01050004909 Đánh giá tính phù hợp mô và Độc tính tế bào của thủy tinh thể nhân tạo sản xuất tại việt nam 01050004909 Đánh giá tính phù hợp mô và Độc tính tế bào của thủy tinh thể nhân tạo sản xuất tại việt nam
TỔNG QUAN
Bệnh đục thủy tinh thể
1.1.1 Đặc điểm cấu trúc của thủy tinh thể
Thủy tinh thể tự nhiên là một thấu kính trong suốt, có hai mặt lồi, với mặt sau lồi hơn mặt trước Nó có tính đàn hồi và nằm ngay sau đồng tử.
Hình dáng của thủy tinh thể thay đổi theo quá trình điều tiết và khác nhau giữa các cá nhân cũng như theo độ tuổi Đường kính của thủy tinh thể dao động từ 7 đến 10 mm, với độ dày từ 3,5 đến 4 mm Chỉ số chiết quang của thủy tinh thể tự nhiên là 1,36 ở các lớp ngoài và 1,4 ở vùng trong Đặc biệt, độ đàn hồi của thủy tinh thể giảm dần theo tuổi tác.
Về cấu tạo mô học, cấu trúc thủy tinh thể tự nhiên bao gồm:
Bao thủy tinh thể là lớp bọc toàn bộ bề mặt của thủy tinh thể, được hình thành chủ yếu từ những lá keo mỏng, thuần nhất và trong suốt Lớp bao này có tính đàn hồi và khả năng chiết quang cao, với độ dày dao động từ 11 đến 18 micromet.
Biểu mô dưới bao là lớp biểu mô vuông đơn nằm ở mặt trước của thủy tinh thể Tại rìa thủy tinh thể, các tế bào biểu mô chuyển đổi dần thành các tế bào dẹt, dài, được gọi là sợi thủy tinh thể.
Sợi thủy tinh thể là những tế bào biệt hóa cao, hình thành các trụ dài và mảnh, có hướng theo đường vĩ tuyến Kích thước của sợi thủy tinh thể dao động từ 7 đến 10 mm về chiều dài, 8 đến 12 µm về chiều rộng và dày 2 µm Chất kết dính giữa các sợi thủy tinh thể được xem như chất bôi trơn, cho phép các sợi này di chuyển trong quá trình điều tiết thủy tinh thể.
- Thủy tinh thể được giữ ở nguyên vị trí bởi một hệ thống sợi từ bờ thủy tinh thể tới dính vào thể mi gọi là dây chằng Zinn
Thủy tinh thể đóng vai trò quan trọng trong hệ thống khúc xạ của mắt, với chức năng chính là tập trung các tiêu điểm ảnh lên võng mạc Đây là cấu trúc có khả năng khúc xạ mạnh thứ hai trong mắt người, chỉ sau giác mạc.
1.1.2 Hiện tƣợng đục thủy tinh thể
Bệnh đục thủy tinh thể là kết quả của quá trình lão hóa của thủy tinh thể, trong đó độ trong suốt của thấu kính bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố quang học Sự lão hóa dẫn đến sự tích tụ sắc tố vàng nâu, làm giảm khả năng truyền ánh sáng Đồng thời, cấu trúc của các sợi thấu kính cũng thay đổi, gây ra sự phá vỡ cấu trúc thông thường và ảnh hưởng đến độ nét quang học.
Đục thủy tinh thể chủ yếu phát triển do tiếp xúc lâu dài với bức xạ như tia cực tím hoặc do các bệnh như tiểu đường và suy dinh dưỡng Nguyên nhân thường là sự biến tính của các protein thấu kính, trong khi yếu tố di truyền có thể gây đục thủy tinh thể bẩm sinh Tiền sử gia đình có người mắc bệnh cũng có thể làm tăng nguy cơ đục thủy tinh thể ở trẻ em, dẫn đến hiện tượng "dự đoán" bệnh trước tuổi già Ngoài ra, chấn thương mắt cũng có thể gây ra tình trạng này Khoảng một phần ba ca đục thủy tinh thể ở trẻ em không liên quan đến bệnh hệ thống hoặc mắt Đột biến tự phát có thể dẫn đến đục thủy tinh thể cho thế hệ sau, với 23% trường hợp bẩm sinh có tính chất gia đình Đục thủy tinh thể có thể xuất hiện dưới nhiều dạng khác nhau, vì vậy tất cả các thành viên trong gia đình nên được kiểm tra.
