So sánh một số tác dụng trên máu in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

So sánh một số tác dụng trên máu in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin So sánh một số tác dụng trên máu in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

TỔNG QUAN

Tổng quan về quercetin

1.1.1 Công thức hóa học và tính chất lý hóa

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Quercetin [13]

Tên của quercetin bắt nguồn từ từ tiếng Latin “ Quercetum ”, có nghĩa là Rừng sồi, và cũng thuộc loại flavonol, không được sản xuất trong cơ thể con người [14]

Danh pháp IUPAC: 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1 benzopyran-4- one [13]

Quercetin là một flavonol với cấu trúc C6 - C3 - C6, bao gồm hai vòng benzen (A và B) nối với nhau qua một mạch 3 carbon Trong cấu trúc của quercetin, có 5 nhóm hydroxyl (-OH) tại các vị trí 3, 3’, 4’, 5 và 7, giúp nó trở thành một trong những chất chống oxy hóa mạnh nhất trong nhóm flavonoid Quá trình glycosyl hóa có thể xảy ra trên bất kỳ nhóm hydroxyl nào của quercetin, cho phép nó liên kết với các loại đường như glucose, xylose hoặc rutinose, tạo thành các dạng glycosid khác nhau, ảnh hưởng đến tính tan, hấp thu và hoạt tính sinh học của nó.

Quercetin có cấu trúc phân tử với nhóm ketocarbonyl và nguyên tử oxy bazơ trên carbon đầu tiên, cho phép tạo muối với axit mạnh Nó chứa bốn nhóm hoạt động: nhóm dihydroxy giữa vòng A, nhóm o-dihydroxy B, vòng C1 C2, và liên kết đôi C3 cùng 4-carbonyl Nhờ sự hiện diện của nhóm hydroxyl phenolic và các liên kết đôi, quercetin thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ Vòng B trong flavonoid tự nhiên là vị trí chính để loại bỏ các loại oxy phản ứng và chống oxy hóa (ROS).

Tổng quan tính chất lý hoá của quercetin được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc tính lý hóa của quercetin [13] Đặc điểm Nội dung

Tính chất vật lý Tinh thể màu vàng, bột vàng Chuyển hóa thành dạng anhydrous tại 203-207°F Dung dịch có cồn vị hơi đắng

Màu sắc Tinh thể màu vàng

Nhiệt độ nóng chảy 316,5°C Độ hòa tan

Trong nước: 60 mg/mL tại 16°C; < 1 mg/mL tại 70°F Tan nhiều trong ete, metanol; tan được trong ethanol, aceton, pyridin, acid axetic Áp suất bay hơi 2,81x10 -14 mmHg tại 25°C

Sự phân hủy Khi đun sôi, bốc ra khói hăng và kích ứng

Hệ số phân ly pKa1=7,17; pKa2=8,26; pKa3,13; pKa4,30; pKa5,11

Phổ UV-vis Hấp thụ tối đa: 256 nm (logE=4,32); 301 nm (logE=3,89);

Quercetin chuẩn từ thực nghiệm

OH tự do (3218,09-3411 cm -1 ), OH phenol (1663 cm -1 ), C=O (1608 cm -1 ), C=C (1523 cm -1 ), C-H (1496 cm -1 ), mặt phẳng uốn (1383 cm -1 ), C-O aryl (1318 cm -1 ), C-O phenol

Quercetin thuộc nhóm II trong bảng sinh dược học bào chế nhờ vào tính thấm tốt, nhưng độ hòa tan của nó trong nước chỉ khoảng 0,01 mg/mL.

Quá trình hấp thu, chuyển hóa, phân bố, thải trừ của quercetin trong cơ thể được minh họa ở hình 1.2

Quercetin liên kết với protein nước bọt giàu proline qua liên kết hydro hoặc tương tác kỵ nước, tạo thành phức hợp tan trong nước mà không ảnh hưởng đến quá trình hấp thu Trong dạ dày, chỉ một phần nhỏ quercetin bị phân hủy thành axit phenolic do môi trường axit và được hấp thu tại biểu mô dạ dày Hấp thu quercetin chủ yếu diễn ra qua niêm mạc ruột non, tuy nhiên mức độ hấp thu thấp do hoạt chất này ít tan trong nước Nồng độ tối đa của quercetin trong huyết tương được ghi nhận sau khi uống ở chuột.

Liều 50 mg/kg tương đương với 2,01 àmol/l, cho thấy sinh khả dụng khoảng 16,2%, trong khi ở lợn là khoảng 17% Ở người khỏe mạnh, khi uống liều 500 mg, nồng độ quercetin trong huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 10,93 ng/ml Quercetin chủ yếu được chuyển hóa qua các quá trình methyl hóa, sulfat hóa và glucuronate tại ruột non và gan, thuộc giai đoạn II của quá trình chuyển hóa.

Quercetin được hấp thụ vào máu qua tĩnh mạch cửa và tại ruột non và già, nó chuyển hóa thành các axit phenolic Trong huyết tương, các dạng chuyển hóa chính tồn tại dưới dạng glucuronide methyl hóa hoặc sulfat không methyl hóa, với quercetin-3-O-β-D-glucuronide là chất chuyển hóa chủ yếu, được vận chuyển đến mô đích để phát huy tác dụng sinh học.

Quercetin, sau khi được hấp thu ở ruột non, được phân bố rộng rãi đến các mô trong cơ thể và có khả năng liên kết mạnh với albumin trong huyết tương lên đến 98%.

