Nguyễn Phương Thảo Nghiên Cứu Bào Chế Hỗn Dịch Chứa Tieu Phân Nano Mangiferin Và Đánh Giá Khả Năng Hòa Tan In Vivo Trên Mắt Thỏ Khóa Luận Tốt Nghiệp Dược Sĩ.pdf

Với kích thước tiểu phân đủ nhỏ đến khoảng nanomet, hỗn dịch còn có thể cải thiện được khả năng hòa tan dược chất [1], do đó thường được lựa chọn đối với các dược chất có độ tan thấp.. H

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỖN DỊCH CHỨA TIỂU PHÂN NANO MANGIFERIN

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HÒA TAN

IN VIVO TRÊN MẮT THỎ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2025

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

Mã sinh viên: 2001571

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỖN DỊCH CHỨA TIỂU PHÂN NANO MANGIFERIN

VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG HÒA TAN

IN VIVO TRÊN MẮT THỎ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Đào Văn Nam

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa lý Khoa Bào chế - Công nghệ dược phẩm

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn chân

thành đến TS Đào Văn Nam, PGS.TS Võ Quốc Ánh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo,

đồng hành và luôn truyền động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Nhờ

sự dìu dắt của các thầy cô, em đã được tích lũy thêm nhiều kiến thức chuyên môn cũng như các kỹ năng nghiên cứu quý báu

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa lý, Khoa Bào chế – Công nghệ Dược phẩm, Khoa Dược lý – Dược lâm sàng, những người đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo và toàn thể các thầy cô, cán bộ, nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, tạo điều kiện và hỗ trợ em trong suốt những năm tháng học tập tại trường

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến bạn Lê Thị Huyền Trang, em Chi, Loan, Tuấn, Ngọc, cùng các anh chị, bạn bè và các em trong nhóm nghiên cứu thuộc Bộ môn Hóa lý,

Bộ môn Bào chế, đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện thực nghiệm

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và người thân – những người luôn ở bên, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc để em vượt qua mọi khó khăn trong suốt hành trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2025

Sinh viên

Nguyễn Phương Thảo

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về mangiferin 3

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hóa lý và dược động học 3

1.1.2 Tác dụng dược lý 4

1.1.3 Một số chế phẩm trên thị trường 5

1.2 Tổng quan về hỗn dịch trong nhãn khoa 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Đặc tính hóa lý hỗn dịch và các yếu tố ảnh hưởng 5

1.2.2.1 Kích thước tiểu phân 5

1.2.2.2 pH và áp suất thẩm thấu của hỗn dịch 7

1.2.2.3 Tính lưu biến 7

1.2.2.4 Dạng thù hình 8

1.2.3 Sự hòa tan - hấp thu dược chất từ hỗn dịch và các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của hỗn dịch nhỏ mắt 9

1.2.3.1 Đặc điểm sinh lý của mắt 9

1.2.3.2 Các yếu tố thuộc công thức bào chế 10

1.3 Phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh trong kĩ thuật bào chế hỗn dịch 11

1.3.1 Thiết bị nghiền bi hành tinh 11

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP trong quá trình nghiền bi kiểu hành tinh 12

1.3.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố quy trình nghiền 12

1.3.2.2 Ảnh hưởng của thông số công thức 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế 16

2.3.1.1 Phương pháp giảm KTTP MGF sử dụng máy nghiền bi hành tinh 16

2.3.1.2 Phương pháp bào chế hỗn dịch MGF định hướng dùng để nhỏ mắt 16

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính của hỗn dịch MGF 2 % trong quá trình bảo quản 17

2.3.2.1 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân 17

2.3.2.2 Phương pháp điều chỉnh và đo áp suất thẩm thấu 18

2.3.2.3 Phương pháp xác định đặc tính lưu biến 18

2.3.2.4 Phương pháp xác định dạng thù hình của dược chất 19

2.3.2.5 Phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) 19

2.3.2.6 Phương pháp xác định tạp phân hủy 20

2.3.3 Phương pháp định lượng MGF trong dịch thử hòa tan/ mẫu bào chế 20

2.3.4 Phương pháp thử hòa tan kiểu khuấy 21

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng hòa tan - giải phóng in vivo trên mắt thỏ 22

2.3.5.1 Phương pháp thực hiện 22

2.3.5.2 Phương pháp định lượng mangiferin trong nước mắt thỏ 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Bào chế hỗn dịch mangiferin 2% 24

3.1.1 Sử dụng phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh để giảm KTTP MGF 24

3.1.2 Bào chế hỗn dịch MGF 2 % 26

3.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ bền của hỗn dịch MGF 2 % 27

3.2.1 Ảnh hưởng thành phần công thức đến kích thước tiểu phân 28

3.2.2 Ảnh hưởng thành phần công thức đến khả năng hòa tan in vitro 30

3.2.3 Ảnh hưởng của thành phần đến đặc tính lưu biến của hỗn dịch 31

3.2.3.1 Ảnh hưởng đến độ nhớt 31

3.2.3.2 Ảnh hưởng đến ứng suất chảy lỏng (yield stress) và tanδ 32

3.3 Theo dõi độ bền của hỗn dịch chứa tiểu phân nano MGF ở một số điều kiện bảo quản

33

3.3.1 Điều kiện bảo quản, tiêu chí đánh giá 33

3.3.2 Hình thức cảm quan, pH, áp suất thẩm thấu 34

3.3.3 Kích thước tiểu phân 35

3.3.4 Đặc điểm cấu trúc mangiferin trong hỗn dịch và tương tác dược chất - tá dược 36

3.3.5 Đặc tính lưu biến HD 2 % sau 2 tháng 38

3.3.6 Hàm lượng dược chất trong hỗn dịch 38

3.3.7 Đánh giá thành phần và tỷ lệ tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản 39

3.3.8 Đánh giá khả năng hòa tan dược chất từ hỗn dịch 40

3.4 Đánh giá sự hòa tan dược chất in vivo trên mắt thỏ 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN Dược điển Việt Nam

ĐKT Điều kiện thường

DSC Quét nhiệt lượng vi sai (Differential Scanning Calorimetry)

FTIR Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier Transform Infrared)

HD Hỗn dịch

HLB Chỉ số cân bằng dầu nước

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPMC Hydroxypropyl methylcellulose

HSV Herpes simplex virus

KHV Kính hiển vi

kl/kl Khối lượng/Khối lượng

KTTP Kích thước tiểu phân

LHCT Lão hóa cấp tốc

MeOH Methanol

MGF Mangiferin

MP Pha động (Mobile Phase)

NaCMC Natri carboxymethyl cellulose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Công thức dịch nghiền MGF 10 % 24 Bảng 3.2 Thông số kỹ thuật của quy trình nghiền bi 24 Bảng 3.3 Phân bố KTTP của nguyên liệu MGF (CT 3) (*) và hỗn dịch nghiền CT 1, CT2 25 Bảng 3.4 Công thức hỗn dịch MGF 2 % 26 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá Hình thức cảm quan, pH, áp suất thẩm thấu của hỗn dịch ngay sau bào chế 27 Bảng 3.6 Đặc tính lưu biến của HD MGF 2 % 32 Bảng 3.7 Kết quả pH, áp suất thẩm thấu của hỗn dịch Ca1 bào chế sau 2 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và LHCT 34 Bảng 3.8 Phân bố KTTP của HD 2 % tại 0,1,2 tháng ở điều kiện dài hạn 35 Bảng 3.9 Kết quả thử nghiệm tính lưu biến Ca1 sau 0, 2 tháng điều kiện dài hạn 38 Bảng 3.10 Hàm lượng dược chất (%) trong HD 2 % theo thời gian ở hai điều kiện bảo quản (TB ± SD) (n=3) 38 Bảng 3.11 Tỷ lệ thành phần tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản 39 Bảng 3.12 Kết quả định lượng nồng độ MGF trong nước mắt của HD Ca1,2,3 H1, Na1 (n=3) 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức hóa học của mangiferin 3 Hình 1.2 Hình mô phỏng cơ chế quay thiết bị nghiền bi hành tinh 11 Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo của thiết bị thử giải phóng kiểu khuấy 21 Hình 3.1 Hình ảnh soi kính hiển vi ở vật kính 40, thang đo 1 μm của mẫu hỗn dịch nghiền CT1 - CT3 25 Hình 3.2 Biểu đồ phân bố KTTP của các mẫu dịch nghiền theo công thức CT 1 - CT 3 25 Hình 3.3 Ảnh chụp 5 mẫu HD 2 % tại thời điểm ban đầu 27 Hình 3.4 Hỗn dịch ngay sau bào chế được quan sát trên KHV (Ca1, Ca2, Ca3) ở vật kính