Một nghiên cứu tại Iceland cho thấy phi công của hãng hàng không thương mại có nguy cơ mắc đục thủy tinh thể cao gấp 3 lần so với những người không làm công việc bay, điều này được cho là do tiếp xúc với bức xạ từ không gian Đục thủy tinh thể cũng thường gặp ở những người tiếp xúc với bức xạ hồng ngoại và những người thổi thủy tinh.
Hội chứng tróc da là một ví dụ về tác động của bức xạ, trong khi tiếp xúc với bức xạ vi sóng có thể dẫn đến đục thủy tinh thể Ngoài ra, một số loại thuốc như corticosteroid cũng có thể gây ra sự phát triển của đục thủy tinh thể.
Nguyên nhân gây đục thủy tinh thể rất đa dạng, dẫn đến tỷ lệ người mắc bệnh này cao Điều này cho thấy nhu cầu điều trị bệnh lớn, đặc biệt là trong việc cấy ghép thủy tinh thể từ người hiến tặng.
1.1.3 Điều trị bệnh đục thủy tinh thể
Các biện pháp phòng ngừa đã được thực hiện để ngăn ngừa bệnh đục thủy tinh thể Trong trường hợp không thể chữa khỏi, nhiều kỹ thuật điều chỉnh thị lực đã được phát triển và cho kết quả khả quan, ngay cả khi không cần phẫu thuật Phẫu thuật đục thủy tinh thể cũng là một phương pháp điều trị hiệu quả, bao gồm việc loại bỏ thủy tinh thể.
―aphakia‖, ―không có thủy tinh thể‖ và cần phải cung cấp thủy tinh thể nhân tạo để mắt có thị lực
Hiện nay, phẫu thuật lấy thủy tinh thể ngoài bao và phẫu thuật nhũ tương hóa thể thủy tinh là hai kỹ thuật phổ biến nhất để điều trị đục thủy tinh thể Các phương pháp này thay thế thủy tinh thể tự nhiên của mắt bằng thủy tinh thể nội nhãn (IOL), một thấu kính quang học bằng nhựa dẻo mỏng với công suất quang điều chỉnh được Nhiều loại vật liệu khác nhau đã được phát triển để chế tạo IOL.
Với sự tiến bộ của khoa học, nhu cầu về vật liệu mới cho IOLs ngày càng tăng, đặt ra thách thức trong việc phát triển vật liệu phù hợp Nhu cầu này phụ thuộc vào mức độ và hình thức điều chỉnh thị lực, quy trình điều chỉnh, và điều kiện của bệnh nhân Đặc biệt, yêu cầu về tính tương thích sinh học cùng với các đặc tính cơ lý và quang học cơ bản ngày càng trở nên quan trọng Để thiết kế vật liệu cho các thiết bị y sinh như IOLs, cần hiểu rõ các khía cạnh của khoa học vật liệu và yêu cầu ứng dụng, đồng thời xem xét những khiếm khuyết của vật liệu hiện có Tính tương thích sinh học của IOLs, do được cấy ghép bên trong mắt, là mối quan tâm lớn đối với các nhà khoa học vật liệu, dẫn đến yêu cầu phát triển các vật liệu tạo thủy tinh thể nhân tạo có tính ổn định lâu dài và tương thích sinh học.
Thủy tinh thể nhân tạo
1.2.1 Lịch sử ra đời thủy tinh thể nhân tạo
Các thủy tinh thể nhân tạo đầu tiên được chế tạo từ thủy tinh, nhưng nặng và dễ vỡ Harold Ridley là người đầu tiên phát minh ra thấu kính nội nhãn (IOL) từ nhựa dẻo Sau Thế chiến II, ông nhận thấy các mảnh vỡ từ buồng lái máy bay không gây phản ứng có hại cho mắt, và phát hiện nguồn gốc của chúng là polymethyl methacrylate (PMMA) Ridley đã sử dụng PMMA để chế tạo thủy tinh thể nhân tạo, ứng dụng trong điều trị bệnh đục thủy tinh thể và một số phẫu thuật tật khúc xạ như cận thị và viễn thị Phẫu thuật cấy ghép IOL đầu tiên vào mắt người diễn ra vào ngày 29 tháng 11 năm 1949.
Trong suốt 50 năm qua, công nghệ chế tạo IOL đã liên tục được cải tiến, với nhiều loại vật liệu được áp dụng để sản xuất IOL, nhằm tạo ra sản phẩm tối ưu và phù hợp nhất cho mắt người.
