bảo vệ hiệu quả chuỗi xoắn DNA chống lại sự phân tách sợi và stress oxy hóa trong các tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người Hơn nữa, ở nồng độ 100 àg/ml, cắn chiết Bồ công anh còn ức chế hoàn toàn sự tạo thành gốc NO kích thích bởi LPS ở đại thực bào RAW 264.7 [14]
+ Petra Luthjea và cộng sự (2011) đã thử nghiệm khả năng chống nhiễm khuẩn đường tiết niệu của Bồ công anh Mặc dù tác dụng kháng E coli không rõ ràng, Bồ công anh có khả năng làm giảm đáng kể sự xâm nhập của vi khuẩn vào các tế bào biểu mô bàng quang Kết quả này chỉ ra ngoài tác dụng lợi tiểu, Bồ công anh có khả năng tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô, bảo vệ chống lại nhiễm trùng E coli [15]
+ Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của dịch chiết ethanol Bồ công anh của Yi-Hsuan Chen và cộng sự (2007) cho thấy khả năng ức chế mạnh tế bào bạch cầu HL-60 ở người Dịch chiết ethanol Bồ công anh chứa 5% phenolic, chủ yếu là quercetin, caffeic acid, rutin, và acid clorogenic Trong đó quercetin được cho là thành phần chính hiệu quả nhất trong ức chế khả năng sống của tế bào và thay đổi chức năng của ty thể [16]
+ Wang và cộng sự (2003) đã nghiên cứu và công bố chiết xuất từ cây có khả năng quét gốc tự do mạnh mẽ và bảo vệ DNA khỏi sự phân cắt Các hợp chất phenolic chính như luteolin-7-O-β-D-glucosid và quercetin-3-O-β-D- glucosid được xác định là thành phần hoạt tính chính [17]
+ Kiều Thị Thủy và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống viêm và chống oxy hóa của cây Bồ công anh, qua đó xác định được cao cloroform ức chế sản sinh NO mạnh nhất và cao ethyl acetat trung hoà DPPH tốt nhất Từ cao cloroform và ethyl acetat phân lập được 6 hợp chất: acid pentadecanoic, lupeol, vanillin, 5-hydroxy-3ʹ,4ʹ,7-trimethoxyflavon, luteolin-7-O-β-D- glucosid, acacetin-7-O-β-D-rutinosid [4]
Các nghiên cứu đã cho thấy tác dụng sinh học đặc trưng của dược liệu bồ công anh là tính kháng viêm và chống oxy hóa, đây là tác dụng được thể hiện rõ nhất, trong đó các thành phần hóa học nổi bật tạo nên tác dụng kháng viêm và chống oxy hóa là Luteolin 7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic, đây cũng chính là lý do nhóm nghiên cứu lựa chọn phân tích 4 chất này trong đề tài này
Tổng quan về Các chất nghiên cứu
Luteolin-7-glucuronid được biết đến với các tác dụng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa Tuy nhiên theo các tài liệu tham khảo, chất này có tác dụng kháng viêm là chủ yếu
1.2.1.1 Định danh và tính chất lý hóa
Thông tin về định danh hóa học của Luteolin-7-glucuronid [18] được thể hiện trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Định danh hóa học của Luteolin-7-glucuronid Đặc điểm Thông tin
Tên hóa học Luteolin-7-glucuronide
Tên khác và tên thương mại
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5- hydroxy-4-oxochromen-7-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane- 2-carboxylic acid
Một số tính chất lý hóa của Luteolin-7-glucuronid [18,19,20,21] được trình bày trong bảng 1.2
Bảng 1.2 Tính chất lý hóa của Luteolin-7-glucuronid Đặc tính Thông tin
Khối lượng phân tử 462,4 g/mol
Màu sắc Màu trắng đến vàng nhạt Trạng thái vật lý Bột vô định hình Nhiệt độ nóng chảy 242-244 o C Độ hòa tan Hơi tan trong DMSO và methanol
Không tan trong nước LogP (dự đoán) -0,25 đến 1,22 pKa (dự đoán) 2,73 ± 0,70
- Tác dụng chống viêm: Luteolin-7-glucuronid ức chế sản xuất oxide nitric (NO) trong các tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS thông qua việc điều hòa biểu hiện gen của enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) phụ thuộc vào liều lượng Ngoài ra, chất này còn làm giảm biểu hiện mRNA của các chất trung gian gây viêm như cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) và tumor necrosis factor-α (TNF- α) Cơ chế này được thực hiện thông qua việc ức chế kinase TAK1, dẫn đến giảm hoạt hóa các yếu tố phiên mã NF-κB, p38 và JNK, từ đó làm giảm phản ứng viêm [22]
- Tác dụng chống oxy hóa: Luteolin-7-glucuronid thể hiện khả năng quét gốc tự do mạnh và tăng cường hiệu quả của các enzyme chống oxy hóa như heme oxygenase-1 (HO-1), glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) và NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) Hiệu ứng này được
7 điều hòa thông qua việc hoạt hóa yếu tố phiên mã Nrf2, đóng vai trò then chốt trong việc bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa [22]
Luteolin được tìm thấy ở nhiều loại cây phổ biến Chất này có tác dụng như một chất chống oxy hóa, chống viêm với nhiều cơ chế khác nhau
1.2.2.1 Định danh và tính chất lý hóa
Thông tin về định danh hóa học của Luteolin [23] được thể hiện trong bảng 1.3
Bảng 1.3 Định danh hóa học của Luteolin Đặc điểm Thông tin
Tên khác và tên thương mại
Một số tính chất lý hóa của Luteolin [23] được trình bày trong bảng 1.4
Bảng 1.4 Tính chất lý hóa của Luteolin Đặc tính Thông tin
Khối lượng phân tử 286,24 g/mol
Trạng thái vật lý Bột Nhiệt độ nóng chảy 329,5 o C pK a 2,53
Hoạt tính chống viêm của luteolin được thể hiện ở nồng độ micromol và bao gồm ức chế các chất trung gian gây viêm (ví dụ, COX-2, NO, IL-6, IL- 1β, TNF-α) và điều hòa một số con đường truyền tín hiệu, bao gồm con đường NF-κB, AP-1 và JAK–STAT Tuy nhiên, tác dụng quan trọng nhất của luteolin bao gồm khả năng chống oxy hóa mạnh với đặc tính dọn gốc tự do và bảo vệ tế bào rất hiệu quả Do đó, tác dụng chống viêm của luteolin có thể một phần là do khả năng chống oxy hóa của nó Hơn nữa, luteolin tương tác với các chất chống oxy hóa khác như vitamin và hệ thống oxy hóa khử tế bào Theo cách này, luteolin có thể tăng cường khả năng chống oxy hóa của nó một cách hiệp đồng [24]
