Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin trong chất tinh khiết thu được sau khi kết tinh lại.. Tổng hợp các phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dâ
TỔNG QUAN
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Tổng quan về cây Chè dây
Tên khoa học: Ampelopsis cantoniensis (Hook et Arn.) Planch [7]
Tên đồng nghĩa: Cissus cantoniensis Hook et Arn [8]
Tên khác: Chè hoàng giang, song nho, pàn oỏng, khau cha (Tày) [8]
Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [9], vị trí phân loại của cây Chè dây như sau:
Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae)
Cây leo có thân và cành cứng, hình trụ, có lông nhỏ, với tua cuốn chẻ đôi mọc đối diện với lá Lá kép lông chim, mọc so le, gồm 7-13 lá chét hình trái xoan dài từ 2,5-7,5 cm, rộng 1,5-5 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, mép có ít răng cưa, nhẵn, mặt trên khi khô xuất hiện các vệt trắng loang lổ như bị nấm mốc, còn mặt dưới rất nhạt; lá kèm đã khô xác Cụm hoa mọc đối diện lá, dạng ngù phân nhánh rộng 3-6 cm, gồm nhiều hoa màu trắng, đài hình chén có lông mịn và 5 răng ngắn, tràng có 5 cánh mép hơi nhăn, tạo điểm nhấn cho vẻ đẹp tự nhiên của cây.
5, chỉ nhị mảnh; bầu hình nón, nhăn, có 2 ô, mỗi ô 2 noãn [7]
Quả mọng khi chín màu đen; hạt 3-4, thót lại ở gốc [7]
1.1.1.3 Đặc điểm sinh thái, phân bố
Chè dây có ở một số tỉnh phía nam Trung Quốc, Lào, Ấn Độ và Indonesia [8] Tại Việt Nam, Chè dây phân bố ở Lạng Sơn, Cao Bằng, Lào Cai Sau đó được phát hiện thêm ở nhiều điểm như Đồng Văn, Mèo Vạc, Yên Minh, Quản Bạ (Hà Giang); Hương Khê (Hà Tĩnh); Trà My (Quảng Nam); Đăk Tô, Konplông (Kon Tum); K’Bang (Gia Lai) và một số điểm khác ở Nghệ An, Lâm Đồng và Đồng Nai Trong đó Đồng Văn và Yên Minh là nơi có Chè dây mọc tập trung nhất [8]
Chè dây là loại cây ưa ẩm và ưa sáng, thường phát triển bằng cách leo và trùm lên các loại cây bụi, cây gỗ nhỏ ở vùng đồi, ven rừng hoặc bờ nương rẫy Cây có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu ẩm ướt, thường mọc trên độ cao phù hợp để phát triển tối ưu Các đặc điểm sinh trưởng của chè dây giúp nó trở thành loại cây phổ biến trong tự nhiên, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái khu vực đồi núi và rừng rậm.
600-1600 m Cây thích nghi với vùng á nhiệt đới núi cao như Hà Giang, Lào Cai,… Mùa ra chồi và sinh trưởng mạnh trùng với mùa mưa ẩm [8]
Phần trên mặt đất của cây Chè dây thu hái vào lúc cây chưa ra hoa, cắt nhỏ, phơi khô [8]
1.1.2 Tổng quan về dược liệu lá Chè dây Folium Ampelopsis
Lá của cây Chè dây (Ampelopsis cantoniensis) thuộc họ Nho (Vitaceae) đã được phơi sấy khô, có đặc điểm là thường nhàu nát và hình dạng trái xoan hoặc mũi mác, dài từ 2,5 cm đến 7,5 cm Mặt trên của lá có màu lục xám với các vết trắng loang lổ như mốc, trong khi mặt dưới có màu nhạt hơn; cuống lá nhẵn, dài từ 3 mm đến 12 mm Lá có thể nhẹ, giòn, dễ gãy nát, mang mùi thơm đặc trưng, vị đắng sau đó có vị ngọt nhẹ, phù hợp để sử dụng trong y học cổ truyền.
Lá Chè dây chứa các thành phần quan trọng như flavonoid, tanin, acid hữu cơ, caroten, cùng các nguyên tố vi lượng K, Ca, Fe, Zn và một số vitamin, góp phần nâng cao giá trị dược liệu của loại thảo dược này Trong số đó, flavonoid được biết đến với khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, hỗ trợ hệ miễn dịch và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương, làm cho lá Chè dây trở thành một loại dược liệu tự nhiên có nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Lá Chè dây chứa năm flavonoid chính gồm myricitrin, myricetin, quercetin, dihydromyricetin và phloretin, đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý của dược liệu [12], [13] Ngoài ra, các hợp chất flavonoid khác như quercetin, phloritin, 5,7-dihydroxychromone, 3,5,7-trihydroxychromone, alstilbin, aromadendrin và 3′,5′,5,7-tetrahydroxyflavanone cũng được phát hiện trong lá Chè dây [13] Trong số này, myricetin và dihydromyricetin chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 18-19%, góp phần quan trọng vào tác dụng sinh học của cây thuốc này [12], [14].
Bảng 1.1 Một số hợp chất flavonoid được phân lập từ Chè dây
STT Tên thành phần Công thức cấu tạo Phân nhóm TLTK
Tanin catechin trong lá Chè dây có hàm lượng cao, khoảng 10,8-13,3%, là một loại tannin thuộc nhóm tannin catechic được ngưng tụ từ các đơn phân tử cơ bản là catechin và epicatechin, hai đồng phân của nhau.
Epicatechin Catechin c Acid hữu cơ
Bảng 1.2 Công thức cấu tạo của một số acid hữu cơ trong Chè dây
STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK
3 Acid digallic [13] d Các hợp chất khác
Bảng 1.3 Công thức cấu tạo của một số thành phần khác trong Chè dây
STT Tên chất Công thức cấu tạo TLTK
1.1.2.3 Tác dụng dược lý a Tác dụng chống loét dạ dày
Nghiên cứu thực nghiệm gây loét dạ dày bằng mô hình Shay trên chuột cống trắng cho thấy, việc uống flavonoid toàn phần với liều 1 g/kg/ngày trong 4 ngày trước khi thắt môn vị đã giảm đáng kể các chỉ số loét Cụ thể, chỉ số loét của lô chứng là 7,1 so với 2,66 của lô thuốc, giảm 62,5% Đồng thời, thể tích dịch vị trong lô thuốc giảm 24,4%, độ acid tự do giảm 26,4%, và độ acid toàn phần giảm 21,5%, cho thấy tác dụng chống loét rõ rệt của flavonoid toàn phần.
Lá Chè dây có hoạt tính chống loét được đánh giá qua thử nghiệm gây loét do indomethacin Trong nghiên cứu, sau 12 giờ nhịn ăn, chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm, mỗi nhóm gồm 10 con, trong đó nhóm đối chứng và nhóm dùng nước cất để so sánh hiệu quả chống loét của lá Chè dây.