1.2.2 Các yêu cầu đối với vật liệu chế tạo thủy tinh thể nhân tạo
IOL được sử dụng như thủy tinh thể tự nhiên của mắt, vì vậy vật liệu chế tạo IOL cần đáp ứng bốn tiêu chí cơ bản: phản ứng với cơ thể, vòng đời, hiệu suất và tính phù hợp khi phẫu thuật IOL phải tương thích sinh học với cơ thể mà không gây ra phản ứng bất lợi Về vòng đời, IOL cần bền vững, không xuống cấp hay phân hủy trong suốt thời gian sử dụng, ít nhất là trong tuổi thọ mong đợi của con người Hiệu suất của IOL phải đảm bảo các đặc điểm quang học tương tự như thấu kính tự nhiên, bao gồm mật độ, chiết suất, độ truyền quang và tính ổn định Cuối cùng, về tính phù hợp, IOL phải được làm từ chất liệu hóa học an toàn, đảm bảo không gặp vấn đề khi đưa vào mắt và phù hợp với các kỹ thuật phẫu thuật hiện có.
1.2.3 Các loại vật liệu chế tạo thủy tinh thể nhân tạo
IOL được chế tạo từ các vật liệu cơ bản có sẵn, dễ thay thế là silicone, acrylic (ưa nước và kỵ nước) và polymethyl methacrylate
Polymethyl Methacrylate (PMMA) là vật liệu đầu tiên được sử dụng cho IOL PMMA có đặc tính cứng, không thể gấp lại được, kỵ nước, hàm lượng nước
Thấu kính PMMA có chỉ số khúc xạ 1,49, đường kính từ 5 – 7 mm, thường là mảnh đơn, dễ vỡ và mỏng Trong phẫu thuật ghép PMMA IOL, bác sĩ cần tạo vết rạch lớn, khiến loại IOL này ít được sử dụng hiện nay Tuy nhiên, ở các nước đang phát triển, PMMA IOL vẫn được ưa chuộng do chi phí thấp và độ bền lâu dài trong cấy ghép mắt ở trẻ em Khi tiếp xúc với nước, PMMA có thể bị xâm nhập, dẫn đến sự hình thành các không bào nhỏ trong thấu kính quang học, mặc dù hiện tượng này rất hiếm Hiện tại, PMMA được sử dụng cho IOL đặt tại chỗ nhờ vào độ cứng giúp chống nghiêng và ổn định vị trí.
Silicone là polymer của silicon với oxy và được đưa vào làm vật liệu cho
IOL được giới thiệu từ năm 1984 với vật liệu silicone kỵ nước, có chỉ số khúc xạ từ 1,41 đến 1,46 và đường kính từ 5,5 đến 6,5 mm Loại IOL này nổi bật với khả năng giảm biến chứng PCO sau phẫu thuật và là lựa chọn ưa thích cho phương pháp phẫu thuật sử dụng kim phun với vết mổ nhỏ hơn 2,8 mm Tuy nhiên, trong quá trình cấy ghép, thấu kính silicone có thể tăng nguy cơ nhiễm trùng do vi khuẩn bám dính Ngoài ra, silicone cũng gặp phải các nhược điểm tương tự như PMMA, bao gồm sự lắng đọng của giọt silicone trên bề mặt IOL sau khi loại bỏ dầu silicone, dẫn đến sự tạo và trao đổi Do đó, vật liệu silicone có thể không được ưu tiên cho những bệnh nhân cận thị có nguy cơ cao trong phẫu thuật đoạn sau.
Vật liệu acrylic ưa nước được cấu tạo từ hỗn hợp hydroxyethylmethacrylate
PolyHEMA và monome acrylic ưa nước là nhóm vật liệu có hàm lượng nước cao, từ 18-38%, với đặc tính thấu kính mềm và khả năng tương thích sinh học tốt nhờ bề mặt ưa nước Tuy nhiên, vật liệu acrylic ưa nước yếu hơn so với loại kỵ nước, với khả năng chống co thắt túi nang thấp hơn Hiện tượng này có thể do hàm lượng nước cao thu hút tế bào biểu mô bao sau thủy tinh thể phát triển, hoặc do IOLs này không có cạnh sắc như loại acrylic kỵ nước, làm giảm khả năng cản trở sự tái tạo của các tế bào này Thêm vào đó, thấu kính acrylic ưa nước có thể gây hiện tượng lắng đọng canxi, dẫn đến mờ mắt ở một số bệnh nhân.