10, thang đo 100 μm và (H1, Na1) ở vật kính 40, thang đo 10 μm 28 Hình 3.5 Biểu đồ phân bố KTTP HD 2 % tại thời điểm sau khi bào chế (a) và 1 tháng (b) 30 Hình 3.6 Đồ thị thể hiện khả năng hòa tan MGF theo thời gian của HD Ca1, 2, 3 (a) và HD H1, Na1 (b) (n=3) 30 Hình 3.7 Đường biểu diễn sự thay đổi độ nhớt theo tốc độ trượt của các HD MGF 2 % Placebo-carbopol: dung dịch placebo của các HD Ca1, Ca2, Ca3 31 Hình 3.8 Ảnh chụp 5 mẫu HD 2 % tại thời điểm 1, 2 tháng tại 2 điều kiện bảo quản ĐKT: điều kiện dài hạn; LHCT: lão hóa cấp tốc 34 Hình 3.9 Biểu đồ phân bố KTTP HD 2 % tại 0,1,2 tháng ở điều kiện dài hạn 35 Hình 3.10 Phổ DSC của a Nguyên liệu MGF NL2; b dịch nghiền CT1; c, d, e: hỗn dịch Ca1 tại thời điểm t = 0, 1, 2 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn; f Carbopol 974P 36 Hình 3.11 Phổ hồng ngoại của mẫu nguyên liệu MGF NL02 (a), mẫu HD Ca1 ở điều kiện dài hạn ở thời điểm 0 tháng (b) và 2 tháng (c) 37 Hình 3.12 Đồ thị thể hiện khả năng hòa tan MGF theo thời gian của HD Ca1 tại các thời điểm 0; 1; 2 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn (n = 3) 41 Hình 3.13 Đồ thị nồng độ MGF trong nước mắt thỏ theo thời gian sau khi nhỏ 25 µl HD Ca1 (n=3) 42 Hình 3.14 Ảnh chụp mắt thỏ sau khi nhỏ 25 µl HD Ca1 tại 5 phút (a), 60 phút (b), 90 phút (c) 43 Hình 3.15 Ảnh chụp mắt thỏ cho thấy HD 2 % Ca1 trong mắt thỏ sau 5 phút (a), 60 phút (b), 90 phút (c) 43 Hình 3.16 Đồ thị nồng độ MGF trong nước mắt thỏ theo thời gian sau khi nhỏ 25 µl hỗn dịch Ca1, H1, Na1 (n=3) 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các bệnh lý ở mắt, việc sử dụng thuốc dùng tại chỗ được lựa chọn phổ biến

do thuốc có thể tập trung với nồng độ cao tại vị trí bị bệnh, hạn chế tác dụng không mong muốn toàn thân của thuốc, ngoài ra nhiều trường hợp người bệnh có thể tự sử dụng hoặc được đồng ý để điều trị ngoại trú Thuốc nhỏ mắt dung dịch là dạng bào chế chiếm tỉ trọng lớn nhất trong số các chế phẩm dùng tại mắt Tuy nhiên, do đặc điểm giải phẫu và sinh lý đặc biệt của mắt như chớp mắt - tiết nước mắt liên tục và sự dẫn lưu mũi lệ, phần lớn thuốc nhỏ mắt bị trào ra ngoài ngay khi khép mi mắt và thuốc đồng thời bị rửa trôi rất nhanh Điều này dẫn đến sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thấp, bệnh nhân phải dùng nhiều lần trong ngày Để khắc phục điểm này, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các dạng thuốc có khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc tại mắt, qua đó làm tăng sự hấp thu và sinh khả dụng của thuốc Một trong những hướng đi đó là đưa thuốc dưới dạng hỗn dịch Các tiểu phân thuốc trong hỗn dịch có thể lưu lại tại mắt tốt hơn, đóng vai trò như kho dự trữ, liên tục hòa tan bổ sung cho phần thuốc đã mất đi do hấp thu hoặc rửa trôi Với kích thước tiểu phân đủ nhỏ (đến khoảng nanomet), hỗn dịch còn có thể cải thiện được khả năng hòa tan dược chất [1], do đó thường được lựa chọn đối với các dược chất có độ tan thấp

Mangiferin (MGF) là hoạt chất tự nhiên có nguồn gốc từ cây xoài, đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học nổi bật như kháng virus, kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo

vệ mô… MGF thể hiện hoạt tính ức chế mạnh với virus Herpes simplex (HSV), đây là căn

nguyên chính của bệnh herpes gây ra nhiễm trùng tại mắt Thuốc có tác dụng trên nhiều chủng virus, bao gồm thể tiềm ẩn và chủng đã kháng acyclovir Tuy nhiên, MGF có độ tan trong nước và tính thấm qua màng sinh học kém, thuốc khó được hấp thu nếu sử dụng trực tiếp dưới dạng nhỏ mắt thông thường Điều này đặt ra thách thức trong việc ứng dụng MGF vào điều trị lâm sàng các bệnh nhiễm trùng tại mắt do virus

Với mục đích phát triển chế phẩm hỗn dịch nhỏ mắt mangiferin có thể ứng dụng trong

điều trị nhiễm trùng tại mắt do virus herpes, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào

chế hỗn dịch chứa tiểu phân nano mangiferin và đánh giá khả năng hòa tan in vivo

trên mắt thỏ” với các mục tiêu sau:

1 Bào chế và đánh giá được ảnh hưởng của thành phần trong công thức đến đặc tính hỗn dịch mangiferin

2 Đánh giá được đặc tính của hỗn dịch chứa tiểu phân nano mangiferin khi bảo quản

ở một số điều kiện

3 Đánh giá được đặc tính hòa tan in vivo trên mắt thỏ của hỗn dịch bào chế được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về mangiferin

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm hóa lý và dược động học

Hình 1.1 Công thức hóa học của mangiferin

Tên khoa học: 2-C-β-D-glucopyranozido-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon

được chiết xuất từ thực vật tự nhiên mà còn có thể thu được bằng tổng hợp hóa học hoặc

tổng hợp sinh học [2] Mangiferin chủ yếu được phân lập từ lá cây xoài (Mangifera indica

L.), bằng các phương pháp chiết hồi lưu và chiết siêu âm [3]

Tính chất hóa lý

- Cảm quan: bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, gần như không mùi

- Độ tan: hơi tan trong hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), thực tế không tan trong nước, ethanol 96 % và cloroform [4]

- Nhiệt độ nóng chảy của MGF khan: 271 oC [5]

- Mangiferin thể hiện tính acid yếu, chỉ số pKa: 6,52; 7,97; 9,44; 12,10 [6]

Đặc điểm dược động học

Nghiên cứu dược động học mangiferin đường uống ở người chỉ ra rằng dược động học đường uống của MGF phù hợp với phương pháp không dựa trên mô hình ngăn Nồng

độ MGF trong huyết tương người đạt 38,64 ± 6,75 ng/ml sau khoảng 1 giờ sử dụng đường uống với mức liều 0,9 g MGF và thời gian bán thải (t1/2) là 7,85 ± 1,72 giờ [7] MGF có thể qua được hàng rào máu - võng mạc Sau khi dùng đường tiêm tĩnh mạch 0,5 giờ với mức liều 50 mg/kg, nồng độ MGF trong võng mạc mắt chuột đạt 5,69 ± 1,48 µg/ml và giảm dần còn 0,30 ± 0,02 µg/ml trong 0,5 giờ tiếp theo [8] Sau khi dùng đường nhỏ mắt dung dịch MGF (nồng độ 0,1 %) mức liều 0,1 ml, nồng độ đỉnh trong huyết tương thỏ đạt 0,17 ± 0,05 µg/ml sau 0,22 ± 0,10 giờ và thời gian bán thải % (t1/2) là 0,66 ± 0,16 giờ [9]

1.1.2 Tác dụng dược lý

- Tác dụng kháng virus: MGF đã được công bố có tác dụng ức chế virus Herpes

simplex týp 1 và týp 2 (HSV-1, 2) Khả năng ức chế HSV-1 của MGF gần như tương đương

với các thuốc hóa dược là acyclovir, idoxuridin, và cyclocytidin thông qua cơ chế ức chế

sự nhân lên của virus trong tế bào vật chủ [10] Theo Rechenchoski và cộng sự, MGF có khả năng làm thay đổi cấu trúc hóa học protein vỏ của HSV-1, từ đó ngăn không cho virus bám vào thụ thể receptor trên màng tế bào vật chủ ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nhân lên, giúp hạn chế các tổn thương mà virus có thể gây ra Do vậy, MGF có tác dụng với cả chủng HSV 1 đã kháng acyclovir, điều này khác với cơ chế tác dụng của acyclovir là ngăn cản HSV tổng hợp DNA trong quá trình sao chép [11] Hiện nay, MGF được dùng với chỉ định chính là trị các bệnh Herpes cấp tính và tái phát (sinh dục & ngoài sinh dục), thủy đậu, eczema Caposi & các bệnh ở miệng do virus gây ra [12]