Trong nghiên cứu này, các nhóm chuột được điều trị bằng các liều khác nhau của các loại thuốc để đánh giá tác dụng chống loét và giảm đau Nhóm III được cho dùng omeprazol với liều 30 mg/kg, trong khi các nhóm IV và V được uống bột phun khô của lá Chè dây với liều lượng 500 và 1000 mg/kg trong 7 ngày liên tục, sau đó không ăn trong 24 giờ Kết quả cho thấy, mức độ loét do indomethacin ở nhóm IV và V giảm lần lượt là 41,46% và 61,57% so với nhóm đối chứng, còn nhóm dùng omeprazol giảm 71,62%, cho thấy tác dụng chống loét hiệu quả của các phương pháp điều trị này [16].
Tiến hành gây đau bằng tiêm trong màng bụng 0,1 mL/20 g chuột nhắt trắng dung dịch acid acetic 0,1%, nhằm mô phỏng cơn đau cấp tính Liều flavonoid toàn phần được tiêm dưới da với liều lượng 1 g/kg để đánh giá tác dụng giảm đau Kết quả cho thấy số cơn quặn đau tính theo từng 5 phút đã giảm từ 50-80% so với lô chứng, cho thấy hiệu quả đáng kể của flavonoid trong việc giảm đau cấp tính Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã xác định tác dụng kháng khuẩn của flavonoid, góp phần vào khả năng điều trị các bệnh nhiễm trùng.
Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch với hai nồng độ 0,5% và 1% flavonoid toàn phần cho thấy thuốc có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt trên Bacillus subtilis ATCC 6633, tương đương gần bằng ampicillin 0,2 UI/mL ở nồng độ 1% Ngoài ra, enzyme còn hiệu quả mạnh hơn erythromycin 0,2 UI/mL trên Bacillus pumilus ATCC 8241, nhưng có tác dụng yếu hơn tetracycline 2 UI/mL trên Bacillus cereus 958 Tuy nhiên, tác dụng trên Staphylococcus aureus và Escherichia coli là yếu, và không có tác dụng đối với Shigella.
[8], [16] d Tác dụng chống oxy hóa
Phản ứng oxy hóa lipid màng tế bào gan chuột nhắt trắng sinh ra malonyl dialdehyd (MDA), một chất phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức màu Đo cường độ màu tại 532 nm giúp xác định lượng MDA sinh ra, qua đó đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất Các thuốc chống oxy hóa đều làm giảm hàm lượng MDA trong tế bào gan, thể hiện khả năng bảo vệ chống oxy hóa Thử nghiệm trên cao khô toàn phần chè dây cùng hai flavonoid là myricetin và dihydromyncetin cho thấy cả ba chế phẩm đều làm giảm mức MDA, khẳng định tác dụng chống oxy hóa hiệu quả của chúng [8], [3].
Ngoài ra kết quả của nghiên cứu tiến hành để khảo sát hoạt động dọn gốc 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) của 5 hợp chất flavonoid có trong lá Chè dây được thể hiện trong bảng 1.4 [12]
Bảng 1.4 Hoạt tính chống oxy hóa của 5 hợp chất flavonoid có trong lá Chè dây
Phần trăm hấp thụ DPPH
Kết quả cho thấy quercetin có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất với tỷ lệ 85,18% ở nồng độ 100 μM, vượt trội so với dihydromyricetin chỉ đạt 69,31% và vitamin C đạt 81,20% Độ hấp thụ DPPH của quercetin ở nồng độ 5 μM là cao nhất với 38,62%, trong khi dihydromyricetin có độ hấp thụ thấp nhất chỉ 11,11%, còn vitamin C là 25,66%.
Theo kết quả của bảng, với phương pháp bẫy gốc tự do DPPH cho thấy khả năng chống oxy hóa khá mạnh của Chè dây, mạnh hơn cả vitamin C
Tổng quan về chất chuẩn phân lập từ dược liệu
1.2.1 Khái niệm về chất chuẩn
Chất chuẩn hay chất đối chiếu hóa học là một chất đồng nhất đã được xác định chính xác để sử dụng trong các phép thử về hóa học, vật lý và sinh học theo tiêu chuẩn quy định Các phép thử này giúp so sánh các tính chất của chất đối chiếu với các đặc tính cần kiểm tra, đảm bảo độ chính xác của phân tích Chất đối chiếu cần có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.
Chất chuẩn hay chất đối chiếu hóa học đóng vai trò thiết yếu trong việc đánh giá nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm theo các quy trình đã được xác định rõ ràng Việc sử dụng chất chuẩn đảm bảo kết quả phân tích đạt độ chính xác cao, tin cậy trong quá trình kiểm tra chất lượng sản phẩm Điều này giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng, đáp ứng các yêu cầu khắt khe của các tiêu chuẩn kỹ thuật và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.
1.2.2 Tình hình thiết lập chất chuẩn là hợp chất tự nhiên từ dược liệu
Trong những năm gần đây, các chuẩn hóa học từ dược liệu đã được sản xuất trên toàn thế giới với mức độ tinh khiết cao, đóng vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm dược phẩm Dược điển Mỹ 30 (2007) đã bổ sung nhiều chất chuẩn đối chiếu hóa học như quercetin USP CRS, rutin USP RS và silybin USP CRS, giúp nâng cao tiêu chuẩn chất lượng Dược điển Mỹ 44 (2022) tiếp tục cập nhật nhiều chất đối chiếu hóa học đặc trưng từ dược liệu, phản ánh sự tiến bộ trong công nghiệp dược phẩm Dược điển Trung Quốc từ năm 2005 cũng ghi nhận lượng lớn các chất đối chiếu hóa học từ dược liệu, phục vụ kiểm nghiệm và nghiên cứu Viện Kiểm nghiệm thuốc và sản phẩm sinh học Trung Quốc đã cung cấp từ năm 2005 các chất đối chiếu chiết tách từ dược liệu có độ tinh khiết từ 80% đến trên 90%, hỗ trợ kiểm tra chất lượng thuốc Tại Việt Nam, chất đối chiếu hóa học giữ vị trí quan trọng trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc từ sản xuất đến lưu hành Hiện nay, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và thành phố Hồ Chí Minh sở hữu gần 1000 chuẩn dược điển trong kiểm nghiệm thuốc, bao gồm chuẩn của Dược điển Việt Nam, Quốc tế, Trung Quốc và Nhật Bản, giúp nâng cao độ tin cậy cho công tác kiểm tra chất lượng thuốc.
Mỹ đã xây dựng các tiêu chuẩn Dược điển tiên tiến, phù hợp với tiêu chuẩn châu Âu và khu vực ASEAN, nhằm đảm bảo chất lượng của các sản phẩm dược phẩm Các tiêu chuẩn này bao gồm các chuẩn chất chuẩn, chuẩn chất đối chiếu hóa dược, chuẩn dược liệu, cũng như chuẩn các hợp chất thiên nhiên chiết xuất từ dược liệu và chuẩn tạp chất, nhằm đảm bảo độ chính xác và đồng nhất trong phòng thí nghiệm và sản xuất dược phẩm [33], [34].
