Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư... Khung benzimidazol-5-carboxamid trong các chất ức chế ung thư Gần đây nhất, vào năm 2
TỔNG QUAN
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất mang khung benzimidazol
Benzimidazol đầu tiên được tổng hợp bởi nhà khoa học Hobrecker vào năm
1872 [6] Hợp chất này là một dị vòng thơm chứa nitơ bao gồm vòng benzen kết hợp tại vị trí số 4 và 5 của vòng imidazol [7].
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của benzimidazol
Trong lịch sử nghiên cứu, benzimidazol được chú ý từ khi Woolley phát hiện ra sự tương đồng về mặt cấu trúc của 2-aminobenzimidazol với purine vào năm 1944 và Brink phát hiện ra 5,6-dimethylbenzimidazol là sản phẩm phân hủy của vitamin B12 [8] Sau đó, khung benzimidazol được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và chứng minh là một khung cấu trúc được chú ý trong lĩnh vực y học với một loạt tác dụng dược lý Điều này được cho rằng xuất phát từ sự kết hợp của vòng benzen và imidazol độc đáo, có thể tương tác không cộng hóa trị với một loạt các mục tiêu sinh học do sự có mặt của hệ thống vòng thơm giàu điện tử và dị vòng 2 nguyên tử nitơ [9] Theo thời gian, benzimidazole và dẫn chất của nó đã phát triển thành hệ dị vòng đầy tiềm năng với nhiều loại thuốc được FDA chấp thuận như albendazole, bendamustin, thiabendazol, benzitriamid, mizolastin, omeprazol, (Hình 1.2) [10]
Hình 1.2 Các thuốc trên thị trường có chứa khung benzimidazol [10]
1.1.2 Khung benzimidazol trong điều trị ung thư
Một trong những nguyên nhân chính gây ra sự phát triển của ung thư là rối loạn biểu sinh, đây là một biến đổi di truyền làm thay đổi biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự ADN Do đó tác động vào mục tiêu thay đổi biểu sinh là liệu pháp điều trị ung thư tiềm năng [8] Đặc biệt, benzimidazol có cấu trúc giống với các nucleotid purin tự nhiên, cho phép chúng dễ dàng tiếp xúc với các mục tiêu sinh học trong cơ thể sống [11] Vì vậy, các hợp chất mang khung benzimidazol có nhiều tác dụng sinh học trên các tế bào ung thư khi chúng tương tác với nhiều mục tiêu biểu sinh khác nhau như ức chế HDAC, ức chế protein kinase CK2, ức chế topoisomerase, ức chế tyrosine kinase, chống hình thành mạch, ức chế chống tăng sinh, ức chế yếu tố gây thiếu oxy [10]
Histone deacetylase (HDAC) là một loại enzym loại bỏ nhóm acetyl các gốc histone lysine dẫn đến sự ngưng tụ chromatin và ức chế phiên mã Chúng cũng điều chỉnh trạng thái acetyl hóa của các protein không phải histone và protein tế bào chất Ức chế HDAC có thể dẫn đến histone bị acetyl hóa quá mức, chu kỳ tế bào bị dừng lại và tế bào chết [12] Vì vậy, chất ức chế histone deacetylase (HDAC) là một nhóm thuốc chống ung thư tương đối mới đóng vai trò quan trọng trong điều hòa biểu sinh hoặc không biểu sinh, gây ra cái chết, apoptosis và ngừng chu kỳ tế bào ở các tế bào ung thư [13] Do đó, HDAC là một mục tiêu tiềm năng để nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư
Năm 2009, Wang và cộng sự đã tổng hợp N-hydroxy-1,2-R1,R2-1H- benzimidazol-5-yl acrylamid, nhấn mạnh rằng hợp chất 1a (hình 1.3) là chất có khả năng ức chế HDAC1 với IC50 là 0,035 ± 0,016 μM và ức chế các isoenzyme HDAC loại I, II và IV trong phạm vi nanomolar Nó có hoạt tính chống tăng sinh khi được thử nghiệm trên các dòng tế bào HCT116, A2780 và PC3 với giá trị IC50 (μM) lần lượt là 0,20, 0,19 và 0,15 [14]
Một nghiên cứu khác vào năm 2010, Bressi và cộng sự đã tổng hợp N - hydroxy-3-[3-(1-R-1H- benzimidazol-2-yl)-phenyl]-acrylamid và dẫn chất của nó Hợp chất 1b (hình 1.3) cho thấy hoạt tính ức chế HDAC2 (IC50 là 10,0 nM), HDAC6 (IC50 là 100 nM) và HDAC8 (IC50 là 200 nM) Hơn thế nữa, cơ chế tác dụng của nó đã được chứng minh bằng quá trình tăng acetylation H3 và H4 trong các tế bào bệnh bạch cầu HL60 Tuy nhiên, nghiên cứu mới chỉ đánh giá khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (EC50) của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư phổi A549 (EC50 là
0,6 - 50 μM), bệnh bạch cầu HL60 (EC50 là 0,03 - 50 μM) và PC3 (EC50 là 0,05 - 50 μM) [15]
Hình 1.3 Một số dẫn chất của benzimidazol ức chế HDAC [13],[14]
Protein kinase là các enzyme điều chỉnh các con đường tế bào bao gồm tăng trưởng, tăng sinh, biệt hóa và chết tế bào theo chương trình, đặc biệt là những enzyme liên quan đến quá trình truyền tín hiệu bằng cách phosphoryl hóa các protein tế bào khác Vì vậy, sự mất điều hòa hoạt động của kinase là nguyên nhân thường gặp gây ra bệnh, đặc biệt là ung thư [16] Do đó, ức chế protein kinase là liệu pháp điều trị ung thư tiềm năng và khung benzimidazol là đã được nghiên cứu rộng rãi như một khuôn mẫu để tổng hợp chất ức chế protein kinase (Hình 1.4)
Năm 2021, Abemaciclib là chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (CDK) đã được FDA chấp thuận để sử dụng làm thuốc bổ trợ với liệu pháp nội tiết để điều trị ung thư vú [17] Abemaciclib (hợp chất 1c) nhắm mục tiêu chọn lọc vào CDK4 (IC50 2 àmol/L) và CDK6 (IC50 = 10 àmol/L) và liờn kết cạnh tranh với vị trớ liờn kết ATP của các enzym [18] Ức chế CDK4/6 làm ức chế quá trình phosphoryl hóa Rb, dẫn đến cản trở sự tăng sinh tế bào ung thư [19]
Hình 1.4 Cấu trúc dẫn chất ức chế protein kinase [17]
1.1.3 Khung benzimidazol-5-carboxamid trong các chất ức chế ung thư
Gần đây nhất, vào năm 2023, Shailendra Singh cùng các cộng sự đã tiến hành tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất benzimidazol-5-carboxamid [20] Nhóm nghiên cứu đã tổng hợp và thử độc tính tế bào của 12 hợp chất đối với các dòng tế bào ung thư đại tràng (HCT-116 và CaCO-2), ung thư vú (MCF-7) và dòng tế bào bình thường (HEK293) đã được nghiên cứu in vitro sử dụng xét nghiêm sống sót tế bào 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) Tất cả các hợp chất đều được chứng minh có tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư trên ở mức độ từ trung bình đến tốt với giá trị IC50 đối với các dòng tế bào ung thư HCT-116, CaCO-2 và MCF-7 lần lượt là (3,0-10,0 àM), (4,1-11,6 àM), (3,5-9,8 àM) Đồng thời cỏc hợp chất trờn khụng ảnh hưởng tới dũng tế bào bỡnh thường HEK293 (IC50: 30,1- 42,4 àM) Đặc biệt, trong số đú thỡ hợp chất 1d thể hiện khả năng gây độc tế bào tốt nhất đối với ba dòng tế bào ung thư trên [20]
Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất 1d [20]
Từ đó, chúng tôi thấy các hợp chất mang khung benzimidazol có tiềm năng trong việc nghiên cứu và điều trị các tế bào ung thư Đặc biệt, trong những năm gần đây, khung benzimidazol-5-carboxamid được chứng minh là khung có hoạt tính kháng ung thư tốt Do vậy, khóa luận đã sử dụng khung cấu trúc benzimidazol-5-carboxamid với mong muốn tìm ra hợp chất mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt hơn các hợp chất đã công bố trước đó.