- Tác dụng chống oxy hóa: Nhờ cấu trúc polyphenol, MGF có khả năng chống lại gốc tự do, ức chế quá trình oxy hóa lipid, và đồng thời tăng cường hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa nội sinh như superoxide dismutase, catalase và glutathione [13] MGF bảo

vệ các ty thể khỏi quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi Fe(II) citrat cũng như ức chế phá hủy 2 deoxyribose gây ra bởi phức hợp Fe(III)-EDTA-ascobat do gốc catechol của mangiferin tạo phức hợp ổn định với sắt [14]

- Tác dụng chống viêm: Thông qua sự bất hoạt các yếu tố Nrf2 và NF-κB, kiểm soát các con đường truyền tín hiệu tế bào, kiểm soát giải phóng cytokin, cản trở thụ thể nhận biết mô hình và hoạt hoá tự thực bào, MGF được sử dụng để điều trị nhiều viêm trong các bệnh về thận, viêm gan, ung thư, viêm khớp, tim mạch và viêm mũi dị ứng [15]

- Một số tác dụng dược lý khác của MGF đã được công bố, gồm có: kháng khuẩn, điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch, bảo vệ tế bào thần kinh, chống ung thư, điều trị đái

tháo đường [16], [17], [15]

1.2 Tổng quan về hỗn dịch trong nhãn khoa

1.2.1 Khái niệm

Thuốc nhỏ mắt là những chế phẩm lỏng, có thể là dung dịch, nhũ tương, hay hỗn dịch vô khuẩn, chứa một hoặc nhiều dược chất, được nhỏ vào túi cùng kết mạc với mục đích chẩn đoán, phòng hay điều trị bệnh ở mắt

Hỗn dịch nhỏ mắt là dạng thuốc vô khuẩn được dùng để nhỏ vào mắt, chứa các tiểu phân dược chất có kích thước nhỏ dưới 50 μm không tan hoặc khó tan được phân tán đều trong môi trường phân tán thích hợp (thường là nước để pha tiêm) [20]

1.2.2 Đặc tính hóa lý hỗn dịch và các yếu tố ảnh hưởng

1.2.2.1 Kích thước tiểu phân

Dược chất trong hỗn dịch thuốc nhỏ mắt dược phân tán trong môi trường phân tán dưới dạng các tiểu phân có kích thước nhỏ, dưới 50 µm [20] Kích thước tiểu phân trong hỗn dịch có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh khả dụng của mắt: các tiểu phân rắn trong hỗn dịch khó bị rửa trôi hơn so với dung dịch, từ đó làm tăng thời gian lưu của dược chất trước giác mạc, nhưng tiểu phân lớn trên 10 µm có thể gây kích ứng mắt mạnh, gây tổn thương giác mạc [21] Giảm kích thước tiểu phân đến mức nanomet có thể cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt, tăng khả năng tuân thủ và tránh tình trạng kích ứng mắt [22]

Việc giảm kích thước hạt thực sự có tác động đến động học hòa tan của dược chất

và theo Phương trình Ostwald-Freundlich (Phương trình (1) ), độ hòa tan tăng đáng kể khi giảm kích thước hạt xuống dưới 1 μm Điều này là do việc giảm kích thước xuống dưới

1 μm làm tăng áp suất dung môi, dẫn đến tăng độ hòa tan và cũng gây ra sự gián đoạn

tương tác giữa phân tử chất tan, giúp quá trình hòa tan dễ dàng hơn [23]

𝑙𝑜𝑔 𝐶𝑠

𝐶∞ = 2𝜎𝑣

2,303𝑅𝑇𝜌𝑟 (1)

Trong đó, C s là độ tan của tiểu phân kích thước nhỏ (dưới 1 μm), C ∞ là độ tan của

tiểu phân kích thước micron trở lên, σ là sức căng bề mặt, V là thể tích mol của tiểu phân, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, ρ là tỷ trọng tiểu phân và r là bán kính tiểu

phân

Tất cả các khả năng dẫn đến tăng KTTP do quá trình lão hóa Ostwald hoặc kết tụ đều ảnh hưởng sinh khả dụng và gây kích ứng mắt Vì vậy, cần được đánh giá thông qua thử nghiệm độ ổn định [21] Quá trình lão hóa Oswald phụ thuộc dải phân bố KTTP và độ hòa tan của các hạt theo kích thước của chúng Khi hỗn dịch có khoảng phân bố kích thước rộng, tiểu phân nhỏ có năng lượng bề mặt cao hòa tan nhanh hơn và tái kết tinh lên bề mặt các tiểu phân lớn hơn Quá trình này dẫn đến sự tăng kích thước tiểu phân trung bình và mất ổn định hệ phân tán theo thời gian [24]

Hỗn dịch là hệ phân tán dị thể, thường xảy ra các hiện tượng kết tụ, sa lắng và đóng bánh của các tiểu phân dược chất rắn, dẫn đến không có khả năng tái phân tán đồng nhất trở lại Khả năng sa lắng của hỗn dịch có thể được dự đoán bằng tỷ số giữa trọng lực và khả năng chuyển động Brown của các tiểu phân có trong hỗn dịch:

ổn định lâu hơn là làm chậm tốc độ sa lắng của tiểu phân bằng cách tăng độ nhớt của môi trường phân tán [25] Thế zeta đặc trưng cho điện tích trên bề bề mặt tiểu phân phân tán

Để tăng ổn định vật lý cho hỗn dịch, có thể sử dụng các chất điện ly (hệ đệm), CDH hoặc

polyme anionic / cationic hấp phụ lên bề mặt tiểu phân pha phân tán nhằm tạo điện thế Zeta Thông thường, khi thế Zeta nằm ngoài khoảng ± 30 mV, lực đẩy tĩnh điện đủ mạnh để chống lại lực hút Van der Waals, giúp hệ phân tán ổn định quá trình bảo quản [26]

1.2.2.2 pH và áp suất thẩm thấu của hỗn dịch

Sự biến đổi hóa học của dược chất trong dung dịch thuốc thường gặp so các phản ứng hóa học như thủy phân, oxy hóa khử, quang hóa, trùng hợp hóa hay racemic hóa Các phản ứng này gây hiện tượng kết tủa hay thay đổi màu sắc trong quá trình bào chế và bảo quản, làm giảm hàm lượng dược chất, tăng tỷ lệ tạp chất, có thể thay đổi tác dụng dược lý của sản phẩm pH của chế phẩm được kể đến như một yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình ức chế tốc độ phân hủy dược chất Vì vậy, việc điều chỉnh pH của chế phẩm đến một khoảng giá trị thích hợp mà tại khoảng pH đó, tốc độ phân hủy dược chất là thấp nhất là cần thiết pH thuốc nhỏ mắt thường được duy trì ở khoảng 7,4 nhằm đảm bảo sự tương hợp với vị trí hấp thu thuốc Mắt có thể dung nạp các sản phẩm trong phạm vi giá trị pH từ khoảng 3,0 đến khoảng 8,6, tùy thuộc vào khả năng đệm của công thức pH thuốc nhỏ mắt thường được duy trì bằng các hệ đệm như hệ đệm boric – borat, citric – citrat, photphat [20]

Các sản phẩm nhãn khoa có thể được dung nạp trong phạm vi độ thẩm thấu rộng (0,5% - 5% natri clorid, tương đương với khoảng 171 - 1711 mOsm/kg) [27] Các dung dịch nhược trương được dung nạp tốt hơn các dung dịch ưu trương Tuy nhiên, thường điều chỉnh độ thẩm thấu của dung dịch nhỏ mắt ở phạm vi sinh lý 290 - 310 mOsmol/kg để mang lại hiệu quả tối ưu và sự thoải mái cho người dùng [28]

1.2.2.3 Tính lưu biến

Độ nhớt của nước không thay đổi theo tốc độ cắt, tuy nhiên nó thay đổi tùy thuộc vào thành phần chứa trong đó Các yếu tố này bao gồm các đặc tính liên quan đến các tiểu phân rắn trong pha phân tán (kích thước, hình dạng, độ xốp, kết tụ), các đặc tính của chất điều chỉnh độ nhớt (một hoặc hỗn hợp nhiều polyme, polyme chuỗi ngắn hoặc dài, chuỗi liên kết chéo) và nồng độ pha phân tán trong hỗn dịch Tiểu phân xốp sẽ có không gian bên trong để chứa chất lỏng, qua đó độ nhớt hỗn dịch sẽ thay đổi Các tiểu phân nhỏ hơn có diện tích bề mặt lớn hơn, tương tác giữa các hạt với nhau và với pha liên tục tăng; do đó tác động lên độ nhớt của hỗn dịch sẽ lớn hơn Người ta thường sử dụng polyme có phân tử lượng lớn như methyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose và polyacrylic; gọi là chất điều chỉnh lưu biến hoặc chất làm tăng độ nhớt Ví dụ methyl cellulose giúp ổn định hỗn dịch bằng cách tăng độ nhớt và giảm lực hút giữa các hạt, ngăn ngừa sự kết tụ và đóng bánh

theo thời gian Bất kỳ yếu tố nào ở nồng độ ít hay nhiều đều có thể khiến hệ có đặc tính của chất lỏng phi Newton, hệ sẽ mất khả năng duy trì độ nhớt khi phạm vi tốc độ cắt rộng