Nước ta hàng năm cần khoảng 50.000 tấn dược liệu cho ngành dược, nhưng chỉ thu hoạch được 25-30% nhu cầu, phần còn lại phải nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc Thị trường thực phẩm chức năng ngày càng phát triển, dẫn đến nhu cầu tiêu thụ dược liệu tăng mạnh, nhưng chất lượng dược liệu còn nhiều vấn đề đáng lo ngại Việc kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm từ dược liệu trở nên vô cùng cần thiết, trong đó các loại dược liệu chuẩn và chất chuẩn đặc trưng đóng vai trò then chốt Phương pháp cảm quan dễ gây ra sai lệch trong đánh giá, trong khi các phương pháp sắc ký hiện đại dựa trên các chất chuẩn giúp kiểm nghiệm chính xác hơn Vì vậy, nghiên cứu chiết tách, tinh chế hợp chất tự nhiên từ dược liệu để làm nguyên liệu cho các chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu là nhiệm vụ cấp thiết, nhằm nâng cao chất lượng và an toàn của dược phẩm từ dược liệu tại Việt Nam.
Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin
Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm khảo sát các điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần và dihydromyricetin như sau:
Bảng 1.5 Tổng hợp các phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây
STT Quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Kết quả Ưu điểm và nhược điểm
1 Chiết xuất cao dược liệu
- Dung môi: ethanol 70 % (tỷ lệ dược liệu/dung môi = 1:10)
- Phương pháp: chiết siêu âm ở nhiệt độ phòng
- Sau chiết: lọc và cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không
Hàm lượng DHM trong cao chiết:
Phương pháp siêu âm tăng hiệu quả chiết
2 Phân lập, tinh chế DHM bằng phương pháp tạo phức với kim loại
- Trộn bột Chè dây với ZnSO4.7H2O
(tỷ lệ 1:4) trong nước cất (1:20)
- Điều chỉnh pH = 2 bằng HCl, đun
90 ℃ trong 2 giờ để tạo kết tủa phức
• Tách Zn bằng EDTA-2Na
- Thêm EDTA-2Na vào kết tủa, đun
90 ℃ trong 5 phút để loại Zn 2+ ra khỏi phức, thu hồi DHM tự do
- DHM thu được sau tách Zn có dạng tinh thể kim trắng, độ tinh khiết cao Ưu điểm:
- Dễ dàng thu hồi DHM sau khi loại ion
- Tinh thể DHM có hình dạng đẹp, kích thước đều
Lưu ý: Cần kiểm soát chặt pH và thời gian phản ứng để tránh tái kết tủa hoặc mất chất
75 % (tt/tt) trong nước khử ion
- Chiết siêu âm: 30 phút ở 60 ℃, sau đó lọc qua giấy lọc 30-50 μm
- Cô đặc: cô quay chân không ở
- Kết tinh lại: hoà tan lại trong 1,0 L nước nóng có chứa 0,1 % than hoạt tính, lọc nóng, để nguội, để trong tủ kết tinh
- Lặp lại kết tinh 5 lần, sấy khô ở
DHM tinh khiết (99,5%), hiệu suất xấp xỉ
4 Chiết xuất flavonoid bằng nước
- Nguyên liệu: bột lá Chè dây sấy khô (8 % ẩm), nghiền mịn lọt rây 40 mesh
- Điều kiện tối ưu: 80 ℃, 120 phút, tỷ lệ nguyên liệu/nước 1:50 (g/mL)
- Chiết 3 lần liên tiếp để nâng hàm lượng flavonoid
Hiệu suất chiết flavonoid tối đa: 24,74 %
- Nồng độ flavonoid trong dịch chiết: 18,90 mg/mL Ưu điểm:
- Dùng dung môi an toàn (nước), phù hợp thực phẩm
- Flavonoid dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ cao và thời gian kéo dài
5 Chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin
- Nguyên liệu: lá và cành nhỏ
- Sấy khô ở nhiệt độ 40-60 ℃, nghiền thành bột mịn (40 mesh)
• Chiết xuất bằng nước có hỗ trợ siêu âm
- Điều kiện: 50-80 ℃, thời gian 1-3 giờ, khuấy siêu âm Sau đó lọc thu dịch chiết và đặc dịch chiết
- Dùng bay hơi chân không ở 40-
60 ℃ để thu dịch cô đặc
- Thêm ethanol để kết tủa tạp chất
- Dịch được để lạnh 4-8 ℃ qua đêm, sau đó lọc lấy kết tủa flavonoid
- Sấy kết tủa và tinh chế lần 2
- Sấy lạnh hoặc sấy chân không ở nhiệt độ thấp để thu bột DHM
DHM tinh khiết cao, dùng được trong dược phẩm Ưu điểm:
- Dung môi sử dụng rẻ tiền, an toàn, thân thiện môi trường
- Siêu âm giúp phá vỡ thành tế bào, tăng hiệu suất chiết
6 Chiết xuất, phân lập DHM
- Nguyên liệu: lá và cành non
• Kết tinh lại 8 lần bằng nước
- Kết tinh ở 25 ℃, mỗi lần 12 giờ
- Dựa vào sự khác biệt độ tan của
DHM ở nhiệt độ thường và khi đun
- Tinh thể DHM đạt độ tinh khiết
- Tinh thể hình khối lập phương, bề mặt mịn, đồng đều Ưu điểm:
- Dung môi sử dụng là nước cất, rẻ tiền và không độc hại
- Hiệu quả cao, thu được DHM tinh sạch
- Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC gian và công sức
- Hiệu suất không được báo cáo rõ ràng
- Dược liệu: lá Chè dây đạt chuẩn
- Làm khô, nghiền nhỏ, chuẩn bị bột thô
• Chiết xuất siêu âm nón
- Tỷ lệ bột: 100 g/1000 mL dung môi
- Chiết siêu âm ở nhiệt độ xác định, sau đó lọc, cô đặc và sấy tạo cao
• Tối ưu hóa bằng RSM - Box -
- Biến số khảo sát: nồng độ EtOH
(40-80 %), thời gian (60-180 phút), nhiệt độ (60-80 ℃)
- Phân tích mô hình hồi quy để tìm điểm tối ưu
EtOH 66 %, thời gian chiết 136 phút, nhiệt độ chiết
- Hàm lượng DHM thực nghiệm:
- Độ chính xác mô hình:
- Xác định được điều kiện tối ưu khoa học
- Ứng dụng mô hình toán học chính xác (R² 0,95)
- Tiết kiệm thời gian và công sức nghiên cứu
Dù đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất và phân lập dihydromyricetin từ Chè dây, nhưng phần lớn quy trình tập trung vào thu cao chiết hoặc flavonoid toàn phần để phục vụ nghiên cứu dược lý Các quy trình này chưa chú trọng phát triển phương pháp tinh chế dihydromyricetin đạt độ tinh khiết cao chuẩn làm nguyên liệu cho các sản phẩm chất lượng Điều này cho thấy cần thiết phải tối ưu hóa quy trình để điều chế dihydromyricetin tinh khiết, đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn cho nguyên liệu chuẩn trong nghiên cứu và ứng dụng y học.