[63] Điều này dẫn đến hậu quả là bệnh nhân phải ghép lại lần hai [31, 36, 55]
Vật liệu acrylic kỵ nước là các đồng trùng hợp của acrylate và methacrylate, có nguồn gốc từ PMMA cứng, với đặc điểm mềm dẻo, có thể gập lại ở nhiệt độ phòng và hàm lượng nước rất thấp Thấu kính gập lại bằng acrylic kỵ nước được giới thiệu vào năm 1993 và đã trở thành một trong những IOLs thành công nhất Mặc dù loại vật liệu này có thể gây ra chứng loạn thị sau phẫu thuật, nhưng tỷ lệ này đã giảm đáng kể nhờ vào những thay đổi trong thiết kế Biến chứng mờ đục bao sau (PCO) luôn là mối quan tâm trong phẫu thuật thay thế thủy tinh thể nhân tạo, dẫn đến nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra vật liệu tối ưu với tỷ lệ PCO thấp nhất Nghiên cứu của Luis G Vargas (2003) cho thấy tỷ lệ PCO ở mắt ghép thấu kính hai mặt lồi thấp hơn so với mắt ghép thấu kính hai mặt lõm Nikolaos Trakos (2008) và Virginie Bertrand (2014) đã so sánh nguy cơ PCO giữa các thủy tinh thể nhân tạo acrylic ưa nước và kỵ nước, với kết quả cho thấy bản chất và thiết kế không ảnh hưởng đến nguy cơ PCO Rahmi Duman và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng tỷ lệ mờ đục bao sau của nhóm acrylic ưa nước cao hơn rõ rệt so với nhóm kỵ nước sau 84 tháng theo dõi.
Tại Việt Nam, việc đầu tư nghiên cứu và chế tạo vật liệu sinh học, đặc biệt là thủy tinh thể nhân tạo, vẫn còn hạn chế do cơ sở sản xuất và quy trình công nghệ chưa phát triển Hầu hết các vật liệu sinh học hiện nay đều phải nhập khẩu Gần đây, Công ty cổ phần nhà máy thiết bị y học và vật liệu sinh học đã trở thành cơ sở đầu tiên sản xuất thủy tinh thể nhân tạo trong nước Tuy nhiên, trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng, cần thực hiện các thử nghiệm về tính phù hợp sinh học của vật liệu sản xuất trong nước.
Các nghiên cứu về tính phù hợp sinh học của vật liệu sinh học sản xuất trong nước đã được tiến hành, với những kết quả đáng chú ý Năm 2013, Ngô Duy Thìn và cộng sự nghiên cứu tính phù hợp mô của gốm sinh học Hydroxy Apatite (HA) và vật liệu carbon composite cấy vào cơ mông thỏ Tiếp theo, năm 2015, nhóm của Ngô Duy Thìn tiếp tục đánh giá tính phù hợp mô và độc tính tế bào của hợp kim Titan 5Al – 2.5 Fe và Titan 6 Al – 7 Nb Cùng năm, Đỗ Thùy Hương và cộng sự nghiên cứu tính phù hợp mô và khả năng cấy ghép của các loại stent trong bộ dụng cụ can thiệp mạch máu Kết quả cho thấy các vật liệu sinh học sản xuất tại Việt Nam có tính phù hợp mô cao, tương đương với vật liệu chứng của các công ty nước ngoài.
Thủy tinh thể nhân tạo do Công ty cổ phần nhà máy thiết bị y học và vật liệu sinh học sản xuất là một loại vật liệu sinh học mới Trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng, cần thực hiện nghiên cứu về tính phù hợp sinh học và phù hợp mô của vật liệu này.
Đánh giá tính an toàn, tương thích sinh học và thử nghiệm với thủy tinh thể nhân tạo
1.3.1 Tính phù hợp sinh học của vật liệu sinh học Đối với các vật liệu sinh học dùng trong cấy ghép như thủy tinh thể nhân tạo sử dụng cho mục đích điều chỉnh tầm nhìn của mắt, bên cạnh chất lượng và hiệu suất của vật liệu thì tính phù hợp sinh học là vấn đề được các nhà khoa học vật liệu và y học lâm sàng quan tâm
Phù hợp sinh học là khả năng của vật liệu ghép trong việc tạo ra phản ứng sinh học thích hợp cho các ứng dụng chức năng đặc biệt Những vật liệu này thường không gây ra sự phá vỡ hay rối loạn các chức năng bình thường của cơ thể, nghĩa là chúng không độc hại, không gây dị ứng, không kích thích phản ứng miễn dịch, và không gây ung thư hay đột biến.
