Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus Epstein Barr ở Việt Nam và quy trình sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán

NỘI DUNG PHẦN 1 : BÁO CÁO TỔNG HỢP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS EPSTEIN

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/06-10

(MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC 10.31/06-10)

8658

NỘI DUNG

PHẦN 1 : BÁO CÁO TỔNG HỢP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ

VIRUS EPSTEIN-BARR Ở VIỆT NAM CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN VẬT LIỆU CHO KIT

MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ CHƯƠNG 6: KẾT QUẢ TẠO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ VÀ

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG KIT CHƯƠNG 7: BÀN LUẬN VỀ ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA

2 BỘ KIT PHỤ LỤC

PHẦN 2: CÁC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

1 BÁO CÁO ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM

2 QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

3 QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

4 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

5 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ

6 QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ

7 QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ

8 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ

9 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ

PHẦN 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 DỊCH TỄ HỌC CỦA UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EBV 4

1.1.1 TẦN SỐ MẮC UTVMH VÀ YẾU TỐ ĐỊA LÝ CỦA EBV 4

1.1.2 VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG 4

1.1.3 SỰ NHÂN LÊN VÀ TÀNG NHIỄM GÂY UNG THƯ CỦA EBV 6

1.2 CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA EPSTEIN-BARR VIRUS 8

1.2.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA EBV 8

1.2.2 SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SẮP XẾP HỆ GEN CỦA EBV 9 1.3 CHẨN ĐOÁN EBV BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 15

1.3.1 KỸ THUẬT PCR 15

1.3.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI 18

1.3.3 KỸ THUẬT TÁCH DÒNG 19

1.3.4 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 21

1.4 NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC ASSAY, ICA) VÀ QUI TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT ICT (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC TEST) 21

1.4.1 TẦM QUAN TRỌNG CỦA ICA TRONG CHẨN ĐOÁN 21

1.4.2 NGUYÊN LÝ CHẨN ĐOÁN KIT ICA 24

1.4.3 THÀNH PHẦN TẠO KIT ICT 25

1.5 NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR VÀ QUI TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ( SHPT) 28

1.5.1 NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 28

1.5.2 NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ KIT SHPT 28

1.5.3 NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG VÀ SẢN XUẤT BỘ KIT SHPT 29

1.6 TẦM QUAN TRỌNG CỦA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV Ở VIỆT NAM VÀ QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN 29

1.6.1 Chẩn đoán sớm UTVMH có thể phối hợp giữa lâm sàng và xét nghiệm 30

1.6.2 Đề nghị có sự hợp tác chặt chẽ của nhiều chuyên ngành 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 34

2.1 NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ 34

2.1.1 ĐỐI TƯỢNG THU MẪU BỆNH PHẨM NGHIÊN CỨU 34

2.1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ BẢO QUẢN MẪU UTVMH 34

2.1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 34

2.1.4 PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI KIỂM TRA DNA TỔNG SỐ 34

2.1.5 PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ THU NHẬN GEN EBNA-1 35

2.1.6 PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ THU NHẬN GEN LMP-1 36

2.1.7 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 37

2.1.8 PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG THU NHẬN TOÀN BỘ SẢN PHẨM GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 38

2.1.9 PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA -1 VÀ LMP-1 39

2.1.10 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VỊ TRÍ ACID AMIN 487 CỦA GEN EBNA-1 ĐỂ XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV 41

2.1.11 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN EBNA-1, LMP-1 VÀ SO SÁNH ĐỐI CHIẾU VỚI CÁC CHỦNG EBV TRÊN THẾ GIỚI 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42

2.2.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42

2.2.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42

2.2.3 PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ, TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 CHO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 43

2.2.4 PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU TRÌNH NHIỆT CHO PCR CỦA KHUÔN DƯƠNG TÍNH ĐỂ SẢN XUẤT KHUÔN ĐỐI CHỨNG DƯƠNG TÍNH 46

2.2.5 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM, KIỂM TRA BỘ KIT SHPT ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT SHPT 47

2.2.6 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 49

2.2.7 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SỬ DỤNG KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 50

2.2.8 PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIT SHPT 50

2.3.2 PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN

KHÁNG NGUYÊN EBNA-1 (THIẾT KẾ MỒI, PCR, NHÂN

DÒNG, KIỂM TRA VÀ THU NHẬN PROTEIN EBNA-1) 51

2.3.3 PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN, TINH SẠCH PROTEIN EBNA-1 53

2.3.4 PHƯƠNG PHÁP TẠO TẾ BÀO LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT HÓA KHÁNG NGUYÊN EBNA-1) 55

2.3.5 PHƯƠNG PHÁP NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN PHÁT TRIỂN TẾ BÀO LAI EBNA-1 (để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và kháng thể đơn dòng MAb EBNA-1) 58

2.3.6 PHƯƠNG PHÁP TẠO BÁNG CHO CHUỘT BẰNG TẾ BÀO HYBRID, THU DỊCH, TINH SẠCH KHÁNG THỂ 60

2.3.7 PHƯƠNG PHÁP GẮN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 VÀO HẠT NANO VÀNG 62

2.3.8 PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ HOÀN CHỈNH BỘ SINH PHẨM SẮC KÝ MIỄN DỊCH ICT 63

2.3.9 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA BỘ KIT SĂC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) 67

2.3.10 TRÊN CƠ SỞ PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH (ICT), ĐÃ ĐƯỢC THỬ NGHIỆM THÀNH CÔNG, LÀ CƠ SỞ KHOA HỌC ĐỂ XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, SỬ DỤNG, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH CHẨN ĐOÁN EBV 68

2.4 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 70

2.4.1 DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ MÁY MÓC 70

2.4.2 HÓA CHẤT 71

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 73

2.5.1 QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ MÔ BỆNH HỌC 73

2.5.2 QUI TRÌNH LẤY MẪU BỆNH PHẨM SINH THIẾT CHẨN ĐOÁN GEN EBV 73

2.6 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊM CỨU 74

2.6.1 THU MÃU BỆNH PHẨM 74

2.6.2 NGHIÊN CỨU LABO 74

2.7 XỬ LÝ SỐ LIỆU 74

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS EPSTEIN BARR Ở VIỆT NAM 76

3.1 KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 76

3.2 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT THU DNA TỔNG SỐ HỆ GEN EBV TỪ CÁC

MẪU BỆNH PHẨM 76

3.3 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 76

3.3.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 76

3.3.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 78

3.3.3 KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN SỰ CÓ MẶT EBV TRONG 50 MẪU BỆNH PHẨM SINH THIẾT BẰNG PCR ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 (EBK1F và EBNA1R) 79

3.4 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ THU NHẬN GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 80

3.5 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 81

3.5.1 THU NHẬN TOÀN BỘ GEN EBNA-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA-1 81

3.5.2 THU NHẬN TOÀN BỘ GEN LMP-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN LMP-1 82

3.5.3 BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN 82

3.6 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN ĐỂ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PHÂN TỬ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM 84

3.6.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN EBNA-1 84

3.6.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN LMP-1 87

3.6.3 KẾT LUẬN 92

3.7 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM 92

3.7.1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI CHIẾU GEN EBNA-1 VỚI THẾ GIỚI 92

3.7.2 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI CHIẾU GEN LMP-1 VỚI THẾ GIỚI 96

3.7.3 XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV Ở VỊ TRÍ ACID AMIN 487 GEN EBNA-1 102

3.7.4 BÀN LUẬN 104

3.7.5 KẾT LUẬN 107

CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108

4.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108

4.1.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108

4.1.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SHPT 108 4.2 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU NHÂN GEN

4.2.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA VỚI CẶP MỒI

ĐẶC HIỆU NHÂN ĐOẠN GEN EBNA-1 111 4.2.3 BÀN LUẬN 111 4.3 KẾT QUẢ ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT PHÙ HỢP CHO PHẢN

ỨNG PCR 112 4.3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT

CHO PCR 112 4.3.2 KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR VỚI CÁC THÔNG SỐ ĐÃ

ĐIỀU CHỈNH 113 4.3.3 KẾT QUẢ TỐI ƯU HOÁ NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU TRÌNH

NHIỆT 115 4.3.4 KẾT LUẬN 117 4.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHẢN ỨNG PCR

ĐỂ XÂY DỰNG CÁC QUI TRÌNH BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 117 4.4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA PHA

LOÃNG NỒNG ĐỘ DNA TỔNG SỐ CỦA MẪU THỬ 117 4.4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA KHẢO SÁT PCR VỚI

CẶP MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 118 4.4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ

NGHIỆM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÀ UNG THƯ VMH VÀ

KHÔNG UNG THƯ 119 4.5 KẾT QUẢ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ XÂY

DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ, QUI TRÌNH SỬ

DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN EBV 128 4.5.1 NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SHPT 128 4.5.2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 129