Đề tài tập trung khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây Nghiên cứu này nhằm xác định điều kiện tối ưu để chiết xuất dihydromyricetin, đảm bảo chất lượng cao phù hợp làm nguyên liệu cho sản phẩm chuẩn Kết quả hướng tới nâng cao hiệu quả chiết xuất và tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây, góp phần hỗ trợ phát triển các sản phẩm dược liệu chất lượng, đáp ứng tiêu chuẩn y tế và tiêu dùng.
Dựa trên các nghiên cứu đã được thực hiện, đề tài chọn phương pháp chiết siêu âm sử dụng dung môi ethanol 75% để tối ưu hóa quá trình chiết xuất dihydromyricetin Quá trình phân lập được thực hiện bằng cách kết tinh lại trong nước, nhằm thu nhận dihydromyricetin tinh khiết cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm Phương pháp này giúp nâng cao hiệu quả chiết xuất và tối ưu hóa độ tinh khiết của dihydromyricetin, góp phần phát triển các ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị
Mẫu Chè dây được thu hái tại tỉnh Yên Bái, cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược liệu Indochina Herb, đảm bảo nguồn gốc rõ ràng Sản phẩm đã qua giám định tên khoa học (Ampelopsis cantoniensis) bởi ThS Nghiêm Đức Trọng, bộ môn Thực Vật, Khoa Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Số phiếu giám định tên khoa học là 16/2023, xác nhận chất lượng và nguồn gốc chính xác của Chè dây trên thị trường.
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích bao gồm:
- Dung môi: ethanol, nước cất, toluen, ethyl acetat, acid formic
- Hóa chất: natri tetraborat Na2B4O7 2,0 %, acid hydrocloric HCl 5 %
- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U-1800
- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg
- Cân kỹ thuật Precisa XT 620M (Precisa, Thụy Sĩ)
- Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức)
- Bể điều nhiệt Memmert (Đức)
- Máy siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)
- Máy đo hàm ẩm Ohaus (Trung Quốc)
- Máy li tâm Z207A (HermLe, Đức)
- Giấy lọc, giấy chỉ thị vạn năng, bông lọc, bình triển khai sắc ký lớp mỏng, mao quản, bản mỏng tráng sẵn Silicagel G60 F254 của Merck
- Ống đong, cốc có mỏ, phễu, bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích.
Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin tinh khiết bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
Chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây nhằm tạo ra nguyên liệu làm chất chuẩn, đảm bảo độ chính xác trong nghiên cứu và sản xuất Quá trình này giúp xác định độ tinh khiết của dihydromyricetin sau quá trình tinh chế, nâng cao chất lượng sản phẩm và độ tin cậy của kết quả phân tích Việc nghiên cứu này góp phần phát triển nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú, phù hợp cho các ứng dụng y học và thực phẩm chức năng.
Nội dung 3: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin trong sản phẩm thu được sau tinh chế
Phương pháp định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của ICH và AOAC [38], đảm bảo tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ lặp lại và độ đúng trung gian Những tiêu chuẩn này giúp xác nhận độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích, nâng cao chất lượng và hiệu quả của quá trình kiểm nghiệm Việc áp dụng các hướng dẫn quốc tế này đảm bảo phương pháp định lượng phù hợp với các yêu cầu chặt chẽ của ngành dược phẩm và phòng xét nghiệm.
2.3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống Độ phù hợp của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cân chính xác khoảng 10,0 mg dihydromyricetin vào cốc có mỏ và hòa tan trong khoảng 20 mL ethanol 75% Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100 mL và thêm ethanol 75% đến vạch, tạo thành dung dịch chuẩn gốc Tiếp theo, hút chính xác 2,0 mL dung dịch chuẩn gốc, cho vào bình định mức 20 mL và định mức đến vạch bằng ethanol 75%, đảm bảo độ chính xác cao cho quá trình phân tích.
Trong quá trình phân tích, tiến hành đo 6 lần một mẫu dung dịch chuẩn trên hệ thống quang phổ để ghi lại giá trị độ hấp thụ và tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Độ lặp lại của hệ thống được đánh giá dựa trên mức độ biến đổi của các phép đo quang, thể hiện qua chỉ số RSD, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
2.3.1.2 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền…
Cách xác định: tiến hành quét phổ lần lượt dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử dihydromyricetin rồi tiến hành so phổ
Yêu cầu: các đỉnh phổ của mẫu chuẩn và mẫu thử trùng nhau, phổ UV của mẫu chuẩn và mẫu thử tương đồng về hình dáng [38]
2.3.1.3 Độ tuyến tính Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Kết quả được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính, xác định mối quan hệ trực tiếp giữa độ hấp thụ và nồng độ mẫu Quá trình thực hiện bắt đầu từ dung dịch chuẩn gốc dihydromyricetin, sau đó pha ít nhất 5 dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau trong phạm vi từ 50% đến 150% của nồng độ mẫu thử Các mẫu dung dịch này được đo quang để ghi nhận kết quả, từ đó xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối liên hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch.
Yêu cầu: 0,99 ≤ R 2 ≤ 1 hay hệ số tương quan tuyến tính 0,995 ≤ r ≤ 1 [38]
2.3.1.4 Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận
Tiến hành: thực hiện trên mẫu tự tạo bằng cách thêm chuẩn vào lượng nền thử đã biết trước Thêm chính xác một lượng chuẩn xác định vào bình định mức có sẵn lượng thử ứng với 50 % nồng độ định lượng sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử có thêm chuẩn dựa trên phương trình đường chuẩn, thực hiện ở 3 nồng độ 80 %, 100 % và 120 % của nồng độ định lượng, mỗi nồng độ thực hiện 3 mẫu thử Đánh giá kết quả: Độ đúng (%) = Lượng hoạt chất tìm lại
Lượng hoạt chất thêm vào ban đầu 100%
Yêu cầu: tỉ lệ thu hồi 98,0-102,0 % và RSD ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ [38]
2.3.1.5 Độ lặp lại Độ lặp lại là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích
Tiến hành: thực hiện lặp lại quy trình phân tích 6 lần ở mức nồng độ định lượng
Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thẩm định được thực hiện bằng phương pháp hồi quy tuyến tính, theo hướng dẫn tại mục 2.3.1.3, nhằm đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phân tích Để đáp ứng quy chuẩn, hệ số RSD của phép phân tích phải không vượt quá 2,0 %, đảm bảo tính nhất quán và độ tin cậy của kết quả.
