BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID URSOLIC TRONG DƯỢC LIỆU BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO HEDYOTIS DIFFUSA W.. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC
TỔNG QUAN
Tổng quan về Bạch hoa xà thiệt thảo
Vị trí phân loại họ Cà phê (Theo hệ thống phân loại Kew)
Giới: Plantae (Thực vật bậc cao)
Ngành: Streptophyta (Thực vật trên cạn và một số tảo lục)
Lớp: Equisetopsida (Thực vật có mạch)
Phân lớp: Magnoliidae (Bạc hà)
Bộ: Gentianales (Bộ Long đởm)
Họ: Rubiaceae (Họ Cà phê)
Bạch hoa xà thiệt thảo có tên khoa học là Hedyotis diffusa (Willd.) thuộc họ cà phê (Rubiaceae) [1]
Tên gọi khác: An điền bò, An điền lan, Bò ngòi bò, Lưỡi rắn trắng [5]
Bạch hoa xà thiệt thảo là cây thảo mọc bò, sống hàng năm, dài 20-25 cm [2] Thân màu nâu nhạt, tròn ở gốc, thân non có bốn cạnh, mang rất nhiều cành Lá hình mác thuôn, dài khoảng 1,5 cm đến 3,5 cm, rộng 1 mm đến 2 mm, nhọn ở đầu, màu xám, dai, gần như không có cuống, lá kèm khía răng cưa ở đỉnh [1]
Hoa mọc đơn độc, hoặc từng đôi ở nách lá Hoa nhỏ có 4 lá đài hình giáo nhọn, ống đài hình cầu Tràng gồm 4 cánh hoa, 4 nhị dính ở họng ống tràng Quả bé, bầu hạ, còn đài, hình cầu hơi dẹt ở 2 đầu, bên trong có chứa nhiều hạt nhỏ, có góc cạnh [1]
Mùa hoa quả từ tháng 6-9 [5]
Hình 1.1 Hình ảnh cây Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa W.)
1.1.2 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng của Bạch Hoa xà thiệt thảo
Bạch hoa xà thiệt thảo là một loại thảo mộc hàng năm, phân bố rộng rãi ở phương Đông và châu Á nhiệt đới, như Trung Quốc, Nhật Bản và Indonesia[3] Ở Việt Nam, Bạch hoa xà thiệt thảo phân bố ở các tỉnh ven biển miền Trung và trung du Bắc Bộ [2] Phân bố ở một số tỉnh ở Việt Nam như: Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Ninh Bình (Phương Mai, Khang Thượng), Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Kon Tum (Đắk Glei, Sa Thầy), Lâm Đồng (Lang Bian, Đức Trọng), Đồng Nai (Biên Hòa), Tp Hồ Chí Minh, Bà Rịa-Vũng Tàu (Côn Đảo) [5]
Bạch hoa xà thiệt thảo là cây ưa ẩm, ưa sáng thường mọc rải rác hoặc thành từng đám ở vườn, ven đường đi và nhất là ở các gò đất cao, ruộng trồng màu ở vùng trung du Hàng năm, cây con mọc từ hạt và sinh trưởng, phát triển nhanh trong mùa hè Sau khi có hoa quả, toàn cây tàn lụi vào giữa mùa thu Cần lưu ý, hạt Bạch hoa xà thiệt thảo tồn tại 5-
6 tháng qua mùa đông và gần hết mùa xuân năm sau mới nảy mầm [2]
Bộ phần dùng của cây Bạch hoa xà thiệt thảo là toàn cây, thu hái vào mùa hạ, thu, rửa sạch rồi phơi hoặc sấy khô [2]
Nhiều nghiên cứu về Bạch hoa xà thiệt thảo đã tiết lộ một số lượng lớn các hợp chất thực vật quan trọng, bao gồm iridoid, triterpen, flavonoid, anthraquinone, axit phenolic và các dẫn xuất của chúng, sterol, alkaloid, tinh dầu dễ bay hơi, polysaccharide, cyclotide, coumarin và alkaloid
Cho đến nay, 171 hợp chất đã được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo, bao gồm 32 iridoid, 26 flavonoid, 24 anthraquinone, 26 phenolic và các dẫn xuất của chúng, 50 loại tinh dầu dễ bay hơi và 13 hợp chất hỗn hợp [3]
Công thức cấu tạo của một số hợp chất được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Một số hợp chất được phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo
TT Tên hợp chất TLTK
9 Deacetyl asperulosidic acid methyl ester [3], [8]
Acid phenolic và dẫn chất của chúng
Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ Bạch hoa xà thiệt thảo 1.1.4 Tác dụng dược lý
Nhiều kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý của Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy dược liệu này có nhiều tác dụng đáng chú ý như: chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch và một số tác dụng khác
1.1.4.1 Tác dụng chống ung thư
Bạch hoa xà thiệt thảo đã được sử dụng để điều trị các khối u ác tính và nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dịch chiết từ Bạch hoa xà thiệt thảo có tác dụng chống khối u rõ ràng
Chiết xuất ethanol của dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo gây ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư trực tràng HT-29 và gây ra chứng apoptosis thông qua việc vô hiệu hóa con đường truyền tín hiệu interleukin-6 Nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết ethanol của dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo làm giảm khả năng sống và tăng sinh của các tế bào HT-29 khi không có sự kích thích của IL-6 Ở những tế bào kích thích IL-6 làm tăng đáng kể khả năng sống của các tế bào HT-29 lên 162,17% so với các tế bào đối chứng (P 0,998) Các giá trị độ chệch (%) so với điểm chuẩn đều trong khoảng giới hạn cho phép là ± 15%
Hình 3.7 Đường chuẩn acid ursolic
Bảng 3.6 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic Dung dịch chuẩn Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic
Phân tích độc lập 6 mẫu thử của mẫu dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo quy trình xử lý mẫu như trên vào 2 ngày phân tích khác nhau theo quy trình phân tích đã xây dựng Tiến hành sắc ký Kết quả thu được ở bảng 3.7: y = 3711.5x - 40126 R² = 0.9999
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp
Nhận xét: Kết quả độ lặp lại cho thấy hàm lượng trung bình của acid ursolic là 0,287% với RSD = 0,5% và độ chính xác trung gian cho kết quả hàm lượng trung bình của acid ursolic trong mẫu thử dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo là 0,289% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,9% Độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp đã đạt theo hướng dẫn của AOAC
Xác định trên các mẫu thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ, mỗi mức nồng độ ít nhất 3 mẫu độc lập Kết quả được trình bày như bảng 3.8:
Bảng 3.8 Kết quả độ đúng của phương pháp
Lượng thêm vào theo lý thuyết (mg)
Lượng thêm vào theo thực tế (mg)
Tổng Lượng xác định được (mg)
Nhận xét: Độ thu hồi của phương pháp phân tích nằm trong khoảng từ 99,9% đến
101,7% Độ thu hồi của phương pháp đạt theo yêu cầu của AOAC Vì vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng
3.2.7 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng acid ursolic trong bạch hoa xà thiệt thảo trên thị trường Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng acid ursolic trong một số mẫu Bạch hoa xà thiệt thảo được thu thập tại được, mỗi mẫu thử tiến hành phân tích lặp lại 3 lần độc lập Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.9:
Bảng 3.9 Kết quả xác định hàm lượng acid ursolic trên các mẫu thu được
ST T Kí hiệu mẫu Nơi thu hái
Thời điểm thu hái Độ ẩm (%)
Hàm lượng (%kl/kl, tính theo dược liệu khô kiệt) (TB ± SD, n = 3)
BÀN LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng thành công phương pháp định lượng acid ursolic trong dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp được tối ưu về điều kiện tách và phát hiện, đảm bảo các tiêu chí về độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng, độ lặp lại theo hướng dẫn của AOAC