Hình 1.2 Quá trình hấp thu, chuyển hóa và thải trừ của quercetin [24]

Quercetin được thải trừ chủ yếu qua thận, bên cạnh đó còn được bài tiết qua phân, nước tiểu với liều lượng cao và hơi thở Các sản phẩm thải trừ của quercetin bao gồm acid 3-hydroxy phenylacetic, acid hippuric và acid benzoic.

Nghiên cứu về dược động học của quercetin cho thấy hoạt chất này có độ tan thấp, chuyển hóa mạnh và thải trừ nhanh, dẫn đến sinh khả dụng (SKD) của quercetin ở mức thấp.

1.1.3 Đặc tính chống đông máu của quercertin

Quercetin có cấu trúc đặc trưng với nhóm hydroxyl tại vị trí C3 và hai nhóm hydroxyl khác tại vòng B (tại vị trí 3', 4'), giúp tăng cường khả năng ức chế thrombin Nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy quercetin ức chế quá trình đông máu bằng cách làm chậm sự hình thành polyme fibrin, ngăn chặn sự tạo cục máu đông và hỗ trợ phân hủy huyết khối Cơ chế tác động của quercetin bao gồm việc ức chế trực tiếp hoạt động enzym của thrombin và các yếu tố liên quan.

Xa (FXa) là một proteinase quan trọng trong chuỗi đông máu Quercetin có khả năng tạo liên kết hydro với các vị trí hoạt động trong túi S3 của thrombin, từ đó góp phần vào hiệu quả ức chế Một dẫn xuất của quercetin, quercetin-3-O-β-D-glucoside, cũng cho thấy tác dụng chống đông máu, nhưng ở mức độ thấp hơn do sự hiện diện của glucose tại vị trí C-3 làm giảm hoạt tính sinh học.

Tổng quan về phytosome quercetin

Phytosome là cấu trúc tương tự như màng tế bào sinh học, với "phyto" có nghĩa là thực vật và "some" ám chỉ tế bào Nhờ vào tính tương hợp sinh học cao, phytosome dễ dàng được vận chuyển vào bên trong tế bào.

Phytosome là sự kết hợp giữa phospholipid và các hoạt chất dược liệu như polyphenol và triterpen ở cấp độ phân tử Chúng được hình thành từ phản ứng giữa phosphatidylcholin hoặc các nhóm có đầu phân cực ưa nước với chiết xuất thực vật trong dung môi không phân cực.

1.2.2 Thành phần cấu tạo của phytosome

Hai thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân phytosome: Hoạt chất và phospholipid (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc của phytosome [30]

Các hoạt chất trong hệ phytosome chủ yếu có nguồn gốc từ dược liệu, đặc biệt là nhóm polyphenol như flavonoid (rutin, silymarin, quercetin) Ngoài ra, hệ phytosome còn có thể chứa các nhóm hoạt chất khác như saponin và terpenoid.

Phospholipid có cấu trúc gồm hai phần: phần phosphatidyl thân dầu và phần cholin thân nước Trong phức hợp phytosome, đầu cholin của phospholipid liên kết với hoạt chất, trong khi đầu phosphatidyl bao bọc hoạt chất, tạo thành các tiểu phân hình cầu Cấu trúc này giúp bảo vệ hoạt chất khỏi tác động bất lợi từ môi trường trong quá trình bảo quản và hạn chế sự phân hủy khi vào cơ thể.

Hai loại phospholipid phổ biến trong bào chế phytosome là lecithin và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC), trong đó HSPC có độ tinh khiết và độ ổn định cao hơn lecithin Phosphatidylcholin (PC) là thành phần chính của màng tế bào, do đó phytosome chứa PC có cấu trúc tương tự màng sinh học, giúp tăng cường khả năng hấp thu nhanh và hiệu quả.

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của phosphatidyl cholin [33]

1.2.3 Ưu nhược điểm của phytosome Ưu điểm

Phytosome có khả năng tan trong cả dung môi thân dầu và thân nước, giúp tăng cường hấp thu chất và sinh khả dụng đường uống Điều này không chỉ giảm liều dùng mà còn nâng cao hiệu quả trong điều trị.

Phức hợp phyto-phospholipid có khả năng chuyển đổi dễ dàng giữa môi trường ưa nước và môi trường ưa béo của màng tế bào, giúp tăng cường hấp thụ qua da Việc ứng dụng các thành phần thực vật dưới dạng phytosome đã cải thiện đáng kể khả năng hấp thụ của chúng Chính vì vậy, phytosome ngày càng được sử dụng phổ biến trong ngành mỹ phẩm.

Phytosome được cấu tạo từ hai thành phần chính: hoạt chất có nguồn gốc dược liệu và phospholipid (PL) PL là tá dược phân giải sinh học cao, an toàn cho cơ thể, không độc hại và không gây phản ứng miễn dịch khi vào tuần hoàn.

Quercetin là một hợp chất có độ tan trong nước thấp (0,01 mg/ml) và độ ổn định không cao, phụ thuộc vào nhiệt độ, pH, sự hiện diện của các ion kim loại và glutathion Tuy nhiên, độ tan của quercetin có thể được cải thiện khi tạo phức với lecithin theo tỉ lệ 1:1 trong tất cả các môi trường.