2.3.1.6 Độ chính xác trung gian Độ chính xác trung gian thực hiện tương tự như độ lặp lại nhưng thay đổi điều kiện phân tích, ví dụ như: thực hiện vào những ngày khác nhau, khác người phân tích, khác thiết bị, hoặc điều kiện vận hành
Trong quá trình phân tích, mẫu thử được chuẩn bị và đo quang trong 2 ngày khác nhau, mỗi ngày thực hiện 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng chỉ số RSD (độ lệch chuẩn tương đối) của các giá trị đo quang giữa các ngày, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
2.3.2 Quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây với dung môi là ethanol 75 %
2.3.2.1 Chiết xuất và thu flavonoid toàn phần
Cây Chè dây được phơi khô, nhặt riêng phần lá và phần thân, sau đó lá Chè dây được xay thành bột thô để chuẩn bị chiết xuất Khoảng 50 g dược liệu chính xác được cho vào bình chiết, thêm 150 mL dung môi ethanol 75%, rồi trộn đều bằng đũa thủy tinh để dược liệu thấm đều dung môi và ngâm trương nở trong 30 phút Quá trình chiết siêu âm được thực hiện 3 lần ở nhiệt độ 50-55 ℃: lần 1 với 300 mL dung môi trong 60 phút, lần 2 cũng với 300 mL trong 60 phút, và lần 3 với 150 mL trong 30 phút, sau đó rút kiệt và gộp dịch chiết Dịch chiết được lọc qua bông để lấy dịch lọc, sau đó cô quay đến còn 1/5 thể tích, rồi đổ ra cốc có mỏ để kết tinh trong 24 giờ ở nhiệt độ 0-4 ℃ Cuối cùng, tủa được lọc chân không, rửa bằng nước cất, sấy khô ở 60 ℃ để thu toàn phần flavonoid.
2.3.2.2 Phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ hỗn hợp flavonoid
Hòa tan lại tủa flavonoid toàn phần vào khoảng 50 mL nước sôi để dễ dàng hòa tan Tiến hành lọc nóng qua phễu sứ có lót giấy lọc nhằm loại bỏ các tạp chất không hòa tan Thu dịch lọc vào cốc mỏ để thực hiện kết tinh trong 24 giờ ở nhiệt độ từ 0-4 ℃, giúp tinh chất kết tinh tốt hơn Sau đó, thu tủa bằng phương pháp lọc hút chân không và sấy khô ở nhiệt độ 60 ℃ để thu được tủa dihydromyricetin thô, đảm bảo độ tinh khiết thích hợp cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thẩm định phương pháp định lượng dihydromyricetin trong chất tinh khiết thu được sau khi kết tinh lại
3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống
Kết quả đo độ hấp thụ của 6 lần đo quang được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng
Kết quả khảo sát cho thấy, hệ thống đo quang của chúng tôi hoạt động ổn định, khi phần phân tích có RSD của 6 độ hấp thụ qua 6 lần đo dung dịch chuẩn đều nhỏ hơn 2,0 % Điều này chứng tỏ độ chính xác và độ lặp lại của thiết bị đạt tiêu chuẩn chất lượng cao, đảm bảo tin cậy trong các phân tích quang học.
Hình ảnh phổ UV của dung dịch chuẩn và thử:
Hình 3.1 Phổ của dung dịch chuẩn
Hình 3.2 Phổ của dung dịch thử
Phổ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tương đồng về hình dạng, đều có cực đại hấp thụ tại 292 nm, chứng tỏ hai hệ thống đo quang đạt độ đặc hiệu cao.
3.1.3 Độ tuyến tính Độ hấp thụ và phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa độ hấp thụ đo được và nồng độ dihydromyricetin chuẩn được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.3
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính mạnh mẽ giữa độ hấp thụ và nồng độ của dihydromyricetin trong phạm vi khảo sát, với hệ số tương quan r = 0,9997, đáp ứng điều kiện 0,995 ≤ r ≤ 1 Phương pháp rất chính xác và đạt tiêu chuẩn độ tuyến tính cao, đảm bảo độ tin cậy trong đo lường hàm lượng dihydromyricetin. -**Sponsor**Bạn đang tìm cách tối ưu hóa bài viết của mình theo chuẩn SEO? Hãy tập trung vào những câu then chốt thể hiện ý chính của đoạn văn một cách mạch lạc Ví dụ, từ kết quả khảo sát, cần nhấn mạnh: "Có sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ dihydromyricetin với hệ số tương quan r = 0,9997," và "Phương pháp đạt chỉ tiêu độ tuyến tính." Để hỗ trợ bạn sâu hơn trong việc này, hãy khám phá các công cụ và tài nguyên hữu ích tại [Novakid Global ARABIC](https://pollinations.ai/redirect-nexad/GluKvREq), nơi cung cấp các giải pháp học tập và phát triển kỹ năng toàn diện.
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng dihydromyricetin trong dược liệu lá Chè dây cho thấy độ chính xác cao dựa trên dữ liệu lặp lại, được trình bày trong bảng 3.3 Phương trình tuyến tính y = 47.044x + 0.0277 cùng hệ số xác định R² = 0.9995 thể hiện mối tương quan tốt giữa hàm lượng dihydromyricetin và tín hiệu phân tích Điều này xác nhận phương pháp đã được hiệu chuẩn chính xác và phù hợp để xác định lượng dihydromyricetin trong mẫu lá Chè dây.
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ của DHM
Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng
Lượng hoạt chất thêm vào từ dd thử gốc (mg)
Lượng hoạt chất thêm vào từ dd chuẩn gốc (mg)
Lượng hoạt chất tìm lại (mg)
Lượng hoạt chất tìm lại (mg)
Phương pháp khảo sát độ đúng được thực hiện tại ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với mẫu thử Kết quả phần trăm thu hồi dao động từ 98,52% đến 101,53%, nằm trong giới hạn cho phép từ 98,0% đến 102,0% Độ lệch chuẩn tương đối ở mỗi mức nồng độ đều dưới 2,0%, chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Phân tích mẫu thử, so sánh kết quả 6 lần phân tích đánh giá độ lặp lại Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng
STT Khối lượng chất thử (g) Độ hấp thụ quang Hàm lượng (%)
Giá trị RSD của hàm lượng dihydromyricetin là 0,77%, thấp hơn ngưỡng 2,0% theo hướng dẫn của AOAC, chứng tỏ phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại.
3.1.6 Độ chính xác trung gian
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng
Khối lượng chất thử (g) Độ hấp thụ (A)
Hàm lượng dihydromyricetin trung bình từ 12 lần định lượng của 2 ngày là 97,52 %
❖ Tính thích hợp của hệ thống
Bảng 3.6 Kết quả tính thích hợp hệ thống ngày 2
Bảng 3.7 Kết quả đo quang xây dựng đường chuẩn ngày 2
Phần đánh giá cho thấy giá trị RSD của hàm lượng dihydromyricetin hàng ngày đều dưới 2,0%, và tổng cộng hai ngày đều dưới 3,0%, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ lặp lại cao và đáp ứng yêu cầu về độ chính xác trung gian Phương pháp này dựa trên mô hình tuyến tính y = 48.019x + 0.028 với hệ số xác định R² = 0.9995, cho thấy độ phù hợp rất cao và độ chính xác của phương pháp đo lường.