CHƯƠNG 5 : KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN LIỆU CHO KIT MIỄN DỊCH

HỌC SẮC KÝ (ICT) 135

5.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH

HỌC SẮC KÝ (ICT) 135 5.1.1 XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC

KÝ(ICT) 135 5.1.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC

KÝ(ICT) 135 5.2 KẾT QUẢ SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP EBNA-1 136 5.2.1 KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN EBNA-1 136 5.2.2 KẾT QUẢ XỬ LÝ GEN EBNA-1, VECTOR pET22b(+) VỚI

ENZYME GIỚI HẠN XhoI, EcoRI VÀ NỐI GHÉP VỚI NHAU 137 5.2.3 KẾT QUẢ BIẾN NẠP VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO E coli TG1 137

5.2.4 KẾT QUẢ CHỌN DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP MANG GEN EBNA-1 138

5.2.5 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, THU PROTEIN EBNA-1 TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM NGHIỆM ĐẶC TÍNH SINH HỌC 139

5.2.6 TINH SẠCH PROTEIN EBNA-1 TRÊN CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC 146

5.2.7 KẾT LUẬN 147

5.3 KẾT QUẢ TẠO TỔ HỢP LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT HOÁ KHÁNG NGUYÊN EBNA-1) VÀ CHỌN LỌC, NUÔI CẤY, KIỂM NGHIỆM DÒNG TẾ BÀO LAI 147

5.3.1 KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH CHO CHUỘT THUẦN CHUẨN DÒNG BALB/C BẰNG PROTEIN EBNA1 147

5.3.2 KẾT QUẢ TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU EBNA-1 148

5.4 KẾT QUẢ NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN, KIỂM TRA, PHÁT TRIỂN TẾ BÀO LAI EBNA-1 (ĐỂ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG MAB EBNA-1) 155

5.4.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA DỊCH NỔI CỦA 5 DÒNG TẾ BÀO 155

5.4.2 KẾT QUẢ NHÂN NUÔI LƯU GIỮ DÒNG TẾ BÀO LAI EBNA-1-1 157

5.5 KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 TRÊN CHUỘT BALB/C EBNA-160

5.5.1 KẾT QUẢ GÂY BÁNG CHO CHUỘT 160

5.5.2 KẾT QUẢ TINH SẠCH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 161

5.5.3 KẾT LUẬN 162

5.6 KẾT QUẢ TẠO PHỨC HỆ KHÁNG THỂ - HẠT NANO VÀNG 162

CHƯƠNG 6 : KẾT QUẢ TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG KIT 165

6.1 KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ LẮP BỘ KIT 165

6.1.1 KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU SINH HỌC 165

6.1.2 KẾT QUẢ CHUẨN BỊ VẬT LIỆU CƠ HỌC 166

6.1.3 KẾT QUẢ CHUẨN BỊ THÀNH PHẦN PHỤ TRỢ CỦA KIT ICT 168

6.2 BAO GÓI BỘ KIT ICA (EBV-Ag/Fast KIT) 170

6.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT MIỄN DỊCH HỌC ( ICT ) 171

6.3.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ KIT VỚI 3 LOẠI MẪU THỬ: MÔ UTVMH, MẪU TẾ BÀO BONG Ở THÀNH SAU HỌNG, MẪU MÁU NGƯỜI BÌNH THƯỜNG 171 6.3.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU KIT ICT (EBV-Ag/FastKIT®)

6.4 KẾT QUẢ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SẮC Kí MIỄN DỊCH ICT VÀ XÂY

DỰNG TIấU CHUẨN CƠ SỞ 175

CHƯƠNG 7 : BÀN LUẬN VỀ ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA 2 BỘ KIT EBV-PCRKIT (SHPT) VÀ EBV-Ag/FastKIT (ICA) 177

7.1 ĐỘ NHẠY 177

7.2 ĐỘ ĐẶC HIỆU 180

7.3 BÀN LUẬN 182

KẾT LUẬN, ĐÁNH GIÁ CHUNG VÀ ĐỀ NGHỊ 186 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1 Phương pháp nghiên cứu

2 Kết quả nghiên cứu và danh sách bệnh nhân nghiên cứu

3 Mẫu bệnh án nghiên cứu

4 Một số bộ kit lưu hành trên thế giới

5 Phiếu kiểm định sinh học

6 Xét duyệt quyết toán ngân sách

CHỮ VIẾT TẮT

BARF Bam HIA reading frames Protein xuất tiết gây nhiễm trùng

muộn trên đoạn gen Bam HIA

CTAR C-terminal activating region Vùng hoạt động của đầu tận C

của gen LMP1

EBER EB encoded latent infection

membran protein regulator RNA

RNA của EBV điều chỉnh protein màng gây nhiễm trùng tiềm tàng

EBNA Epstein Barr virus nuclear

antigen

Kháng nguyên nhân EBV

virus

Virus gây bệnh AIDS

nhiễm trùng

KBMKSH Ung thư biểu mô không sừng hóa

muộn

MAPK Mitogen activated protein

kinase

Protein hoạt hóa hoạt động phân bào

NF-kB Nuclear factor kappa in mature

B

Yếu tố nhân của chuỗi kappa kích hoạt tế bào B

Khối u, hạch, di căn xa, giai đoạn

UCNT Undifferentiated carcinoma

nasopharyngeal type

Ung thư biểu mô không biệt hóa vòm mũi họng

VADS Voie aero-digestif superieure Đường tiêu hóa và hô hấp trên

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV

trong cơ thể bị nhiễm 7

Hinh 1.2 Sơ đồ cấu trúc phân tử của Herpesvirus 8

Hình 1.3 Cấu trúc hệ gen EBV 10

Hình 1.4 Thời điểm nhiễm EBV và thời gian biểu hiện gen có kháng nguyên kích thích kháng thể trong cơ thể .23

Hình 1.5 Nguyên lý của kit ICT 24

Hình 1.6 Các thành phần vật liệu cơ học và thành phần vật liệu sinh học cấu tạo nên bộ sinh phẩm ICA và các yêu cầu kết quả đánh giá 26

Hình 1.7 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen EBNA-1 29

Hình 2.1 Thành phần vật liệu và lắp giáp hoàn chỉnh bộ kit ICT 69

Hình 2.2 Thành phần nguyên liệu sinh học của kit ICT 71

Hình 2.3 Các bộ phận của bộ kit ProPur Ni-IMAC spin column Kit .72

Hình 2.4 Bộ khung của kit ICT 72

Hình 2.5 Máy tia kháng thể 73

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu UTVMH 76

Hình 3.2 Sơ đồ mồi bám trên trình tự EBNA-1 77

Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn 77

Hình 3.4 Sơ đồ mồiLMP1F và LMP1R bám trên trình tự LMP-1 78

Hình 3.5 Đoạn DNA gen LMP-1 kích thước khoảng 1,3 kb 79

Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 79

Hình 3.7 Ảnh minh hoạ các đĩa thạch nuôi cấy vi khuẩn sau chuyển nạp 80

Hình 3.8 Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp gen EBNA-1 .80

Hình 3.9 Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp gen LMP-1 81

Hình 3.10 Trình bày kết quả truy cập Ngân hàng gen 81

Hình 3.11 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen LMP-1 82

Hình 3.12 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen LMP-1 82

Hình 3.13 Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid gen EBNA-1 .86

Hình 3.15 Trình bày cấu trúc khung gen LMP-1 .91 Hình 3.16 So sánh đối chiếu trình tự nucleotide của gen EBNA-1 93 Hình 3.17 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng EBV Việt

Nam và thế giới .96 Hình 3.18 Minh họa so sánh chuỗi gen LMP-1 97

các chủng EBV của Việt Nam và thế giới 101

Hình 3.20 So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 27 chủng 103

Hình 4.1 Polypeptide của EBNA-1 .109 Hình 4.2 So sánh chuỗi gen EBNA-1 .110 Hình 4.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1 111 Hình 4.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận đoạn gen EBNA-1

chưa bổ sung DMSO .114 Hình 4.5 Điện di kiểm tra phản ứng PCR bổ sung thành phần

phù hợp điều chỉnh thông số .115 Hình 4.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR thực hiện tối ưu hóa

nhiệt độ bám mồi 116 Hình 4.7 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-1 từ khuôn

là DNA tổng số pha loãng theo hệ số 2 .118 Hình 4.8 Kiểm tra độ đặc hiệu băng PCR với mồi đực hiệu gen LMP-1 119 Hình 4.9 Vị trí bám mồi của EBK1F – EBVR trong chuỗi gen EBNA-