Nhược điểm: Bên cạnh ưu điểm của phytosome thì hiện nay phytosome vẫn chưa được sử dụng rộng rãi, bởi vì phytosome cũng còn nhiều hạn chế:

Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome hiện nay sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, gây ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường và có khả năng để lại dư lượng trong sản phẩm Phương pháp bào chế phytosome bằng siêu tới hạn có thể khắc phục nhược điểm này, tuy nhiên, nó yêu cầu kỹ thuật phức tạp và chưa phổ biến.

1.2.4 Một số nghiên cứu về so sánh tác dụng dược lý của quercetin và phytosome quercetin

Một số nghiên cứu về so sánh tác dụng dược lý của quercetin và phytosome quercetin được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về so sánh tác dụng dược lý của quercetin và phytosome quercetin Tác dụng dược lý Phương pháp nghiên cứu Kết quả TLTK

Chống lại ký sinh trùng

Các mẫu quercetin và phytosome quercetin được đánh giá in vitro trên hai mô hình ký sinh trùng là Leishmania major và Plasmodium falciparum

Ngoài ra, độ an toàn của các mẫu được kiểm tra trên tế bào người HFF (Human Foreskin Fibroblast) bằng thử nghiệm MTT

Phytosome quercetin có hiệu lực diệt ký sinh trùng vượt trội hơn quercetin Ở nồng độ

Quercetin phytosome với nồng độ 400 àg/mL có khả năng tiêu diệt 65-70% tế bào, trong khi quercetin thông thường chỉ đạt hiệu quả khoảng 40-45% Giá trị IC₅₀ của quercetin phytosome thấp hơn rõ rệt, cho thấy tính hiệu quả cao hơn Đặc biệt, cả hai dạng quercetin đều không gây độc đáng kể trên tế bào người, nhưng quercetin phytosome thể hiện độ an toàn cao hơn.

Phytosome quercetin được chế tạo thông qua phương pháp dung môi bay hơi kết hợp với siêu âm Hiệu quả ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 được đánh giá bằng xét nghiệm MTT để xác định giá trị IC₅₀, cùng với các phương pháp nhuộm DAPI và phân tích flow cytometry nhằm khảo sát khả năng gây apoptosis của phytosome quercetin và quercetin.

Trong các thử nghiệm trên tế bào MCF-7, phytosome quercetin cho thấy hoạt tính ức chế mạnh mẽ hơn so với quercetin tự do, với giá trị IC₅₀ giảm gần một nửa, cụ thể là 18.79 µg/mL so với 35.42 µg/mL.

Chống loãng xương và giảm stress oxy hóa

Mô hình chuột cắt buồng trứng được sử dụng để mô phỏng tình trạng thiếu estrogen, với các nhóm điều trị bao gồm quercetin tự do và quercetin dưới dạng phytosome Hiệu quả của các phương pháp điều trị này được đánh giá thông qua mật độ xương, các chỉ số sinh hóa và phân tích mô học xương.

Nhóm điều trị bằng quercetin phytosome đã ghi nhận sự tăng trưởng mật độ xương lên đến 25% so với nhóm không điều trị Đồng thời, các chỉ số men chuyển hóa xương và dấu hiệu stress oxy hóa cũng giảm đáng kể So với nhóm sử dụng quercetin thông thường, nhóm phytosome quercetin cho thấy hiệu quả vượt trội hơn, với sự cải thiện rõ rệt về mật độ xương và giảm stress oxy hóa.

Sinh lý quá trình đông máu

1.3.1 Các giai đoạn của cơ chế cầm máu

1.3.1.1 Giai đoạn cầm máu ban đầu (giai đoạn cầm máu tức thời)

Giai đoạn cầm máu ban đầu diễn ra trong 5 bước (Hình 1.5)

Cầm máu ban đầu diễn ra khi thành mạch bị tổn thương, làm lộ lớp dưới nội mạc và kích hoạt tiểu cầu Yếu tố von Willebrand (VWF) liên kết với collagen trong thành mạch, giúp tiểu cầu bám dính vào vị trí tổn thương qua thụ thể GPIb Đồng thời, mạch máu co lại, giảm lưu lượng máu để hạn chế chảy máu.

Hoạt hóa tiểu cầu là quá trình quan trọng sau khi tiểu cầu bám dính, trong đó chúng thay đổi hình dạng để tăng cường khả năng kết nối Quá trình này đi kèm với việc giải phóng các chất như ADP, serotonin, epinephrin và thromboxan A₂, giúp kích thích kết tập tiểu cầu và khuếch đại phản ứng cầm máu.

Kết tập tiểu cầu và hình thành nút tiểu cầu là quá trình quan trọng trong cầm máu Các tiểu cầu liên kết với nhau qua thụ thể GPIIb/IIIa, tạo thành một nút tiểu cầu tạm thời tại vùng tổn thương Nút tiểu cầu này phát triển trong vài phút để bịt kín vết thương, tuy nhiên, đây chỉ là biện pháp cầm máu tạm thời, đặc biệt là ở các mạch máu lớn.

Hình 1.5 Sơ đồ đinh cầm máu (nút tiểu cầu) [42]

Kích hoạt quá trình đông máu bắt đầu khi nút tiểu cầu hình thành, trong đó tiểu cầu tiết lộ yếu tố 3 tiểu cầu, một phospholipid bề mặt quan trọng Yếu tố này thúc đẩy quá trình đông máu bằng cách kích hoạt các yếu tố đông máu huyết tương, dẫn đến sự hình thành lưới fibrin, giúp ổn định cục máu đông.