Nồng độ DHM (mg/ml)
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ của
Kết quả chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ Chè dây 29 3.3 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập,
Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây được trình bày ở hình 3.5
Bột lá Chè dây thô (50,03g)
Chiết siêu âm Gộp dịch chiết 3 lần Lọc thu lấy dịch lọc
5 thể tích Kết tinh 24 giờ ở nhiệt độ 0-4 ℃ Lọc hút chân không thu tủa Sấy tủa ở nhiệt độ 60 ℃
Lọc nóng thu dịch lọc Kết tinh 24 giờ ở nhiệt độ 0-4 ℃ Lọc hút chân không thu tủa
Cô quay thu hồi cồn Để lạnh kết tinh 24 giờ ở nhiệt độ 0-4 ℃ Lọc hút chân không thu tủa và sấy khô tủa ở 60 ℃ Kết tinh lại 3 lần
Sấy khô, nghiền thành bột thô
Hình 3.5 Sơ đồ quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây sử dụng dung môi ethanol 75%
Dihydromyricetin sau quá trình tinh chế có dạng bột màu trắng ngà, tơi nhẹ và mịn xốp Kết quả xác định hợp chất này qua phương pháp sắc kế lớp mỏng cho thấy dihydromyricetin hiện diện trong mẫu tinh chế, phản ánh qua đặc tính ánh sáng UV32 nm.
Trước tinh chế Sau tinh chế
Hình 3.6 SKĐ định tính DHM trong bột kết tinh sau tinh chế bằng phương pháp chiết siêu âm với ethanol 75%
Vết chính trên sắc kí đồ của dung dịch thử có màu sắc và giá trị Rf giống hệt như vết chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu, xác nhận sự phù hợp giữa hai mẫu thử.
Kết quả định lượng: độ tinh khiết sau 3 lần tinh chế đạt 97,23 %
Hình 3.7 Dihydromyricetin thu được bằng phương pháp chiết siêu âm với dung môi ethanol 75 %
Nghiên cứu đã thành công trong việc chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ dược liệu lá Chè dây, đạt hiệu suất 3,88% Sản phẩm sau khi tinh chế có độ tinh khiết lên đến 97,23%, được xác định chính xác qua phương pháp quang phổ UV-VIS Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng của dihydromyricetin trong lĩnh vực dược phẩm và y học cổ truyền.
Dưới đây là sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây, sử dụng dung môi là dung dịch natri tetraborat 2,0%, được trình bày rõ ràng trong hình 3.9, giúp làm rõ các bước quan trọng để thu nhận sản phẩm đạt chất lượng cao.
Hình 3.8 Sơ đồ quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá
Chè dây sử dụng dung dịch natri tetraborat 2,0 %
Sấy khô, nghiền thành bột thô
DD HCl 5% Acid hóa dịch chiết tới pH=2-3 Để kết tủa, lọc, ly tâm, rửa tới pH trung tính
Tẩy màu, lọc nóng Để lạnh kết tinh
Cô quay thu hồi cồn Để lạnh kết tinh 24 giờ ở nhiệt độ 0-4 ℃ Lọc hút chân không thu tủa
Sấy khô tủa ở 60 ℃ Kết tinh lại 3 lần
Dihydromyricetin thu được sau tinh chế có dạng bột kết tinh màu trắng ngà, tơi nhẹ, mịn xốp
Kết quả định tính dihydromyricetin trong bột kết tinh lại sau tinh chế bằng sắc kí lớp mỏng: Ánh sáng thường UV 254 nm Ánh sáng thường UV 254 nm
Trước tinh chế Sau tinh chế lần 3
Hình 3.9 SKĐ định tính DHM trong bột kết tinh thu được bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi Na 2 B 4 O 7 2,0 %
Sau khi tinh chế lần thứ ba, vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử có màu sắc và giá trị Rf tương tự như vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu, xác nhận sự tinh khiết của mẫu.
Kết quả định lượng: độ tinh khiết sau 3 lần tinh chế đạt 96,34 %
Hình 3.10 Dihydromyricetin thu được bằng phương pháp ngâm lạnh với dung môi là dung dịch Na 2 B 4 O 7 2,0 %
Nghiên cứu đã thành công trong việc chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ dược liệu lá Chè dây với hiệu suất đạt 0,50% Sản phẩm cuối cùng có độ tinh khiết cao lên đến 96,34% được xác định thông qua phân tích quang phổ UV-VIS Đây là kết quả đáng ghi nhận, góp phần nâng cao giá trị dược liệu lá Chè dây trong ngành y dược tự nhiên.
3.3 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin
Trong quá trình khảo sát, năm yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin, gồm phương pháp chiết, nồng độ ethanol, thể tích sau cô quay để kết tinh flavonoid toàn phần, nồng độ ethanol sử dụng trong quá trình tinh chế lại và số lần kết tinh Các yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong tối ưu hóa hiệu quả thu nhận và làm sạch dihydromyricetin, giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm cuối cùng Ứng dụng các phương pháp phù hợp và điều chỉnh các thông số này sẽ cải thiện quá trình tinh chế flavonoid toàn phần, đồng thời tối ưu hóa quá trình chiết xuất dihydromyricetin từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Kết quả khảo sát các yếu tố như sau:
Tiến hành khảo sát phương pháp chiết siêu âm với dung môi ethanol 75 % và phương pháp chiết ngâm lạnh với dung môi natri tetraborat 2,0 %
Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8 So sánh kết quả của 2 phương pháp chiết DHM từ lá Chè dây
Phương pháp chiết Dung môi sử dụng
Thời gian chiết (giờ) m DHM
Phương pháp chiết siêu âm sử dụng dung môi ethanol 75% cho hiệu suất cao hơn 3,88% so với phương pháp chiết ngâm lạnh với dung môi natri tetraborat 2,0%, đạt 0,50% Phương pháp chiết siêu âm không chỉ nâng cao hiệu suất mà còn rút ngắn đáng kể thời gian chiết, phù hợp với quy mô sản xuất hoặc nghiên cứu có trang thiết bị máy móc hiện đại.
Phương pháp chiết ngâm lạnh với dung môi Na2B4O7 2,0% có ưu điểm tiết kiệm dung môi, hóa chất và ít sử dụng trang thiết bị máy móc hơn Tuy nhiên, hiệu suất chiết dihydromyricetin đạt khoảng 0,50%, thấp hơn đáng kể so với phương pháp siêu âm sử dụng ethanol 75%.
3.3.2 Nồng độ dung môi ethanol dùng để chiết suất (tt/tt)
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát nồng độ dung môi ethanol sử dụng để chiết dihydromyricetin từ lá Chè dây, với các mức nồng độ lần lượt là 0%, 75%, và 96% Các thông số thực hiện đều được cố định, bao gồm thời gian chiết xuất là 150 phút và nhiệt độ chiết xuất là 55 ℃.
Kết quả khảo sát yếu tố nồng độ ethanol trong dung môi được trình bày ở hình 3.11
Hình 3.11 Kết quả khảo sát nồng độ dịch chiết ethanol (tt/tt)
Dựa trên phân tích, khi chiết xuất bằng dung môi ethanol 75 %, hàm lượng dihydromyricetin đạt mức cao nhất (323,79 mg/g) và lượng dihydromyricetin thu được lớn nhất (3,0105 g), trong khi sử dụng nước cho kết quả thấp nhất (144,06 mg/g và 1,6977 g) Do đó, nồng độ ethanol 75 % được chọn làm dung môi tối ưu để chiết xuất dihydromyricetin hiệu quả nhất.