Tính phù hợp sinh học là yêu cầu bắt buộc cho tất cả các loại vật liệu ghép Việc đánh giá tính phù hợp sinh học của vật liệu với cơ thể trước khi ứng dụng lâm sàng là rất cần thiết ISO 10993 đã thiết lập các tiêu chí đánh giá tính phù hợp sinh học cho từng loại vật liệu ghép, dựa trên bản chất và thời gian tiếp xúc của chúng.
Bảng 1.1 Các phép thử đánh giá ban đầu để xem xét khả năng phù hợp sinh học của vật liệu [9]
Cách phân loại các trang thiết bị y tế theo Tác động sinh học
Bản chất tiếp xúc Thời gian tiếp xúc
Gây kích thích hoặc phản ứng da
Nhiễ m độc cấp tính Độc tính bán trường diễn Đột biến gen
Trang thiết bị bề mặt
Bề mặt bị thủng hoặc tổn thương
Trang thiết bị truyền ngoài Đường huyết, gián tiếp
Trang thiết bị cấy ghép
Thủy tinh thể nhân tạo là thiết bị cấy ghép tiếp xúc vĩnh viễn với mô Để đánh giá khả năng phù hợp sinh học của vật liệu, hai tiêu chí quan trọng hàng đầu là tính phù hợp mô và độc tính tế bào đã được lựa chọn để trình bày trong luận văn thạc sĩ này.
1.3.2 Tính phù hợp mô của vật liệu sinh học
1.3.2.1 Phản ứng của cơ thể với vật liệu ghép
Sau khi cấy ghép, sự tương tác giữa hệ miễn dịch của người nhận và vật liệu sinh học diễn ra phức tạp, liên quan đến đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, ảnh hưởng đến khả năng hòa hợp mô Phản ứng viêm là phản ứng bình thường khi vật lạ được đưa vào cơ thể, bắt đầu bằng việc hình thành cục máu đông tạm thời, sau đó là viêm cấp tính vô khuẩn, tiến triển đến viêm mạn tính, phát triển mô hạt và cuối cùng là xơ hóa Các đặc điểm của vật liệu sinh học như kích thước, hình dạng và tính chất lý hóa có vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến mức độ và thời gian phản ứng của cơ thể Do đó, mức độ và diễn biến của phản ứng sau khi ghép sẽ phản ánh tính phù hợp mô của vật liệu cấy ghép.
1.3.2.2 Diễn biến quá trình phản ứng của cơ thể sau ghép vật liệu sinh học
Viêm là phản ứng tự vệ của cơ thể chống lại tác nhân xâm nhập, diễn ra ngay sau khi cô lập vùng tổn thương trong cấy ghép vật liệu sinh học Phản ứng viêm cấp tính xuất hiện với các dấu hiệu sưng, nóng, đỏ, đau và sự xâm nhập của bạch cầu đa nhân trung tính, thường xảy ra nhanh chóng Tiếp theo, viêm mạn tính phát triển với sự xuất hiện của bạch cầu đơn nhân và lympho bào tại vị trí tổn thương, nhưng thường bị giới hạn tại khu vực cấy ghép Thời gian phản ứng viêm sau cấy ghép, bao gồm cả viêm cấp tính và mạn tính, thường không kéo dài quá hai tuần; nếu kéo dài trên ba tuần, có thể là dấu hiệu của nhiễm trùng và thải ghép.
Sự phát triển của mô hạt diễn ra sau khi phản ứng viêm kết thúc, tại các vị trí ghép vật liệu sinh học Mô hạt được đặc trưng bởi sự xuất hiện của đại thực bào, nguyên bào sợi và sự gia tăng mạch máu Các nguyên bào sợi đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp collagen và proteoglycan, tạo nền tảng cho quá trình xơ hóa.
Xơ hóa là giai đoạn cuối trong quá trình lành vết thương, nơi vị trí tổn thương do cấy ghép vật liệu sinh học được sửa chữa thông qua tái tạo mô mới hoặc hình thành sẹo xơ.