Quá trình đông máu tiếp tục nhờ các yếu tố đông máu huyết tương, hình thành mạng lưới fibrin ổn định cục máu đông dưới áp lực dòng máu Đây là bước quan trọng để cầm máu hoàn toàn, đặc biệt ở mạch máu lớn, và ngăn ngừa chảy máu tái phát.

1.3.1.2 Đông máu huyết tương (giai đoạn cầm máu duy trì)

Các chuỗi phản ứng hóa học của đông máu được chia thành ba giai đoạn

Giai đoạn 1 của quá trình đông máu là giai đoạn tạo protrombinase, còn được gọi là tromboplastin hoạt động hoặc yếu tố chuyển protrombin Giai đoạn này bắt đầu khi máu tiếp xúc với mô tổn thương qua con đường ngoại sinh hoặc được khởi động khi tiếp xúc với mô tổn thương qua con đường nội sinh.

Đông máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổn thương, dẫn đến sự giải phóng yếu tố III từ mô Yếu tố này tương tác với yếu tố VII trong huyết tương và ion calci, tạo thành tác nhân hoạt hóa yếu tố X Yếu tố X hoạt hóa (Xh) kết hợp với ion calci và yếu tố V trên các hạt mixen phospholipid của mô, hình thành phức hợp protrombinase.

Đông máu nội sinh bắt đầu khi yếu tố XII được kích hoạt do tiếp xúc với collagen, fibrin hoặc màng tiểu cầu, cũng như do stress hoặc bề mặt lạ Yếu tố XIIa sau đó kích hoạt yếu tố XIa, và cùng với ion calci, kích hoạt yếu tố IX Yếu tố IXa kết hợp với yếu tố VIIIa trên phospholipid tiểu cầu và ion calci để tạo thành phức hợp enzym hoạt hóa yếu tố X.

Va trên tiểu cầu và ion calci hình thành phức hợp prothrombinase, tương tự con đường ngoại sinh [43]

Giai đoạn 2: Giai đoạn chuyển protrombin thành trombin

Prothrombin là một globulin do gan sản xuất, tồn tại trong huyết tương như tiền enzym của thrombin Quá trình chuyển đổi prothrombin thành thrombin diễn ra dưới tác động của prothrombinase và ion calci (Ca²⁺) Mặc dù ban đầu quá trình này diễn ra chậm, nhưng thrombin sau đó kích hoạt yếu tố V và VIII, tạo ra vòng khuếch đại, giúp tăng tốc độ chuyển đổi Thrombin cũng kích hoạt yếu tố XIII, ổn định mạng lưới fibrin và hoàn thiện cục máu đông.

Giai đoạn 3: Giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin

Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tương, được sản xuất bởi gan Trombin chuyển đổi fibrinogen thành sợi fibrin đơn phân, sau đó các sợi fibrin này tự trùng hợp để tạo thành mạng fibrin không hòa tan Trombin cũng kích hoạt yếu tố XIII, và với sự có mặt của ion canxi, mạng lưới fibrin trở nên ổn định nhờ các liên kết đồng hóa trị giữa các sợi fibrin.

1.3.1.3 Giai đoạn tiêu sợi huyết

Mục đích cơ bản của quá trình tiêu sợi huyết là làm tan fibrin và trả lại sự thông thoáng cho mạch máu

Tiêu sợi huyết là phản ứng sinh lý quan trọng giúp loại bỏ cục máu đông sau tổn thương mạch máu Plasminogen, một tiền enzyme dạng β-globulin trong máu và dịch tổ chức, được kích hoạt thành plasmin qua con đường nội sinh hoặc ngoại sinh, chủ yếu nhờ tPA (tissue plasminogen activator) do tế bào nội mô tiết ra Plasmin sau khi được hoạt hóa sẽ phân hủy fibrin, fibrinogen và các yếu tố đông máu như V và VIII, giúp điều hòa giữa đông máu và tiêu sợi huyết Cơ thể kiểm soát quá trình này bằng các chất ức chế như PAI, α₂-antiplasmin và α₂-macroglobulin để ngăn ngừa tiêu sợi huyết quá mức và tránh chảy máu.

Huyết khối là sự hình thành cục máu đông trong động mạch hoặc tĩnh mạch, gây cản trở dòng máu Quá trình này phụ thuộc vào sự cân bằng giữa tiểu cầu, tế bào máu, protein huyết tương, yếu tố đông máu, yếu tố viêm và nội mạc mạch máu Mất cân bằng trong cơ chế này làm tăng nguy cơ huyết khối hoặc rối loạn đông máu, và một số trường hợp lâm sàng đặc biệt như DIC hoặc bệnh ác tính có thể dẫn đến nguy cơ đồng thời của huyết khối và chảy máu.

Huyết khối động mạch chủ yếu xảy ra do sự vỡ của mảng xơ vữa trong thành động mạch, dẫn đến việc lộ ra các thành phần bên trong mạch máu và kích hoạt tiểu cầu Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tính toàn vẹn mạch máu, nhanh chóng di chuyển và bám dính vào vùng tổn thương thông qua tương tác với collagen và yếu tố von Willebrand Chúng liên kết với nhau qua quá trình kết tập tiểu cầu, tạo thành cục máu đông ban đầu Enzyme thrombin kích hoạt thụ thể PAR1 trên bề mặt tiểu cầu, thúc đẩy quá trình tập hợp và hoạt hóa thêm nhiều tiểu cầu khác, làm cho cục máu đông phát triển nhanh chóng Sự tắc nghẽn do cục máu đông có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng như nhồi máu cơ tim hoặc đột quỵ, đe dọa tính mạng nếu không được xử lý kịp thời.