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất mang khung 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen
Trong những năm gần đây, tubulin trở thành mục tiêu cho sự phát triển của thuốc chống ung thư do chúng tham gia vào một loạt các quá trình tế bào bao gồm điều chỉnh sự vận động, tín hiệu tế bào, duy trì hình dạng tế bào, sự tăng sinh tế bào và vận chuyển nội bào [21] Do đó, ức chế tubulin gây gián đoạn quá trình phân bào dẫn đến dừng chu kỳ tế bào và apoptosis Vì vậy, tubulin là mục tiêu được chú ý là liệu pháp điều trị ung thư trong nhiều nghiên cứu
Trong đó, Millemachin là dẫn xuất có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư nhắm mục tiêu vào tubulin Millemachin là một pyranochalcon tự nhiên, lần đầu
6 được phân lập từ Millettia pachycarpa bởi Chen và công sự trong phòng thí nghiệm vào năm 2013 Những hợp chất này ức chế mạnh mẽ sự phát triển của các dòng tế bào ung thư và sự trùng hợp tubulin bằng cách liên kết với vị trí colchicin của tubulin và khiến các tế bào ngừng hoạt động trong giai đoạn G2/M của chu kỳ tế bào [21]
Hình 1.6 : Cấu trúc hóa học của Millemachin [21]
Năm 2014, Ở Trung Quốc, Zhuang Yang và cộng sự đã tổng hợp dẫn xuất mới của Millepachine và đánh giá hoạt tính chống tăng sinh trong ống nghiệm Dãy dẫn chất đều chứa 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen và thay thế nhóm methoxyl bằng diethyl amino hoặc đưa nhóm hydroxyl vào vòng B để tăng hoạt tính chống ung thư và hiệu quả in vivo hoặc thay thế ở vị trí ortho của nhóm methoxy bằng nhóm este propionat (hợp chất 1e) thì hoạt tính tăng gấp 15-45 lần so với Millemachin Sau đó, họ tập trung nghiên cứu và tổng hợp dãy dẫn chất thay thế vị trí ortho của nhóm methoxy bằng nhóm amino thì kết quả ghi nhận tăng đáng kể hoạt động chống tăng sinh Trong số đó, 8 chất thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 từ 8 – 27 nM đối với nhóm dòng tế bào ung thư Đặc biệt, hợp chất 1f được chứng minh là chất ức chế trùng hợp tubulin bằng cách liên kết tại vị trí colchicin và có tác dụng chống tăng sinh mạnh đối với khối u HepG2 trờn dũng tế bào gan (IC50= 0,008 ± 1 àM), khối u MCI- H358 của phổi (IC50= 0,012 ± 5 àM), ung thư vỳ MCF-7 (IC50= 0,027 ± 4 àM) [22]
Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của chất 1e và 1f [22]
Xét với một mục tiêu đầy tiềm năng khác mà các nhà nghiên cứu nhắm tới để tìm ra các chất có hoạt tính kháng ung thư tốt là HSP90 HSP90 là một mục tiêu đặc biệt do nó tồn tại ở tế bào thường với số lượng cực lớn, đóng vai trò quan trọng trong các quá trình tế bào thiết yếu và các con đường điều hòa [23] Vì vậy, sự biểu hiện quá
7 mức của HSP90 đã được tìm thấy trong nhiều tế bào khối u bao gồm ung thư vú, phổi, đại trực tràng, buồng trứng, nội mạc tử cung, thực quản, xương, tiết niệu và tuyến tiền liệt Từ đó, ức chế HSP90 là một mục tiêu trong nhiều công trình nghiên cứu về ung thư Trong một nghiên cứu các dẫn xuất của deguelin về khả năng ức chế HSP90 được công bố vào năm 2012, Dong-Jo Chang và các cộng sự đã tổng hợp một dãy các dẫn chất mang khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen đồng thời chứng minh được tác dụng kháng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ H1299 của chúng [24] Hợp chất đều có giá trị IC50 rất nhỏ nên đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư phổi rất tốt
Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1g-1i [24]
Vì vậy, khóa luận chọn khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen để tiến hành khóa luận với mong muốn tìm ra hợp chất có hoạt tính kháng ung thư tốt hơn hợp chất đã công bố.
Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol
Quá trình tổng hợp đầu tiên của benzimidazol được Hoebrecker thực hiện bằng cách khử 4-methyl-2-nitroacetanilid và sau đó ngưng tụ đóng vòng tạo khung benzimidazol (Sơ đồ 1.1) [8]
Sơ đồ 1.1 Tổng hợp khung benzimidazol từ 4-methyl-2-nitroacetanilid [8]
Với sự phát triển về kiến thức và theo nhu cầu hiện tại, các phương pháp tổng hợp khác nhau đã được phát triển để tổng hợp khung cấu trúc benzimidazol, trong thường xuất phát từ nguyên liệu ortho-phenyldiamine (OPDA)
1.3.1 Phản ứng ngưng tụ o-phenyldiamin với acid carboxylic
Một phương pháp sử dụng phổ biến là ngưng tụ OPDA cùng với acid cacboxylic hoặc các dẫn xuất của nó, rồi đun nóng chúng lại với nhau trong môi
8 trường acid HCl Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất được giải thích bởi ệzbey và cỏc cộng sự [25] Sơ đồ 1.2 thể hiện quỏ trỡnh ngưng tụ cú xỳc tỏc HCl của OPDA và acid carboxylic
Sơ đồ 1.2 Phản ứng ngưng tụ Philip để tổng hợp khung benzimidazol [25]
Tuy nhiên, phương pháp mang lại hiệu suất thấp khi tổng hợp 2- arylbenzimidazol từ acid cacboxylic thơm [26]
1.3.2 Phản ứng ngưng tụ OPDA với aldehyd
Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Fazlinia và Sheikh, sử dụng hạt nano CuO để tổng hợp 2-arylbenzimidazole bằng phản ứng ngưng tụ giữa OPDA và aldehyde trong điều kiện không có dung môi trong thời gian ngắn (Sơ đồ 1.3) Hiệu ứng phản ứng đạt từ 76-97% Chất xúc tác của phản ứng này có thể được tái sử dụng 8 lần chạy phản ứng mà không bị mất hoạt tính xúc tác đáng kể của nó [27]
Sơ đồ 1.3 Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác hạt nano CuO [27]
Một tác nhân khác sử dụng để tổng hợp 2-phenylbenzimidazol là NaHSO3 Phản ứng ngưng tụ của OPDA với aldehyde được thúc đẩy từ NaHSO3 trong nước Phản ứng diễn ra đơn giản trong thời gian ngắn [28] (Sơ đồ 1.4)
Sơ đồ 1.4 Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác NaHSO 3 [28]
Bên cạnh đó, NaHSO3 là một hợp chất đặc biệt, có khả năng kết hợp với aldehyd Tính chọn lọc của phản ứng phụ thuộc vào đương lượng của NaHSO3 với đương lượng lớn hơn 11 thì phản ứng có tính chọn lọc cao và tạo ra một sản phẩm duy nhất.Việc sử dụng NaHSO3 trong quá tình tổng hợp này cũng đã cho thấy hiệu suất tốt, tiến hành và xử lý phản ứng đơn giản (lọc thu tủa) [29] Do đó nghiên cứu sử dụng phản ứng này để tổng hợp khung benzimidazol
Các phương pháp tổng hợp khung chromen
1.4.1 Sự alkyl hóa và đóng vòng Claisen bởi Jiyoung Mun
Năm 2012, trong quá trình tổng hợp các chất ức chế HIF-1 dựa trên 3,4- dimethoxy-N-[(2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)methyl]-N-phenylbenzensulfonamid, Jiyoung Mun và cộng sự [30] đã tổng hợp được 2,2-dimethyl-2H-chromen-6- carbaldehyd như một chất trung gian
Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp 2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd bởi Jiyoung
Tác nhân alkyl hóa Jiyoung Mun sử dụng là dẫn chất clo thay vì alcol như Dong-Jo Chang với điều kiện phản ứng đơn giản hơn [24] Ở phản ứng đóng vòng Claisen, N-methyl-2-pyrrolidon được sử dụng làm dung môi do có điểm sôi cao
(202°C) và dễ loại bỏ khỏi dung dịch diethyl ether bằng cách rửa với nước Tuy nhiên hiệu suất của 2 bước này chỉ đạt 15%
1.4.2 Phản ứng oxy hóa dị vòng
Trong năm 2018, Hongchan An đã có sự khác biệt, đột phá hơn trong việc điều chế dẫn chất, khi chỉ sử dụng 1 phản ứng với 3-methyl-2-butenal đi từ resorcinol được hòa tan trong dung môi Ethanol với xúc tác CaCl2.2H2O với triethylamin chỉ cần hồi lưu trong 3 giờ với hiệu suất khá cao hơn 70% [31]
Sơ đồ 1.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi Hongchan
Định hướng thiết kết cấu trúc
Từ phần lý thuyết trên, các hợp chất chứa khung benzimidazol và cấu trúc dẫn chất của chromen đã được nghiên cứu và chứng minh hoạt tính sinh học đa đạng đặc biệt khả năng kháng ung thư tốt qua những hợp chất đã công bố Trên cơ sở đó, khóa luận đã tiến hành tổng hợp khung benzimidazol kết hợp với cấu trúc khung 5- methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen một cách hợp lý với mong muốn tăng khả năng