1 của phản ứng PCR bán lồng phát hiện EBNA-1 của bộ kit

SHPT 120 Hình 4.10 Hình ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu đại diện 121 Hình 4.11 Thử nghiệm KIT SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR) 123 Hình 4.12 Thử nghiệm kit SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR) 123 Hình 4.13 Thử nghiệm kit SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR)

Hình 4.14 Thử nghiệm KIT SHPT (Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

thực hiện tối ưu hóa nhiệt độ bám mồi) 124 Hình 4.15 Thử nghiệm KIT SHPT: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

thu nhận gen LMP-1 125 Hình 4.16 Tiêu chuẩn cơ sở, thành phần và qui trình sử dụng

và bảo quản bộ kit sinh học phân tử 131

Hình 4.17 Ảnh trình bày bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV 132 Hình 4.18 Sử dụng kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV các mẫu thu

nhận từ bệnh nhân nhập viện tại các bệnh viện trong cả nước 132 Hình 4.19 Mô tả bộ kit sinh học phân tử phát hiện EBNA-1

từ các mẫu lâm sàng 134 Hình 5.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen EBNA-1 136 Hình 5.2 Kết quả biến nạp sản phẩm nối ghép giữa vector pET22b(+)

với gen EBNA-1 vào E coli chủng TG1 138

Hình 5.3 Kết quả kiểm tra DNA plasmid chọn dòng cùng

với DNA plasmid pET22b(+) .138 Hình 5.4 Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp của 5 khuẩn

lạc sau khi xử lý với hai enzyme giới hạn EcoRI và XhoI 139 Hình 5.5 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli BL21,

tất cả đều cho khuẩn lạc thuần nhất .140 Hình 5.6 Điện di kiểm tra kết quả biểu hiện của gen EBNA-1

trong E coli 141

Hình 5.7 Lượng protein tái tổ hợp kháng EBNA-1 được tổng hợp

theo thời gian 142 Hình 5.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng

biểu hiện của EBNA-1 143 Hình 5.9 Ảnh hưởng của OD đến sự biểu hiện của gen EBNA-1 .144 Hình 5.10 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng

biểu hiện EBNA-1 145 Hình 5.11 Ảnh hưởng của IPTG đến khả năng biểu hiện của EBNA-1 Hình 5.12 Điện di protein kháng nguyên EBNA-1 trên gel

polyacrylamid .146 Hình 5.13 (A) Tế bào Sp2/0 trước khi dung hợp; (B) Tế bào P3X

trước khi dung hợp, độ phóng đại 10×20 148 Hình 5.14 Tế bào lai giữa tế bào lympho B với tế bào myeloma Sp2/0

trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20 150 Hình 5.15 Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển,

độ phóng đại 10×20 và 10×10 .151

EBNA-1 với các kháng nguyên khác nhau

bằng phương pháp ELISA .155

Hình 5.17 Kiểm tra khả năng phát triển của tế bào sau khi đánh thức 159

Hình 5.18 Gây báng cho chuột bằng cách tiêm tế bào lai chứa liên hợp kháng thể đơn dòng EBNA-1 (dòng lai EBNA-1-1) .160

Hình 5.19 Kết quả tạo phức hệ kháng thể-hạt nano vàng (KT-Au) và xác định phức hệ kháng thể - hạt nano vàng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần .163

Hình 5.20 Kết quả xác định phổ hấp thụ của các phức hệ kháng thể - hạt vàng 163

Hình 5.21 Biểu đồ kết quả xác định phổ hấp thụ của các phức hệ kháng thể-hạt vàng ở bước sóng 540 nm .163

Hình 5.22 Sơ đồ phổ hấp thụ của phức hệ kháng thể-Au 164

Hình 6.1 Thành phần nguyên liệu sinh học (của kit ICT) .165

Hình 6.2 Máy tia kháng thể lên tấm màng nitrocellulose của hãng Arista Biologicals đang thực hiện tia kháng thể đơn dòng anti-EBNA1 và goat anti-mouse IgG do chúng tôi phối hợp thực hiện 167

Hình 6.3 Máy tia kháng thể đang hoạt động 167

Hình 6.4 Bộ khung của kit ICT .167

Hình 6.5 Các thành phần của bộ kit EBV-Ag/FastKIT 169

Hình 6.6 Nhãn mác của bộ kit EBV-Ag/FastKIT .169

Hình 6.7 Hình dáng bao gói của bộ kit EBV-Ag/FastKIT .170

Hình 6.8 Bố trí đánh giá kiểm tra chất lượng tấm thử của kit EBV-Ag/FastKIT 171

Hình 7.1 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen EBNA-1 từ khuôn là DNA tổng số pha loãng theo hệ số 2 178

Hình 7.2 Kiểm tra độ đặc hiệu bằng PCR với mồi đặc hiệu gen LMP-1 181

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần thực hiện phản ứng PCR 35

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng 36

Bảng 2.3 Thành phần thực hiện phản ứng PCR 37

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng 37

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối 38

Bảng 2.6.Thành phần cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI 39

Bảng 2.7 Phản ứng giải trình tự 40

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng giải trình tự 40

Bảng 2.9 Thành phần thực hiện phản ứng PCR 44

Bảng 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng 44

Bảng 2.11 Thành phần thực hiện phản ứng PCR được điều chỉnh lại 45

Bảng 2.12 Chu trình nhiệt của phản ứng 45

Bảng 2.13 Thành phần thực hiện phản ứng PCR của chứng dươngtính 46

Bảng 2.14 Chu trình nhiệt của phản ứngPCR của chứng dương tính 46

Bảng 2.15 Thành phần của phản ứng được phối hợp theo đúng chỉ dẫn 48

Bảng 2.16 Thành phần dung môi 65

Bảng 3.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen EBNA-1 của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (763 bp) 85

Bảng 3.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen LMP-1 của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (1238 bp) 87

Bảng 3.3 Đặc điểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV Việt Nam và thế giới 88

Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide và amino acid 95

Bảng 3.5 Đặc điểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV Việt Nam và thế giới 98

Bảng 3.6 Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân tích acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1 103

Bảng 4.1 Thành phần thực hiện phản ứng PCR 115

Bảng 4.2 Chu trình nhiệt của phản ứng bố trí thử nghiệm so sánh 116

Bảng 4.3 Thành phần phản ứng 120

Bảng 5.1 Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột 147 Bảng 5.2 Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung

hợp 149 Bảng 5.3 Kết quả xác định các giếng có mặt kháng thể kháng EBNA-1 150 Bảng 5.4 Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 152 Bảng 5.5 Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương

tính .153 Bảng 5.6 Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào 156 Bảng 5.7 Ảnh hưởng của nồng độ FBS đến kết quả nuôi cấy tế bào lai

sinh kháng thể đơn dòng EBNA-1-1 157 Bảng 5.8 Tỉ lệ sống và sinh trưởng của tế bào EBNSA-1-1 sau các lần

cấy chuyển 158 Bảng 5.9 Khả năng sống sót của tế bào sau khi đánh thức 159 Bảng 5.10 Lượng dịch báng thu từ 7 chuột sản xuất kháng thể đơn

dòng 160 Bảng 6.1 Thành phần Dung môi .168 Bảng 6.2 So sánh độ nhạy kit SHPT (PCR) với kit miễn dịch học (ICA).179 Bảng 6.3 So sánh độ nhạy của 2 bộ kit và với cả số mẫu khác nhau của

PCR 179 Bảng 6.4 So sánh độ đặc hiệu của 2 bộ kit PCR và ICA 179

Bảng 6.5 So sánh độ nhạy của kit SHPT .180 Bảng 7.1 Kiểm định dộ nhạy của EBV-PCRKIT với kit Nam khoa

(Việt Nam) 177 Bảng 7.2 So sánh độ nhạy của kit SHPT (phát hiện kháng nguyên)

với một số nghiên cứu (phát hiện kháng thể trong máu) 179 Bàng 7.3 So sánh độ nhạy của 2 bộ kít và với cả số mẫu

khác nhau của PCR 179 Bảng 7.4 So sánh độ nhạy kit SHPT (PCR) với kit miễn dịch học (ICA).180 Bảng 7.5 Kết quả kiểm định độ đặc hiệu chạy PCR trên 30 mẫu DNA-

HBV (tách từ huyết tương bệnh nhân viêm gan B) cho PCR KIT và so sánh đối chiếu với Kit Nam khoa 180

EBV-Bảng 7.6 So sánh độ đặc hiệu của 2 bộ kit PCR và ICA 181

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vòm mũi họng (nasopharyngeal carcinoma-NPC) là khối u ác tính xuất phát từ biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng Loại ung thư này được xếp vào các khối u biểu mô của đường tiêu hoá và hô hấp trên Đây là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp nhất trong các ung thư vùng tai mũi họng, đầu cổ Trên thế giới, ung thư vòm cũng gặp nhiều ở các nước vùng Đông nam Á và nhiều hơn cả là ở phía nam Trung Quốc [15],[16],[42],[43],[44],[62],[69],[71]