Acid caffeic là chất rắn, có màu vàng đến vàng nhạt, được tìm thấy trong các loài thực vật như rau, hoa quả, thảo mộc thường gặp Chất này có nhiều tác dụng tích cực với sức khỏe con người như hạn chế ung thư, xơ vữa động mạch, chống nhiễm trùng do vi khuẩn và virus [25,26]
1.2.3.1 Định danh và tính chất lý hóa
Thông tin về định danh hóa học của Acid caffeic [27] được thể hiện trong bảng 1.5
Bảng 1.5 Định danh hóa học của Acid caffeic Đặc điểm Thông tin
Tên hóa học Acid caffeic
Tên khác và tên thương mại
Trans-caffeic acid, 3,4-Dihydroxycinnamic acid, 3-(3,4-dihydroxyphenyl) acrylic acid, (2E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl) prop-2-enoic acid
Một số tính chất lý hóa của Acid caffeic [27] được trình bày trong bảng 1.6
Bảng 1.6 Tính chất lý hóa của Acid caffeic Đặc tính Thông tin
Khối lượng phân tử 180,16 g/mol Màu sắc Màu vàng đến vàng nhạt Trạng thái vật lý Rắn
Nhiệt độ nóng chảy 433 đến 437°F (phân hủy) Độ hòa tan Dưới 1 mg/mL ở 72°F pKa 4,62 (ở 25 o C)
Hệ số log K 1,15 Độ tan - Ít tan trong nước lạnh
- Tan trong nước nóng, rượu
Acid caffeic được sử dụng rộng rãi như một chất chống oxy hóa, ngoài ra nó còn được công nhận là thuốc chống huyết khối, hạ huyết áp, trị đái tháo đường Đặc biệt, một số nghiên cứu đã chỉ ra chất này có tính kháng viêm, được sử dụng để điều trị vi khuẩn, virus và nấm Vì vậy, acid caffeic có thể được dùng riêng lẻ với tác dụng kháng viêm hoặc áp dụng kết hợp với kháng sinh để đạt được tác dụng hiệp đồng [25,26]
Acid chlorogenic (GA) là một hợp chất phenolic tự nhiên phổ biến trong nhiều loại thực vật như cà phê, bồ công anh và actiso Nhiều nghiên cứu đã chứng minh GA có đa dạng tác dụng sinh học có lợi cho sức khỏe con người [28,29,30]
1.2.4.1 Định danh và tính chất lý hóa
Thông tin về định danh hóa học của Acid clorogenic [31] được thể hiện trong bảng 1.7
Bảng 1.7 Định danh hóa học của Acid clorogenic Đặc điểm Thông tin
Tên hóa học Acid clorogenic
Tên khác và tên thương mại
3-O-Caffeoylquinic acid; Caffeoyl quinic acid; Heriguard; 3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl)quinic acid
Một số tính chất lý hóa của Acid clorogenic [31] được trình bày trong bảng 1.8
Bảng 1.8 Tính chất lý hóa của Acid clorogenic Đặc tính Thông tin
Khối lượng phân tử 354,31 g/mol
Màu sắc Trắng đến vàng nhạt
Trạng thái vật lý Rắn
Nhiệt độ nóng chảy 210 – 220 o C pKa 3,8 Độ tan Tan tốt trong methanol, ethanol, dimethyl sulfoxid, acetone; tan kém trong nước lạnh
- Tác dụng chống oxy hóa:
Acid clorogenic có khả năng loại bỏ các gốc tự do và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa Cơ chế này liên quan đến việc ức chế hoạt động của các caspase, từ đó ngăn chặn quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trong nhiều mô khác nhau [29]
Acid clorogenic điều hòa sản xuất và giải phóng các chất trung gian gây viêm như TNF-α, IL-1β, IL-6, NO và PGE2 Nó cũng tác động lên các con đường tín hiệu như NF-κB, MAPK và Nrf2, giúp giảm viêm và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương [30].
Các nghiên cứu định lượng các chất nghiên cứu bằng HPLC
Các nghiên cứu định lượng các chất trong dược liệu bồ công anh được tóm tắt trong bảng 1.9
Bảng 1.9 Các công bố định lượng các chất nghiên cứu bằng HPLC
Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký
Tóm tắt kết quả TLTK
Thuốc y học cổ truyền Trung
Chiết xuất dung môi ethanol hoặc methanol đối với từng mẫu
Xác định được đồng thời các flavonoid và một số hợp chất khác
Hương thảo, húng tây, bạc hà, oải hương
Sử dụng mẫu lá khô của các loại thảo mộc như hương thảo, húng tây, bạc hà, oải hương
Hàm lượng acid caffeic là 0- 0,4mg/g Phương pháp nhạy, giới hạn định lượng thấp
Dịch chiết rau mùi tây
Nước:ACN (95:5) (dung môi A) và amoni format 10mM (pha trong nước):ACN (50:50) (dung môi B) được rửa giải gradient
- pH: 4,0 (điều chỉnh bằng acid formic)
Tách và định lượng được acid caffeic, luteolin, luteolin-7- glucuronid và một số chất khác với độ nhạy cao, pic tách hoàn toàn
0,005mg/ml Khoảng hàm lượng các chất (mg/kg mẫu khô):
Chiết xuất siêu âm với dung môi methanol 80%
- Pha động: dung dịch acid formic 0,1% (A) trong nước và (B) trong methanol
- Độ thu hồi trong khoảng 90,4 – 109,4%
- Phân lập và định lượng được các chất cần phân tích, trong đó có quercetin, acid caffeic, luteolin- 7-glucuronid, luteolin
Prunella grandiflora L và Prunella orientalis
Bornm.) thuộc họ Bạc hà
Chiết với dung môi methanol 80%
Chiết tách và định lượng thành công
11 hợp chất phenolic, trong đó có acid caffeic
- Sử dụng pha tĩnh là cột C18
- Pha động là pha A là dung dịch acid acetic hoặc acid formic nồng độ thấp, pha
- Chế độ gradient pha động bắt đầu với tỉ lệ thấp của B và tăng dần theo thời gian Định lượng đượng các flavonoid và các phenolic khác, trong đó có acid caffeic và luteolin
Phân tích được Luteolin-7- glucuronid với LOD=6àg/ml, LOQ àg/ml
Pha A: Nước acidified với 0.1% phosphoric acid
- Chế độ gradient pha động với nồng độ tăng dần của pha B
- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút
- Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng
Phân tích được Luteolin với LOD=0,448àg/ml, LOQ=1,493 àg/ml Xác định được hàm lượng Luteolin ở các bộ phận khác nhau:
Cành: 49.06 ± 0.46μg/g Quả: 56.61 ± 0.62μg/g Phần trên mặt đất:
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) là một trong những kỹ thuật phân tích hiện đại và phổ biến nhất hiện nay trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm, thực phẩm, hóa chất và sinh học HPLC cho phép tách, định tính và định lượng chính xác các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với độ nhạy và độ chính xác cao