3.3.1 Về quy trình phân tích
- Lựa chọn phương pháp phân tích
Acid ursolic là một triterpenoid có hoạt tính sinh học đa dạng, hiện diện trong nhiều loại dược liệu, trong đó có Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) Tuy nhiên, do đặc tính ít tan trong nước, có cấu trúc tương đối bền vững và không có nhóm chức dễ phản ứng, việc định lượng acid ursolic đòi hỏi kỹ thuật phân tích có độ nhạy và độ chọn lọc cao
Vì vậy, lựa chọn phương pháp HPLC với detector DAD làm phương pháp phân tích
Hệ thống HPLC-UV của hãng Shimadzu
Cột: C18, hóng Agilent (250 x 4,6 mm; 5 àm)
Pha động: MeOH (A) – CH3COONH4 10 mM trong nước (B) (83 – 17, v/v)
Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Về quy trình xử lí mẫu: Để định lượng được acid ursolic cần phải chiết được hoàn toàn chất này và loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu, đồng thời quy trình xử lý mẫu phải đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, lựa chọn dung môi chiết là methanol vì đảm bảo khả năng chiết tốt nhóm triterpennoid, ít độc hại và phổ biến ở các phòng thí nghiệm
Kỹ thuật chiết siêu âm giúp tăng khả năng khuếch tán của dung môi vào mô thực vật, từ đó tăng hiệu suất chiết Ngoài ra, kĩ thuật chiết này đơn giản, tiết kiệm dung môi, tránh phân hủy acid ursolic ở nhiệt độ cao
Ngoài ra, thời gian chiết và tỉ lệ dung môi – dược liệu cũng là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Với mục tiêu thu được hiệu suất chiết tối ưu nhưng vẫn đảm bảo tối ưu thời gian chuẩn bị mẫu và tiết kiệm dung môi Do đó, đã lựa chọn thời gian chiết 30 phút và tỉ lệ dung môi dược liệu là 50:1 cho quy trình xử lí mẫu
3.3.2 Về thẩm định quy trình phân tích
Sau khi đã xây dựng được quy trình định lượng acid ursolic trong bạch hoa xà thiệt thảo, tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp phân tích đạt yêu cầu về:
- Tính thích hợp hệ thống
- Giới hạn phỏt hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 5,305 àg/ml và 15,915 àg/ml
- Khoảng tuyến tớnh trong khoảng từ 16,48 → 1055,00 (àg/ml) với hệ số tương quan 0,9999>0,998 với độ chệch < 15% ở tất cả các điểm
- Độ lặp lại (lặp lại 6 mẫu thử) và độ chính xác trung gian (lặp lại 12 mẫu thử), cho kết quả hàm lượng trung bình của acid ursolic trong mẫu thử là 0,289% với (RSD, n = 12) là 0,9%
- Độ đúng có tỷ lệ thu hồi trong khoảng từ 99,9 đến 101,7%
3.3.3 Ứng dụng trong phân tích dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo
Chuyên luận Bạch hoa xà thiệt thảo trong Dược điển Việt Nam V chưa có chỉ tiêu định lượng chất đánh dấu “maker” cho dược liệu này Do vậy, nghiên cứu này nhằm mục tiêu hướng tới kiểm soát chất lượng cho dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo
Nghiên cứu đã tiến hành định lượng acid ursolic trong 5 mẫu dược liệu Bạch hoa xà thiệt thảo thu hái ở các vùng khác nhau ở Việt Nam Kết quả hàm lượng acid ursolic dao động từ 0,286 đến 0,331% Sự khác biệt hàm lượng hoạt chất này không quá lớn có thể do vùng thổ nhưỡng, địa lý và thời gian thu hái dược liệu khác nhau Bên cạnh đó, số lượng mẫu nghiên cứu trong đề tài này còn giới hạn nên chưa thể đánh giá đầy đủ hàm lượng acid ursolic trong mẫu Bạch hoa xà thiệt thảo tại Việt Nam, cần tiến hành phân tích trên số lượng mẫu lớn hơn và trên nhiều vùng khác nhau.