3.3.3 Thể tích để kết tinh flavonoid toàn phần
Tiến hành khảo sát thể tích để kết tinh flavonoid toàn phần với các giá trị lần lượt là 1
Lượng dịch chiết thu được sau ba lần chiết siêu âm đạt 5V, cho thấy hiệu quả cao trong quá trình chiết xuất Các tham số cố định gồm tiến trình chiết siêu âm thực hiện liên tiếp ba lần, mỗi lần kéo dài 1 giờ để tối ưu hóa hiệu suất chiết xuất Quá trình này giúp nâng cao khả năng trích xuất các hợp chất từ nguồn nguyên liệu một cách hiệu quả và tiết kiệm thời gian.
30 phút; nhiệt độ chiết xuất 55℃; nồng độ ethanol 75 % (tt/tt)
Kết quả khảo sát thể tích để kết tinh flavonoid toàn phần được trình bày ở hình 3.12
Hình 3.12 Kết quả khảo sát thể tích dịch chiết để kết tinh flavonoid toàn phần
Khối lượng DHM (g) Hàm lượng DHM (mg/g)
Thể tích để kết tinh m fla toàn phần (g) m DHM kết tinh được (g)
Nhận xét: khối lượng flavonoid toàn phần kết tinh lại được tăng dần từ 0 g;
2,6684 g đến 9,4731 g tương ứng khối lượng dihydromyricetin sau phân lập tăng dần từ
0 g; 0,9452 g đến 3,0105 g khi giảm thể tích dịch sau cô quay theo thứ tự lần lượt từ
5V dịch chiết ban đầu Điều này cho thấy thể tích dịch chiết sau cô đặc có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả kết tinh
Vì vậy dựa vào kết quả khảo sát 3 thể tích dịch cô quay để kết tinh, lựa chọn thể tích sau cô quay còn 1
5 thể tích dịch chiết ban đầu để thu được hiệu suất cao nhất
3.3.4 Nồng độ ethanol dùng để tinh chế dihydromyricetin
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát hiệu quả của các nồng độ ethanol khác nhau (90%, 70%, 50%) trong việc tinh chế dihydromyricetin từ dung môi ethanol sau phân lập Quá trình tinh luyện được thực hiện với các thông số cố định như thời gian kết tinh là 12 giờ, nhiệt độ kết tinh duy trì từ 0-4℃, sử dụng thể tích dung môi 100 mL và thực hiện qua 3 vòng kết tinh lại để tối ưu hóa hiệu suất tinh chế.
Kết quả khảo sát nồng độ ethanol dùng để kết tinh được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol dùng để kết tinh
DHM thô trước tinh chế (g)
Khối lượng DHM sau tinh chế lần
Khối lượng DHM sau tinh chế lần
Khối lượng DHM sau tinh chế lần
Hàm lượng DHM trước tinh chế (%)
Hàm lượng DHM sau tinh chế lần
Hàm lượng DHM sau tinh chế lần
Hàm lượng DHM sau tinh chế lần 3 (%)
Trước tinh chế Sau tinh chế lần 3
Hình 3.13 SKĐ định tính DHM sau tinh chế bằng các dung môi ethanol
Kết quả định tính cho thấy, trước tinh chế, mẫu thử có vết chính trên sắc ký đồ với Rf = 0,52 tương tự mẫu đối chiếu, nhưng còn xuất hiện vết phụ (Rf = 0,63) cho thấy còn lẫn tạp chất Sau 3 lần tinh chế, sắc ký đồ của mẫu thử chỉ còn một vết duy nhất (Rf = 0,634) cùng màu sắc và vị trí với mẫu đối chiếu, chứng tỏ tạp chất đã được loại bỏ hiệu quả.
Từ kết quả định lượng, tương ứng với các dung môi ethanol với 3 nồng độ 90 %,
Sau quá trình tinh chế, khối lượng dihydromyricetin giảm dần qua các lần lần lượt là 2,8116 g, 2,4802 g và 2,0121 g sau ba lần tinh chế 70% và 50% lượng dihydromyricetin ban đầu đều giảm dần theo từng lần tinh chế Hàm lượng dihydromyricetin thu được sau khi tinh chế bằng dung môi ethanol 90% cao hơn so với phương pháp sử dụng ethanol 70% và ethanol 50%, cho thấy hiệu quả tinh chế tốt hơn với dung môi ethanol nồng độ cao.
Từ khảo sát, lựa chọn hỗn hợp dung môi ethanol 90 % để tinh chế lại sẽ cho chất tinh khiết với hàm lượng cao nhất
Bàn luận
3.4.1 Về kết quả chiết xuất, phân lập, tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây
Trong quá trình thực nghiệm, đề tài đã chiết xuất, phân lập và tinh chế thành công dihydromyricetin từ lá Chè dây bằng hai dung môi chính là ethanol 75% và dung dịch natri tetraborat 2,0% Phương pháp chiết siêu âm sử dụng ethanol 75% được đánh giá là tối ưu nhờ hiệu suất cao hơn (3,88%), thời gian chiết ngắn (2,5 giờ) và độ tinh khiết đạt 97,23% sau lần tinh chế thứ ba Ethanol 75% là dung môi phổ biến, giá rẻ, ít độc hại, dễ kiếm và có thể thu hồi để tái sử dụng, giảm chi phí và tác động tiêu cực đến môi trường Phương pháp chiết siêu âm sử dụng sóng âm giúp phá vỡ thành tế bào, từ đó hoạt chất dễ dàng khuếch tán ra ngoài dung môi Đồng thời, duy trì nhiệt độ 50-55 ℃ giúp giảm nhớt, giảm sức căng bề mặt của dung môi, thúc đẩy thấm vào dược liệu, tăng độ tan và tốc độ khuếch tán hoạt chất, góp phần nâng cao hiệu quả và năng suất chiết.
So sánh kết quả thực nghiệm với các tài liệu công bố cho thấy quy trình chiết siêu âm sử dụng ethanol 75% là phương pháp hợp lý, đạt hàm lượng dihydromyricetin cao (97,23% sau 3 lần tinh chế) Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi dihydromyricetin còn thấp (3,88%) so với một số nghiên cứu khác (10-12%), nguyên nhân có thể do điều kiện chiết chưa tối ưu hoặc mất mát trong quá trình lọc, cô đặc và tinh chế Ngoài ra, kích thước dược liệu và tỷ lệ dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết, cần nghiên cứu điều chỉnh để nâng cao năng suất.
Có thể tiến hành tinh chế bằng quy trình kết tinh lại nhiều lần bằng nước nóng có chứa than hoạt để thu được dihydromyricetin hàm lượng cao [31]
Phương pháp chiết dihydromyricetin từ lá Chè dây sử dụng dung môi natri tetraborat 2,0% cho ra hàm lượng tinh khiết 96,34% với hiệu suất 0,50%, thấp hơn đáng kể so với phương pháp dùng ethanol 75%, nhưng lại tiết kiệm chi phí và ít yêu cầu trang thiết bị Dihydromyricetin có đặc tính ổn định trong môi trường axit pH 1,0-5,0 nhưng dễ bị oxy hóa và phân hủy trong môi trường kiềm, đặc biệt là ở pH 6,0-8,0 Phương pháp này mang lại lợi ích về mặt chọn lọc hóa học, mở ra cơ hội mở rộng nghiên cứu để phân lập các flavonoid khác Tuy nhiên, hiệu suất chiết vẫn còn thấp, cần nghiên cứu thêm các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ, pH và thời gian làm kết tinh để nâng cao hiệu quả của quy trình.