Lưu biến quan trọng trong sản xuất các sản phẩm dùng ngoài da, đặc biệt là sản phẩm dùng tại mắt Chế phẩm mong muốn phải có độ nhớt thấp ở tốc độ bơm cao (tốc độ cắt) nhưng có thể nhanh chóng phục hồi và trở lại độ nhớt cao hơn khi để yên Điều này làm cho thuốc nhỏ mắt dễ dàng phân liều khi nhỏ và đảm bảo độ phủ đồng đều trên bề mặt nhãn cầu khi chớp mắt, sau đó hệ trở lại độ nhớt đủ để duy trì trên giác mạc, không chảy lỏng tránh rửa trôi bởi nước mắt, đồng thời ổn định pha phân tán trong chế phẩm còn lại Thông số được quan tâm trong trường hợp này là ứng suất chảy lỏng (yield stress) và các

mô đun dao động như G′ và G″ Ứng suất chảy lỏng (yield stress) là giá trị ứng suất tối thiểu cần thiết để hệ bắt đầu chảy lỏng, nó phản ánh khả năng duy trì cấu trúc của sản phẩm

khi không bị tác động G′ (mô đun đàn hồi) cho biết mức độ tích trữ năng lượng biến dạng

(cấu trúc giống chất rắn), trong khi G″ (mô đun nhớt) phản ánh năng lượng tiêu tán (cấu trúc giống chất lỏng) Tỷ số tan δ = G″/G′ được sử dụng để xác định bản chất ưu thế của hệ: tan δ < 1 cho thấy hệ có tính đàn hồi (rắn), tan δ > 1 cho thấy tính nhớt chiếm ưu thế (lỏng) [29], [30]

1.2.2.4 Dạng thù hình

Dạng thù hình dược chất ảnh hưởng đến trực tiếp đến kích thước tiểu phân và độ ổn định của hỗn dịch Các dạng thù hình ổn định hơn ít trải qua những biến đổi về mặt vật lý theo thời gian, trong khi đó dạng thù hình có mức năng lượng cao có thể chuyển thành dạng

có mức năng lượng thấp hơn, ổn định hơn, làm thay đổi hiệu quả của thuốc [31] Hany cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano hydrocortisone ở 25

°C trong khoảng thời gian 2 tháng Kết quả cho thấy cho thấy hỗn dịch nano hydrocortisone được làm giảm KTTP bằng phương pháp nghiền ướt (top-down) không có thay đổi đáng kể

về KTTP so với ban đầu (tương ứng là 300 nm và 298 nm) Trong khi đó, KTTP của hỗn dịch nano hydrocortisone bào chế bằng phương pháp kết tủa và bốc hơi dung môi (bottom-up) tăng lên 440 nm, so với kích thước ban đầu là 295 nm Sự khác biệt này liên quan đến dạng thù hình của tiểu phân dược chất [32] Trong khi phương pháp nghiền ướt thường ít làm thay đổi dạng thù hình, phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi có thể tạo ra dạng

vô định hình hoặc tinh thể kém bền Điều này dẫn đến sự khác biệt về độ ổn định hỗn dịch

1.2.3 Sự hòa tan - hấp thu dược chất từ hỗn dịch và các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả

dụng của hỗn dịch nhỏ mắt

Khi hỗn dịch nhỏ mắt được nhỏ lên bề mặt nhãn cầu, dược chất tồn tại ở hai pha: dạng rắn phân tán (tiểu phân) và dạng đã hòa tan trong nước mắt Chỉ có dược chất đã hòa tan mới có thể khuếch tán và hấp thu qua biểu mô giác mạc hoặc kết mạc để đi vào các mô trong mắt như thủy dịch Trong khi đó, các tiểu phân rắn đóng vai trò như kho dự trữ, duy trì trạng thái bão hòa cục bộ xung quanh hạt, giúp cung cấp liên tục dược chất cho pha hòa tan, kéo dài quá trình hấp thu

Sau khi nhỏ, một phần hỗn dịch nhỏ mắt đều bị loại bỏ khỏi bề mặt nhãn cầu thông qua hệ dẫn lưu dịch vào ống mũi lệ Quá trình này khiến thuốc không qua mắt mà đi vào tuần hoàn toàn thân Do đó, dược chất có thể được hấp thu ngoài ý muốn và làm tăng nguy

cơ xảy ra tác dụng phụ toàn thân, vì các chế phẩm này thường chứa hàm lượng dược chất cao Thuốc cũng có thể khuếch tán từ tuần hoàn toàn thân vào mô mắt; tuy nhiên, con đường hấp thu này chỉ đóng vai trò thứ yếu so với sự khuếch tán trực tiếp từ màng phim nước mắt [33]

1.2.3.1 Đặc điểm sinh lý của mắt

Nhiều hạn chế về mặt giải phẫu và sinh lý như quá trình tiết nước mắt, dẫn lưu dịch vào ống mũi lệ, phản xạ chớp mắt và các rào cản tĩnh, rào cản động khác của mắt gây ra thách thức và cản trở sự thấm thuốc vào mắt sâu hơn [34]

Việc chớp mắt tự phát theo chu kỳ hay phản xạ là không tránh được, nó cùng với quá trình tiết nước mắt liên tục, đẩy phần lớn thuốc ra ngoài hay xuống ống mũi lệ làm giảm lượng thuốc trước giác mạc Thêm vào đó, liên kết tạo phức dược chất – protein (có trong dịch nước mắt) làm giảm dạng tự do dược chất, dẫn tới giảm sự hấp thu vào niêm mạc mắt [20]

Rào cản tĩnh được kể đến là các lớp mô khác nhau của giác mạc [34] Cấu tạo giác mạc gồm một lớp thân nước giữa hai lớp thân lipid, gây trở ngại cho dược chất không có khả năng hòa tan hai pha dầu, nước hấp thu Lưu lượng máu màng mạch - kết mạc, sự đào thải của thủy dịch được nhắc đến như một rào cản động Các mao mạch máu và tính thấm tốt của kết mạc làm cho quá trình hấp thụ thuốc không hiệu quả và chịu trách nhiệm cho việc thuốc bị mất vào tuần hoàn toàn thân, dẫn đến giảm sinh khả dụng ở mắt [35] Tốc độ thay thế thủy dịch tương đối lớn (2 - 3 µl/phút) làm nồng độ dược chất trong thủy dịch giảm rất nhanh, hiệu quả điều trị hạn chế [20]

1.2.3.2 Các yếu tố thuộc công thức bào chế

Thực hiện đánh giá ảnh hưởng của KTTP trong quá trình hấp thu dược chất qua mắt, Toropainen và cộng sự đã chỉ ra rằng, mặc dù hỗn dịch có các tiểu phân indomethacin nhỏ

bị loại bỏ nhanh hơn khỏi dịch nước mắt so với các tiểu phân lớn hơn, nhưng hỗn dịch có KTTP nhỏ (0,4 – 1,3 µm) cho thấy khả năng phân phối thuốc vào dịch thủy dịch cao hơn khoảng hai lần so với hỗn dịch có KTTP lớn (3,1 – 3,5 µm) Điều này được giải thích do KTTP càng nhỏ dẫn đến tăng diện tích bề mặt, giúp tốc độ hòa tan dược chất càng nhanh Indomethacin hòa tan nhanh hơn từ tiểu phân KT nhỏ dẫn đến hấp thu thuốc vào mắt cao hơn Thử nghiệm cũng cho thấy, độ nhớt của hỗn dịch nhỏ mắt có tác động rõ ràng đến sự hấp thu indomethacin ở mắt Khi tăng độ nhớt từ 1,3 đến 15 mPa dẫn đến AUC trong dịch thủy dịch tăng 3,4 - 4,3 lần đối với các hỗn dịch có cùng KTTP [36]

Trong một nghiên cứu in vivo trên mắt thỏ, tác giả Sunil đã sử dụng loại HPMC có

độ nhớt cao hơn (từ K100 lên K15M) có thể tăng khả năng phân phối thuốc từ hỗn dịch budesonide có kích thước micromet vào thủy dịch mắt thỏ Kết quả cho thấy nồng độ budesonide trong thủy dịch mắt thỏ theo thời gian có khác biệt đáng kể giữa các công thức hỗn dịch khác nhau Cụ thể, nồng độ budesonide trong thủy dịch luôn có xu hướng cao nhất đối với công thức có độ nhớt cao Hỗn dịch micro (2 μm) có độ nhớt cao nhất thể hiện nồng

độ budesonide trong thủy dịch mắt cao hơn đáng kể so với hỗn dịch độ nhớt thấp có cùng KTTP ở thời điểm 0,117 và 1 giờ, và cao hơn so với hỗn dịch độ nhớt thấp chứa tiểu phân nano (700 nm) ở thời điểm 24 giờ Giá trị nồng độ đỉnh (Cmax) và diện tích dưới đường cong (AUC0-6h) cũng lớn nhất đối với hỗn dịch micro độ nhớt cao [37]