Diễn biến thời gian của các phản ứng hàn gắn vết thương sẽ được diễn ra như sau :
0 giờ (Ngay khi phẫu thuật): đường rạch sẽ được lấp đầy bởi các cục máu đông
Trong khoảng thời gian từ 3 đến 24 giờ sau phẫu thuật, phản ứng viêm cấp diễn ra với sự tập trung của các bạch cầu đa nhân trung tính tại vị trí tổn thương Các tế bào này được thu hút đến ổ viêm nhờ các chất hóa ứng động như histamin, leukotrien và bổ thể C5a Bạch cầu đa nhân trung tính đóng vai trò quan trọng trong việc thực bào mô bị tổn thương và tiêu diệt các vi khuẩn có thể xâm nhập vào mô trong quá trình phẫu thuật.
Trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ sau phẫu thuật, các tế bào biểu mô bắt đầu di chuyển từ mép vết thương để tạo ra màng đáy, trong khi sự tăng sinh của tế bào diễn ra ở mức tối thiểu.
Vào ngày thứ 3 sau phẫu thuật, quá trình chuyển từ phản ứng viêm cấp sang viêm mạn tính bắt đầu diễn ra Các bạch cầu đa nhân trung tính dần được thay thế bởi các bạch cầu đơn nhân như đại thực bào và lympho bào Đại thực bào tiếp tục thực hiện nhiệm vụ thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính và đồng thời trình diện kháng nguyên với các tế bào miễn dịch đặc hiệu Sau giai đoạn này, mô hạt bắt đầu xuất hiện.
Vào ngày thứ 5 sau phẫu thuật, vết thương đã được lấp đầy bởi mô hạt giàu mạch máu tân tạo, cho thấy quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra mạnh mẽ và sự xuất hiện của collagen bắt đầu.
Trong tuần thứ 2 sau phẫu thuật, quá trình viêm và phản ứng mô hạt bắt đầu giảm dần, trong khi đó, sự tăng sinh nguyên bào sợi và tích lũy collagen tại vị trí tổn thương gia tăng.
Tháng thứ 2 sau phẫu thuật: vết sẹo đã được hình thành bao gồm mô liên kết không viêm được bao phủ bởi một lớp thượng bì nguyên vẹn
1.3.2.3 Quá trình phản ứng của mắt sau khi ghép thủy tinh thể nhân tạo
Sau phẫu thuật đục thủy tinh thể và cấy ghép IOL, hàng rào nước-máu bị phá vỡ, dẫn đến sự giải phóng ngay lập tức protein và đại thực bào vào khoang trước.
Sự lắng đọng protein trên bề mặt thấu kính IOL phụ thuộc vào đặc tính và cấu trúc hóa học của vật liệu Hiện tượng này không chỉ tạo điều kiện cho sự tích tụ của các tế bào khác mà còn kích hoạt hệ thống miễn dịch, dẫn đến sự chuyển đổi của các tế bào viêm thành đại thực bào và tế bào khổng lồ Phản ứng tế bào diễn ra qua hai giai đoạn: giai đoạn đầu với sự xuất hiện của các tế bào nhỏ, hình tròn trong tháng đầu tiên, và giai đoạn sau với sự gia tăng của các tế bào khổng lồ vào tháng thứ ba Cuối cùng, các tế bào khổng lồ này thoái hóa và tách ra, tạo thành một màng protein bao quanh IOL, cô lập nó khỏi các mô mắt xung quanh.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu diễn ra từ tháng 9/2017 đến tháng 11/2018, tại Bộ môn Mô – Phôi - Tế bào thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, và Bộ môn Mô phôi của Trường Đại học Y Hà Nội.
Cỡ mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu đánh giá khả năng phù hợp mô được thực hiện trên 40 con thỏ, chia thành hai lô: lô nghiên cứu với 30 con ghép vật liệu thử nghiệm (thủy tinh thể nhân tạo CI26Y) và lô chứng với 10 con ghép vật liệu chứng (thủy tinh thể nhân tạo EyePx602) Mỗi lô được chia thành hai nhóm, trong đó nhóm 1 lấy mô vùng cấy ghép vật liệu sau 4 tuần và nhóm 2 lấy mô sau 8 tuần.
Nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào được thực hiện trên các giếng nuôi cấy tế bào với nồng độ 5000 tế bào HEK mỗi giếng Mỗi lô nghiên cứu bao gồm 3 giếng chứa tế bào HEK cùng vật liệu nghiên cứu và 3 giếng đối chứng âm chỉ chứa tế bào HEK.