Về nguyên nhân của bệnh, có ba nhóm chủ yếu đó là do virus Epstein-Barr, do di truyền và do các yếu tố môi trường, tập quán ăn uống, hoá chất Kể từ năm 1964 tìm ra virus Epstein-Barr (EBV) tới nay , đã có rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước cũng như quốc

tế về mối liên quan giữa EBV và ung thư vòm mũi họng (UTVMH) Các nghiên cứu này đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus , kháng thể , ở trong các giai đoạn của bệnh, và vai trò quan trọng của virus Epstein-Barr trong bệnh sinh cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán, điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh Qua nghiên cứu của các tác giả trong

và ngoài nước, đã phát hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ gen hoàn chỉnh của EBV trong các mô sinh thiết ung thư vòm mũi họng thuộc các type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN)… Các chủng virus này có phân bố khác nhau theo các bệnh lý và vùng địa lý trên thế giới Chúng có đặc tính gây bệnh khác nhau là IM,UTVMH, BL.[2,46,51,64,88,82,89,94] Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định được chủng EBV giống chủng của châu Âu B95-8 , chủng QD1 (Nam Trung Quốc) [9],[10],[12],[13],[14],[17],[18],[95]

Từ những năm 1997, nhóm nghiên cứu của chúng tôi thuộc Bộ môn

Phòng Miễn dịch (Viện Công nghệ sinh học – GS.TSKH Đái Duy Ban, TS Phạm Công Hoạt, PGS.TS Lê Thanh Hòa ) đã phối hợp nghiên cứu về lâm sàng và EBV (Nguyễn Đình Phúc, 2006) Từ đó cũng cho thấy sự liên quan chặt chẽ giữa EBV và NPC, tỷ lệ mắc cao, chẩn đoán lâm sàng, điều trị muộn, tiên lượng xấu của bệnh UTVMH [6],[8],[25],[27],[29],[30],[36],[40]

Tuy nhiên những nghiên cứu sâu sắc về sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của EBV tại Việt Nam, cũng như những hướng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán còn rất ít, ngoài một số công trình của Do et al (2008) [1],[3],[4],[6],[7],[11],[24],[52 ]

Xuất phát từ nhũng luận cứ khoa học và những yêu cầu cấp thiết về nghiên cứu EBV trên đây chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài cấp nhà nước:

“Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus Epstein-Barr ở Việt nam và xây dựng qui trình sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán” mã số KC.10.31/ 06-10, với 2 mục tiêu sau đây :

1 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử EBV ở Việt nam

2 Xây dựng qui trình sản xuất, qui trình sử dụng, tiêu chuẩn cơ sở

bộ kit Sinh học phân tử và kit sắc ký miễn dịch học (ICA) đẻ chẩn đoán EBV

Đề tài có 5 Nội dung sau đây:

Nội dung 1: Thu thập mẫu ung thư vòm mũi họng ở Hà Nội (miền

Bắc), Huế, Đà nẵng (miền Trung), TP HCM (miền Nam) và kiểm tra sự

có mặt của EBV PGS TS Nguyễn Đình Phúc Chủ trì

Nội dung 2: Nghiên cứu, xác định đặc điểm cấu trúc phân tử của các

chủng virus Epstein-Barr ở Việt Nam PGS.TS Lê Thanh Hòa và Nguyễn Đình Phúc Chủ trì

Nội dung 3: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở,

quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán EBV bằng sinh học phân tử

Thử nghiệm và báo cáo kết quả sử dụng PGS.TS Lê Thanh Hòa và Nguyễn Đình Phúc chủ trì

Nội dung 4: Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và kháng thể

đơn dòng (Mab-EBNA-1) PGS.TS Lê Thanh Hòa chủ trì

Nội dung 5: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở

và quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên EBV theo nguyên lý sắc ký miễn dịch học (ICA) và báo cáo kết quả sử dụng PGS.TS Nguyễn Đình Phúc và PGS.TS Lê Thanh Hòa chủ trì

Trên cơ sở thực hiện 5 nhiệm vụ trên chúng tôi đã hoàn thành được:

1- Đào tạo 1 Nghiên cứu sinh : PGS TS Lê Thanh Hòa đang hướng dẫn 2- Đào tạo 1 Nghiên cứu sinh: PGS TS Nguyễn Đình Phúc đang hướng dẫn 3- Đào tạo 1 Cao học : PGS TS Nguyễn Đình Phúc hướng dẫn 4- Đề tài cũng đã có 3 Đăng ký giải pháp hữu ích tại Cục Sở hữu trí tuệ 5- Đề tài đã có 6 bản quyển Đăng ký trên Genbank

6- Đề tài đã đăng 05 bài báo: trên Tạp chí Y học Việt nam, Tạp chí Công

nghệ Sinh học, Tạp chí Tai mũi họng Việt nam, Kỷ yếu hội nghị Hóa sinh Việt nam

7- Đề tài đã có 03 bản báo cáo tại Hội nghị Tai mũi họng Việt Pháp, tại

Hội nghị Sinh học Việt nam, Hội nghị Học viện Quân Y – 103

8- Đã tổ chức thành công 1 hội thảo khoa học

9- Đã xuất bản 1 quyển sách

10- Đã mở ra triển vọng hợp tác với Đại học North Carolina (Mỹ),

Dousselldorf (Đức), hãng công nghệ sinh học Arista Biologicals Inc (Mỹ)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 DỊCH TỄ HỌC CỦA UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EBV

1.1.1 TẦN SỐ MẮC UTVMH VÀ YẾU TỐ ĐỊA LÝ CỦA EBV

Có 3 vùng mắc UTVMH khác biệt nhau trên thế giới và cũng liên quan chặt chẽ với EBV [39],[49],[56],[59],[61],[67],[70] là : Vùng có tần

số mắc cao là Đông Nam châu Á như: miền Nam Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, miền Bắc Việt Nam, Philippine, Indonexia, Malaysia,

Thái Lan Ngoài ra còn vùng Groenland (người Innuits), vùng Alaska (người Eskimos, Indiens) Tỷ lệ mắc mới hàng năm vào khoảng 20-30 bệnh nhân/100000 dân Nó chiếm khoảng 1/5 của ung thư toàn cơ thể và khoảng 3/4 các khối u của đường tiêu hóa và hô hấp trên (VADS) Những người Quảng Đông – Trung Quốc di cư sống ở Mỹ, Úc vẫn còn mắc UTVMH cao

cho tới thế hệ thứ 2 Vùng có tần số mắc trung gian gồm miền Đông, Bắc

Phi: Algérie, Maroc, Kenya, Tanzania, Ouganda, Soudan Các nước ven Địa Trung Hải như: Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Malte, Miền Nam nước Ý, Ai Cập, Irak, Nigéria, Congo và Sénegal Tỷ lệ mắc thay đổi từ khoảng 1,5 –

12 bệnh nhân/100000 dân Vùng có tần số mắc thấp là những vùng còn lại

trên thế giới: Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Úc… Tỷ lệ mắc mới hàng năm vào khoảng 0,1 – 0,5 cho 100.000 dân Nó chỉ chiếm khoảng 0,25% ung thư toàn cơ thể và từ 1-3% của đường tiêu hóa và hô hấp trên Ở những vùng mắc UTVMH ít , thì lại có tỷ lệ mắc IM cao – đếu là liên quan đến EBV [1],[35],[37],[58],[60],[66],[77]