Nguyên lý cơ bản của HPLC dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất phân tích giữa hai pha: pha tĩnh (thường là chất rắn hoặc lỏng được gắn trên chất rắn) và pha động (là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi lỏng) Khi dòng pha động đi qua cột sắc ký chứa pha tĩnh, các chất trong mẫu sẽ tương tác với pha tĩnh ở mức độ khác nhau, dẫn đến sự tách biệt theo thời gian lưu Phân tích định tính được dựa vào thời gian lưu đặc trưng, trong khi định lượng dựa vào đáp ứng diện tích pic hoặc chiều cao pic trên sắc ký đồ
Phương pháp HPLC đã được giới thiệu từ thập niên 1960, sau khi các cải tiến về hệ thống bơm áp suất cao và vật liệu cột cho phép thực hiện quá trình sắc ký ở áp suất lớn và tốc độ dòng ổn định hơn so với sắc ký lỏng cổ điển (LC) HPLC ngày nay đã phát triển nhiều biến thể như sắc ký pha đảo (RP- HPLC), sắc ký pha thường (NP-HPLC), sắc ký ion và sắc ký loại trừ kích thước, mỗi loại phù hợp với các ứng dụng và loại chất phân tích khác nhau [40,41,42]
Pha tĩnh trong HPLC thường là vật liệu rắn (như silica gel) có diện tích bề mặt lớn, được xử lý bề mặt bằng các nhóm chức thích hợp để tăng cường tương tác với các chất phân tích Trong sắc ký pha đảo – phương pháp được sử dụng phổ biến nhất – pha tĩnh có tính kỵ nước, thường là silica được liên kết hóa học các chuỗi hydrocacbon dài như C8 (octyl) hoặc C18 (octadecyl)
Sự lựa chọn pha tĩnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách Các chất kém phân cực sẽ tương tác mạnh với pha tĩnh và lưu giữ lâu hơn, trong khi các chất phân cực ít tương tác sẽ rửa giải nhanh hơn Sự khác biệt này là cơ sở để tách các hợp chất trong hỗn hợp mẫu [40,41,42]
Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi chảy qua cột để vận chuyển các chất phân tích Trong RP-HPLC, pha động thường là nước kết hợp với dung môi hữu cơ như methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp của chúng Đôi khi, pha động còn chứa các chất đệm như phosphate, acetate hoặc formate để kiểm soát pH và tăng độ lặp lại
Chế độ rửa giải có thể là đẳng dòng (isocratic) – thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình, hoặc rửa giải gradient – thành phần pha động thay đổi theo thời gian, giúp cải thiện khả năng tách các hợp chất có phổ phân cực rộng [40,41,42]
Detector mảng diode (Diode Array Detector – DAD hoặc Photodiode Array – PDA) là một loại đầu dò phổ UV-Vis đặc biệt thường được sử dụng trong HPLC hiện đại Ưu điểm chính của detector này là khả năng ghi nhận phổ hấp thụ của mẫu trong dải bước sóng rộng (thường từ 190 đến 800 nm) tại nhiều bước sóng đồng thời
Nhờ đó, DAD không chỉ phát hiện các chất phân tích ở bước sóng đặc trưng mà còn thu thập phổ UV-Vis của từng pic, giúp đánh giá độ tinh khiết và định danh chất dựa trên so sánh phổ Đây là lợi thế rõ rệt so với detector UV thông thường vốn chỉ đo tại một bước sóng duy nhất
Detector DAD rất hữu ích trong nghiên cứu dược liệu tự nhiên và các hỗn hợp có nhiều thành phần tương đồng về cấu trúc, bởi vì nó giúp phát hiện các chất đồng phân hoặc chất nhiễu không mong muốn thông qua so sánh phổ UV trực tiếp [43]
1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân tách HPLC
- Trong khi phát triển phương pháp phân tích trên RP-HPLC, bước đầu tiên được thực hiện là lựa chọn các thông số sắc ký khác nhau như lựa chọn pha động, lựa chọn cột, lựa chọn tốc độ dòng chảy của pha động, lựa chọn độ pH của pha động Tất cả các thông số này được lựa chọn dựa trên các thử nghiệm và sau đó là xem xét các thông số phù hợp của hệ thống Các thông số điển hình của tính phù hợp của hệ thống như thời gian lưu phải lớn hơn 5 phút, các đĩa lý thuyết phải lớn hơn 2000, hệ số đuôi phải nhỏ hơn 2, độ phân giải giữa 2 đỉnh phải lớn hơn 1,5, %RSD của diện tích các đỉnh chất phân tích trong sắc ký chuẩn không được lớn hơn 2,0% như các phương pháp khác
- Đường kính trong: Đường kính trong của cột HPLC là một khía cạnh quan trọng quyết định lượng chất phân tích có thể được nạp vào cột và cũng ảnh hưởng đến độ nhạy Các cột lớn hơn thường được thấy trong các ứng dụng công nghiệp như tinh chế sản phẩm thuốc để sử dụng sau Các cột định danh thấp có độ nhạy được cải thiện và tiêu thụ dung môi thấp hơn với cái giá phải trả là khả năng nạp
- Kích thước hạt: Hầu hết HPLC truyền thống được thực hiện với pha tĩnh gắn vào bên ngoài các hạt silica hình cầu nhỏ (hạt rất nhỏ) Các hạt nhỏ hơn
18 thường cung cấp diện tích bề mặt lớn hơn và khả năng tách tốt hơn, nhưng áp suất cần thiết để có vận tốc tuyến tính tối ưu tăng theo nghịch đảo của bình phương đường kính hạt
- Kích thước lỗ: Nhiều pha tĩnh có lỗ xốp để cung cấp diện tích bề mặt lớn hơn Các lỗ xốp nhỏ cung cấp diện tích bề mặt lớn hơn trong khi kích thước lỗ xốp lớn hơn có động học tốt hơn, đặc biệt là đối với các chất phân tích lớn hơn Kích thước lỗ xốp xác định khả năng các phân tử chất phân tích thâm nhập vào bên trong hạt và tương tác với bề mặt bên trong của nó Điều này đặc biệt quan trọng vì tỷ lệ giữa bề mặt hạt bên ngoài và bề mặt bên trong của nó là khoảng 1:1000 Tương tác phân tử bề mặt chủ yếu xảy ra trên bề mặt hạt bên trong
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là phần trên mặt đất của cây Bồ công anh (Lactica indica L., họ Cúc (Asteraceae)) Mùa thu hoạch chính của Bồ công anh là từ tháng 5 đến tháng 9 [47]