Quy trình nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá khả năng phù hợp mô
Nghiên cứu đánh giá phù hợp mô được thực hiện cụ thể theo sơ đồ sau:
2.4.1.1 Đánh giá đáp ứng của cơ thể với mảnh phôi thủy tinh thể
Bước 1: Phẫu thuật cấy ghép thủy tinh thể vào mô dưới da thỏ
- Thỏ được cạo sạch lông bộc lộ vùng mông
Làm sạch vùng da phẫu thuật bằng nước muối sinh lý 0,9% và lau khô Sau đó, sát trùng vùng mông thỏ bằng dung dịch Betadine 10% Cuối cùng, trải săng vô trùng có khoét lỗ tại vị trí phẫu thuật.
- Gây tê tại chỗ vùng mông thỏ bằng Lidocain 2%
Tiến hành cấy ghép bao gồm việc rạch da và bóc tách mô liên kết dưới da của mông thỏ Sau đó, mảnh thủy tinh thể nhân tạo chứng và mảnh thủy tinh thể nhân tạo nghiên cứu được đưa vào lớp mô liên kết dưới da thỏ Cuối cùng, vết mổ được đóng lại bằng chỉ lin.
Mỗi thỏ sẽ được ghép một thủy tinh thể nhân tạo
Bộc lộ vùng phẫu thuật Gây tê bằng Lidocain 2% Đưa vật liệu vào mô dưới da Đóng vết mổ bằng chỉ lin
Hình 2.2 Các bước phẫu thuật cấy thủy tinh thể nhân tạo vào mô dưới da thỏ
Bước 2: Theo dõi tình trạng toàn thân và tại vị trí cấy ghép vật liệu của thỏ sau phẫu thuật trong thời gian nghiên cứu:
Trong tuần đầu tiên sau khi cấy ghép, cần sát trùng vết mổ của thỏ bằng dung dịch Betadine 10% Đồng thời, theo dõi tình trạng ăn uống của thỏ, kiểm tra xem có hiện tượng phân khô, đi ngoài hay không, và quan sát vết mổ để phát hiện dấu hiệu chảy dịch, đỏ hoặc sưng.
Bước 3: Đánh giá sau ghép 4 tuần và 8 tuần
- Đánh giá tình trạng đại thể và vi thể vùng mô cấy ghép vật liệu sau 4 tuần và 8 tuần theo các chỉ tiêu nghiên cứu
Bước 4: So sánh các chỉ số đánh giá giữa lô nghiên cứu và lô chứng
2.4.1.2 Đánh giá phù hợp mô ở mức cấu trúc mô học
Mục đích: đánh giá cấu trúc vi thể của mô sau ghép vật liêu a Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm Hematoxylin-Eosin (H.E)
Quy trình được thực hiện như sau:
+ Lấy bệnh phẩm: lấy vùng mô xung quanh vị trí ghép vật liệu với bán kính
+ Mẫu mô được cố định bằng dung dịch Formalin 10% nhằm làm chết tế bào nhưng vẫn giữ được chúng trong tình trạng giống như khi sống
+ Khử nước bằng cồn có nồng độ tăng dần
+ Làm trong miếng mô bằng Toluen
+ Đúc miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự
+ Cắt mẫu thành cỏc những lỏt mỏng 4 àm, mỗi lỏt cỏch nhau từ 25 – 30 àm + Nhuộm màu lát cắt bằng Hematoxin-Eosin, dán lamelle
+ Tiêu bản được quan sát trên kính hiển vi định lượng Axioplan 2, Carl – Zeiss - Đức và chụp ảnh ở độ phóng đại 100x và 400x, đo màng xơ bằng phần mềm
KS 400 kết nối với máy tính và kính hiển vi, cho phép đánh giá hình ảnh vi thể của cấu trúc mô sau ghép ở tuần thứ 4 và tuần thứ 8 của lô chứng và lô nghiên cứu Kỹ thuật nhuộm tiêu bản 3 màu theo phương pháp Masson được áp dụng để phân tích chi tiết.
+ Lấy bệnh phẩm: lấy vùng mô xung quanh vị trí ghép vật liệu với bán kính
+ Mẫu mô được cố định bằng dung dịch Formaldehyd 10% nhằm làm chết tế bào nhưng vẫn giữ được chúng trong tình trạng giống như khi sống
+ Khử nước bằng cồn có nồng độ tăng dần
+ Làm trong miếng mô bằng Toluen
+ Đúc miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự
Cut the samples into thin slices of 4 microns, ensuring that each slice is spaced 25 to 30 microns apart Stain the cut sections using a three-color dye: Goldner’s Trichrome (Masson’s Trichrome with light green), and then mount them on a slide.