1.1.2 VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG Epstein-Barr Virus (EBV) là virus thuộc họ Herpesviridae EBV gây

nhiễm rộng trong cộng đồng, được nghiên cứu rất sớm từ những năm 1980

về bệnh sinh và dịch tễ học Đến tuổi trưởng thành, gần như tất cả mọi

người đều có khả năng mang EBV Ở các nước đang phát triển, trẻ em đã nhiễm và EBV kích thích sinh kháng thể rất sớm (Biggar và cs, 1978; Ayan

và cs, 2003), ở các nước tiên tiến, EBV nhễm muộn hơn và kháng thể cũng xuất hiện sau thường sau khi trưởng thành (Fry, 1980; Lennette, 1985; Fleisher và cs, 1979) Tiếp theo giai đoạn mở đầu này, cho dù có hay không biểu hiện lâm sàng, EBV tiến triển trạng thái nhiễm tiềm tàng, mãn tính trong tế bào lympho-B và hầu như tồn tại suốt cuộc đời người nhiễm (Merlin, 1986) EBV sử dụng tế bào biểu mô của họng miệng (oropharyngeal epithelial cells) để thực hiện chu kỳ nhân lên và giải phóng

ra khỏi tế bào nhiễm , rồi bài xuất trong niêm dịch của miệng, họng: như nước bọt Ở hầu hết bệnh nhân với IM (Sixbey và cs, 1984), và hầu như 10-20% người lành có khả năng bài xuất EBV qua dịch tiết đường miệng, tạo nên nguồn truyền lây virus rộng rãi trong cộng đồng (Crawford, 2001) Tái hoạt hoá virus từ trạng thái tiềm tàng là hiện tượng được phát hiện khi có sự tăng cường bài thải virus với mức độ mạnh, khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch ví dụ do HIV-AIDS, bị nhiễm Kaposi-sarcoma, bị suy dinh dưỡng, bị bệnh hoặc khi người phụ nữ mang thai (Jones và cs, 1985; DuBois và cs, 1984; Swaminathan, 2003; Bajaj và cs, 2007) Nhiễm EBV mãn tính cho dù tiềm tàng, có hay không có biểu hiện lâm sàng trước đây thường chưa được coi là nguyên nhân gây bệnh mà chỉ coi là liên quan như một yếu tố hỗ trợ tiến triển bệnh đối với NPC, BL và khối u lymphoma ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch (Chang và cs, 1978; Lennette 1985; Hecht

và Aster 2000 ) Nhưng chắc chắn vai trò của EBV rất quan trọng trong tiến triển IM, hoặc các trạng thái bệnh lý biến đổi tế bào lympho ((Rapp và cs, 1978; Tobi và cs, 1982; DuBois và cs, 1984; Jones và cs, 1985; Strauss và

cs, 1985, Crawford, 2001; Sitki-Green và cs, 2004 Những nghiên cứu mới nhất đầu thế kỷ 21 càng khẳng định vai trò tiên quyết của EBV hoạt hoá trong bệnh nhân IM, NPC hay BL (Hecht và Aster, 2000; Raab-Traub,

2002; Sitki-Green và cs, 2004; Landgren và Caporaso, 2007) Như vậy EBV là 1 Virus gây ung thư đầu tiên ở loài người đã được tìm thấy và nghiên cứu trên toàn cầu Ba nhóm bệnh chủ yếu do EBV là : Ung thư vòm mũi họng – NPC (Châu Á), khối u ác tính của xương hàm trên ở trẻ em- BL (Châu Phi ), Bệnh Sốt và tăng Bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng- IM (châu Âu – Mỹ) Gần đây đã phát hiện EBV liên quan đến sốt kéo dài- suy nhược, khối u ác tính hệ Lymphomalin của tế bào T-NK, các bệnh lý liên quan đến cấy ghép các cơ quan nội tạng, các bệnh lý của hệ thần kinh (liệt,viêm tủy…) [45],[68],[76],[78],[84],[87],[93]

1.1.3 SỰ NHÂN LÊN VÀ TÀNG NHIỄM GÂY UNG THƯ CỦA EBV

Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.1:

• Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.1-(2 ))

• Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân

lên (Hình 1.1-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9))

• Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình 1.1(3)/(4))

miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của

lympho T (Hình 1.1-(5))

Đối với trường hợp nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tế

bào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản (productive infection) (Hình 1.1-(2)) EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng tiến triển như đã nêu ở trên EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô, hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B giải phóng virus vào nước bọt; hoặc có thể chuyển từ

sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến triển ung thư vòm họng (Murray và Young, 2001)

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển

của EBV trong cơ thể bị nhiễm (Murray và Young, 2001)

Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có

trong vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này Virus giải phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào quần thể lympho B, gây nhiễm thứ cấp, mà kết quả là có một lượng lớn EBV được tung ra, chúng có rất nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV lại có thể gây nhiễm các tế bào biểu mô khác (Hình 1.1-(7-9))

Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản

(semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình 1.1-(4)) Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và muộn (LMP-1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và biệt hoá chúng tăng sinh và tiến triển ung thư Tuy nhiên, quá trình ung thư

do EBV khởi phát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiều yếu tố factor) mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ.[47],[55],[72],[84]

(co-1.2 CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

EPSTEIN-BARR VIRUS

1.2.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA EBV

EBV hay Herpes virus type 4, thuộc loại virus ADN 2 sợi xoắn,

thuộc họ Herpesviridae (Cohen, 2006) Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi

DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu tính cả phần cấu

trúc lặp ở hai đầu là 184 kb Hệ gen được chứa đựng trong một vỏ capsid,

có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ

nhân ADN của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV

A: Virus Herpes dưới kính hiển vi điện tử B: Sơ đồ cấu trúc virus Herpes

Hinh 1.2 Sơ đồ cấu trúc phân tử của Herpesvirus

Capsid là một vỏ chắc, được xác định bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục

đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3-2 Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là

những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay 6 đỉnh Các đơn vị protein đó được

mã hoá bởi các gen virus Capsid lại được bao quanh bởi một vỏ bao ngoài

khác, gọi là vỏ ngoài (envelope), cấu trúc chủ yếu từ thành phần

glycoprotein Vỏ bao này cũng được mã hoá và cũng mang dấu ấn miễn

dịch Giữa capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu

trúc và các enzyme của virus Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với tác

động của acid, ether, các dung dịch hoà tan, sát khuẩn và đông khô (Cohen,

2006) Hiện nay có hai loại EBV được biết gây nhiễm ở người đó là:

EBV-1 và EBV-2, mặc dù biểu hiện lâm sàng và gây bệnh như nhau, nhưng trong hệ gen có sự sai khác về cấu trúc gen EBNA-2

1.2.2 SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SẮP XẾP HỆ GEN CỦA EBV

EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người ,có đặc tính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào Lympho B thông qua tương tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CD21 của bổ thể C3d Sự xâm nhập của EBV vào Lympho B còn có sự trợ giúp của phức hợp gp25 (gL), gp42/38 và gp85 (gH) Phức hợp này làm trung gian tương tác giữa EBV với MHC lớp 2 và chúng có vai trò như một tổ hợp thụ thể đồng trợ giúp cho EBV xâm nhập sâu vào tế bào Lympho B (Murray và Young, 2001) EBV gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh EBV là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM), và có liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như tăng sinh lympho B hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô như UTVMH và ung thư dạ dày Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gen của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các gen protein màng tàng nhiễm (LMP), cho một lượng lớn các sản phẩm protein mà nó có thể đóng vai trò chuyển hoá khối u lành thành ác tính (Middeldorp và cs, 2003)

Về phân loại, EBV là một thành viên thuộc nhóm Herpes type 4 gây nhiễm bệnh trên người (Middeldorp và cs, 2003), được phân loại theo sơ đồ phân loại như sau: Viruses; dsDNA viruses, no RNA stage; Herpesviridae; Gammaherpesvirinae; Lymphocryptovirus; Human herpesvirus 4 (liệt kê danh pháp phân loại tại Ngân hàng Gen: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/)

Hệ gen của EBV có 6 tổ hợp gen mã hoá cho các loại protein kháng

nguyên: Kháng nguyên nhân, ký hiệu là EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mã hoá cho protein màng (LMP-1, LMP-2A và LMP-2B) (Muray và Young, 2001;

Cohen, 2006) Sáu protein EBNA có liên quan đến vai trò xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, còn 3 loại protein LMP liên quan đến chu kỳ EBV trong dòng tế bào Lympho B đã chuyển đổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dòng tế bào mầm gây nhiễm trùng muộn (LCL) Trong dòng tế bào LCL, EBNA được sao chép trong một ARN thông tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đó được phân cắt thành các EBNA thành phần độc lập (Middeldorp và

cs, 2003; Young và Rickinson, 2004) (Hình 1.3)

mầm và điểm khởi phát oriP; các exon mã hoá cho 6 protein kháng nguyên nhân

(EBNA-1, -2, -3A, -3B -3C, và EBNA-LP) và 3 protein màng (LMP-(EBNA-1, -2A, -2B) Các promoter cho từng vùng sao chép được ký hiệu Cp/Wp, Qp (b) Dạng mạch thẳng tồn tại trong tự nhiên trong đó có 6 gen EBNA và gen LMP-1 giới hạn hai đầu bởi các chuỗi kết thúc TR

(terminal repeat) (theo Muray và Young, 2001)