Ngoài ra áp suất thẩm thấu và pH khác biệt quá lớn so với chỉ số sinh lý bình thường của dịch nước mắt, có thể gây kích ứng mắt, tăng chớp mắt và tăng tiết nước mắt Dẫn đến pha loãng thuốc ở mắt, rửa trôi khỏi mắt nhanh chóng, làm giảm sinh khả dụng của thuốc

Vì vậy, cần điều chỉnh pH, áp suất thẩm thấu của thuốc nhỏ mắt về gần giá trị sinh lý nước mắt và dùng hệ đệm có dung lượng đệm thấp để nước mắt có thể trung hòa được pH của thuốc sau khi nhỏ

Một yếu tố có thể kể đến để nâng cao sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt là làm tăng tính thấm của biểu mô giác mạc với dược chất Thêm chất hoạt động bề mặt vào công thức giúp các phân tử dược chất dễ khuếch tán qua biểu mô giác mạc, giảm sức căng bề mặt giúp thuốc tiếp xúc tốt hơn với giác mạc, dược chất hấp thu tốt hơn Hay thêm vào các chất có tác dụng khóa ion Ca2+ trên màng tế bào biểu mô giác mạc, làm khoảng kẽ giữa các tế bào biểu mô rộng hơn, khuếch tán dược chất dễ dàng hơn [20]

1.3 Phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh trong kĩ thuật bào chế hỗn dịch

Phương pháp nghiền bi được áp dụng rộng rãi cho hầu hết các dược chất tan kém trong nước Các tiểu phân dược chất được làm nhỏ nhờ năng lượng va chạm và ma sát sinh

ra trong quá trình nghiền [38] Những đánh giá gần đây cho thấy rằng, nghiền ướtlà phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất để tạo ra hỗn dịch nano trong cả nghiên cứu và công nghiệp Nghiền ướt thường được ưa chuộng hơn các phương pháp từ kỹ thuật phân chia (top – down) khác trong ngành dược phẩm do có một số ưu điểm riêng biệt, bao gồm vận hành đơn giản hơn, dễ công nghiệp hóa và dải phân bố KTTP hẹp [39]

1.3.1 Thiết bị nghiền bi hành tinh

Hình 1.2 Hình mô phỏng cơ chế quay thiết bị nghiền bi hành tinh

Thiết bị nghiền bi hành tinh có cấu tạo gồm một đĩa xoay chính chứa 4 bể, mỗi bể đựng 1 cối nghiền rỗng, bi nghiền được sử dụng là zirconia với kích thước khác nhau

Nguyên tắc hoạt động: Trong quá trình nghiền, nguyên liệu phải chịu va chạm mài mòn với năng lượng cao, bị biến dạng nứt rạn và đứt gãy làm vỡ thành KTTP nhỏ hơn Do

sự chuyển động quay theo hai hướng ngược nhau của bàn xoay và cối nghiền nên xuất hiện nhiều lực ly tâm khác nhau tác dụng lên viên bi Các viên bi va chạm nhau dưới tác dụng các lực ly tâm khác loại và va chạm với thành cối nhờ lực ly tâm cùng loại Tại một thời điểm nhất định, bi có vận tốc cao sẽ đột ngột chuyển hướng gây va chạm mạnh Động năng được chuyển hóa thành cơ năng để phá vỡ tiểu phân hoặc một phần nhiệt năng Nguyên liệu bị biến dạng do bị tác dụng lực ép giữa các viên bi nghiền cũng như giữa bi và thành cối

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP trong quá trình nghiền bi kiểu hành tinh

Việc tạo ra hỗn dịch nano có kích thước tiểu phân mong muốn và độ ổn định khi bảo quản đòi hỏi phải lựa chọn công thức chất ổn định phù hợp và các thông số thiết bị quy trình hiệu quả cho quá trình nghiền thuốc trong môi trường ướt [40] Trong quá trình nghiền, hai quá trình đối nghịch nhau diễn ra: nghiền nhỏ tiểu phân và kết tụ [41] Đối với các tiểu phân sản phẩm nhỏ hơn kích thước trung bình là 1μm, sự phá vỡ, sự kết tụ và sự tách kết

tụ cùng tồn tại trong máy nghiền Sự cân bằng này chủ yếu chịu ảnh hưởng của các tương tác giữa các tiểu phân Các tiểu phân càng giảm kích thước thì các tương tác hấp dẫn càng trở nên chiếm ưu thế Các lực hấp dẫn này dẫn đến sự kết tụ khi tiểu phân va chạm, do đó tác động ngược lại quá trình nghiền [42]

1.3.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố quy trình nghiền

- Bi nghiền:

Bi có độ cứng càng cao thì năng lượng va chạm càng lớn, KTTP thu được càng nhỏ [40] Kích thước bi càng nhỏ tổng diện tích tiếp xúc bề mặt của bi càng lớn nên số lần va chạm càng nhiều, tiểu phân tạo ra càng nhỏ Do kích thước bi tỷ lệ với khối lượng bi nên nếu bi quá nhỏ, năng lượng va chạm tạo ra sẽ không đủ để nghiền nguyên liệu [43] Ở tốc

độ nghiền cao, kích thước bi nhỏ hơn cho KTTP sau nghiền nhỏ hơn, ở tốc độ nghiền thấp thì kích thước bi lớn hơn cho KTTP sau nghiền nhỏ hơn Cần xác định khối lượng bi nghiền vừa đủ trong cối, tránh giảm hiệu suất nghiền do tần xuất va chạm ít hay hạn chế chuyển động của bi làm giảm năng lượng va chạm [44]

- Tốc độ nghiền:

Khi tăng tốc độ hay tần số nghiền làm tăng số lần, cường độ va chạm và năng lượng giữa bi với dược chất dẫn đến KTTP của nguyên liệu giảm [45] Tuy nhiên, khi tốc độ nghiền tăng lên quá cao, dưới tác dụng lực ly tâm bi chuyển động bám sát vào thành cối nghiền, tương tác giữa bi và dược chất giảm do đó hiệu suất nghiền giảm

- Thời gian nghiền:

Thời gian nghiền tăng thường cho tiểu phân có kích thước nhỏ hơn và đạt đến giới hạn kích thước nào đó [40] Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nghiền, KTTP không giảm thêm

mà có thể tăng trở lại do cơ chế kết tập chiếm ưu thế hơn cơ chế nghiền vỡ Điều này có thể được giải thích là do tiểu phân tạo thành quá mịn, linh động nên khó bị phá vỡ khi va chạm với bi [46], hoặc do các tiểu phân nhỏ dễ bị kết tập hơn bởi hiện tượng quá nhiệt, bay hơi nước trong quá trình nghiền [43]

1.3.2.2 Ảnh hưởng của thông số công thức

Nồng độ dược chất càng lớn tạo ra tiểu phân có kích thước càng nhỏ, do nồng độ dược chất lớn làm tăng số lần va chạm tiểu phân - tiểu phân, tiểu phân - bi nghiền, thành cối [45]

Chất ổn định được thêm vào để làm giảm năng lượng bề mặt các tiểu phân dược chất

kỵ nước, tránh kết tập tiểu phân, tăng độ ổn định của chế phẩm Tá dược polyme và chất diện hoạt (CDH) trong và sau quá trình nghiền đóng vai trò như một chất mang và/hoặc chất ổn định giúp đảm bảo độ ổn định vật lý của hỗn dịch tạo thành Sự có mặt của polyme

và CDH giúp các tiểu phân phân tán đều trong dịch nghiền, tạo điều kiện cho sự phá vỡ làm nhỏ KTTP [44] Việc lựa chọn nồng độ chất ổn định có thể tính dựa vào tỷ lệ của polyme và CDH so với dược chất Thông thường, tỷ lệ polyme/dược chất là 0,1:1 đến 0,5:1;

tỷ lệ CDH/dược chất là 0,02:1 đến 0,06:1 [47] Nồng độ quá thấp không đủ để khoang chặn kết tụ tiểu phân dược chất, nhưng nồng độ quá cao cũng có thể làm giảm hiệu quả nghiền [18] Cụ thể, polyme nồng độ quá cao, làm tăng độ nhớt trong hỗn dịch nghiền, làm cản trở chuyển động của bi dẫn tới giảm hiệu quả làm nhỏ dược chất Đối với CDH, việc sử dụng CDH ở tỷ lệ cao, đặc biệt trên nồng độ micell tới hạn của CDH có thể gây kém ổn định hỗn dịch thu được, do thúc đẩy quá trình kết tụ Ostwald [48]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