Các mẫu dược liệu được thẩm định tên khoa học bởi Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội Dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi và sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 40 – 45 ○ C Dược liệu sau khi sơ chế được bảo quản trong túi kín ở nơi khô, sạch, thoáng mát
Các mẫu dược liệu nghiên cứu thực tế được thu hoạch trong khoảng tháng 7 đến tháng 8 năm 2023 từ 4 tỉnh khác nhau (Thái Nguyên, Hưng Yên,
Hòa Bình, Nghệ An) Lượng lấy mỗi mẫu từ 0,5kg đến 1kg Mẫu đã được xử lý sơ bộ (rửa sạch, sấy khô) và bảo quản trong túi PE kín, nhiệt độ dưới 30 ○ C
Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu thu thập được từ các tỉnh
B6 Hưng Yên B8 Phú Bình, Thái Nguyên B10 Hòa Bình
B11 Hưng Yên B24 Hòa Bình B25 Hưng Yên B26 Hưng Yên B27 Hưng Yên B33 Thái Nguyên B71 Thái Nguyên B90 Thạch Thất, Hà Nội B91 Thái Nguyên
B92 Đồng Quang, Thái Nguyên B93 Hưng Yên
2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị
- Acid caffeic (ChemFaces, CAS 331-39-5, Cat.no CFN99190; Lot.no CFS202401, Độ tinh khiết 98,0%)
- Luteolin-7-glucuronid (ChemFaces, CAS 29741-10-4, Cat.no CFN98512; Lot.no CFS202302, Độ tinh khiết 98,5%)
- Luteolin (ChemFaces, CAS 491-70-3, Cat.no CFN98784; Lot.no CFS202402, Độ tinh khiết 98,1%)
- Acid clorogenic (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, SKS: E0119356.01, Độ tinh khiết 97,0%)
- Methanol (loại dùng cho HPLC)
- Acetonitril (loại dùng cho HPLC)
- Acid formic (loại tinh khiết phân tích)
- Acid o-phosphoric (loại tinh khiết phân tích)
- Acid acetic (loại tinh khiết phân tích)
2.1.2.3 Thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị HPLC ACQUITY Arc LC System (hãng Waters) với Detector
- Cân phân tích Mettler Toledo Newclassic (Thụy Sĩ)
- Máy siêu âm Skymen JP-120ST (Trung Quốc)
- Máy cô quay chân không Buchi rotavapor R300 (Thụy Sĩ)
- Các dụng cụ thủy tinh khác trong phòng thí nghiệm
nội dung NGHIÊN CỨU
2.2.1 Khảo sát quy trình chiết và khảo sát các điều kiện HPLC
- Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
- Khảo sát các điều kiện HPLC
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích và xử lý kết quả
Phương pháp HPLC/DAD được thẩm định theo hướng dẫn của ICH Q2 (R1) nhằm đảm bảo độ tin cậy và tính chính xác của phương pháp phân tích Các thông số thẩm định bao gồm:
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Độ phù hợp hệ thống
2.2.3 Ứng dụng phương pháp Định lượng các chất phân tích trong các mẫu thu thập được trên địa bàn các tỉnh.
Phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo quy trình của Hao et al [48] với một số biến đổi nhỏ, mẫu được xử lý như sau:
Dược liệu L indica được xác định tên khoa học, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 45ºC Dược liệu sau sơ chế được nghiền thành bột mịn, rây qua rây 0.4 mm Cân chính xác khoảng 1,00 g bột dược liệu vào bình nón 100 ml, thêm 25 ml dung môi chiết, đậy nắp, chiết siêu âm công suất 400W trong 30 phút Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, lọc lấy dịch lọc Chiết lặp lại thêm
2 lần, dịch lọc được gom vào bình định mức 100 ml, thêm Ethanol 50% vừa đủ đến định mức (DC1), lắc đều DC1, lọc qua màng PTFE 0,22 àm vào vial để phân tích HPLC
Khảo sát dung môi chiết ethanol ở các mức nồng độ 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% Chọn dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất
- Pha dung dịch chuẩn gốc:
Dung dịch chuẩn gốc: Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic được pha trong dung dịch Ethanol 50% để thu được các dung dịch
22 chuẩn gốc với nồng độ lần lượt là 1,25 mg/ml, 0,51 mg/ml, 1,25 mg/ml và 1,3 mg/ml
2.3.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký
Mục đích của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là để có một quy trình tối ưu cho việc phân tích đồng thời 3 chất phân tích để đạt độ phân giải cao nhất và thời gian phân tích ngắn
Khảo sát các pha động gồm: acetonitril (ACN), methanol MeOH, nước (W), dung dịch acid acetic 0,1% (aA 0,1%); dung dịch acid formic 0,1% (aF 0,1%); dung dịch acid ortho-phosphoric 0,1% (aP 0,1%) Các thông số khác của phương phỏp được cố định như sau: Cột C18 (250 ì 4,6; 5àm), nhiệt độ buồng cột 30ºC, tốc độ dũng 1,0 ml/phỳt, thể tớch tiờm mẫu 10 àl
+ Pha nước được khảo sát gồm: dung dịch acid acetic 0,1%; dung dịch acid formic 0,1% và dung dịch acid o-phosphoric 0,1% Các điều kiện khác của phương pháp hoàn toàn giống nhau
- Chương trình pha động được tối ưu hoá nhằm đạt được độ phân giải Rs > 1,5 và thời gian phân tích ngắn nhất và phương pháp cho kết quả đạt các yêu cầu về thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH Q2 (R1)
Tối ưu chương trình dung môi: Các chương trình dung môi được khảo sát để thu được sắc ký đồ của các pic cần phân tích có độ phân giải Rs đều lớn hơn 1,5 với thời gian phân tích ngắn nhất
- Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến độ nhớt của pha động, tốc độ di chuyển của chất phân tích, độ phân giải và sự lặp lại của kết quả phân tích Các mức nhiệt độ khảo sát gồm: 25°C, 30°C, 35°C và 40°C
- Tối ưu tốc độ dòng: Tốc độ dòng ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian phân tích và độ phân giải Các tốc độ dòng được khảo sát gồm: 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút
- Bước sóng phát hiện tối ưu được lựa chọn nhằm mục đích thu được tỉ lệ giữa tín hiệu và nhiễu lớn nhất
- Tối ưu thể tớch tiờm mẫu: Cỏc thể tớch tiờm 5 àL; 10 àL, 12 àL và 15 àL được khảo sát nhằm đảm bảo pic không bị bão hòa tín hiệu mà vẫn có độ nhạy cao
2.3.3 Phương pháp thẩm định quy trình phân tích
2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống
Mục tiêu của đánh giá độ phù hợp hệ thống là kiểm tra khả năng làm việc ổn định của hệ thống sắc ký
Phương pháp thực hiện: tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp và ghi nhận các thông số bao gồm độ phân giải giữa các pic, độ đối xứng pic và số đĩa lý thuyết của cột sắc ký Tính toán %RSD của diện tích pic và thời gian lưu
Tiêu chí đánh giá yêu cầu độ phân giải Rs > 1,5, độ đối xứng pic nằm trong khoảng 0,9 - 2,0, số đĩa lý thuyết N > 5000 và RSD của diện tích pic ≤ 2% 2.3.3.2 Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử Kiểm tra xem có xuất hiện pic nhiễu tại thời gian lưu của các chất cần phân tích hay không Đánh giá phổ UV của các pic để xác nhận sự trùng khớp với phổ chuẩn của từng hợp chất
Mục tiêu của đánh giá độ đặc hiệu là xác nhận rằng phương pháp có thể tách biệt các hợp chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi nhiễu từ nền mẫu
Tiến hành chồng phổ đánh giá độ tinh khiết So sánh sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử Yêu cầu sắc ký đồ của mẫu trắng không có pic nhiễu tại thời gian lưu của chất phân tích, sắc ký đồ của mẫu thử có pic tại thời gian lưu của chất phân tích so với sắc ký đồ của mẫu chuẩn
2.3.3.3 Tính tuyến tính và khoảng xác định
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Khảo sát Quy trình chiết mẫu và điều kiện HPLC
Khảo sát các nồng độ dung môi ethanol gồm 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%
Biểu đồ thể hiện tương quan giữa hàm lượng các chất phân tích thu được ở các nồng độ dung môi ethanol khác nhau được thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1 Biểu đồ hàm lượng các chất phân tích khi chiết bằng các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau
Từ kết quả khảo sát có thể thấy khi chiết với dung môi ethanol 50% thì khả năng chiết là tối ưu nhất, vậy lựa chọn ethanol 50% để chiết
3.1.2 Khảo sát điều kiện pha động
Khảo sát các pha động gồm: acetonitril (ACN), methanol (MeOH), nước, dung dịch acid acetic 0,1% (aA 0,1%); dung dịch acid formic 0,1% (aF 0,1%); dung dịch acid ortho-phosphoric 0,1% (aP 0,1%) Các thông số khác của phương phỏp được cố định như sau: Cột C18 (250 ì 4,6; 5àm), nhiệt độ buồng cột 30ºC, tốc độ dũng 1,0 ml/phỳt, thể tớch tiờm mẫu 10 àl
3.1.2.1 Khảo sát pha động để chọn dung môi hữu cơ là ACN hoặc MeOH + Chương trình gradient khởi đầu với pha động ACN : Nước như sau:
Bảng 3.1 Chương trình gradient khởi đầu
Nhận xét: Các pic chưa tách khỏi nhau, còn bị kéo đuôi Chương trình này chưa phù hợp để phân tích
Ngoài ra, cần tối ưu thời gian gradient
Bảng 3.2 Điều kiện phân tích sau khi tối ưu thời gian gradient
Thời gian (phút) % ACN % Nước
Nhận xét: Sau khi tối ưu thời gian phân tích, tổng thời gian phân tích còn dưới 20 phút Điều kiện này rút ngắn thời gian phân tích của các khảo sát tiếp theo
- Khảo sát với pha động Methanol : Nước
Bảng 3.3 Chương trình gradient sử dụng pha động Methanol : Nước
Từ kết quả thu được: pha hữu cơ là MeOH cho thấy khả năng phân tách pic tốt hơn so với pha hữu cơ là ACN
- Pha nước được khảo sát gồm: dung dịch acid acetic 0,1%; dung dịch acid formic 0,1% và dung dịch acid o-phosphoric 0,1% Các điều kiện khác của phương pháp hoàn toàn giống nhau
Kết quả cho thấy đối với hệ pha động Methanol : Acid o-phosphoric 0,1%: trên sắc ký đồ mẫu thử, các pic của các chất phân tích có sự tách biệt rõ ràng với các pic liền kề hơn hẳn so với hệ pha động Methanol : Acid acetic 0,1% và hệ Methanol : Acid formic 0,1% Do đó, pha nước được lựa chọn là dung dịch acid o-phosphoric 0,1%
3.1 2.3 Tối ưu tốc độ dòng
Tốc độ dòng ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian phân tích và độ phân giải Các tốc độ dòng được khảo sát gồm: 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút
Kết quả cho thấy tốc độ dòng không ảnh hưởng nhiều đến độ phân giải Với tốc độ dòng là 1,0 ml/phút, các pic cần phân tích có độ phân giải đều lớn hơn 1,5; các pic cân đối, tổng thời gian phân tích khoảng 20 phút Vì vậy, với tốc độ dòng là 1ml/phút là phù hợp để phát triển phương pháp
3.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột
Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến độ nhớt của pha động, tốc độ di chuyển của chất phân tích, độ phân giải và sự lặp lại của kết quả phân tích Các mức nhiệt độ khảo sát gồm: 25°C, 30°C, 35°C và 40°C
Kết quả cho thấy, với điều kiện nhiệt độ cột là 35°C: sắc ký đồ của các pic cần phân tích sắc nét, độ phân giải đều lớn hơn 1,5, thời gian phân tích ngắn nhất Vì vậy nhiệt độ buồng cột 35°C được lựa chọn cho phương pháp phân tích vì ở nhiệt độ này thu được kết quả phân tích hài hòa giữa thời gian lưu và độ phân giải
3.1.4 Tối ưu thể tích tiêm mẫu
Cỏc thể tớch tiờm 5 àL; 10 àL, 12 àL và 15 àL được khảo sỏt nhằm đảm bảo pic không bị bão hòa tín hiệu mà vẫn có độ nhạy cao Với thể tích tiờm 10 àL, tớn hiệu cỏc pic cần phõn tớch thu được rừ ràng, độ phõn giải
30 và độ bất đối xứng pic đạt tốt Vỡ vậy 10 àL được chọn là thể tớch tiờm tối ưu của phương pháp
3.1.5 Lựa chọn bước sóng phát hiện phân tích
Bước sóng phát hiện tối ưu được lựa chọn nhằm mục đích thu được tín hiệu lớn nhất của tất cả các pic một cách tương đối giữa các pic Dựa vào phổ UV-VIS của cả 4 chất như trên hình 3.2 Bước sóng 330 nm được chọn là bước sóng phân tích để xác định đồng thời cả 4 chất
Hình 3.2 Bước sóng phát hiện phân tích được lựa chọn
3.1.6 Điều kiện sắc ký lựa chọn
Sau khi khảo sát và tối ưu các yếu tố trên, điều kiện sắc ký HPLC/DAD tối ưu để định lượng đồng thời bốn hợp chất trong cao chiết bồ công anh như sau:
Cột sắc ký: C18 (250 ì 4.6 mm, 5 àm)
Pha động: Methanol : Acid O-phosphoric 0,1%
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 330 nm
Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL
Bảng 3.4 Chương trình dung môi lựa chọn
Tốc độ dòng (ml/phút)
Hình 3.3 là sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn và mẫu thử B1 với điều kiện sắc ký lựa chọn.
Hình 3.3 Sắc ký đồ điều kiện phân tích đã chọn
Thẩm định phương pháp XÁC định các chất nghiên cứu trong bồ công
Mục đích thẩm định phương pháp phân tích xây dựng được là định tính đồng thời Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic, Acid clorogenic và phương pháp định lượng đồng thời Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid clorogenic trong dược liệu Bồ công anh Việt Nam Do đó, thực hiện thẩm định độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, LOD đối với cả 4 chất; còn thẩm định khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác thực hiện với 3 chất Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid clorogenic
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống được thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống
Chất phân tích Thời gian lưu
RSD (của thời gian lưu)
RSD (của Spic) Acid clorogenic 8,891 0,23% 552765 1,21%
Kết quả thẩm định độ phù hợp hệ thống cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của các pic đều nhỏ hơn 2% Vì vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống
Tiến hành phân tích dung dịch mẫu trắng (dung môi pha mẫu), dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử thu được sắc ký đồ Chồng phổ tại vị trí pic của từng chất trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn Kết quả được thể hiện trình bày ở hình 3.4 và 3.5
Hình 3.4 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu A mẫu trắng; B mẫu chuẩn; C mẫu thử
Hình 3.5 Kết quả chồng phổ hấp thụ UV
NHẬN XÉT: Kết quả ở hình 3.4 và 3.5 cho thấy pic của các hợp chất cần phân tích tách tốt và không có nhiễu tại thời gian lưu Phổ UV của các chất trong mẫu thử so với phổ của các chất chuẩn có sự tương đồng về hình dạng và đỉnh hấp thụ Phương pháp đạt về chỉ tiêu độ đặc hiệu
3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD và LOQ được xác định bằng phương pháp dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền (S/N)
Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được trình bày trong bảng 3.6 và minh họa ở hình 3.6
Bảng 3.6 Kết quả LOD và LOQ Chất phõn tớch s/n LOD (àg/ml) LOQ (àg/ml)
Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định LOD của Luteolin
Các kết quả này cho thấy phương pháp HPLC/DAD có độ nhạy cao trong việc phát hiện và định lượng các hợp chất trong cao chiết bồ công anh, với các giá trị LOD và LOQ thấp, chứng tỏ phương pháp này là phù hợp để phân tích các mẫu có nồng độ thấp
3.2.4 Tính tuyến tính và khoảng xác định
Dãy dung dịch chuẩn được pha từ dung dịch chuẩn gốc được chuẩn bị ở mục 2.3.1
Kết quả tính tuyến tính xác định được của 3 hợp chất được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.7
Bảng 3.7 Kết quả xây dựng đường chuẩn của các chất nghiên cứu
Hình 3.7 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ
Nhận xét: Hình 3.7 trình bày các đường hồi quy tuyến tính của bốn hợp chất với các phương trình hồi quy và hệ số tương quan R 2 được thể hiện ở bảng 3.7
Các hệ số tương quan cao (R 2 đều > 0.999) cho thấy mối quan hệ tuyến tính tốt giữa diện tích pic và nồng độ của các hợp chất cần phân tích
Kết quả này chứng minh rằng phương pháp HPLC/DAD có độ chính xác cao và có thể áp dụng hiệu quả để định lượng các hợp chất trong cao chiết bồ công anh y = 28810x + 1849,4 R² = 0,9998
Khoảng xác định của từng hợp chất được xác định trong phạm vi nồng độ đã khảo sát, đảm bảo tính ứng dụng của phương pháp trong việc phân tích các mẫu có chứa các hợp chất này
Tiến hành phân tích độ lặp lại: Phân tích một mẫu thử độc lập lặp lại 6 lần trong cùng 1 ngày (ngày 1), cùng 1 thiết bị và 1 người thực hiện Độ chính xác trung gian: Phân tích tương tự độ lặp lại vào ngày thứ hai Kết quả thu được ở bảng 3.8
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ chính xác m cân (g) Hàm ẩm
GA GA Lu GA L7N Lu
Kết quả đánh giá độ chính xác được thực hiện bởi một kỹ thuật viên trong hai ngày khác nhau, được trình bày trong bảng 3.8 Kết quả này cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao đối với các hợp chất Acid clorogenic, Luteolin-7-glucuronide và Luteolin, với giá trị RSD của độ lặp lại nằm trong khoảng 1,01% đến 1,56% (RSD đều nhỏ hơn 2%), RSD của độ chính xác trung gian nằm trong khoảng 1,41 đến 1,75 (RSD đều nhỏ hơn 3%) Điều này
40 chứng tỏ phương pháp có độ ổn định cao, lặp lại tốt trong việc phân tích các hợp chất này, đảm bảo tính chính xác và tin cậy trong các phép đo
3.2.6 Độ đúng Độ đúng được làm trên mẫu thực, bằng cách thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp vào nền mẫu thử để được 3 mẫu phân tích có mức nồng độ sau thêm chuẩn là 70%, 100% và 130% (mỗi mức nồng độ làm 3 lần)
Tiến hành phân tích các mẫu Kết quả được biểu diễn trong bảng 3.9 và minh họa trong hình 3.8
Bảng 3.9 Kết quả độ đúng
Mức thêm chuẩn Độ thu hồi
Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện độ thu hồi ở 3 mức nồng độ
Kết quả xác định độ đúng cho thấy độ thu hồi của các pic Acid clorogenic, Luteolin-7-glucuronid, luteolin đều thuộc khoảng 98% đến 102%, RSD đều nhỏ hơn 2% Các kết quả này chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng, phù hợp để định lượng đồng thời các hợp chất trên trong cây bồ công anh.