Ngoài ethanol và natri tetraborat 2,0 %, nước có thể được sử dụng làm dung môi để chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin từ lá Chè dây, mang lại phương pháp đơn giản, thân thiện với môi trường, rẻ tiền và không để lại dư lượng dung môi Tuy nhiên, hiệu suất chiết bằng dung môi nước thấp hơn nhiều so với ethanol 75%, chỉ thu được 1,6980 g so với 3,0105 g dihydromyricetin thô khi sử dụng ethanol, do nước có khả năng hòa tan kém các hoạt chất và nhiều tạp chất hơn Ngoài ra, độ hòa tan của dihydromyricetin trong nước cũng thấp hơn đáng kể so với cồn, khiến cho quá trình chiết xuất bằng nước không đạt hiệu quả mong muốn trong việc chiết xuất hoạt chất này.
Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế dihydromyricetin được đề cập trong đề tài đơn giản, sử dụng các dung môi ít độc hại, giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường Phương pháp này còn sử dụng trang thiết bị dễ thiết kế, lắp đặt và vận hành, phù hợp với nhiều quy mô sản xuất khác nhau Đặc biệt, dung môi ethanol có thể dễ dàng thu hồi để tái sử dụng trong lần sản xuất tiếp theo, góp phần tiết kiệm chi phí và đảm bảo an toàn cho môi trường.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng dihydromyricetin có khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, hạ đường huyết, chống tăng insulin và tăng cường khả năng miễn dịch Khi các bằng chứng lâm sàng về tác dụng của dihydromyricetin trở nên thuyết phục, việc phát triển dạng thuốc chứa hoạt chất tinh khiết này là hoàn toàn khả thi.
3.4.2 Về kết quả nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
3.4.2.1 Nồng độ ethanol trong dung môi
Do độ phân cực của nước và ethanol khác nhau, khi trộn lẫn, chúng tạo thành các hợp chất có mức độ phân cực khác nhau Nồng độ dung môi có độ phân cực phù hợp nhất với hợp chất cần chiết xuất sẽ giúp quá trình hòa tan diễn ra hiệu quả hơn Việc lựa chọn dung môi phù hợp dựa trên mức độ phân cực đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất các hợp chất cần thiết.
Kết quả cho thấy, trong ba hỗn hợp dung môi được khảo sát, ethanol 75% có độ phân cực phù hợp nhất với hợp chất cần chiết xuất, giúp thu được hàm lượng dihydromyricetin cao nhất Ngoài ra, phần nước trong dung môi ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tối ưu hóa hiệu quả chiết.
Dung môi ethanol 75% giúp làm trương nở tế bào dược liệu hơn 75%, từ đó hoạt chất dễ dàng khuếch tán ra khỏi tế bào Trong khi đó, nồng độ ethanol cao (96%) lại gây ra lượng nước trong dung môi làm dược liệu chưa đủ trương nở, dẫn đến hàm lượng dihydromyricetin chiết được thấp hơn Mặc dù ethanol 75% có khả năng hòa tan hoạt chất tương đối mạnh, nhưng không thuận lợi cho quá trình kết tinh do không thể thu hồi hoàn toàn cồn trong dịch chiết, khiến flavonoid toàn phần không thể kết tinh hoàn toàn Do đó, sau quá trình cô đến thể tích thích hợp và thổi hơi cồn trong tủ sấy, thu được flavonoid toàn phần kèm các tạp chất khác Trong 3 dung môi khảo sát, ethanol 75% được chọn làm dung môi chiết xuất để đạt hiệu suất tối ưu.
3.4.2.2 Thể tích sau cô quay để kết tinh flavonoid toàn phần
Việc cô quay thể tích dịch chiết đến một thể tích nhất định trước khi kết tinh flavonoid toàn phần ảnh hưởng đến khả năng hình thành kết tinh và tốc độ kết tinh Nếu dung môi còn nhiều, nồng độ flavonoid chưa đủ bão hòa để kết tủa do thể tích còn lớn Ở thể tích 1/4 V, lượng ethanol còn lại trong dung dịch cao, làm gia tăng khả năng hòa tan của flavonoid trong môi trường nước-ethanol, gây trở ngại cho quá trình kết tinh Khi thể tích giảm xuống còn 1/5, quá trình kết tinh sẽ diễn ra dễ dàng hơn do nồng độ flavonoid tiếp cận mức bão hòa, thuận lợi cho quá trình kết tinh diễn ra nhanh chóng.
V, lượng ethanol còn lại trong dịch cô quay giảm đi, kéo theo nồng độ ethanol giảm, làm tăng độ bão hòa và thúc đẩy sự hình thành tinh thể flavonoid và dihydromyricetin
Khi tăng thể tích dịch chiết sau cô quay lên 1/3 tổng thể tích ban đầu, không thấy xuất hiện flavonoid toàn phần kết tinh, cho thấy quá trình kết tinh chưa xảy ra Việc tiếp tục lưu giữ thêm 2 tuần ở nhiệt độ 0-4℃ vẫn không tạo thành kết tinh mới, điều này phản ánh lượng ethanol còn lại trong dịch chiết vẫn khá cao và dung dịch chưa đạt đến trạng thái bão hòa Do đó, flavonoid toàn phần chưa thể kết tinh lại trong điều kiện này.
Theo kết quả nghiên cứu, cô đến còn 1/5 thể tích ban đầu là điều kiện phù hợp để tạo môi trường bão hòa giúp flavonoid kết tinh lại
3.4.2.3 Nồng độ ethanol dùng để tinh chế dihydromyricetin
Khi tăng tỉ lệ nước trong quá trình tinh chế, có thể gây kết tinh cùng lúc các tạp không mong muốn do nước có khả năng hòa tan nhiều loại chất khác nhau Thêm vào đó, sau khi cô đặc, cồn được thu hồi và quá trình kết tinh diễn ra ở nhiệt độ thấp, dihydromyricetin có thể bị hao hụt do hòa tan trong dung môi, dẫn đến mất mát một phần nhỏ trong quá trình lọc.
Lựa chọn dung môi là ethanol 90 % để tinh chế dihydromyricetin với độ tinh khiết cao và ít bị hao hụt trong quá trình tinh chế
Dựa trên khảo sát về số lần tinh chế, lựa chọn thực hiện năm lần tinh chế để thu được dihydromyricetin tinh khiết trên 98%, đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu cho chất chuẩn Quá trình kết tinh lặp lại giúp loại bỏ tạp chất từng bước, đảm bảo tinh thể dihydromyricetin đạt độ tinh khiết cao, phù hợp cho các ứng dụng yêu cầu chất lượng tốt nhất.