1.2.2.1 Gen và sản phẩm của gen EBNA-1

Gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA mã hoá cho protein EBNA-1, có tác dụng bám vào DNA Protein EBNA-1 có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái

tạo hệ gen của virus Gen EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả mọi dạng khối u có liên quan đến EBV, và gen EBNA-1 có khả năng biểu hiện protein bằng cách sử dụng một trong 4 loại promoter khởi động (Cohen, 2006) EBNA-1 thực hiện chức năng của mình bằng cách bám vào vùng mầm oriP là điểm khởi phát sự nhân lên của DNA hệ gen EBV EBNA-1 còn tương tác điều hoà tiếp tục sự sao chép của tổ hợp EBNA bằng cách bám vào vị trí Qp, và promoter này được sử dụng trong

tế bào nhiễm EBV theo chương trình tàng nhiễm type 1 và tàng nhiễm type

2 (Cohen, 2006) Ngoài ra còn có vai trò kích hoạt sao chép và điều hoà chức năng của promoter Cp và LMP-1 EBNA-1 là chuỗi polypeptide bao gồm 641 acid amin, trong đó thành phần 3 acid amin glycine-glycine-alanine (Gly-Gly-Ala) được lặp lại nhiều lần, mà số lượng lặp thay đổi khác nhau trong các mẫu/chủng EBV khác nhau (Tselis và Jensen, 2006) Vùng lặp 3 acid amin Gly-Gly-Ala này có tác dụng điều hoà nghịch MHC-

I, và ngăn cản quá trình phân giải kháng nguyên Nếu không có trình diện kháng nguyên phân giải thì Lympho T loại CD8 không có chức năng hoạt động để kìm hãm hoạt hoá EBNA-1 Vai trò trong sự hình thành khối u lymphoma tế bào B của EBNA-1 cũng được chứng minh khi gây bệnh thực nghiệm trên chuột Trong tất cả các EBNA thì gen EBNA-1 có vai trò chủ đạo trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV.[49],[57],[79],[75],[94],[96,]

1.2.2.2 Gen và sản phẩm của gen EBNA-2

Gen EBNA-2 cũng là một phân đoạn DNA trong vùng gen cơ bản

EBNA của hệ gen EBV, là gen định vị trong vùng gen Wp hay Cp (Hình 1.3) EBNA-2 mã hoá cho protein kháng nguyên nhân có vai trò trong biệt

hoá Lympho B thành tế bào mầm non hoá LCL cho EBV thực hiện quá trình gây ung thư EBNA-2 là gen được sao chép sớm nhất do vai trò của chúng trong quá trình điều tiết sự nhân lên của EBV EBNA-2 điều hoà sao

chép gen và tổng hợp protein của cả virus và tế bào nhiễm, cũng như có vai trò trong điều hoà tổng hợp kháng nguyên bề mặt của Lympho B bao gồm CD21 và CD23, LMP-1 và LMP-2 Gen gây ung thư c-myc cũng là đích kích hoạt sao chép của EBNA-2, và do vậy gen EBNA-2 được coi là yếu tố quan trọng trong cảm ứng tăng sinh tế bào Lympho B Hiện nay, EBNA-2 được chia làm 3 phân type theo vùng địa lý: các chủng có thành phần gen EBNA-2 AC phân bố chủ yếu ở châu Á, các chủng có thành phần gen EBNA-2 AD phân bố chủ yếu ở Mỹ và các chủng có thành phần gen EBNA-2 B phân bố chủ yếu ở các nước châu Phi (Middeldorp và cs, 2003).[49],[94]

1.2.2.3 Các gen EBNA-3 và sản phẩm của chúng

EBNA-3, bao gồm EBNA-3A (hay chính là EBNA-3), EBNA-3B (hay còn gọi là EBNA-4), EBNA-3C (hay còn gọi là EBNA-6) là sản phẩm gen nằm trong vùng sao chép Wp hay Cp Sản phẩm protein do các gen này tổng hợp có trọng lượng phân tử lần lượt là: 140 kDa, 165 kDa và 155 kDa Sai khác amino acid trong các sản phẩm EBNA-3A, B và C giữa hai type EBV-1 và EBV-2, có thể chủ yếu là do biến đổi thành phần ở đầu cuối

C (-COOH) của chuỗi polypeptide (84%, 80%, 72%), do vậy phân tích sai khác này có thể xác định genotype của EBV (Middeldorp và cs, 2003) Họ hàng sản phẩm gen của EBNA-3A và EBNA-3C có vai trò quan trọng trong biệt hoá và chuyển hoá tế bào lympho B, trong khi đó vai trò của EBNA-3B còn chưa rõ EBNA-3C cảm ứng điều hoà tích cực quá trình sao chép CD21 của tế bào và LMP-1 của virus EBNA-3C cũng có thể tương tác với pRb xúc tiến biệt hoá tế bào lành thành tế bào ung thư (Murray và Young, 2001)

1.2.2.4 Gen EBNA-LP

Gen EBNA-LP là gen mã hoá cho sản phẩm protein có độ dài khác nhau phụ thuộc vào số lượng của cấu trúc lặp BamHI W có trong nhiều

chủng EBV Mặc dù không hoàn toàn có vai trò tiên quyết trong cơ chế chuyển lympho B non hoá khởi động ung thư, nhưng EBNA-LP là protein tương tác cần thiết cho tế bào LCL tăng sinh mạnh EBNA-LP và EBNA-2

có khả năng chuyển phân bào G0 sang G1 EBNA-LP chi phối hoạt động của EBNA-2 bằng cách điều hoà protein đích của EBNA-2 kể cả LMP-1 EBNA-LP được chứng minh cùng tồn tại với pRb và p53, không trực tiếp chịu sự điều hoà của 2 loại protein giám sát ung thư này (Murray và Young, 2001) [77],[84],[94]

1.2.2.5 Gen LMP-1

LMP-1 là sản phẩm gen của khung đọc mở sao chép từ BNLF1 và là sản phẩm sao chép tương đối dư thừa trong tất cả các tế bào tàng nhiễm EBV Sản phẩm ARN thông tin của LMP-1 là kết quả ghép-nối của 3 chuỗi exon, và chịu trách nhiệm tổng hợp protein màng, phân tử lượng là 63 kDa,

có 3 vùng hoạt hoá: vùng acid amin 1-2-3 cắm gốc vào nguyên sinh chất tế bào, vùng có 6 nhóm acid amin kỵ nước liên quan chức năng tự liên kết và vùng tín hiệu (acid amin 187-386) Định vị ở đầu tận cùng C của LMP-1 là 2 vùng hoạt hoá CTAR1 và CTAR2 Vùng CTAR1 (vị trí acid amin từ 186–231) khu trú gần màng và có vai trò thiết yếu cho EBV chuyển non hoá và tăng sinh lympho B Vùng CTAR2 (vị trí acid amin từ 351–386) có vai trò thiết yếu cho chuyển hoá và tăng sinh vững bền của EBV và Lympho B Gen LMP-1 tham gia vào chuyển tải 4 kênh tín hiệu thông qua NF-kB, JNK/AP-

1, p38/MAPK và JAK/STAT (Young và Rickinson, 2004)

Nhiễm tiềm tàng EBV là hiện tượng khởi đầu sớm cho quá trình tiến triển ung thư (Pathmanathan và cs, 1995) Trong một số protein có vai trò quan trọng tiến triển ung thư sớm, LMP-1 là một loại đặc biệt do protein này có khả năng đơn phương gây ung thư thực nghiệm trên chuột (Kaye và

cs, 1993); và LMP-1 còn có khả năng gây nhiều kiểu biến đổi kiểu hình tế bào lympho-B và tế bào biểu mô (Kieff và cs, 1996) Tầm quan trọng vai

trò LMP-1 trong tiến triển ung thư được chứng minh một cách rõ ràng là protein LMP-1 biểu lộ và được tìm thấy trong 78% số mẫu mô bệnh nhân NPC Vùng amino acid quan trọng là điểm nóng của sự chú ý là vị trí giáp ranh tận cùng đầu C của chuỗi polypeptide LMP-1, nơi xẩy ra đột biến xoá

đi 30 bp có tính chất quyết định tiến triển ung thư (Sandvej và cs, 1997) Đột biến điểm dẫn đến việc biến mất vị trí enzyme giới hạn XhoI và đột biến xoá 30 bp xảy ra ngay gần CTAR2 Biến chủng đột biến LMP-1 như thế này còn được gọi là biến chủng delLMP-1 (ở chủng Cao) được chứng minh có khả năng tăng cường ung thư trong thí nghiệm Xoá đi 30 nucleotide ở gen LMP-1 (hay 10 amino acid tận cùng đầu C) làm mất vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI có liên quan đến chuyển biến từ trạng thái không ung thư sang trạng thái ung thư (Li và cs, 1996), hoặc chuyển đổi type III của NPC quan sát được ở bệnh nhân Malaysia (See và cs, 2008) Gen LMP-1 của một số chủng Trung Quốc, Đài Loan cũng có đột biến điểm ở vài vị trí và đột biến xoá gen mất 30 bp trong gen LMP-1 khi so sánh với EBV chủng B95-8 (Lin và cs, 2004) Người ta nghĩ là delLMP-1

có liên quan với UTVMH, nhưng ngày nay người ta lại phát hiện được ở trong bệnh nhân lymphoma-T/và tế bào NK, Hodgkin, và trong LCL của người bình thường Người lành và người bệnh đều có thể có EBV thuộc loại đột biến này Tuy nhiên, biến chủng này thường gặp nhiều hơn và có vai trò trợ giúp ở các bệnh nhân HIV đồng nhiễm Hodgkin (HIV+HD) so với bệnh nhân HIV không đồng nhiễm HD (HIV-HD) Có thể delLMP-1 có tác động nhất định đến tiến triển ung thư liên quan với EBV như HD và UTVMH và tăng cường khả năng tăng sinh lympho và ung thư lymphoma của một số chủng EBV (See và cs, 2008).[53],[69],[84],[94]