Ứng dụng phương pháp TRONG phân tích các mẫu BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM
BỒ CÔNG ANH VIỆT NAM
Kết quả định tính của cả 4 chất được trình bày trong bảng 3.10
Bảng 3.10 Kết quả định tính các mẫu bồ công anh
Kết luận: Cả 4 chất đều dương tính trong 15 mẫu bồ công anh thu thập được
Kết quả phân tích định lượng acid clorogenic (GA), luteolin-7- glucuronid (L7N), luteolin (Lu) bằng phương pháp HPLC trong 15 mẫu Bồ công anh (Lactuca indica L.) được thu thập từ các tỉnh khác nhau (mỗi mẫu tiến hành làm lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình) được trình bày trong Bảng 3.11 và minh họa trong hình 3.9, 3.10 và 3.11
Bảng 3.11 Hàm lượng các hợp chất trong các mẫu bồ công anh
STT Mẫu (n=2) Hàm ẩm (%) Hàm lượng trung bình (%)
Hình 3.9 Hàm lượng Acid clorogenic trong các mẫu bồ công anh nghiên cứu
Hình 3.10 Hàm lượng Luteolin-7-glucuronid trong các mẫu bồ công anh nghiên cứu
Hình 3.11 Hàm lượng Luteolin trong các mẫu bồ công anh nghiên cứu
Kết quả định tính cho thấy sự có mặt của cả 4 hợp chất, kết quả định lượng cho thấy hàm lượng của cả ba hợp chất biến thiên đáng kể giữa các mẫu Một số mẫu có hàm lượng cao nổi bật (như B11, B71, B91), trong khi nhiều mẫu khác có hàm lượng thấp hơn nhiều Giữa các tỉnh có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng các chất phân tích Theo đó, Acid clorogenic có nhiều hơn hẳn trong BCA thu thập được từ Hòa Bình, Luteolin khác biệt không nhiều giữa BCA thu thập được từ các tỉnh, khác biệt lớn nhất là hàm lượng của Luteolin-7-glucuronid, có nhiều hơn hẳn ở BCA thu được ở Hưng Yên, ít hơn ở Thái Nguyên và Hòa Bình Sự sai khác này có thể bắt nguồn từ sự khác biệt về điều kiện sinh thái, thời điểm thu hái, giai đoạn sinh trưởng, và cả khả năng thích nghi sinh hóa của từng quần thể địa phương
Dựa trên phổ phân bố hàm lượng thu được từ 15 mẫu, nhóm nghiên cứu đề xuất các giới hạn tiêu chuẩn hóa tối thiểu cho từng hợp chất nhằm phục vụ kiểm nghiệm chất lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Bồ công anh (Lactuca indica L.) được trình bày ở bảng 3.12
Bảng 3.12 Đề xuất giới hạn tiêu chuẩn hóa các chất phân tích trong dược liệu khô
Hợp chất Giới hạn tối thiểu đề xuất
(% khối lượng khô) Ghi chú
Hàm lượng biến động, nhưng vẫn phổ biến ở đa số mẫu
Luteolin-7- glucuronid ≥ 0,30% Dựa trên 70% mẫu đạt được
Luteolin (L) ≥ 0,05% Hàm lượng khá ổn định trong các mẫu
Giới hạn này mang tính bước đầu, có thể được sử dụng như một ngưỡng tham khảo để phân loại nguyên liệu đạt/không đạt tiêu chuẩn dược liệu dùng trong sản xuất thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe Những mẫu có hàm lượng dưới ngưỡng có thể được loại trừ hoặc sử dụng với mục đích khác (ví dụ: dược liệu phụ trợ, sản phẩm ngoài đường uống…)
BÀN LUẬN
Vận dụng những kiến thức về cấu trúc hóa học, tính chất vật lý của các hợp chất Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic, những lý thuyết cơ bản và tham khảo các tài liệu uy tín đã công bố, đề tài đã xây dựng được phương pháp phân tích 4 chất trong dược liệu bồ công anh Việt Nam bằng HPLC sử dụng detector PDA Phương pháp được thẩm định đầy đủ và đạt các yêu cầu của một phương pháp phân tích theo hướng dẫn của
ICH Kết quả áp dụng phương pháp trong nghiên cứu mẫu thực cho thấy phương pháp đã xây dựng là phù hợp và có tính khả thi Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số bàn luận sau:
4.1 Về đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Bồ công anh (Lactuca indica L.), một dược liệu phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam, được biết đến với tác dụng chống oxy hóa và chống viêm – hai tác dụng sinh học đặc trưng gắn liền với nhóm hợp chất flavonoid và acid phenolic Bốn chất được lựa chọn để nghiên cứu (luteolin-7-glucuronid, luteolin, acid caffeic, acid clorogenic) là những hợp chất chính góp phần tạo nên tác dụng dược lý đó, được nhiều nghiên cứu xác nhận
Việc định tính 4 chất Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic; định lượng đồng thời ba hợp chất Luteolin-7-glucuronid, Luteolin và Acid clorogenic không chỉ phản ánh chính xác chất lượng dược liệu mà còn hỗ trợ xây dựng tiêu chuẩn hóa phù hợp với thực tiễn sản xuất và kiểm nghiệm Trong bối cảnh đã có chuyên luận cho Bồ công anh trong Dược điển Việt Nam tuy nhiên chưa có chỉ tiêu định lượng các marker, việc xây dựng phương pháp định lượng nhóm hợp chất chính là cần thiết