10 kháng ung thư của các hợp chất mới Đồng thời, thay thế vị trí số 5 của khung benzimidazol bằng nhóm thế amid và thay thế gốc R khác nhau để tạo ra nhiều hợp chất mới
Hình 1.9 Chất mục tiêu mới có cấu trúc 5-methoxy -2,2-dimethyl-2H-chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid
Các nội dung sau đây của khóa luận sẽ trình bày cụ thể về cách tiến hành tổng hợp và kết quả thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hóa chất, thiết bị
Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi và hóa chất của Phòng thí nghiệm của Bộ môn Hóa hữu cơ, trường Đại học Dược
2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm có xuất xứ các công ty hóa chất như Merck, Việt Nam, Trung Quốc, Sigma-Aldrich Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm và được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu
TT Nguyên liệu Nguồn gốc, Xuất xứ
4 Bản mỏng silica gel Merck
18 Natri sulfat khan Trung Quốc
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 500 mL, 250 mL, 100 mL, 50 mL, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các loại 250 mL, 100 mL, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur,…
- Bơm hút chân không KNF (Đức)
- Máy cất quay EYELA (Nhật Bản)
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA - RTC (Pháp)
- Cân kỹ thuật (Trung Quốc)
- Cân phân tích (Trung Quốc)
- Buồng soi UV bước sóng 254 nm Spectroline (Mỹ)
- Sắc ký lớp mỏng: được tiến hành trên bản mỏng silica gel 60GF254 (Merck)
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR) Bruker Acance 400 MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) tại Khoa Dược – Trường Đại học Quốc gia Seoul
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR) Bruker Acance 600 MHz và với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NMR) Bruker Acance 100 MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) tại Khoa Dược – Trường Đại học Quốc gia Seoul
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NMR) Bruker Acance 150 MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HR/MS Dionex Ultimate UHPLC + Q- Exactive Orbitrap MS của hãng Thermo Scientific– Viện kiệm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
Nội dung nghiên cứu
- Tổng hợp được 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid bao gồm:
Tổng hợp 2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-propyl-1H benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.1)
Tổng hợp 2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-phenethyl-1H benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.2)
Tổng hợp 2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-(4 sulfamoylphenethyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (VIII.3)
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng
- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được qua các dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR,
2.2.2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp Đánh giá tác dụng kháng ung thư của 3 chất tổng hợp được trên trên 3 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549, tế bào ung thư vú Her2 dương tính SKBR3, tế bào biểu mô thận có nguồn gốc từ phôi người HEK293
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học
- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất đã được thiết kế (VIII.1-3)
- Theo dõi tiến trình phản ứng và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết các chất bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
- Sử dụng phương pháp chiết, sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột để tinh chế các chất tổng hợp được
2.3.3 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Các dẫn chất sau khi tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và nhiệt độ nóng chảy:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silica gel 60GF254 hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp sau đó chấm lờn bản mỏng với 2-6 àL, sấy khụ Triển khai sắc ký, quan sỏt kết quả dưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 nm
- Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện EZ
2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc
Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để xác định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR):
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) với kỹ thuật làm viên nén KBr ghi trong vùng 4000-500 cm -1
- Phổ khối lượng (MS): ghi bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao
LC-HR/MS Dionex Ultimate UHPLC + Q- Exactive Orbitrap MS
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR): được ghi bằng máy Bruker Acance đo ở tần số 400 và 600 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi DMSO-d 6
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker Acance đo ở tần số 100 và 150 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng
15 đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d 6
2.3.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược lý Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được theo phương pháp MTT trên 3 dòng tế bào ung thư A549, SKBR3, HEK293
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp in vitro để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosma, 1983 [32] Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ = 570 nm [33] Từ đó, xác định giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào) Hơn thế nữa, thử nghiệm còn đánh giá khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào thường do đó từ giá trị
IC50 ta có giá trị chọn lọc SI (tỷ lệ nồng độ gây độc tế bào của một chất so với nồng độ hoạt tính sinh học hiệu quả của nó) Chỉ số SI để đánh giá hoạt động chống ung thư của một chất, độc tính của nó đối với tế bào không ác tính Chất có chỉ số SI > 10 thì chất đó có tiềm năng để nghiên cứu thêm Còn chất có giá trị chọn lọc IS ≥ 3 thì chất đó được coi là một chất chống ung thư có tiềm năng [34]
2.3.5.2 Hóa chất, thuốc thử và thiết bị
- Môi trường nuôi cấy DMEM high glucose, môi trường RPMI 1640 và các yếu tố bổ sung bao gồm huyết thanh thai bò (FBS) và kháng sinh Penicillin/Streptomycin được mua từ Pan-Biotech (Aidenbach, Germany)
- Đệm muối phosphat PBS 1X (Pan-Biotech)
- Thuốc thử MTT được mua từ AK Scientific Inc (Union City, CA, USA)
- DMSO được mua từ Merck (Rahway, NJ, USA)
- Doxorubicin (Sigma Aldrich, MO, USA)
- Các thiết bị nuôi cấy tế bào (đĩa nuôi cấy mô 96 giếng, đĩa 10 mm, đĩa 35 mm và phiến kính 8 giếng) được mua từ Corning Incorporated (Somerville, Massachusetts, Hoa Kỳ)
Mẫu thử được hũa tan trong DMSO với nồng độ gốc 50 àM và bảo quản ở -20 o C Khi cần ủ với tế bào, mẫu thử được pha loãng trong môi trường nuôi cấy đến các nồng độ thích hợp
Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm:
- Dòng ung thư phổi không tế bào nhỏ A549
- Dòng ung thư vú Her2 dương tính SKBR3
- Dòng tế bào biểu mô thận có nguồn gốc từ phôi người HEK293 (tế bào lành tính)
Dòng tế bào A549 và HEK293 được nuôi trong môi trường DMEM (Dulbeccos Modified Ethyl acetatgle Medium), SKBR3 được nuôi trong môi trường RPMI (Roswell park memorial institute) Cả hai môi trường đều bổ sung huyết thanh thai bò FBS 10% và dung dịch kháng sinh/kháng nấm 1% (penicillin/streptomycin/antibiotic) Tế bào được duy trì trong tủ ấm tạo ẩm ở 37 0 C với 5% CO2, bão hòa độ ẩm Tế bào được cấy chuyển mỗi khi đạt mật độ 80-90% đĩa nuôi
Tế bào được cấy trong một đĩa 96 giếng thành trong ở mật độ 1×10 4 tế bào/giếng trong môi trường đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, tế bào được ủ với môi trường chứa cỏc mẫu thử ở nồng độ tăng dần trong 72 giờ Kết thỳc thời gian điều trị, 10 àL dung dịch MTT 5 mg/mL được thêm trực tiếp vào môi trường và ủ trong 2 giờ Môi trường sau đó được loại bỏ để thu các tinh thể kết kinh màu tím ở đáy đĩa Tinh thể được hũa tan trong 200 àl DMSO Độ hấp thu của dung dịch tạo thành được đo ở bước sóng 570 nm sử dụng máy đọc đĩa ((Variaskan LUX, Thermo Scientific)