Hình 1.6 Các tác nhân gây huyết khối động mạch và tĩnh mạch a, Động mạch b, Tĩnh mạch [2]

Huyết khối tĩnh mạch sâu (DVT) thường xảy ra ở các tĩnh mạch lớn của chân và có thể dẫn đến biến chứng nguy hiểm là thuyên tắc phổi, khi huyết khối vỡ ra và di chuyển đến phổi, gây gián đoạn lưu lượng máu Cục máu đông đỏ hình thành trong tĩnh mạch chứa nhiều fibrin và tế bào hồng cầu, trong khi cục máu đông trắng hình thành trong động mạch lại giàu tiểu cầu Huyết khối tĩnh mạch hình thành do sự kích hoạt hệ thống đông máu, trong đó thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo ra mạng lưới giữ hồng cầu Quá trình này được khởi phát qua hai con đường: ngoại sinh, do yếu tố mô kích hoạt, và nội sinh, do tiếp xúc với bề mặt tích điện âm, cả hai đều hội tụ tại yếu tố X (FXa) để sản xuất thrombin và hình thành fibrin DVT thường liên quan đến rối loạn đông máu và phản ứng viêm.

Các phương pháp điều trị hiện nay chủ yếu tập trung vào việc ức chế thrombin, yếu tố Xa (FXa) hoặc các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K nhằm ngăn chặn sự hình thành huyết khối.

Một số phương pháp đánh giá tác dụng trên máu in vitro

Máu được chống đông bằng natri citrat sẽ kích hoạt quá trình đông máu theo con đường ngoại sinh khi phục hồi calci và có mặt thromboplastin Dựa vào đặc tính này, thời gian đông máu huyết tương được khảo sát sau khi bổ sung thromboplastin calci nhằm đánh giá yếu tố đông máu đường ngoại sinh, bao gồm phức hệ prothrombin: II, V, VII, X.

- 50 àL huyết tương được ủ 3 phỳt trong cuvet ở 37°C

- Thờm 100 àL húa chất PT vào mỗi ống Đo thời gian PT ở bước súng 660nm

Thời gian prothrombin là khoảng thời gian từ khi thêm hóa chất PT vào huyết tương cho đến khi cục máu đông hình thành, và được đo bằng máy đông máu (Hình 1.7) [51].

Hình 1.7 Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian PT [51]

- PT tính theo giây (PTs): Thời gian Quick bình thường khi sử dụng thromboplastin có hoạt tính đầy đủ thường từ 11–13 giây

The ISI/INR system, which stands for International Sensitivity Index and International Normalized Ratio, is calculated based on disease and test parameters The sensitivity index (SI) is associated with the type of chemical used, while the INR ratio remains independent of the chemical, making it a more objective measure The significance of the results lies in their reliability and consistency across different testing conditions.

Thời gian prothrombin được coi là kéo dài khi vượt quá 2 giây so với thời gian chứng, hoặc khi tỷ lệ tiêu thụ prothrombin giảm xuống dưới 70%, hoặc khi INR lớn hơn 1.3, với điều kiện là lượng fibrinogen không giảm và huyết tương không chứa heparin.

Thời gian Quick kéo dài xảy ra trong các trường hợp rối loạn đông máu ngoại sinh, thường do giảm nồng độ các yếu tố phức hệ prothrombin Nguyên nhân có thể bao gồm suy chức năng gan, thiếu vitamin K, hoặc điều trị chống đông bằng dẫn xuất coumarin.

Xét nghiệm này nhạy nhất với sự thiếu hụt prothrombin

1.4.2 Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT)

Nguyên tắc của xét nghiệm là thời gian phục hồi calci của huyết tương citrat hóa sau khi ủ với kaolin và cephalin, giúp đánh giá chính xác các yếu tố khác của đường đông máu nội sinh Điều kiện hoạt hóa yếu tố tiếp xúc và chất lượng tiểu cầu trong mẫu kiểm tra không ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.

- 50 μL huyết tương được ủ 1 phút trong cuvet ở 37ºC

- Thêm 50 μL hóa chất APTT vào mỗi ống

- Sau 3 phút, thêm 50 μL CaCl₂ 25 mM vào mỗi ống Đo thời gian APTT ở bước sóng 660 nm

Thời gian APTT được đo từ lúc thêm CaCl₂ vào huyết tương và hóa chất APTT cho đến khi cục máu đông hình thành, và quá trình này được thực hiện bằng máy đông máu (Hình 1.8) [50].

Hình 1.8 Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian APTT [52]

Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa của huyết tương bình thường dao động từ 30 đến 35 giây, phụ thuộc vào loại cephalin – kaolin, kỹ thuật và điều kiện mà mỗi phòng xét nghiệm áp dụng.

So sánh APTT bệnh nhân và nhóm chứng ta có tỷ lệ APTT (rAPTT) Ý nghĩa của kết quả:

Nếu rAPTT > 1.2 hoặc APTT kéo dài hơn 8 giây, điều này cho thấy tình trạng giảm đông máu, có thể do thiếu hụt yếu tố đông máu bẩm sinh như Hemophilia, hoặc do tiêu thụ yếu tố đông máu trong DIC, suy gan nặng không tổng hợp được yếu tố, hoặc do sự hiện diện của chất ức chế đông máu nội sinh APTT cũng có thể kéo dài khi điều trị bằng heparin.