STT Nguyên liệu Tiêu chuẩn Xuất xứ

1 Mangiferin (95,3 %) NSX Trung Quốc

2 Carbopol 974P (CBP 974P) USP/NF Ấn Độ

3 Dinatri ethylendiamin tetraacetic acid dihydrat Phân tích Trung Quốc

4 Hydroxypropyl methylcellulose E6 (HPMC E6) USP 43 Trung Quốc

6 Natri dihydrophosphat dihydrat Phân tích Trung Quốc

7 Natri carboxymethyl cellulose (NaCMC) Phân tích Trung Quốc

8 Natri clorid Phân tích Trung Quốc

9 Natri thiosulfate pentahydrate Phân tích Trung Quốc

10 Nước tinh khiết DĐVN V Việt Nam

11 Polysorbat 80 (Tween 80) USP 42 Singapore

12 Sorbitan monooleat (Span 80) USP 42 Singapore

15 Acid acetic Phân tích Trung Quốc

16 Acid hydrocloric Phân tích Trung Quốc

17 Dinatri hydrophosphat dodecahydrat Phân tích Trung Quốc

18 Kali hydrophosphat Phân tích Trung Quốc

19 Natri hydroxyd Phân tích Trung Quốc

2.1.2 Thiết bị

ST

T Tên thiết bị Model Xuất xứ

1 Cân phân tích ES-2255M-DR Thụy Sỹ

2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 Đức

3 Kính hiển vi kết nối camera Eclipse Ci-L Nikon, Nhật

4 Máy đo áp suất thẩm thấu OSMOMAT 3000 basic Đức

5 Máy đo pH Metrohm 827 pH lab Thụy Sỹ

6 Máy khuấy từ IKA RH basic 1 Malaysia

7 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hanil Supra 2 Hàn Quốc

8 Máy phân tích nhiệt DSC 1 StarSystem Thụy Sỹ

9 Máy phân tích nhiễu xạ tia X D8 Advance Mỹ

10 Máy phân tích quang phổ hồng ngoại biến

đổi Fourier IRAffinity-1S FT-IR Nhật Bản

11 Máy đo lưu biến Discovery Hybrid

TA Instrument –

Mỹ

12 Micropipet 100 - 1000 µl Discovery CoMGFort Ba Lan

Đức

14 Thiết bị đo KTTP bằng tán xạ laser

Mastersizer 3000E Malvern, Anh

15 Thiết bị thử hòa tan kiểu khuấy Nội bộ Việt Nam

16 Thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh Tencan 10L Planetary

Ball Mill Trung Quốc

Các dụng cụ chuyên dụng cho bào chế: cân kĩ thuật, cân phân tích, cốc có mỏ, bình định mức, đũa thủy tinh, pipet thủy tinh, micropipet, màng lọc cellulose acetat (0,45 µm và 0,22 µm), tủ sấy, bể siêu âm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế hỗn dịch MGF 2 % bằng kỹ thuật nghiền bi kiểu hành tinh

- Đánh giá ảnh hưởng của KTTP và thành phần tá dược đến đặc tính và độ bền hỗn

dịch MGF

- Theo dõi đặc tính của hỗn dịch chứa tiểu phân nano MGF ở 2 điều kiện bảo quản

(điều kiện dài hạn, lão hóa cấp tốc)

- Đánh giá sự hòa tan dược chất in vivo trên mắt thỏ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp giảm KTTP MGF sử dụng máy nghiền bi hành tinh

- Thiết bị nghiền bi kiểu hành tinh Planetary Ball Mill (Trung Quốc), sử dụng bốn cối nghiền bằng vật liệu zirconia có dung tích 50 ml (kích thước: 45 mm, 65 mm); có bộ phận làm mát bên ngoài

+ Vận hành máy để thực hiện quá trình nghiền; nhiệt độ 20 oC, chu kì nghiền (15 phút nghiền - 5 phút nghỉ)

+ Thu hỗn dịch MGF 10 % bằng cách lọc qua rây (kích thước mắt rây 80 μm), pha loãng với dịch polyme 5 % bảo quản hỗn dịch theo tỉ lệ 3:1 HD 7,5 % được bảo quản trong

lọ thủy tinh, đậy kín bằng nút cao su và bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

2.3.1.2 Phương pháp bào chế hỗn dịch MGF định hướng dùng để nhỏ mắt

Dựa vào kết quả của tác giả Thái Vũ Thảo Nguyên [49] và điều chỉnh phù hợp với thí nghiệm, các bước tiến hành bào chế được thực hiện như sau:

Bước 1 Nghiền làm giảm KTTP MGF: tiến hành theo phương pháp mục 2.3.1.1 Thu được hỗn dịch 7,5 %, bảo quản trong lọ thủy tinh trung tính, đậy kín ở nhiệt độ phòng

Bước 2 Bào chế hỗn dịch MGF 2 %:

- Phân tán polyme vào nước, ngâm trương nở qua đêm, điều chỉnh pH thích hợp bằng NaOH 0,2 M hoặc HCl 0,1 M đến pH 6,2 Phối hợp NaH2PO4, Na2EDTA, Na2S2O3, NaCl và mannitol theo công thức được dung dịch tá dược Sục khí N2 trong 10 phút

- Phối hợp hỗn dịch MGF 7,5 % sau nghiền và dung dịch tá dược theo tỉ lệ phù hợp (bảng 3.4, NaH2PO4 (0,06 %) Na2EDTA (0,001 %), Na2S2O3 (0,05 %), mannitol tùy chỉnh, NaOH/HCl điều chỉnh, pH 5,8 - 6,2, H2O vừa đủ), bổ sung nước vừa đủ khối lượng, khuấy đều thu được hỗn dịch MGF 2 % Sục khí N2 trong 5 phút Đóng nút cao su, bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng

2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính của hỗn dịch MGF 2 % trong quá trình bảo quản

- Tiến hành bảo quản: phân chia HD 2 % vào các lọ thủy tinh 3 ml, đậy nút cao su, tất cả các mẫu được tránh ánh sáng

+ Điều kiện nhiệt độ phòng (bảo quản dài hạn)

+ Điều kiện LHCT: mẫu được đặt trong bình kín chứa dịch NaCl bão hòa (Độ ẩm tương đối 75 % ± 5 %), bảo quản trong tủ ấm 40 oC ± 2 oC

- Tiêu chí đánh giá HD 2 % tại từng thời điểm 0, 1, 2 tháng Với điều kiện lão hóa cấp tốc, chỉ tiến hành xác định hàm lượng và tạp phân hủy

+ Xác định KTTP của HD 2 %

+ Xác định pH, áp suất thẩm thấu

+ Xác định một số thông số lưu biến

+ Đánh giá tạp phân hủy

+ Xác định hàm lượng dược chất

Mangiferin có đặc tính kháng khuẩn tự nhiên, ức chế sự phát triển của nhiều loại vi

sinh vật như Staphylococcus sp., Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans,

Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae và Salmonella typhi [50] Kết quả thí nghiệm tiền khả thi cũng cho thấy việc tiệt khuẩn nguyên

liệu (121oC/ 30 phút) không làm ảnh hưởng đến đặc tính kích thước tiểu phân và dạng thù hình của nguyên liệu MGF Để đảm bảo độ vô khuẩn, buồn nghiền bi chứa dược chất sẽ được tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm trước khi nghiền; toàn bộ quá trình nghiền, thu hỗn dịch và pha chế hỗn dịch sẽ được thực hiện ở điều kiện vô khuẩn

2.3.2.1 Phương pháp xác định kích thước tiểu phân

Phương pháp tán xạ laser: Cài đặt các thông số của tiểu phân MGF gồm: chỉ số

khúc xạ 1,64; hệ số hấp thụ 1; tỉ trọng 1,843 g/cm3 Sau đó tiến hành đo mẫu theo phương

trường phân tán là dung dịch bão hòa MGF đã được lọc qua màng 0,45 μm Nồng độ MGF trong môi trường phân tán được điều chỉnh để giá trị % obscuration phù hợp với khoảng phân bố kích thước tiểu phân Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần Các mẫu đồng thời được quan sát dưới kính hiển vi quang học

Đánh giá kết quả dựa trên giá trị D [4,3] (kích thước tiểu phân trung bình theo thể tích); D10, D50, D90 (phân vị dựa trên thể tích); SPAN (chỉ số đánh giá độ phân tán của phân bố kích thước tiểu phân) [51]

Kính hiển vi: Chuẩn bị các mẫu thử trên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi (KHV)

kết nối camera với cường độ ánh sáng và vật kính thích hợp Pha loãng mẫu trước khi làm tiêu bản (nếu cần) Sử dụng phần mềm NIS Elements D 4.2 để điều chỉnh chất lượng ảnh phù hợp và ghi lại Hình ảnh, xác định kích thước tiểu phân của mẫu

2.3.2.2 Phương pháp điều chỉnh và đo áp suất thẩm thấu

Nồng độ mannitol được lựa chọn phụ thuộc vào sự có mặt của các thành phần tá dược khác cũng gây ra áp suất thẩm thấu (ASTT) Lượng mannitol được tính toán sao cho dung dịch tá dược đẳng trương có giá trị ASTT trong khoảng 290 – 310 mOsmol/kg theo biểu thức 𝜋 = 𝑖 x 𝑚𝐵 Trong đó: 𝜋 là áp suất thẩm thấu (Osmol/kg), i là hệ số Van’t Hoff (giả sử dung dịch tá dược ở điều kiện lý tưởng, i được xác định bằng số ion phân ly được đối với muối phân ly trong nước, hoặc i bằng 1 đối với đường tan trong nước), mB là nồng