2.3.5.5 Xử lý kết quả thực nghiệm
- Tỉ lệ ức chế tế bào tại mỗi nồng độ được tính theo công thức:
% ức chế tế bào = (ΔODchứng - ΔODmẫu thử)/ΔODchứng x 100 trong đó ΔODchứng/mẫu thử = ODchứng/mẫu thử - ODtrắng
Giá trị ức chế 50% tế bào ung thư (IC50) được tính toán sử dụng phân tích hồi qui phi tuyến trên phần mềm Graphpad Prism 10.4 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập
Dữ liều được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (methyl acetatn ± SE)
- Tỉ lệ chọn lọc SI được tính theo công thức:
SI = IC50( tế bào thường )/ IC50( tế bào ung thư )
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Tổng hợp hóa học
Quy trình tổng hợp hóa học chất trung gian 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-carbaldehyd được mô tả theo sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd
Quy trình tổng hợp hóa học dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid được tóm tắt trong sơ đồ dưới đây:
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid
Quy trình tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid gồm:
- Giai đoạn 1: Tổng hợp chất trung gian 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- carbaldehyd
- Giai đoạn 2: Tổng hợp chất trung gian 4-cloro-3-nitrobenzamid
- Giai đoạn 3: Tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid
3.1.1 Tổng hợp chất trung gian
3.1.1.1 Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd (III)
- Tổng hợp 5-hydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd (II)
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp 5-hydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd
Hòa tan 2,4-dihydroxybenzaldehyd (I) (3,00 g; 21,72 mmol) trong EtOH, thêm lần lượt CaCl2 (2,41 g; 21,72mmol), TEA (3 ml; 65,16 mmol), 3-methylbut-2-enal (36 ml; 43,44 mmol) vào bình phản ứng 50 ml Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu và có khuấy từ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi Ea:n-Hexan = 1:20 trên bản mỏng silica gel 60 GF254 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
Sau 3 giờ thì phản ứng kết thúc, bổ sung 15 ml nước cất vào bình phản ứng rồi chiết thu sản phẩm nhiều lần với ethyl acetat, mỗi lần 15 ml ethyl acetat, gộp dịch chiết chung của các lần chiết Sau đó làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 Sau đó, tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với pha động là dung môi n-hexan 100% rồi cất quay ở áp suất giảm ở nhiệt độ 45 o C để loại dung môi Sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được sản phẩm
Chất II thu được là chất rắn màu trắng có khối lượng 2,10 g với hiệu suất phản ứng đạt 48% (SKLM, silica gel 60 GF254, hệ dung môi Ea:n-Hexan = 1:20)
- Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd (III)
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd
Hòa tan chất II (2,10 g; 10,28 mmol) trong DMF, thêm lần lượt K2CO3 (4,25 g; 30,84 mmol), CH3I (0,99 ml; 12,33 mmol) vào bình phản ứng 50 ml, đun hỗn hợp trong bình kín ở 60℃ và có khuấy trong 24 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi Ea:n-Hexan = 1:20 trên bản mỏng silica gel 60GF254 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
Sau 24 giờ thì phản ứng kết thúc, bổ sung nước cất vào bình phản ứng rồi chiết thu sản phẩm nhiều lần với ethyl acetat, mỗi lần 15 ml ethyl acetat, gộp dịch chiết chung của các lần chiết Sau đó làm khan dịch chiết ethyl acetat bằng Na2SO4 rồi cất quay ở áp suất giảm ở nhiệt độ 45 o C để loại dung môi Sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được sản phẩm
Chất III thu được là chất lỏng màu vàng đậm có khối lượng 2,20 g, hiệu suất phản ứng đạt 98% (SKLM, silica gel 60GF254, hệ dung môi Ea:n-Hexan = 1:20)
Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp 4-cloro-3-nitrobenzamid
Hòa tan acid 4-cloro-3-nitrobenzoic (IV) (3,00 g, 14,88 mmol) trong dung môi SOCl2 (khoảng 40 ml), rồi thêm 5-10 giọt DMF làm xúc tác Hỗn hợp phản ứng được đun nóng và có khuấy từ ở 50 0 C , hệ phản ứng kín để tránh hệ tiếp xúc với nước Sau 4 giờ, hỗn hợp phản ứng chuyển thành dung dịch trong suốt Sau đó, hút kiệt SOCl2 rồi làm lạnh sâu bằng nước đá có thêm NaCl Cho thật nhanh và liên tục dung dịch amoniac (chú ý khói thoát ra mạnh và tỏa nhiệt nên chú ý làm trong tủ hút) đến khi hết khí thoát ra Sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi MeOH:DCM = 1:20 trên bản mỏng silica gel 60 F254 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
Sau khi phản ứng kết thúc, thêm 40 ml nước cất vào dung dịch tạo tủa Lọc và rửa tủa bằng nước cất qua phễu lọc buchner 3 lần, mỗi lần 5 ml nước cất Tủa được sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được sản phẩm
Chất V thu được là chất rắn màu trắng có khối lượng 2,80 g, hiệu suất phản ứng đạt 93% (SKLM, silica gel 60GF254, hệ dung môi MeOH:DCM = 1:20)
3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2 H –chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid
3.1.2.1 Tổng hợp các dẫn chất 3-nitro-4-aminobenzamid (VI.1-3)
Các dẫn chất (VI.1-3) được tổng hợp từ chất 4-cloro-2-nitrobenzamid (V) bằng phản ứng thế ái nhân với tác nhân là các amin R-NH2 trong dung môi DMF theo sơ đồ 3.6:
Sơ đồ 3.6 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất 3-nitro-4-aminobenzamid
Quy trình tổng hợp chung:
Cho vào bình cầu phản ứng có thể tích 50 ml hợp chất V (1 mmol) hòa tan vừa đủ trong DMF (10 ml) Rồi thêm amin R-NH2 (1,5 mmol) và K2CO3 (3 mmol) Hỗn hợp đun nóng và có khuấy từ ở nhiệt độ 90 o C Theo dõi phản ứng mỗi 2 giờ bằng SKLM với hệ dung môi MeOH:DCM = 1:20 trên bản mỏng silica gel 60F254 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá và thêm 40 ml nước cất vào trong bình để tạo kết tủa Lọc và rửa tủa bằng nước cất qua phễu lọc buchner 3 lần, mỗi lần 5 ml nước cất Đặc biệt, chất VIII.3 được tạo tủa trong ethyl acetat và thao tác rửa tủa bằng ethyl acetat Tủa được sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được sản phẩm
- Tổng hợp 3-nitro-4-(propylamino)benzamid (VI.1):
Sơ đồ 3.7 Sơ đồ tổng hợp 3-nitro-4-(propylamino)benzamid
Hợp chất VI.1 được tổng hợp từ hợp chất V (0,40 g; 2,00 mmol) và propylamin (0,18 g; 3,00 mmol) và K2CO3 (1,37 g; 29,78 mmol) trong 10 ml DMF Sau 5 giờ, phản ứng kết thúc, chất VI.1 thu được là chất rắn màu vàng có khối lượng là 0,32 g, hiệu suất phản ứng đạt 71,9% (SKLM, silica gel 60 GF254, hệ dung môi Ea:n-Hexan 1:20)
- Tổng hợp 3-nitro-4-(phenethylamino)benzamid (VI.2):
Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tổng hợp 3-nitro-4-(phenethylamino)benzamid
Hợp chất VI.2 được tổng hợp từ hợp chất V (0,60 g; 3,00 mmol) và phenethylamin (0,54 g; 4,50 mmol) và K2CO3 (1,24 g; 8,99 mmol) trong 10 ml DMF Sau 7 giờ, phản ứng kết thúc, chất VI.2 thu được là chất rắn màu cam có khối lượng là 0,80 g, hiệu suất phản ứng đạt 93,6% (SKLM, silica gel 60 GF254, hệ dung môi Ea:n- Hexan = 1:20)
- Tổng hợp 3-nitro-4-((4-sulfamoylphenethyl)amino)benzamid (VI.3):
Sơ đồ 3.9 Sơ đồ tổng hợp 3-nitro-4-((4-sulfamoylphenethyl)amino)benzamid
Hợp chất VI.3 được tổng hợp từ hợp chất V (0,50 g; 2,49 mmol) và 4- sulfamoyl phenethylamine (0,75 g; 3,75 mmol) và K2CO3 (1,03 g; 7,50 mmol) trong
10 ml DMF Sau 8 giờ phản ứng kết thúc, chất VI.3 thu được là chất rắn màu cam có khối lượng là 0,60 g, hiệu suất phản ứng đạt 65,9% (SKLM, silica gel 60 GF254, hệ dung môi Ea:n-Hexan = 1:20)
- Tổng hợp các dẫn chất 3-amino-4-aminobenzamid (VII.1-3)
Các dẫn chất (VII.1-3) được tổng hợp từ các dẫn chất (VI.1-3) bằng phản ứng khử hóa với tác nhân là HCOONH4 với xúc tác Zn trong dung môi EtOH theo sơ đồ 3.10:
Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 3-amino-4-aminobenzamid (VII.1-3)
Quy trình tổng hợp chung:
Cho vào bình cầu phản ứng có thế tích 50 ml hợp chất VI.1-3 tương ứng (1 mmol) hòa tan trong dung môi EtOH (10 ml), sau đó cho thêm Zn (5 mmol) và HCOONH4 (8 mmol) Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong hệ kín ở nhiệt độ 50 o C Theo dõi phản ứng mỗi 15 phút bằng SKLM với hệ dung môi MeOH:DCM trên bản mỏng silica gel 60GF254 và phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm
Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ xúc tác Zn, dùng dung môi DCM để rửa chất từ bình phản ứng vào bình cầu Sau đó cất loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi MeOH: DCM = 1:20 với nồng độ thích hợp rồi cất quay ở áp suất giảm ở nhiệt độ 45 o C để loại dung môi Sấy khô trong tủ sấy chân không để thu được sản phẩm
- Tổng hợp 3-amino-4-(propylamino)benzamid (VII.1)
Sơ đồ 3.11 Sơ đồ tổng hợp 3-amino-4-(propylamino)benzamid
Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc
3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết
Sản phẩm sau khi tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng Các chất sau khi tổng hợp được hòa tan vào dung môi thích hợp, sau đó chấm 2-6àL lờn bản mỏng, sấy khụ Triển khai sắc ký với hệ dung mụi MeOH:DCM với các tỷ lệ khác nhau Sau khi kết thúc, sắc ký được quan sát dưới đèn tử ngoại 254 nm Kết quả cho thấy các chất VIII.1-3 đều cho thấy duy nhất một vết rõ ràng, không có các vết phụ khác, đủ điều kiện đo phổ và đánh giá hoạt tính sinh học Giá trị R f được ghi lại ở bảng 3.2
3.2.1.2 Đo nhiệt độ nóng chảy
Các chất VIII.1-3 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM đồng thời được tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các dẫn chất
VIII.1-3 tổng hợp được đều có điểm chảy rõ ràng, khoảng chênh lệch hẹp 1-2 o C Kết quả cụ thể được tóm tắt ở bảng 3.2
Bảng 3.2 Giá trị R f và t o nc của các chất VIII.1-3
Ký hiệu Công thức cấu tạo t o nc ( o C) R f
Các chất sau khi tổng hợp được tiến hành đi đo: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR)
Kết quả phổ hồng ngoại của 3 hợp chất được trình bày ở bảng 3.3
Dựa vào bảng 3.3 và phân tích phổ đồ (phụ lục 1-3), có thể nhận biết sơ bộ sự xuất hiện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ, hình dạng pic Tuy nhiên dữ liệu phổ IR chưa đủ để khẳng định cấu trúc của 3 dẫn chất tổng hợp được, cần đo thêm phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR)
Bảng 3.3 Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất (VIII.1-3)
Số sóng ứng với dao động hoá trị (cm -1 )
3.2.2.2 Phổ khối lượng HR-MS
Kết quả phân tích phổ khối của 3 hợp chất đã tổng hợp được trình bày ở bảng 3.4
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.4 và phổ đồ (phụ lục
4, 5, 6), có thể thấy các phổ đồ đều có pic phân tử với cường độ mạnh và có số khối
31 đúng bằng số khối tính toán của chất tương ứng Từ đó có thể khẳng định kết quả phổ khối lượng phù hợp với công thức dự kiến của các chất VIII.1-3
Bảng 3.4 Số liệu phổ MS của các dẫn chất (VIII.1-3)
Ký hiệu Công thức cấu tạo CTPT m/z tính toán m/z (ESI-HRMS)
3.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H–NMR
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H–NMR được trình bày ở bảng 3.5
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.5 và phổ đồ (phụ lục
7-9) cho thấy số lượng proton, độ bội tín hiệu, độ dịch chuyển hóa học và hằng số ghép cặp phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của 3 chất
Bảng 3.5 Số liệu phổ 1 H–NMR của các dẫn chất (VIII.1-3)
Ký hiệu Số liệu phân tích phổ
H4); 7,96 (s, 1H, H8’’); 7,81 (dd, J = 8,40; 1,60 Hz, 1H, H6); 7,64 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H7); 7,24 (s, 1H, H9’’); 7,21 (d, J 8,40 Hz, 1H, H3’); 6,69 (d, J = 8,40 Hz 1H, H4’); 6,58 (d, J 10,00 Hz, 1H, H8’); 5,84 (d, J = 10,00 Hz, 1H, H7’); 4,03 (t, J 7,20 Hz, 2H, H1’’); 3,40 (s, 3H, H6’’); 1,55 (sext, J = 7,60 Hz,
H6); 7,68 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H7); 7,23 (s, 1H, H10b’’); 7,14- 7,13 (m, 3H, H3’’, H4’’, H5’’); 6,86 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H3’); 6,85-6,84 (m, 2H, H4’, H8’); 6,62 (dd, J = 9,60 Hz, 7,20 Hz, 2H,
H2’’, H6’’); 5,88 (d, J = 10,20 Hz, 1H, H7’); 4,30 (t, J = 7,20 Hz, 2H, Ha); 3,41 (s, 3H, H8’’); 2,89 (t, J = 7,20 Hz, 2H, Hb); 1,45 (s, 6H, H7’’)
Hz, 1H, H7’); 4,34 (t, J = 6,60 Hz, 2H, Ha); 3,38 (s, 3H, H8’’); 3,00 (t, J = 6,60 Hz, 2H, Hb); 1,45 (s, 6H, H7’’).
Ghi chú: ẟ: độ dịch chuyển hóa học, s: singlet; d: doublet; dd: doublet of doublet; m: multiplet
3.2.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR được ghi ở bảng 3.6
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.6 và phổ đồ (phụ lục
10-12) cho thấy số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến
Bảng 3.6 Số liệu phổ 13 C-NMR của các dẫn chất (VIII.1-3)
Ký hiệu Công thức cấu tạo
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Sau khi khẳng định cấu trúc, nhóm nghiên cứu đã tiến hành đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của 3 dẫn chất (VIII.1-3) trên dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549, tế bào ung thư vú Her2 dương tính SKBR3, tế bào biểu mô thận có nguồn gốc tư phôi người HEK293 tại Phòng thí nghiệm Dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược lý Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội
Kết quả giá trị IC50 cụ thể được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên 2 dòng tế bào
Công thức cấu tạo Độc tính tế bào trên từng dòng tế bào (IC50 àM)
Chỉ số chọn lọc (SI)
Ghi chú: IC50 là nồng độ ức chế 50% sự phát triển
Nhật xét: Kết quả cho thấy 3 dẫn chất benzimidazol mới mang khung 5- methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen VIII.1-3 đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư trờn cả 2 dũng tế bào SKBR3 (IC50 = 8,84 - 38,63 àM), A549 (IC50 = 7,72 – 18,59 àM) Đặc biệt, chất VIII.3 cú chỉ số SI = 6.97 > 3 nờn được đỏnh giỏ là chất chống ung thư tiềm năng
BÀN LUẬN
Tổng hợp hoá học
4.1.1 Phản ứng tổng hợp III
Chất III được tạo thành từ hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Phản ứng ngưng tụ giữa 2,4-dihydroxybenzaldehyd với 3- methylbut-2-enal
Giai đoạn 2: Methyl hóa tạo 5-methoxy-2,2-dimethyl -2H- chromen-6- carbaldehyd
- Phản ứng ngưng tụ giữa 2.4-dihydroxybenzaldehyd với 3-methylbut-2-enal (II)
Cơ chế của phản ứng diễn ra theo sơ đồ 4.1 Trong phản ứng này Et3N (triethylamin) đóng vai trò là một base lấy đi nguyên tử hydro linh động trên nhóm -
OH phenol tạo phenolat Lúc này phenolat đóng vai trò là một nucleophil Sau đó phenolat sẽ tấn công vào hệ liên hợp 3-methylbut-2-enal theo hướng phản ứng ngưng tụ cộng hợp nucleophil 1,4
Sơ đồ 4.1 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian II
Tác nhân CaCl2 rắn khi cho vào hỗn hợp phản ứng có vai trò làm hạ nhiệt độ của hệ phản ứng Ở nhiệt độ thấp, Et3N ưu tiên lấy đi nguyên tử H linh động trên nhóm -OH phenol nằm ở xa nhóm chức -CHO hơn (ưu tiên tạo thành sản phẩm động học ở nhiệt độ thấp) Sau đó tăng nhiệt độ phản ứng và duy trì ở 80 o C, lúc này phenolat sẽ tấn công vào hệ liên hợp 3-methylbut-2-enal theo hướng phản ứng ngưng tụ cộng hợp 1,4 (ở nhiệt độ cao, ưu tiên tạo thành sản phẩm nhiệt động học) Bên cạnh đó, CaCl2 có thể hòa tan tốt trong ethanol, không gây phá hủy nhóm hydroxy của vòng benzen và có giá thành rẻ Trong khi đó các tác nhân khác như AlCl3 hay BF3 dù có khả năng phản
37 ứng tốt hơn nhưng gây phá hủy vòng chromen, nhạy cảm với nhóm -OH nên không chọn lọc Do đó CaCl2 là một lựa chọn tốt trong phản ứng này
- Phản ứng methyl hóa 5-hydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbaldehyd (III)