Nếu rAPTT < 0.8 là biểu hiện tăng đông: Gặp trong DIC giai đoạn đầu do có hiện tượng tăng đông

Nguyên tắc của phương pháp xét nghiệm là cho thrombin vào huyết tương, dẫn đến hiện tượng đông máu, với thời gian đông phụ thuộc vào nồng độ fibrinogen Dựa trên nguyên tắc này, người ta chuẩn bị dung dịch fibrinogen ở các nồng độ khác nhau và thêm thrombin, từ đó tạo ra đường cong nồng độ fibrinogen - thời gian Huyết tương của bệnh nhân được pha loãng và xét nghiệm thời gian đông với thrombin, sau đó so sánh với đường cong chuẩn để xác định nồng độ fibrinogen.

- Pha loóng huyết tương: 10 àL huyết tương được cho thờm 90 àL dung dịch đệm Owren – Koller Ủ ở 37°C trong 3 phút

- Thờm 50 àL húa chất Thrombin, sau đú đo thời gian hỡnh thành fibrin ở bước sóng 660 nm

Thời gian hình thành fibrin là khoảng thời gian tính từ khi thêm hóa chất Thrombin cho đến khi xuất hiện những sợi fibrin đầu tiên, và được đo bằng máy đông máu.

Khi thời gian đông máu quá ngắn hoặc quá dài, cần thực hiện lại xét nghiệm và pha loãng huyết tương với tỷ lệ 1/20 hoặc 1/5 Nồng độ fibrinogen được tính dựa vào biểu đồ mẫu tự làm với huyết tương bình thường hoặc theo biểu đồ chuẩn đi kèm với lô thuốc thử.

Hình 1.9 Nguyên lý của quy trình định lượng fibrinogen [53]

Thông số đánh giá: Bình thường từ 2 - 4g/l Ý nghĩa của kết quả :

Fibrinogen tăng trong: Các bệnh nhiễm trùng cấp, các bệnh viêm mạn, các bệnh lý khối u, nhồi máu cơ tim cấp,…

Fibrinogen giảm có thể xảy ra trong các tình trạng như bệnh lý gan nặng, đông máu nội mạch rải rác (DIC), và tình trạng tiêu fibrin tiên phát hoặc thứ phát do các bệnh lý huyết khối hoặc do sử dụng thuốc tiêu fibrin Ngoài ra, cũng có thể gặp trường hợp không có fibrinogen bẩm sinh.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu bao gồm cao hoa hòe chứa quercetin (Sophora Japonica Extract) với hàm lượng quercetin đạt tối thiểu 90% và phytosome được chế biến từ cao hòe giàu quercetin.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Máu và huyết tương chuột cống trắng

Nghiên cứu tác dụng ly giải cục máu đông và chống đông máu sử dụng huyết tương chuột cống trắng, chủng Wistar

Chuột cống trắng giống đực, chủng Wistar, khỏe mạnh, từ 6-8 tuần tuổi và nặng từ 180 – 280 g được cung cấp bởi Học viện Quân Y Trước khi tiến hành nghiên cứu, chuột được nuôi ổn định trong một tuần trong hệ thống lồng nuôi động vật thông gió, với điều kiện nhiệt độ 23 ± 2°C và độ ẩm 60 ± 10% Động vật được cho ăn bằng thức ăn do Viện cung cấp.

Vệ sinh dịch tễ Trung Ương cung cấp, uống nước tự do, chu kì sáng tối được duy trì là 12 giờ

Quy trình lấy máu từ chuột bắt đầu bằng việc gây mê chuột với liều pentobarbiral 50 mg/kg để đảm bảo không gây đau đớn Sau đó, chuột được đặt ở tư thế ngửa trên giá mổ và sát khuẩn vùng ngực bằng cồn 70% Sử dụng kim tiêm 3–5 ml, chọc kim vào khoang liên sườn trái để hút máu từ tim Đối với thí nghiệm ly giải cục máu đông, máu toàn phần được chia vào ống không có chất chống đông Còn trong thí nghiệm chống đông máu, máu được thu vào ống nghiệm chứa EDTA và trộn nhẹ để tránh tan huyết.

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Chuẩn PTN

(chiết xuất từ hoa hòe, hàm lượng quercetin  90 %)

3 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc TCNSX

STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

6 DMSO Sigma Aldrich, Singapore TCNSX

8 Đệm phosphat pH 7,4 Gibco TCNSX

9 Acid hydrochlorid Trung Quốc Tinh khiết hóa học

10 Natri hydroxid Trung Quốc Tinh khiết hóa học

14 Thuốc thử PT (Thuốc thử

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

1 Cân kĩ thuật Sartorius PRACTUM612 – 1S Đức

2 Cân phân tích Sartorius QUINTIX224 – 1S Đức

3 Máy lọc nước PURELAB Classic UV, ELGA Đức

4 Máy siêu âm Elmasonic S100H Đức

5 Bộ lọc chân không Trung Quốc

6 Tủ sấy Memmert UN110 Đức

Hệ thống máy HPLC Agilent 1260

Technologies với đầu dò DAD, bơm mẫu tự động (Agilent Technologies)