Phương pháp được lựa chọn là HPLC - PDA – kỹ thuật hiện đại, phổ biến, có độ nhạy và độ chính xác cao Quy trình xử lý mẫu được tối ưu bằng cách chiết siêu âm với ethanol 50% – dung môi an toàn, hiệu quả cao trong chiết flavonoid và phenolic Quy trình này đảm bảo tính đơn giản và hiệu quả, tối ưu thời gian chuẩn bị mẫu Quá trình khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký được tiến hành toàn diện: lựa chọn cột C18; sử dụng hệ dung môi methanol và acid orthophosphoric 0,1% với chương trình gradient tối ưu; tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 35°C, bước sóng phát hiện 330 nm Các điều kiện này phù hợp với cấu trúc và tính chất phổ UV của các chất phân tích, đảm bảo
47 phân tách hoàn toàn các pic cần định lượng Cột C18 được lựa chọn cũng như các dung môi, hóa chất sử dụng đều phổ biến ở hầu hết các phòng thí nghiệm, vậy nên có tính ứng dụng cao
So sánh với nghiên cứu của Hao et al (2020) khi phân tích flavonoid trong dịch chiết Bồ công anh bằng HPLC sử dụng methanol - nước chứa acid acetic với bước sóng 370 nm [49], phương pháp được xây dựng trong đề tài này có thời gian phân tích ngắn hơn (35 phút so với 55 phút), đồng thời lựa chọn bước sóng 330 nm giúp tối ưu tín hiệu cho cả 4 hợp chất trong một lần phân tích Ngoài ra, quy trình chiết siêu âm với ethanol 50% thay vì methanol tuyệt đối giúp giảm độc tính dung môi và dễ ứng dụng trong sản xuất
4.2 Về kết quả thẩm định phương pháp:
Phương pháp được thẩm định theo các tiêu chí: độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ phù hợp hệ thống
Tất cả các chất phân tích đều có độ phân giải Rs > 1,5, số đĩa lý thuyết
> 5000, độ đối xứng pic trong khoảng cho phép Phổ UV-VIS thể hiện tính đặc hiệu cao của phương pháp phân tích dựa trên sự tương xứng giữa pic thu được từ dung dịch thử và dung dịch chuẩn
Các đường chuẩn có độ tuyến tính cao với R² ≥ 0,998 trong khoảng nồng độ đã khảo sát LOD và LOQ đều rất nhỏ, đủ nhạy để phát hiện và định lượng trong các mẫu dược liệu thực tế Độ đúng được xác nhận thông qua phương pháp thêm chuẩn tại ba mức nồng độ (70%, 100%, 130%) với độ thu hồi dao động từ 96,2–103,4%, đáp ứng yêu cầu của ICH Độ lặp lại (RSD < 2%) và độ chính xác trung gian (RSD < 3%) chứng minh phương pháp ổn định, đáng tin cậy, phù hợp áp dụng trong kiểm nghiệm thường quy
4.3 Về ứng dụng phân tích mẫu thực tế:
Phương pháp đã được áp dụng để phân tích định lượng các chất nghiên cứu trong 15 mẫu Bồ công anh thu thập từ 4 tỉnh khác nhau Kết quả cho thấy sự dao động về hàm lượng các hợp chất giữa các mẫu, phản ánh ảnh hưởng của nguồn gốc, điều kiện sinh trưởng và sơ chế dược liệu
Cụ thể, luteolin-7-glucuronid dao động trong khoảng 0,05% – 1,56% dược liệu khô, luteolin từ 0,01% – 0,12% và acid clorogenic từ 0,01% –
1,19% Hàm lượng các chất này nhìn chung tương đương với nghiên cứu của Man Thanh Long và cộng sự (2019) [13], trong đó luteolin-7-glucuronid có mặt ở mức 0,04 - 0,08 mg/g Tuy nhiên, mức độ dao động giữa các mẫu cho thấy cần thiết phải thiết lập giới hạn hàm lượng tối thiểu trong tiêu chuẩn hóa dược liệu
Sự chênh lệch về hàm lượng giữa các mẫu có thể bắt nguồn từ điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng, thời điểm thu hái và quy trình sơ chế Kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào cũng như áp dụng các tiêu chuẩn hóa phù hợp để đảm bảo tính nhất quán trong sản xuất Phương pháp phân tích đã chứng minh tính khả thi cao, có thể áp dụng trong thực tiễn sản xuất, nghiên cứu và quản lý chất lượng dược liệu
Bồ công anh, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chuyên luận riêng cho dược liệu này trong tương lai
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
Từ kết quả đã thu được, đề tài có những kết luận sau:
1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC phân tích đồng thời Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic trong bồ công anh Đề tài đã xây dựng thành công phương pháp HPLC/PDA định tính được các chất Luteolin-7-glucuronid, Luteolin, Acid caffeic và Acid clorogenic; phương pháp định lượng đồng thời Luteolin-7-glucuronid, Luteolin và Acid clorogenic trong bồ công anh Việt Nam Cụ thể là:
Mẫu thử được chiết siêu âm với dung môi ethanol 50%, pha tĩnh sử dụng cột C18 (250 x 4,6mm; 5àm), sử dụng dung mụi pha động là methanol : acid o-phosphoric 0,1%, tốc độ dũng 1,0ml/phỳt, thể tớch tiờm 10àl, bước sóng phát hiện 330nm, thời gian phân tích 35 phút
Phương pháp được thẩm định đạt tiêu chí độ chính xác, độ đúng, tính đặc hiệu và độ nhạy, có khả năng ứng dụng cao trong kiểm nghiệm