Hợp chất III được tạo thành từ phản ứng thế ái nhân SN2 giữa hợp chất II với
CH3I Cơ chế phản ứng được mô tả trong sơ đồ 4.2 Tác nhân được sử dụng trong phản ứng là CH3I Tác nhân CH3I được chọn thay vì alkyl halogenid khác do CH3I có khả năng alkyl hóa mạnh, cho phản ứng nhanh hơn các tác nhân alkyl khác do cấu trúc không gian ít bị cản trở Tuy nhiên cần cân nhắc kĩ do CH3I có giá thành rất cao, lại khá độc hại cho môi trường, con người và dễ bị thủy phân thành iod nên khó khăn trong quá trình bảo quản
Sơ đồ 4.2 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất trung gian III
Chất V được tạo thành từ quá trình amid hóa nhóm -COOH tạo ra -CONH2 Cơ chế của phản ứng được trình bày ở sơ đồ 4.3 Phản ứng này gồm 2 bước Bước đầu tiên, dưới tác dụng của SOCl2, nhóm COOH được chuyển thành nhóm -COCl Bước thứ 2, chất V’ với vai trò là một nucleophin, NH4OH tấn công vào vị trí carbon tích điện dương trong acyl clorid (O và Cl đều có độ âm điện lớn) Khi đó, -Cl trở thành nhóm rời đi và -NH2 thay thế vào vị trí của -Cl Trong quá trình này, khí SO2 được tạo ra
Sơ đồ 4.3 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp chất V
Việc chuyển acid thành acyl clorid làm phản ứng amid hóa xảy ra dễ dàng hơn
Do acyl clorid là chất không bền, rất dễ bị các nucleophin tấn công Phản ứng sử dụng tác nhân SOCl2 dư đồng thời đóng vai trò dung môi Tác nhân SOCl2 khá phổ biển,
38 mạnh, rẻ, tuy nhiên nó là chất lỏng dễ bay hơi đồng thời sản phẩm phụ tạo thành là khí
SO2 độc và HCl nên tiến hành và xử lý phản ứng cần thực hiện trong tủ hút Trong quá trình phản ứng với NH4OH, phản ứng cần được làm lạnh xuống 0 o C do phản ứng này tỏa nhiệt mạnh Sản phẩm được tách chiết thông qua lọc rửa tủa với nước và không cần tinh chế gì thêm ở sản phẩm tạo thành
4.1.3 Phản ứng tổng hợp VI.1-3
Phản ứng tổng hợp VI.1-3 là phản ứng N-alkyl hóa được tiến hành đơn giản với tác nhân alkyl amin: R-NH2 trong dung môi DMF và xúc tác base K2CO3 ở nhiệt độ
90 o C Đây là phản ứng xảy ra với cơ chế thế ái nhân (SNAr) (Sơ đồ 4.4)
Sơ đồ 4.4 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp VI.1-3
Thông thường, phản ứng thế SNAr đối với các nhóm thế gắn trực tiếp vào hệ vòng thơm rất khó xảy ra Tuy nhiên trong trường hợp này, hợp chất 4-chloro-3- nitrobenzamid chứa 2 nhóm thế hút electron mạnh theo hiệu ứng -I (cảm ứng) và hiệu ứng -M (liên hợp) là -NO2 và -CONH2 lần lượt ở vị trí ortho và para so với nhóm thế -
Cl Như đã trình bày trên sơ đồ 4.4, phản ứng tạo ra hợp chất trung gian (VI’.1-3) là anion trung gian (phức σ) được làm bền bởi hiệu ứng liên hợp giải toả điện tích âm nhờ 2 nhóm thế -NO2 và -CONH2 lần lượt ở vị trí ortho và para Vì vậy, phản ứng thế lưỡng phân tử SNAr giữa 4-cloro-3-nitrobenzamid và amin R-NH2 xảy ra một cách dễ dàng và đạt hiệu suất cao theo cơ chế trình bày ở sơ đồ 4.4
Bên cạnh đó K2CO3 đóng vai trò là chất trung hòa acid HCl hình thành sau phản ứng đồng thời tạo môi trường base để giữa amin ở trạng thái tự do để đóng vai trò là một hợp chất có tính nucleophil mạnh và cũng là xúc tác để phản ứng xảy ra nhanh hơn Nghiên cứu cũng đã khảo sát nhiệt độ phản ứng và nhận thấy ở 90 o C phản ứng xảy ra với hiệu suất cao với khoảng 90%
4.1.4 Phản ứng tổng hợp VII.1-3
Phản ứng tổng hợp VII.1-3 là phản ứng khử nhóm -NO2 để tạo nhóm -NH2, sử dụng tác nhân HCOONH4 và Zn trong dung môi EtOH Cơ chế phản ứng tổng hợp
VII.1-3 diễn ra theo sơ đồ 4.5
Sơ đồ 4.5 Cơ chế đề xuất cho phản ứng VII.1-3
Nhóm nitro thơm có thể khử hóa bằng nhiều tác nhân khác nhau như thiếc, sắt, kẽm trong môi trường acid, khử hóa bằng hydro phân tử với các xúc tác (niken, platin) hoặc bằng các hydrid kim loại (LiAlH4, NaBH4) Nhóm nghiên cứu đã chọn ra 3 phương pháp để thử nghiệm:
Bảng 4.1 So sánh các phương pháp khử khác nhau
Phương pháp Cách xử lý Ưu điểm Nhược điểm
Sản phẩm dễ dàng thu được qua lọc rửa xúc tác và cất loại dung môi MeOH
Thời gian phản ứng nhanh và thu được sản phẩm duy nhất
Khí H2 nhẹ, dễ bị rò rỉ và tạo hỗn hợp nổ với không khí ở khoảng nồng độ rất rộng
HCOONH4, xúc tác Zn, dung môi
Lọc rửa xúc tác của hỗn hợp phản ứng, cất loại dung môi và tinh chế trên sắc ký cột
Thời gian phản ứng nhanh và an toàn
Trải qua nhiều trạng thái trung gian trước khi đưa về amin nên phản ứng có thể không xảy ra hoàn toàn và có tạp chất
Sử dụng nhiệt độ nên amin tạo ra bị ảnh hưởng
SnCl2.2H2O, HCl đặc, dung môi
Sản phẩm thu được qua quá trình chiết và tinh chế trên sắc ký cột
An toàn do hạn chế được nguy cơ cháy nổ so với khi khử hóa bằng hydro
Thời gian phản ứng lâu hơn và phải sử dụng nhiệt độ nên amin tạo ra bị ảnh hưởng
Trải qua nhiều trạng thái
40 phân tử xúc tác trung gian trước khi đưa về amin nên phản ứng có thể không xảy ra hoàn toàn và có tạp chất
Trong quá trình chiết dễ bị nhũ hóa do tủa của muối thiếc
Sản phẩm ở dạng muối cần chuyển về dạng base tự do trước khi chiết tách, quá trình này tiến hành trong điều kiện lạnh với dung dịch NaOH và có thể sinh ra nhiều sản phẩm phụ
Từ bảng 4.1, dựa vào ưu nhược điểm của các phương pháp khóa luận đã chọn phương pháp sử dụng HCOONH4, xúc tác Zn, dung môi Ethanol
4.1.5 Phản ứng tổng hợp VIII.1-3
Xác định cấu trúc
3 dẫn chất (VIII.1, VIII.2, VIII.3) đã tổng hợp đều được xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng HR-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H- NMR và 13 C-NMR) Dữ liệu các phổ đã được trình bày trong chương 3 và phần phổ đồ được trình bày trong phần phụ lục Dưới đây là một số bàn luận về việc xác định cấu trúc thông qua dữ liệu phổ
Phổ hồng ngoại thể hiện sự dao động của các nhóm chức trong phân tử, cho thông tin về đỉnh hấp thụ của các kiểu dao động trong các nhóm chức Qua phổ đồ của các chất, dải hấp phụ đặc trưng của các nhóm chức và liên kết ở các chất tổng hợp
42 được đã được xác định Đó là các dải phổ đặc trưng liên kết N-H, liên kết C(sp 3 )-H, C(sp 2 )-H, liên kết C=O, liên kết C-O của các akyl aryl ether, liên kết C-N của amin, liên kết S=O Kết quả phổ hồng ngoại của các chất VIII.1, VIII.2, VIII.3 được ghi tại phụ lục và bảng 3.3 Dưới đây là hình ảnh minh họa của phổ hồng ngoại của chất
Hình 4.1 Phổ hồng ngoại của hợp chất VIII.3
Nhận thấy: Trên phổ đồ của hợp chất VIII.3 xuất hiện đỉnh dao động hóa trị của liên kết N-H tại vùng 3416,09 cm -1 và 3305,73 cm -1 , dải hấp thụ đặc trưng của liên kết C(sp 2 )-H xuất hiện tại vùng 3197,88 cm -1 , liên kết C(sp 3 )-H có dải hấp thụ tại vùng 2964,64 cm -1 , dải hấp thụ đặc trưng của nhóm carbonyl (C=O) tại 1652,66 cm -1 , liên kết S=O có dải hấp thụ tại vùng 1396,71 và 1331,80 cm -1 , liên kết C-O có dải hấp thụ mạnh trong 2 vùng tần số sóng tại 1215,59 cm -1 và 1069,63 cm -1 Đặc biệt, ở phổ đồ của hợp chất VIII.3 có thể quan sát thấy sự xuất hiện của 2 vân hấp thụ của dao động hóa trị liên kết S=O có cường độ tương đối mạnh tại vùng 1331,80 và 1163,21 cm -1
Như vậy, dữ liệu phổ IR đã cho thấy một số nhóm chức và liên kết trong các chất tổng hợp được, phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của 3 chất VIII.1, VIII.2,
VIII.3 Tuy nhiên, phổ IR chưa cung cấp đủ thông tin để khẳng định được cấu trúc của các chất, do vậy để khẳng định cấu trúc, chúng ta cần đo thêm phổ khối lượng (HR- MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR)
4.2.2 Phổ khối lượng (HR-MS)
Phổ đồ của các dẫn chất VIII.1-3 đều xuất hiện các đỉnh với giá trị tương ứng [M+H]+ có cường độ mạnh Vì vậy, có thể khẳng định các dẫn chất VIII.1-3 tổng hợp được có phân tử khối đúng với cấu trúc dự kiến Kết quả phổ hồng ngoại của các chất
VIII.1, VIII.2, VIII.3 được ghi tại phụ lục và bảng 3.4
Ví dụ, trên phổ đồ của chất hợp chất VIII.3, xuất hiện pic với cường độ lớn nhất [M+H] + (m/z S3,1870) phù hợp với M dự đoán là 533,1853 ứng với công thức phân tử C28H28N4O5S