1.2.2.6 Gen LMP-2

Gen LMP-2 mã hoá cho 2 protein riêng biệt: LMP-2A và LMP-2B, hai loại protein này có cấu trúc tương tự như nhau, chứa 12 vùng hoạt tính

chuyển màng và vùng cuối C, có tác dụng định vị màng nguyên sinh chất LMP-2A bám vào màng của lympho B tàng nhiễm bằng cách đính các vùng hoạt tính lên màng tế bào chủ Cả hai loại LMP-2A và LMP-2B đều không có chức năng trong chuyển hoá lympho B LMP-2 có khả năng làm biến đổi chương trình hoạt động tế bào của lympho- B tạo điều kiện cho EBV tàng nhiễm và cản trở sự dung giải tế bào của lympho B Sự có mặt thường xuyên của LMP-2 thường trực trong tế bào HD và UTVMH cho thấy gen LMP-2 có thể có vai trò trợ giúp thiết yếu mà vắng chúng không hoặc kém sự tiến triển ung thư do EBV (Murray và Young, 2001)

Một nhóm các RNA được biểu hiện ở vùng BamHIA của hệ gen EBV ban đầu được xác định ở những bệnh nhân UTVMH, sau này, chúng biểu hiện cả ở những khối u ác tính có liên quan đến EBV như u lympho Burkitt, u lympho Hodgkin, và u lympho tế bào T vùng mũi xoang, thậm chí cả ở trong máu của những người khoẻ mạnh Một bản sao mã khác được tạo ra từ vùng BamHIA là BARF1, mã hoá cho một protein 31 kDa Ban đầu, protein này được xác định là một kháng nguyên sớm, biểu hiện vào chu kỳ ly giải của virus Những nghiên cứu mới đây cho thấy, BARF1

là một protein xuất tiết, nó biểu hiện như là một protein muộn trong bệnh cảnh UTVMH phối hợp với EBV và ung thư biểu mô dạ dày Những nghiên cứu như vậy cho thấy, một số gen của EBV có vai trò quan trọng trong một số loại UTBM có liên quan đến EBV cũng như sự tồn tại dai dẳng (nhiễm tiềm tàng) của virus này (Young và Rickinson, 2004).[94]

1.3 CHẨN ĐOÁN EBV BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 1.3.1 KỸ THUẬT PCR

Kỹ thuật PCR được đề xướng vào giữa thập kỷ 1980, được công bố nam1986, bởi Kary Mullis [74],[75] (đưa lại một cuộc cách mạng trong di

truyền học phân tử PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử

enzym DNA-polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn DNA sợi đơn làm mồi (có độ dài từ 6-30 nucleotide) và dùng đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên từ 92oC – 98oC (thường ở 94oC) cho chuỗi xoắn kép DNA bung ra Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia để cho ra sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí vài ngàn cặp nucleotid Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này lại được dùng làm khuôn cho các chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết, sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi Như vậy, kết quả là một đoạn DNA định trước được

“nhân lên” với lượng rất lớn Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao DNA

của PCR là trên 1 triệu bản sao Có nhiều loại PCR, trong đó có PCR thông thường và PCR đặc biệt PCR thông thường (conventional PCR)

là sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR thu được có độ dài vài trăm đến vài nghìn nucleotide PCR đặc biệt trước hết phải kể đến: 1.3.1.1 PCR dài (long PCR): cho sản phẩm vài chục nghìn nucleotide,

thành phần tham gia đòi hỏi tinh khiết, chọn lọc, có tính năng cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu giải mã hệ gen

1.3.1.2 PCR lồng (nested PCR): Có PCR lồng đơn (sử dụng 1 cặp mồi);

sự bán lồng (semi-nested PCR) sử dụng 3 mồi; và lồng hoàn toàn (fully nested PCR) sử dụng 2 hay nhiều cặp mồi PCR lồng đảm bảo cho sản

phẩm tin tưởng và ADN sinh ra ở chu kỳ trước là nguồn khuôn tiếp cho các chu kỳ sau của PCR iii) PCR đơn, kép và đa năng: PCR đơn (uniplex-PCR) sử dụng 1 cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên 1 nguồn khuôn từ 1 loại (vi) sinh vật; PCR kép (duoplex-PCR) sử dụng 2 cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên 2 nguồn khuôn từ 2 loại (vi) sinh vật; PCR đa năng (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên nhiều nguồn khuôn khác nhau, do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện nhiều loại (vi) sinh vật khác nhau

1.3.1.3 PCR khác: Ngoài ra còn nhiều loại PCR sử dụng mồi không đặc

hiệu, hoặc PCR cực đại (mega PCR), PCR tăng /giảm, PCR định lượng (Real-time PCR), PCR xác suất

1.3.1.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu chẩn đoán EBV

Khi EBV trong người bị nhiễm có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển UTVMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triển thành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng thái sao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1 xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào

đã chuẩn bị cho sự chuyển dạng sớm trở thành ung thư Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên, đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặc biệt cho sự xác nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm (Thompson và Kurzrock, 2004) VCA (viral capsid antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong người nhiễm EBV, vì EBV nhân lên trong tế bào biểu mô cần protein này Đối với EBV gây nhiễm tiềm tàng lympho-B và có dấu hiệu chuyển dạng gây ung thư hay biểu mô vùng họng chuyển thành NPC, sự biểu hiện của gen EBNA nói chung và EBNA-1 nói riêng cũng như thành phẩm của gen này là protein EBNA-1 trong cơ thể là chỉ thị chẩn đoán hết sức quan

trọng và cần thiết xác định người bệnh xuất hiện ung thư ở giai đoạn sớm (Gulley, 2001; Hao và cs, 2004) EBNA-1 cần thiết cho virus nhân lên và khép vòng tạo episome chuẩn bị cho sự gây nhiễm tiềm tàng và chuyển dạng ung thư, do vậy, gen này có giá trị chẩn đoạn sớm rất cao trong ứng dụng sinh học phân tử (Thompson và Kurzrock, 2004) Chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thông thường và PCR định lượng (real-time PCR)

đã được áp dụng rộng rãi đối với phát hiện EBV ở mọi dạng gây nhiễm và gây bệnh, ở ung thư NPC hay Burkitt hoặc trong các ung thư khác có liên quan đến vai trò của EBV (Gulley, 2001) Một số nghiên cứu sử dụng PCR

và real-time PCR đã thành công trong phát hiện EBV ở ung thư vú, trong liên kết tiến triển NPC (Lin và cs, 2005), trong tế bào di căn lan toả trong

cơ thể (Lin và cs, 2002), hoặc sử dụng phát hiện gen trước khi kiểm nghiệm bằng huyết thanh học (Sheen và cs, 1998), và PCR còn phát hiện được EBV trong bệnh phẩm cố định paraffin hoặc mẫu máu lâm sàng (Marziliano và cs, 2005) Như vậy có thể phân làm 2 giai đoạn chẩn đoán: chẩn đoán sớm (trong vòng 6 tháng) sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện gen EBNA-1 hoặc kỹ thuật miễn dịch phát hiện sản phẩm của gen này; và chẩn đoán muộn kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể kháng EBNA-1 (Gulley, 2001) [28],[31],[32],[74],[90],[91]