8 Nồi đung cách thủy Buchi B-490 Trung Quốc

9 Máy ly tâm Biocen 22R Tây Ban Nha

STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

10 Máy lắc Ika Vortex 3 Đức

11 Máy đo pH Sension + PH3 Trung Quốc

12 Hệ thống cất quay Rovapor R - 300 Đức

13 Máy đo thế zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Horiba Scientific nano partica SZ-100 Nhật bản

14 Máy khuấy từ IKA-RCT basic Đức

15 Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu Trung Quốc

16 Bếp cách thủy MEMMERT WNB10 Đức

17 Máy phân tích máu STAR MAX-1 Pháp

Các dụng cụ thí nghiệm quan trọng bao gồm cốc có mỏ, đũa, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, pipet Pasteur, micropipet, xi lanh, đĩa Petri, ống Eppendorf, ống Falcon và đầu côn đa kênh.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đề ra, đề tài thiết kế các nội dung nghiên cứu như sau:

- Để nâng cấp quy mô bào chế được phytosome cao hoè giàu với quy mô 100g/mẻ đề tài tiến hành:

Hoạt động 1: Bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin 100g/mẻ trên hệ thống cất quay Rovapor R – 300

Hoạt động 2: Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng và đưa ra TCCS cho phytosome cao hoè giàu quercetin

Để so sánh tác dụng ly giải cục máu đông và tác dụng chống đông máu in vitro của quercetin cùng với phytosome cao hòe giàu quercetin, nghiên cứu đã được tiến hành.

Hoạt động 1: So sánh tác dụng ly giải cục máu đông in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Hoạt động 2: So sánh tác dụng chống đông máu in vitro dựa vào chỉ số thời gian prothrombin (PT) của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Hoạt động 3: So sánh tác dụng chống đông máu in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin dựa trên chỉ số thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (ATPP).

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp định lượng hàm lượng quercetin trong cao hòe giàu quercetin

Thẩm định quy trình phân tích:

Phương pháp phân tích được đánh giá theo tiêu chí độ đặc hiệu, đường chuẩn, khoảng tuyến tính và tính thích hợp của hệ thống theo hướng dẫn ICH Để kiểm tra độ đặc hiệu, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng được tiêm vào hệ thống sắc ký, và pic của quercetin phải được nhận diện rõ trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không có pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của quercetin trên mẫu trắng Để đánh giá tính tương hợp hệ thống, dung dịch chuẩn quercetin (nồng độ 200 μg/ml) được tiêm lặp lại 6 lần, ghi lại thời gian lưu và diện tích pic Yêu cầu là độ lệch chuẩn tương đối RSD% của thời gian lưu và diện tích pic không được lớn hơn 2%.

Để xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch quercetin chuẩn, chúng tôi đã chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng dung dịch gốc với methanol, tạo ra nồng độ quercetin trong khoảng 10 - 200 μg/ml Sau đó, tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r.

Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng: y=ax+b và giá trị r ≥ 0,995 Điều kiện sắc kí:

Chương trình sắc kí được lựa chọn theo Dược điển Việt Nam [54] như sau:

- Cột sắc ký Agilent C18 (4,6x250mm, 5μm)

- Pha động: tiến hành trên hệ dung môi pha động gồm Methanol (A), nước tinh khiết/acid formic 0,1% (B) với tỷ lệ 45:55

- Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút

- Dung môi pha loãng: Methanol dùng cho HPLC

Pha dung dịch chuẩn và xử lý mẫu

- Dung dịch trắng: Dung môi pha mẫu methanol

- Dung dịch chuẩn: Chuẩn quercetin được pha trong methanol với nồng độ 200μg/ml

Chuẩn bị dung dịch thử bằng cách hòa tan 15mg cao hòe giàu quercetin trong methanol, sau đó lọc qua màng cellulose acetat kích thước 0,45 m và pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng methanol.

Hàm lượng quercetin trong các mẫu thử được xác định thông qua phương trình đường chuẩn đã được xây dựng Phương pháp này được áp dụng để định lượng hàm lượng quercetin trong phytosome cao hòe giàu quercetin Bên cạnh đó, cần thực hiện phương pháp bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của phytosome cao hòe này.

2.4.2.1 Phương pháp nâng cấp quy mô bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin quy mô 100g/mẻ

Dựa trên kết quả nghiên cứu trước của nhóm nghiên cứu [55], quy trình nâng cấp quy mô bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin đã được thực hiện với quy mô 100g/mẻ, sử dụng hệ thống cất quay Rovapor R - 300 (Buchi - Đức).

Quy trình bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin bắt đầu bằng việc hòa tan cao hòe và phosphatidylcholine (PC) theo tỷ lệ mol 1:1 (28,5g cao hòe và 71,5g PC) trong 800 ml ethanol tuyệt đối Hỗn hợp này được đưa vào bình cầu 1000 ml và cất quay ở 40 o C với tốc độ 50 vòng/phút trong 8 giờ để tạo phytosome Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được cô quay dưới áp suất giảm ở 80 o C để thu được bột nhão phytosome Bột này sau đó được sấy trong tủ sấy chân không trong 24 giờ nhằm loại bỏ hoàn toàn dung môi hữu cơ, đảm bảo hàm ẩm không quá 5% Cuối cùng, phytosome bào chế được bảo quản trong túi zip kín ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng.