+ Tiêu bản được quan sát trên kính hiển vi định lượng Axioplan 2, Carl –
Zeiss - Đức và chụp ảnh ở độ phóng đại 10x và 40x, đo màng xơ bằng phần mềm
KS 400 kết nối với máy tính và kính hiển vi, cho phép đánh giá hình ảnh vi thể của cấu trúc mô sau ghép ở tuần thứ 4 và tuần thứ 8 của lô chứng và lô nghiên cứu.
2.4.2 Đánh giá khả năng gây độc tế bào
Chúng tôi sử dụng bộ Kit Luminescent Cell Viability Assay để đánh giá độc tính tế bào, tuân thủ theo TCVN 7391 (ISO 10993 -5) và OECD Với mẫu rắn được cấy trực tiếp vào mô trong quá trình điều trị, phương pháp thử độc trực tiếp được lựa chọn để kiểm tra ảnh hưởng của vật liệu đối với dòng tế bào HEK293 Mẫu cũng được thử nghiệm với vật liệu chứng là thủy tinh thể nhân tạo EyePx602 do công ty Oculentis (Pháp) sản xuất.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phơi nhiễm tế bào HEK293 với vật liệu thử ở các nồng độ khác nhau để đánh giá tác động độc tính của vật liệu lên tế bào Quá trình thử nghiệm bao gồm việc chuẩn bị tế bào và vật liệu thử nghiệm.
2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào HEK293
Tế bào HEK293 có hình dạng đa giác, khả năng phân chia mạnh và sức sống ổn định qua nhiều lần cấy chuyển
Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào HEK293 trong 1-2 tuần, thực hiện 3 lần cấy chuyển để ổn định dòng tế bào trước khi kiểm tra tác động của vật liệu.
Hình 2.3 Hình thái tế bào HEK293 trong điều kiện nuôi cấy ổn định
2.4.2.2 Chuẩn bị vật liệu thử nghiệm:
Dụng cụ nghiền mẫu bao gồm thanh dũa mài kim loại cứng, panh gắp mẫu, đĩa petri và ống eppendorf để chứa mẫu sau khi nghiền Tất cả các dụng cụ này cần được khử trùng ướt ở nhiệt độ 121 oC trong 20 phút và sau đó sấy khô trước khi sử dụng.
Các vật liệu thử nghiệm được nghiền nhỏ bằng cơ học và sau đó được đựng trong ống Eppendorf 1.5mL Trước khi pha vào môi trường nuôi tế bào, các mẫu này được khử trùng để ngăn ngừa nhiễm vi khuẩn trong quá trình xử lý.
Hình 2.4 Hình ảnh mẫu trước và sau khi nghiền nhỏ bằng cơ học
Bước 1: Cấy chuyển tế bào lên đĩa 96 giếng với mật độ tế bào 5000 tế bào/giếng
Bước 2: Pha vật liệu vào trong môi trường nuôi cấy theo một dải nồng độ giảm dần đều như trình bày trong bảng 2.8
Bảng 2.8 Dải nồng độ các vật liệu thử nghiệm
Tên vật liệu Dải nồng độ (mg/mL)
Mẫu chứng: EyePx602; Mẫu thử: CI26Y
Sau 24 giờ cấy chuyển tế bào, cần hút bỏ môi trường cũ và bổ sung môi trường chứa vật liệu vào giếng Mỗi nồng độ vật liệu được thử nghiệm trong 3 giếng để đảm bảo dữ liệu thu được có độ lặp lại thống kê Đối chứng âm bao gồm 3 giếng chỉ chứa tế bào và môi trường nuôi cấy mà không có vật liệu Cuối cùng, ủ đĩa trong tủ nuôi cấy trong 48 giờ.
Bước 4: Bổ sung 100àL Celltiter Glođ Luminescent vào mỗi giếng chứa sẵn 100àL mụi trường
Bước 5: Lắc đĩa 2000 vòng/phút trong 2 phút trên máy lắc mẫu
Bước 6: Đo tín hiệu phát quang trên máy TriStar LB942.
Xử lý số liệu
2.5.1 Nghiên cứu đánh giá khả năng phù hợp mô
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t – test Student bằng phần mềm SPSS 16.0
Số liệu được biểu diễn dưới dạng ̅ ± SD
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tế bào
2.5.2 Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tế bào
Thu nhập dữ liệu và phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism5
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm sẽ tuân thủ các quy định về sử dụng động vật, nhằm giảm thiểu số lượng động vật được sử dụng và hạn chế tối đa sự đau đớn cho chúng.