độ molan của các chất tan trong dung dịch (mol/kg)

Kiểm tra lại ASTT bằng máy đo ASTT, hiệu chỉnh lại nếu cần Mẫu HD đo ASTT được chuẩn bị bằng cách ly tâm với tốc độ 20000 vòng/phút trong 30 phút, thu lấy phần dịch trong Máy đo ASTT được khởi động, tạo băng và hiệu chỉnh bằng dung dịch chuẩn trước khi đo

2.3.2.3 Phương pháp xác định đặc tính lưu biến

Đặc tính lưu biến của mẫu được đánh giá bằng cách sử dụng lưu biến kế DHR-1, TA Instruments với đĩa xoay hình nón có đường kính 40 mm, góc 4,019o Đĩa dưới tĩnh phẳng phía dưới là đĩa tiêu chuẩn đồng thời được dùng để điểu khiển/kiểm soát nhiệt độ mẫu Dùng pipet đưa khoảng 1,5 ml hỗn dịch lên trung tâm của đĩa dưới Tiếp theo, hạ đĩa xoay xuống đến cách đĩa dưới một khoảng bằng 120mm (trim gap) Vét sạch phần mẫu tràn ra bên ngoài phần giữa 2 đĩa, sau đó hạ tiếp đĩa trên xuống khoảng cách 100 µm (geometry gap) và bắt đầu đo lưu biến với chương trình được thiết lập như sau:

- Nhiệt độ: 25 oC (nhiệt độ phòng thí nghiệm nhằm tránh sự thay đổi độ tan của hỗn dịch khi bào chế), thời gian cân bằng và ổn định nhiệt độ mẫu 180 giây

- Đo độ nhớt: thực hiện phép đo quay một chiều với tốc độ thay đổi từ 0,65 x 10-4

rad/giây đến 35,07 rad/giây Độ nhớt động của mẫu được xác định tại 2 tốc độ quay trượt (shear rate) khác nhau

- Xác định yield stress: thực hiện phép đo dao động với độ biến dạng 0,01 - 200 %, tốc độ thay đổi 1,6 Hz Yield stress được xác định bởi điểm bắt đầu có sự thay đổi đáng kể của thông số storage modulus

- Xác định tanδ: tanδ = loss modulus/ storage modulus

- Xác định khả năng phục hồi cấu trúc Cài đặt thông số máy để dao động theo thời gian, tiến hành theo 3 giai đoạn: Giai đoạn 1, tần số góc 6,28 rad/s trong 200 giây; giai đoạn

2, tần số góc 188,5 rad/s trong 200 giây; giai đoạn 3, tần số góc 6,28 rad/s trong 300 giây

Đánh giá sự thay đổi tanδ khi tác động lực mạnh lên hệ

2.3.2.4 Phương pháp xác định dạng thù hình của dược chất

Mẫu đo: hỗn dịch MGF được ly tâm với tốc độ 20000 vòng/phút trong 30 phút, lấy phần cắn đem làm khô ở trong bình hút ẩm chứa silicagel trong 48 giờ; các mẫu nguyên liệu, hỗn hợp vật lý, hỗn hợp placebo được đo trực tiếp

Phương pháp quét nhiệt lượng vi sai (DSC)

- Thiết bị phân tích nhiệt DSC 1 StarSystem (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)

- Cách tiến hành: Cân mẫu đo vào đĩa phân tích với lượng mẫu chứa khoảng 1 - 5

mg dược chất, dập hàn kín sau đó đưa vào buồng máy Dùng kẹp đưa đĩa phân tích vào buồng gia nhiệt của thiết bị Thông số: ổn định mẫu ở 25 oC trong 5 phút; khoảng quét nhiệt

25 oC – 350 oC, tốc độ gia nhiệt: 10 oC/phút, lưu lượng khí N2: 50,0 ml/phút

Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X (XRD)

- Thiết bị: hệ thống phân tích nhiễu xạ tia X D8 Advance Bruker (Mỹ)

- Cách tiến hành: Quét phổ nhiễu xạ tia X với các thông số: nhiệt độ 25 oC; độ phân giải: 0,020o; khoảng góc đo 2θ từ 5o đến 60o; độ quét góc 2θ: 0,020 o/giây

2.3.2.5 Phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

- Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu đo tương tự mục 2.3.2.3 Điều chỉnh cần nén mẫu sao cho mẫu cần đo tiếp xúc tối đa với bề mặt ATR với một lực ép vừa phải Tiến hành quét phổ IR trong dải số sóng 4000 - 400 cm-1 Dựa vào các dải hấp thụ đặc trưng để đánh giá thành phần hóa học và tương tác giữa các thành phần trong công thức

2.3.2.6 Phương pháp xác định tạp phân hủy

Ly tâm các hỗn dịch (20000 vòng/phút x 30 phút) thu được dịch trong Phân tích phần dịch trong theo phương pháp HPLC với điều kiện như mô tả dưới đây, đánh giá sự phân hủy thông qua sự xuất hiện của píc tạp và tỉ lệ S píc tạp/ S píc MGF

Điều kiện sắc kí: cột sắc kí C18 4,6 x 250 mm, kích thước hạt nhồi 5 μm, duy trì 40

oC bằng ổn nhiệt cột (Athena Technology, India); pha động: hỗn hợp AcOH 3 % : ACN (tỉ

lệ 88:12 v/v) Tốc độ rửa giải: 1,0 ml/phút Detector DAD - UV - VIS, bước sóng phát hiện:

258, 320, 370, 500 nm Tiêm mẫu tự động, thể tích tiêm 70 μl

2.3.3 Phương pháp định lượng MGF trong dịch thử hòa tan/ mẫu bào chế

- Điều kiện sắc kí: thiết bị HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Đức); cột C18 - 4,6 x 150 mm, hạt nhồi 5 μm (GL Sciences, Japan), nhiệt độ 40 oC được duy trì bởi bộ ổn nhiệt cột (Athena Technology, India); detector DAD - UV - VIS, bước sóng 258,4 nm; pha động: dung dịch AcOH 3 % : ACN (85 : 15 v/v), được lọc qua màng 0,22 μm và siêu âm đuổi bọt khí trong 10 phút; tốc độ rửa giải: 1,35 ml/phút; tiêm mẫu tự động, thể tích tiêm: 10 μL Kết quả được xử lý trên phần mềm ChemStation

- Cách tiến hành: Quá trình chuẩn bị và phân tích mẫu được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng nhiệt độ phòng thí nghiệm

+ Dung môi hòa tan mẫu chuẩn: dung dịch đệm phosphat 0,1M pH 7,4;

+ Dung môi pha loãng mẫu: pha động

+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 11 mg MGF, chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung môi hòa tan mẫu, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung thêm dung môi hòa tan mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều

+ Dãy dung dịch chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng pha động thành các nồng độ thích hợp (0,171 – 22 μg/ml)

+ Dung dịch thử: mẫu dịch hòa tan thu được sau mỗi thời điểm, được pha loãng bằng pha động đến nồng độ thích hợp Mẫu chế phẩm được hòa tan trong đệm pH 7,4 trước khi pha loãng bằng pha động

+ Dung dịch mẫu placebo (mẫu không chứa dược chất nhưng chứa các thành phần khác với tỉ lệ tương tự mẫu thử): tiến hành tương tự giống mẫu thử

2.3.4 Phương pháp thử hòa tan kiểu khuấy

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo của thiết bị thử giải phóng kiểu khuấy

- Thiết bị thử hòa tan kiểu khuấy có cấu tạo được mô tả như Hình 2.1, bao gồm: một buồng khuấy hình trụ (đường kính đáy 22 mm, chiều cao 63 mm) đặt trên máy khuấy từ, bên trong có một lớp lưới mỏng (có kích thước mắt lưới 1 mm) được đặt cách đáy khoảng

50 mm và giữ con khuấy từ (kích thước 1 cm)

- Điều kiện thử hòa tan:

+ Môi trường thử hòa tan: dung dịch đẳng trương pH 7,4 (tham khảo theo DĐVN V chứa 0,6 g KH2PO4; 5,85 g NaCl; 6,4 g Na2HPO4; 0,01 g EDTA; 15,8 g Na2S2O3) hòa tan trong cốc có mỏ, điều chỉnh về pH 7,4, siêu âm và sục khí N2 trong 10 phút Thể tích môi trường: 10 ml Nhiệt độ thử nghiệm: 34 oC ± 2 oC

+ Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút

- Cách tiến hành: dùng micropipet đưa chính xác một lượng mẫu khoảng 0,05 g tới mặt lưới của buồng khuấy đã chứa sẵn môi trường hòa tan, vận hành máy khuấy từ Thời điểm lấy mẫu: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180,… phút sau khi bắt đầu Tại mỗi mốc thời điểm, hút 1 ml môi trường thử tại vị trí cách bề mặt chất lỏng 1 cm

và bổ sung ngay 1 ml môi trường thử mới Dịch thử hoà tan tại mỗi thời điểm được lọc qua màng 0,22 μm ngay sau khi lấy mẫu và pha loãng bằng pha động, sau đó định lượng mẫu theo phương pháp HPLC (mục 2.3.3) Toàn bộ quá trình thử hòa tan và pha loãng mẫu được thực hiện trong điều kiện hạn chế ánh sáng

- Tỉ lệ (%) MGF hòa tan tại các thời điểm được tính như sau, trong đó: % GPn là tỉ

lệ % MGF hòa tan khỏi hỗn dịch so với lượng lý thuyết; Cn là nồng độ MGF trong môi

Vo là thể tích dịch thu được tại thời điểm thứ n (1 ml); m là khối lượng MGF đem thử hòa tan (mg)

% 𝐺𝑃𝑛 =𝐶𝑛∗ 𝑉 + ∑ (𝐶𝑛 − 1 ∗ 𝑉0)

𝑛 𝑖=1

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng hòa tan - giải phóng in vivo trên mắt thỏ

2.3.5.1 Phương pháp thực hiện

- Động vật thử nghiệm: thỏ New Zealand Albino trắng, khỏe mạnh, khối lượng 2,5

- 3,5 kg Các thỏ được cho ăn rau và cám tổng hợp, uống nước đầy đủ, và được vận động

tự do trong lồng trong quá trình nghỉ giữa các lần thử Thỏ được nuôi ổn định 1 tuần theo điều kiện phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu Quá trình chăm sóc - thử

nghiệm được thực hiện tại Khoa Dược lý - Dược lâm sàng, trường Đại học Dược Hà Nội

- Quy trình thử: Các thỏ được cho ăn, cố định trong hộp lấy mẫu trước khi thử thuốc Trên mỗi mắt thỏ, nhỏ khoảng 25 µl HD 2 % vào túi cùng giác mạc của mắt thỏ Giữ hai

mí mắt trong khoảng 5 giây để mẫu thử không bị trượt khỏi vị trí Mắt còn lại được nhỏ nước mắt sinh lý và quan sát trong cùng điều kiện (mẫu chứng) Tại từng thời điểm, tiến hành thu mẫu nước mắt chứa dược chất

- Phương pháp thu mẫu nước mắt chứa dược chất:

+ Chuẩn bị các mảnh giấy thấm kích thước 3 x 15 mm từ giấy lọc định lượng (Newstar, Trung Quốc)

+ Dùng panh kẹp một đầu giấy thấm, đầu còn lại được cho tiếp xúc nhẹ nhàng với niêm mạc mắt thỏ (tại mi trên ở khu vực gần khóe mắt thỏ) đến khi lượng nước mắt thấm đến 2/3 chiều dài mảnh giấy thấm Khối lượng nước mắt trên giấy thấm được xác định bằng phương pháp cân, sử dụng cân phân tích ES 225SM-DR Mẫu giấy thấm được chứa trong các ống Eppendorf (dung tích 0,5 ml) và được bảo quản ở - 20 ºC cho đến khi xử lý

2.3.5.2 Phương pháp định lượng mangiferin trong nước mắt thỏ

Điều kiện sắc ký: thiết bị hệ thống HPLC Agilent 1200 Series, Agilent Technologies

(Đức), cột: C18 4,6 x 250 mm (GL Sciences, Japan), kích thước hạt nhồi 5 μm , nhiệt độ

40 ºC được duy trì bởi bộ ổn nhiệt cột (Athena Technology, India), pha động: dung dịch

acid acetic 0,6 % (tt/tt) : methanol (65 : 35, tt/tt), tốc độ dòng: 1 ml/phút, bước sóng: 258

nm, thể tích tiêm mẫu: 10 µl

Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu chuẩn

- Chuẩn bị mẫu nước mắt trắng (giấy thấm chứa nước mắt thỏ nhưng không có dược

chất) Tiến hành tương tự như quy trình lấy mẫu nước mắt trong phép thử giải phóng in

vivo, nhưng không nhỏ HD Mẫu giấy thấm được chứa trong các ống Eppendorf (dung tích

0,5 ml) và được bảo quản ở điều kiện - 20 ºC chờ xử lý

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn MGF trong đệm pH 7,4 đẳng trương để tạo mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg MGF chuyển vào bình định mức 200 ml Thêm khoảng

150 ml dung dịch đệm pH 7,4 đẳng trương chứa Na2EDTA 0,01 mg/ml (dung môi pha mẫu), đã được siêu âm và sục khí nitơ, siêu âm kết hợp lắc đến khi dược chất tan hoàn toàn Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng trong dung môi pha mẫu đẳng trương để thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ phù hợp

- Chuẩn bị các mẫu chuẩn (mẫu giấy thấm nước mắt được hấp phụ MGF ở các khối lượng xác định) Rã đông các mảnh giấy thấm chứa nước mắt trắng ở nhiệt độ phòng trong

30 phút Dùng micropipet đưa chính xác 5 µl dung dịch chuẩn đã pha ở trên lên mảnh giấy thấm Mẫu chuẩn được bảo quản ở điều kiện - 20 ºC và được phân tích trong 2 tuần sau khi chuẩn bị

Xử lý mẫu (mẫu chuẩn trong nước mắt; mẫu nước mắt chứa dược chất từ phép thử giải phóng in vivo)

Thêm chính xác 200 µl pha động (AcOH 0,6 % : MeOH = 65 : 35) vào ống Eppendorf chứa mẫu giấy thấm nước mắt được hấp phụ MGF (mẫu chuẩn), hoặc mẫu nước

mắt chứa MGF thu được từ phép thử giải phóng in vivo Lắc xoáy trong 10 phút Gắp bỏ

giấy lọc, ly tâm các ống Eppendorf ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút Hút khoảng 80

µl dịch sau ly tâm cho vào lọ đựng mẫu và phân tích sắc ký đã nêu ở trên [52], [53]

Phương pháp định lượng dược chất sử dụng trong nghiên cứu đã được tác giả Đào Văn Nam và cộng sự tiến hành thẩm định về các tiêu chí độ đúng, độ chính xác, độ lặp lại và độ tuyến tính, và đã được công bố trong tài liệu tham khảo [53]

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Bào chế hỗn dịch mangiferin 2%

3.1.1 Sử dụng phương pháp nghiền bi kiểu hành tinh để giảm KTTP MGF

Trong nghiên cứu này, chúng tôi định hướng sử dụng máy nghiền bi kiểu hành tinh

để làm giảm KTTP MGF, tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu MGF khác so với nghiên cứu trước đó của tác giả Thái Vũ Thảo Nguyên [49] Kết quả đánh giá đặc tính nguyên liệu,

có so sánh với tài liệu cho thấy hai nguồn nguyên liệu có cấu trúc tinh thể và dạng thù hình

là tương tự nhau (Phụ lục 2) Do vậy mặc dù KTTP có sự khác biệt (D90, D[4,3] và SPAN của NL1 và NL2 lần lượt là 22,5 μm; 10,4 μm; 2,77; và 9,93 μm; 5,08 μm; 2,06 μm), những quy luật ảnh hưởng của thông số công thức và quy trình bào chế lên nguyên liệu cũ (NL 01) vẫn có thể áp dụng với nguyên liệu MGF mới (NL 02)

Với mục đích tạo ra các hỗn dịch có phân bố KTTP khác nhau (lớn - trung bình - nhỏ) nhằm lựa chọn được công thức phù hợp, và dựa vào kết quả phân tích đặc tính nguyên liệu, nguyên liệu NL 02 được lựa chọn để bào chế HD có KTTP lớn (không qua nghiền)

Để giảm KTTP NL 02 đến mức trung bình và nhỏ, lựa chọn thành phần công thức và thông

số quy trình nghiền như trong Bảng 3.1 và Bảng 3.2 dựa trên tham khảo tài liệu và có điều chỉnh dựa vào các thí nghiệm tiền khả thi

Bảng 3.1 Công thức dịch nghiền MGF 10 %

Tốc độ nghiền _ Thời gian

Thực hiện nghiền 2 quá trình:

350 rpm _ 90 phút

550 rpm _ 60 phút

350 rpm _ 90 phút

Tiến hành thí nghiệm với quy mô 2 mẻ Dịch nghiền thu được ở 2 mẻ được gộp lại

và xác định KTTP MGF theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.1 Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3, Hình 3.1 và Hình 3.2 Tất cả các công thức thỏa mãn D90 ≤ 25 𝜇m [54] phù hợp để bào chế hỗn dịch định hướng nhỏ mắt Đồ thị phân bố KTTP cũng cho thấy 3 hỗn dịch nghiền có phân bố KTTP khác biệt rõ ràng

Bảng 3.3 Phân bố KTTP của nguyên liệu MGF (CT 3) (*) và hỗn dịch nghiền CT 1, CT2