Hình 4.2 Phổ khối của chất VIII.3
4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR
Phổ 1 H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của các proton của 3 dẫn chất tổng hợp được qua số liệu về độ dịch chuyển hóa học 𝛿 (ppm), độ bội, hằng số tương tác J (Hz), và cường độ của các peak được trình bày ở bảng 3.5
Hình 4.3 Công thức chung của các chất mục tiêu
Trên phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của cả 3 chất mục tiêu đều xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với các proton có độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu phù hợp với khung cấu trúc chung (trừ nhóm R thay đổi giữa các chất):
- Proton của nhân thơm nằm trong vùng 6,5-8 (ppm)
- Proton alkyl thường nằm trong vùng trường cao, có độ dịch chuyển hóa học thường là ẟ = 1- 4 (ppm)
Dưới đây là ví dụ minh họa 1 H-NMR của hợp chất VIII.2:
Hình 4.4 Phổ 1 H-NMR của hợp chất VIII.2
Hình 4.5 Vùng trường cao của phổ 1 H-NMR của hợp chất VIII.2
- Proton H10a’’ và H10b’’ trong cấu trúc -CONH2 có 2 tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học ở khoảng 7,97 ppm và 7,23 ppm Do hiệu ứng cộng hưởng giữa đôi điện tử không phân chia trên nguyên tử nitơ và nhóm carbonyl nên trong phần lớn những hợp chất amid, sự quay quanh nối C-N bị giới hạn, làm cho 2 proton gắn trên nitơ không tương đương nhau và xuất hiện 2 proton cộng hưởng khác nhau (sơ đồ 4.7)
Sơ đồ 4.7 Cơ chế hình thành 2 proton khác nhau trên nhóm amid
- Proton ở vị trí 8’’ xuất hiện trên phổ đồ dưới dạng singlet với độ dịch chuyển 3,41 ppm và có 3 proton
- Proton tại vị trí 7’’ xuất hiện trên phổ đồ dưới dạng singlet do 6H tương đương nhau, cộng hưởng ở 1,45 ppm với số proton cộng hưởng là 6 phù hợp với công thức dự kiến
- Peak tại độ dịch chuyển 4,30 ppm và 2,89 ppm đều có diện tích tương đối là 1, tách tín hiệu triplet và cùng giá trí tương tác J = 7,20 Hz nên gán với 2 proton gần nhau Tuy nhiên, proton tại vị trí a chịu ảnh hưởng từ hiệu ứng không đẳng hướng từ dị vòng benzimidazol, làm giảm chắn nhiều hơn vòng benzen Do vậy, proton tại vị trí a nằm ở vùng thấp hơn proton tại vị trí b nên proton ở vị trí a có độ dịch chuyển là 4,30 ppm dưới dạng triplet do tương tác với 2 proton ở vị trí Hb Còn proton ở vị trí b có độ dịch chuyển là 2,89 ppm dưới dạng triplet do tương tác với 2 H ở vị trí a
- Proton ở vị trí 4 có độ dịch chuyển tại 8,23 ppm dưới dạng doublet do có tương tác với H6 với hằng số tách J meta = 1,80 Hz
- Độ dịch chuyển của proton H6 trên phổ đồ là 7,83 ppm dưới dạng doublet doublet với các hằng số tách là J orthor = 8,40 Hz và J meta = 1,80 Hz do chịu ảnh hưởng của proton
H4 ở vị trí meta và H7 ở vị trí orthor
- Proton H7 có độ dịch chuyển là 7,68 ppm dưới dạng doublet Proton H7 chịu ảnh hưởng bởi proton H6 ở vị trí ortho với J ortho = 8,40 Hz
- Proton ở vị trí 3’ chịu ảnh hưởng hiệu ứng hút e của vòng benzimidazol mạnh hơn so với proton ở vị trí 4’,8’,7’ nên cộng hưởng ở vùng trường thấp hơn so với 3 proton còn lại Vì vậy, peak tại độ dịch chuyển 6,86 ppm dưới dạng doublet với diện tích peak tương đối là 1 được gán cho proton H3’ do tương tác với proton H4’ với hằng số tách J
Hoạt tính kháng tế bào ung thư
Các dẫn chất VIII.1, VIII.2,VIII.3 đã được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư theo phương pháp MTT Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm gồm: ung thư vú SKBR3, ung thư phổi A549 và thử trên một dòng tế bào lành tính HEK293 Chất đối chiếu dương tính là doxorubicin, một chất có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư được trình bày ở bảng 3.7
Nhìn chung kết quả cho thấy, cả 3 hợp chất VIII.1, VIII.2, VIII.3 đã được tổng hợp đều có tác dụng kháng tế bào ung thư tương đối tốt trên dòng tế bào ung thư vú SKBR3 với giỏ trị IC50 = 8,84 – 38,63 àM và tế bào ung thư phổi A549 với giỏ trị
IC 50 = 8,54 – 18,59 àM Tuy nhiờn, hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư của 3 chất đều yếu hơn chất đối chiếu doxorubicin
Trong 3 hợp chất trên, hợp chất VIII.2 có tác dụng kháng tế bào ung thư mạnh nhất trong 3 chất trên cả 2 dòng tế bào ung thư Hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hợp chất VIII.2 với giỏ trị IC50 = 7,72 àM và tỏc dụng khỏng tế bào ung thư trờn dũng tế bào ung thư vỳ SKBR3 với giỏ trị IC50 = 8,84 àM Hợp chất
VIII.2 có hoạt tính kháng tế bào ung thư trên 2 dòng tế bào A549 và SKBR3 gấp lần lượt khoảng 2,4 và 3,2 lần so với hợp chất VIII.1 ở mỗi dòng tế bào và gấp lần lượt khoảng 1,1 và 4,4 lần so với hợp chất VIII.3 ở mỗi dòng tế bào Bên cạnh đó, hợp chất
VIII.3 cũng có hoạt tính kháng trên dòng tế bào ung thư phổi A549 tốt với IC50 = 8,54 àM và đặc biệt chất này cú chỉ số chọn lọc SI ≥ 3 duy nhất nờn được coi là chất khỏng ung thư có tiềm năng Từ đó, ta có thể thấy hợp chất VIII.2 tuy có IC50 nhỏ hơn so với
2 chất còn lại nhưng khả năng gây độc trên tế bào thường lại mạnh hơn so với hợp chất
Qua đó, ta nhận thấy các nhóm thế khác nhau và vị trí gắn nhóm thế vào mạch chính có thể ảnh hưởng khác nhau tới hoạt tính kháng tế bào ung thư
Hình 4.7: Ảnh hưởng của cấu trúc đến tác dụng kháng ung thư
Hợp chất VIII.1 có hoạt tính kháng ung thư yếu nhất trong 3 chất do nhóm –
CH3 đẩy e có thể làm giảm hoạt tính của kháng ung thư so với 2 nhóm hút e (-C6H5 và –C6H4SO2NH2) Xét giữa 2 chất VIII.1 và VIII.3 thì hiệu ứng hút e của –
C6H4SO2NH2 mạnh hơn -C6H5 nhưng khả năng gây chết tế bào ung thư trên 2 dòng A549 và SKBR3 của VIII.2 lại tốt hơn VIII.3 Tuy nhiên, khả năng gây độc chọn lọc của VIII.2 lại kém hơn VIII.3 Từ những điều trên, sự có mặt của các nhóm thế hút e trong các dẫn chất mục tiêu có thể đóng vai trò trong việc ảnh hưởng tới hoạt tính kháng tế bào ung thư Tuy nhiên số lượng chất thử còn ít (3 chất) và mới chỉ thử nghiệm hoạt tính trên 2 dòng tế bào ung thư A549 và SKBR3 do đó chưa có đủ cơ sở chắc chắc để kết luận về chiều hướng thay đổi hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất benzimidazol mang khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ kết quả của nghiên cứu đã trình bày kết luận rằng đề tài đã thực hiện được 2 mục tiêu đề ra
1.1 Tổng hợp và khẳng định cấu trúc Đã tổng hợp được 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H–chromen mới mang khung benzimidazol-5-carboxamid 3 dẫn chất đều là chất mới, chưa được công bố trong tài liệu bao gồm:
+2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-propyl-1H-benzo[d]imidazol- 5-carboxamid
+2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-phenethyl-1H- benzo[d]imidazol-5-carboxamid
+2-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-1-(4-sulfamoylphenethyl)-1H- benzo[d]imidazol-5-carboxamid
Tất cả các chất tổng hợp được đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy, được xác định cấu trúc bằng các phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Kết quả thu được cho thấy các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến
1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư Đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 3 dẫn chất tổng hợp được với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư vú SKBR3, ung thư phổi A549 và thử trên một dòng tế bào lành tính HEK293 Kết quả cho thấy cả 3 hợp chất tổng hợp được có hoạt tính sinh học tốt trên 2 dòng tế bào ung thư thử nghiệm SKBR3 và A549
Trong đó, hợp chất VIII.2 có hoạt tính kháng ung thư tốt trên dòng tế bào ung thư phổi A549 với giỏ trị IC50 = 7,73 àM và trờn dũng tế bào ung thư vỳ SLBR3 với giỏ trị IC50 = 8,84 àM Đặc biệt, hợp chất VIII.3 cú hoạt tớnh khỏng ung thư tốt trờn dũng tế bào ung thư phổ A549 với giỏ trị IC50 = 8,54 àM đồng thời cú chỉ sổ chọn lọc
SI ≥ 3 trên dòng tế bào ung thư phổi A549 nên VIII.3 được đánh giá là chất có tiềm năng chống ung thư.
Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Từ các kết quả ở trên em xin có một số đề xuất như sau:
Nghiên cứu sâu hơn cơ chế tác dụng của hợp chất tiềm năng nhất VIII.3 trên dòng tế bào A549
Tiếp tục thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được trên các dòng ung thư khác nhau: ung thư đại tràng, ung thư dạ dày, ung thư gan…
Tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen chứa khung benzimidazol-5-carboxamid nhằm tìm kiếm các chất có triển vọng trong dãy chất này
1 WHO (2022), Global cancer observatory, pp.1-2
2 Dengfu Yao Z A., Monde Ntwasa, Phil Ubana, et al.(2018), "An Overview of
3 Haider K., Yar M S (2022), "Advances of benzimidazole derivatives as anticancer agents: bench to bedside", Benzimidazole
4 Lee Y T., Tan Y J., Oon C E (2023), "Benzimidazole and its derivatives as cancer therapeutics: The potential role from traditional to precision medicine",
5 Mohsin N u A., Irfan M., Hassan S u., Saleem U (2020), "Current strategies in development of new chromone derivatives with diversified pharmacological activities: A review", Pharmaceutical chemistry journal, 54, pp.241-257
6 Manna S K., Das T., Samanta S (2019), "Polycyclic benzimidazole: Synthesis and photophysical properties", ChemistrySelect, 4(30), pp.8781-8790
7 Walia R., Hedaitullah M., Naaz S F., Iqbal K., et al (2011), "Benzimidazole derivatives–an overview", Int J Res Pharm Chem, 1(3), pp.565-74
8 Wagih N., Abdel-Rahman I M., El-Koussi N A., et al (2025), "Anticancer benzimidazole derivatives as inhibitors of epigenetic targets: a review article",
9 Gaba M., Mohan C (2016), "Development of drugs based on imidazole and benzimidazole bioactive heterocycles: recent advances and future directions",
10 Chunarkar-Patil P., Kaleem M., Mishra R., Ray S., et al (2024), "Anticancer drug discovery based on natural products: From computational approaches to clinical studies", Biomedicines, 12(1), pp.201
11 Marinescu M (2019), Chemistry and applications of benzimidazole and its derivatives, BoD–Books on Demand, pp.1-19
12 Manal M., Chandrasekar M J N., Gomathi Priya J., Nanjan M J (2016),
"Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review",
13 Khangura R K., Bali A., Jaggi A S., Singh N (2017), "Histone acetylation and histone deacetylation in neuropathic pain: An unresolved puzzle?", European journal of pharmacology, 795, pp.36-42
14 Wang H., Yu N., Song H., Chen D., et al (2009), "N-Hydroxy-1,2- disubstituted-1H-benzimidazol-5-yl acrylamides as novel histone deacetylase inhibitors: Design, synthesis, SAR studies, and in vivo antitumor activity",
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19(5), pp.1403-1408
15 Bressi J C., de Jong R., Wu Y., Jennings A J., et al (2010), "Benzimidazole and imidazole inhibitors of histone deacetylases: synthesis and biological activity", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(10), pp.3138-3141
16 Trembley J H., Chen Z., Unger G., Slaton J., et al (2010), "Emergence of protein kinase CK2 as a key target in cancer therapy", Biofactors, 36(3), pp.187-195
17 FDA, FDA approves abemaciclib with endocrine therapy for early breast cancer (2021)
18 Corona S P., Generali D (2018), "Abemaciclib: a CDK4/6 inhibitor for the treatment of HR+/HER2− advanced breast cancer", Drug design, development and therapy, pp.321-330
19 Gelbert L M., Cai S., Lin X., Sanchez-Martinez C., et al (2014), "Preclinical characterization of the CDK4/6 inhibitor LY2835219: in-vivo cell cycle- dependent/independent anti-tumor activities alone/in combination with gemcitabine", Investigational new drugs, 32, pp.825-837
20 Singh S., Paul S., Brás N F., Kundu C N., et al (2023), "Design, synthesis, and anticancer activity of some novel 1H-benzo [d] imidazole-5-carboxamide derivatives as fatty acid synthase inhibitors", Bioorganic Chemistry, 138, pp.106658
21 Wang G., Li C., He L., Lei K., et al (2014), "Design, synthesis and biological evaluation of a series of pyrano chalcone derivatives containing indole moiety as novel anti-tubulin agents", Bioorg Med Chem, 22(7), pp.2060-79
22 Yang Z., Wu W., Wang J., Liu L., et al (2014), "Synthesis and biological evaluation of novel millepachine derivatives as a new class of tubulin polymerization inhibitors", J Med Chem, 57(19), pp.7977-89
23 Birbo B., Madu E E., Madu C O., Jain A., et al (2021), "Role of HSP90 in
Cancer", International journal of molecular sciences, 22(19), pp.10317
24 Chang D.-J., An H., Kim K.-s., Kim H H., et al (2012), "Design, synthesis, and biological evaluation of novel deguelin-based heat shock protein 90 (HSP90) inhibitors targeting proliferation and angiogenesis", Journal of medicinal chemistry, 55(24), pp.10863-10884
25 Kaushik P., Rawat B S., Kumar R (2023), "Various approaches for the synthesis of benzimidazole derivatives and their catalytic application for organic transformation", Applied Chemical Engineering, 6(2), pp.2003
26 L'abbate F P (2018), "Synthesis and investigation of benzimidazole and carbazole ò-haematin inhibiting scaffolds with antimalarial activity", Thesis presented for the Degree of Doctor of phylosophy, South Africa
27 Chung N T., Dung V C., Duc D X (2023), "Recent achievements in the synthesis of benzimidazole derivatives", RSC advances, 13(46), pp.32734-
28 Tupe A P., Devkate G V., Tate S S., Deokate S B., et al (2017), "Substituted benzimidazole a potential drug candidate: an overview", World Journal of Pharmaceutical Research, 6(13), pp.204-217
29 Jiang Y.-q., Jia S.-h., Li X.-y., Sun Y.-m., et al (2018), "An efficient NaHSO 3- promoted protocol for chemoselective synthesis of 2-substituted benzimidazoles in water", Chemical Papers, 72, pp.1265-1276
30 Mun J., Jabbar A A., Devi N S., Liu Y., et al (2012), "Structure–activity relationship of 2, 2-dimethyl-2H-chromene based arylsulfonamide analogs of 3, 4-dimethoxy-N-[(2, 2-dimethyl-2H-chromen-6-yl) methyl]-N- phenylbenzenesulfonamide, a novel small molecule hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) pathway inhibitor and anti-cancer agent", Bioorganic & medicinal chemistry, 20(14), pp.4590-4597
31 An H., Lee S., Lee J M., Jo D H., et al (2018), "Novel hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) inhibitors for angiogenesis-related ocular diseases: discovery of a novel scaffold via ring-truncation strategy", Journal of Medicinal
32 Mosmann T (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of immunological methods, 65(1-2), pp.55-63
33 Scudiero D A., Shoemaker R H., Paull K D., Monks A., et al (1988),
"Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines", Cancer Res,
34 Indrayanto G., Putra G S., Suhud F (2021), "Validation of in-vitro bioassay methods: Application in herbal drug research", Profiles of drug substances, excipients and related methodology, 46, pp.273-307.