1.3.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI

Là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Các phân tử acid nucleic ở pH trung tính, tích điện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi acid nucleic Khi đặt chúng vào một điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước

sẽ dịch chuyển với các tốc độ khác nhau; loại có phân tử lượng lớn dịch chuyển chậm, loại bé hơn sẽ dịch chuyển nhanh hơn Thạch argarose được dùng để chạy trong máy điện di, gel polyacrylamid thường dùng để phân tách

các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ trong các ứng dụng như xác định trình tự DNA Chỉ thị phân tử DNA hay được dùng nhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43kb được cắt bằng enzyme giới hạn HindIII DNA của thực khuẩn thể được HindIII cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb Nhờ chỉ thị phân

tử này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn DNA nghiên cứu

1.3.3 KỸ THUẬT TÁCH DÒNG

Tách dòng (clonning) hay còn được gọi là tạo dòng, nhân dòng là nhằm nhân lên và thu nhận một lượng lớn bản sao DNA từ một trình tự DNA xác định Nó gồm 5 bước chủ yếu là: i) Chọn và xử lý vector; ii) Xử

lý DNA cần cho tách dòng; iii) Tạo vector tái tổ hợp từ hai thành phần trên; iv) Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ (vi khuẩn); v) Chọn lọc dòng vi khuẩn có chứa vector tái tổ hợp cần tìm hay còn gọi là phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen

Quá trình tách dòng sản phẩm PCR được bắt đầu bằng công đoạn đưa DNA sản phẩm của PCR gắn vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế trước gọi là plasmid Plasmid chứa DNA ngoại lai này được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng để nuôi cấy với số lượng lớn và tách DNA plasmid chứa sản phẩm PCR ra, nhằm thu được một số lượng lớn bản sao DNA Để thực hiện tách dòng sản phẩm PCR, phải có các thành phần sau: DNA ngoại lai (DNA sản phẩm của PCR, vector dẫn truyền - hay còn gọi là plasmid mang), dòng tế bào chủ thích ứng Sản phẩm PCR có độ dài dưới 3kb có thể được gắn trực tiếp vào plasmid theo cơ chế bổ sung adenin (A) của đầu 3’ ở sản phẩm PCR với thymine (T) ở đầu 3’ của vector (plasmid) đã được thiết kế trước theo cơ chế tách dòng TA (tách dòng TA trực tiếp) Plasmid được sử dụng thông dụng hiện nay là loại vector pCR®2.1-TOPO® của hãng Invitrogen.Vector pCR®2.1−TOPO® có kích

thước là 3,9 kb, thuộc loại T- vector, được thiết kế với sự có mặt của hai nucleotid thymine (T) nằm ở hai đầu trong vùng nhân dòng đa điểm cắt của vector (vùng MCS) Do đó, vector này không tự đóng vòng được Các đoạn DNA, sản phẩm của phản ứng PCR thông thường sẽ được gắn thêm một nucleotid adenin (A) ở cuối đầu 3’ nhờ hoạt tính đặc biệt của Taq DNA- polymerase Các nucleotit này sẽ liên kết bổ sung với các nucleotid thymine (T) của vector tách dòng trong quá trình ghép-nối sản phẩm PCR vào vector pCR®2.1−TOPO®, nhờ đó mà tạo thành một plasmid tái tổ hợp vòng khép kín Tại hai đầu của vùng MCS có bố trí rất nhiều điểm cắt của các enzyme giới hạn, trong đó có điểm cắt của enzyme giới hạn EcoRI, rất thuận lợi cho quá trình kiểm tra sản phẩm tách dòng Ngoài ra, vector pCR®2.1−TOPO® cũng chứa các gen mã hoá cho các protein-enzyme cần thiết trong qua trình chọn lọc các plasmid tái tổ hợp (gen kháng kháng sinh, operon−lac) Operon−lac chứa gen mã hoá cho enzyme β- galactosidase nằm trong vùng MCS, có khả năng thuỷ phân một loại hoá chất có tên là X- gal không màu tạo thành sản phẩm có màu xanh Vì vậy, nếu sản phẩm PCR được gắn vào vector thì sẽ làm bất hoạt gen Lac Do đó, các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu trắng được phân biệt với các vi khuẩn mang vector pCR®2.1- TOPO® nguyên bản có khuẩn lạc màu xanh

Đầu tiên, DNA ngoại lai được nối vào vector nhằm tạo ra vector tái tổ hợp Sau đó vector tái tổ hợp chuyển nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ được cấy trong môi trường thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần Cuối cùng qua các bước tách chiết DNA, người ta sẽ thu được một số lượng lớn DNA của plasmid tái tổ hợp (plasmid chứa DNA-PCR).Các nhân tố như vector, tế bào chủ có thể thay đổi nhưng tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua các bước: chọn và xử lý vector, xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vector tái

tổ hợp vào tế bào chủ, phát hiện và thu hoạch dòng cần tìm

1.3.4 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu Phương pháp này kết hợp ba bước của một phản ứng, bao gồm: bung liên kết, bám mồi và tổng hợp sợi đơn nucleotid Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5'-3' Mỗi một lần giải trình trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm cho đến 1000 nucleotid, thông thường là 500-

700 nucleotide, nếu giải trình được thực hiện trên máy giải trình tự động loại hiện đại nhất hiện nay Giải trình trình tự gen có các thành phần tham gia giống như thành phần tham gia phản ứng PCR, nhưng có một số đặc trưng riêng biệt Có 2 phương pháp: i) Đối với giải trình trực tiếp thì dùng một mồi đơn đặc hiệu bám trên chuỗi DNA của sản phẩm; ii) Đối với trường hợp sản phẩm PCR được dòng hoá thì dùng mồi xuôi M13F (forward) hoặc mồi ngược M13R (reverse), do hai đầu biên bao quanh DNA tái tổ hợp, chuỗi DNA của vector được bố trí vị trí cho các mồi này bám vào, nên trong quá trình giải trình tự, chúng sẽ cho trật tự nucleotide từ điểm bám xuyên ngang qua DNA ngoại lai, cho chuỗi thô nucleotide của DNA plasmid tái tổ hợp Các chuỗi thô sẽ được xử lý bằng chương trình máy tính, để có chuỗi có trình tự đúng chính xác trước khi đối chiếu Sau khi đối chiếu, chúng ta thu được chuỗi cuối cùng, và có thể xem xét trình tự nucleotide và trình tự acid amin tương ứng

1.4 NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN MIỄN DỊCH HỌC SẮC

KÝ (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC ASSAY, ICA) VÀ QUI TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT ICT (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC TEST) 1.4.1 TẦM QUAN TRỌNG CỦA ICA TRONG CHẨN ĐOÁN

(ICA)) là một kỹ thuật hoàn toàn dựa trên nguyên lý kết hợp kháng

nguyên-kháng thể thể hiện nhanh và dễ thực hiện, phương pháp này còn được coi là test cực nhanh và nhạy, được phát hiện từ rất lâu từ năm 1956

sử dụng hạt latex (Singer và Plotz, 1956) Trong 15 năm gần đây, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có viêc sử dụng hạt nano (ví dụ: hạt vàng (Au)) và màng nitrocellulose (NC), cũng như kỹ thuật gia công băng nhúng và/hoặc hộp thử, ICA đã trở thành một phương pháp phát triển để thành bộ sinh phẩm chẩn đoán ứng dụng rộng rãi cho hàng chục loại vi sinh vật khác nhau; và cho cả việc phát hiện độc tố, độc chất trong thực phẩm, kháng sinh tồn dư và nhiều loại khác (von Lode, 2005) Tính đơn giản trong sử dụng, thời gian thực hiện nhanh, kết quả chính xác, giá thành rẻ, có thể dùng như một phương tiện lưu động, không cần máy móc quy mô và đắt tiền, ICA test đã được coi như là một lợi thế miễn dịch học và phát hiện ứng dụng hết sức kinh tế trong cuộc sống hiện nay (von Lode, 2005)

Miễn dịch học sắc ký ICA đã được phát triển thành bộ sinh phẩm chẩn đoán (kit) đối với nhiều bệnh ở người và gia súc, gia cầm, trước hết phải kể đến chẩn đoán nhiều loại bệnh do virus như viêm gan B do virus - HBV, viêm gan E do virus – HEV, virus Epstein-Barr (Gomez và cs, 2000), virus suy giảm miễn dịch mắc phải HIV type 1 và 2 ở người (Syed Iqbal và cs, 2008), kháng nguyên H5 và H9 của virus cúm A (Tsuda và cs, 2007), virus gây ung thư cổ tử cung ở người – HPV (Peck và cs, 2008), West Nile virus, Herpes simples virus – HSV (Laderman và cs, 2008), rotavirus gây ỉa chảy

ở trẻ em, Norovirus, virus gây bệnh ở tôm (Sithigorngul và cs, 2007) và nhiều tác nhân gây bệnh do virus khác ICA còn sử dụng chẩn đoán nhanh bệnh do vi khuẩn như vi khuẩn lao; vi khuẩn gây bệnh giang mai ở người (Bronzan và cs, 2007), Campylobacter spp, Helicobacter pylori (Yang và

cs, 2008) ; Vibrio harveyi, Brucella canis ở chó nhiều loại bệnh do ký sinh trùng gây ra như sốt rét- Plasmodium spp (Hawkes và Kain, 2007) ký sinh