2.4.2.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính phytosome cao hòe giàu quercetin Đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố KTTP Đo kích thước tiểu phân bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS

Chuẩn bị hỗn dịch phytosome cao hòe giàu quercetin bằng cách hydrat hóa một lượng nhỏ phytosome trong 50ml nước cất Sau đó, hỗn dịch được làm nhỏ kích thước bằng cách siêu âm trong 5 phút Tiến hành đo mẫu trên máy Horiba SZ100 với cuvet nhựa, thiết bị cũng cho phép đo chỉ số đa phân tán PDI của hệ.

Chuẩn bị hỗn dịch phytosome cao hòe giàu quercetin bao gồm việc xác định kích thước tiểu phân Tiến hành xác định kích thước tiểu phân bằng phương pháp sử dụng cuvet nhựa có 2 lá điện cực bằng đồng và đo mẫu trên máy Horiba SZ100 Cuối cùng, thực hiện định lượng quercetin trong phytosome cao hòe giàu quercetin.

Hàm lượng quercetin trong phytosome được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với điều kiện như mục 2.4.1

Cân 1 lượng phytosome tương ứng với 5 mg quercetin vào định mức 50ml, thêm 40 ml methanol, siêu âm 30 phút, bổ sung thể tích đến vạch Lọc mẫu qua màng cellulose acetat 0,45 μm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký

Hàm lượng quercetin trong phytosome cao hòe giàu quercetin được xác định vào phương trình đường chuẩn đã được xây dựng

2.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng trên máu in vitro

2.4.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ly giải cục máu đông in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Phương pháp đánh giá tác dụng ly giải cục máu đông dựa trên khả năng của các tác nhân thử nghiệm trong việc phân hủy mạng lưới fibrin, thành phần chính tạo nên cục máu đông.

Cách tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành theo nghiên cứu của Prasal [57] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm:

Mẫu thử nghiên cứu bao gồm phytosme cao hòe giàu quercetin, trong đó quercetin được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 7,4 có chứa 1% DMSO, tạo thành dung dịch gốc với nồng độ 10000 μg/ml Từ dung dịch gốc, các nồng độ thấp hơn được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,4 Mẫu thử này được sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá tác dụng trên máu in vitro.

Các ống Eppendorf được làm sạch, sấy khô, cân khối lượng ban đầu (m₀) và dán nhãn Máu động mạch chuột được thu vào ống không có chất chống đông, sau đó chia 500 µL mẫu vào từng ống Các ống chứa mẫu được ủ ở 37°C trong 45 phút để hình thành cục máu đông tự nhiên, sau đó chụp ảnh ghi nhận Phần huyết thanh phía trên được loại bỏ nhẹ nhàng, giữ lại phần máu đông, và các ống được cân lại để xác định khối lượng chứa cục máu đông trước xử lý (m₁) Mỗi ống được thêm 100 µL dung dịch mẫu thử gồm quercetin và phytosome cao huế giàu quercetin ở các nồng độ khác nhau (10, 20, 50, 100 μg/ml, dung dịch sinh lý làm chứng âm) Toàn bộ được ủ ở 37°C trong 90 phút, sau đó hút bỏ phần dịch lỏng và cân lại các ống để xác định khối lượng sau ly giải (m₂) Thí nghiệm được lặp lại ba lần với cùng một mẫu máu.

Phần trăm ly giải cục máu đông được tính theo công thức:

Trong đó: m0 : Khối lượng ống eppendorf ban đầu m1: Khối lượng cục máu đông trước xử lý m2: Khối lượng cục máu đông sau xử lý

2.4.3.2 Phương pháp đánh giá PT tác dụng chống đông máu của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin Đo thời gian prothrombin (PT)

Xét nghiệm thời gian prothrombin (PT) là phương pháp đánh giá quá trình đông máu theo con đường ngoại sinh, trong đó máu được chống đông bằng natri citrate Khi hồi phục calci và có mặt thromboplastin, thời gian đông của huyết tương sẽ được khảo sát sau khi bổ sung thromboplastin calci, từ đó đánh giá các yếu tố đông máu đường ngoại sinh như phức hệ prothobin II, V, VII, và X.

Cách tiến hành: Thời gian đông máu thông qua chỉ số PT được đo bằng máy

STAR MAX-1 hoạt động theo nguyên lý đo quang, sử dụng phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ Quy trình thí nghiệm được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Li và cộng sự (2013) [58].

Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2016 và được trình bày dưới dạng TB ± SD, trong đó TB là giá trị trung bình và SD là độ lệch chuẩn.

Các hình được xử lý và vẽ bằng phần mềm GraphPad Prism 9

Với các mẫu liên tục, phân bố chuẩn, dữ liệu được biểu diễn dưới dạng X ±

SD (X: giá trị trung bình, SD: độ lệch chuẩn) được sử dụng để so sánh trung bình giữa hai nhóm thông qua phương pháp t-test cho mẫu ghép (paired-sample t-test) Để so sánh giá trị trung bình giữa nhiều nhóm, phương pháp one-way ANOVA được áp dụng, kèm theo kiểm định hậu kiểm Tukey.

KẾT QUẢ

Kết quả thẩm định phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC

Diện tích pic, thời gian lưu của dung dịch trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử được thể hiện trong bảng 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng

Hình 3.2 Sắc kí đồ mẫu chuẩn có nồng độ quercetin 100μg/ml

Hình 3.3 Sắc kí đồ mẫu thử Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của quercetin Các mẫu dung dịch Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)

Kết quả sắc ký cho thấy các mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian lưu của pic quercetin trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử, chứng tỏ phương pháp sắc ký đã chọn có tính đặc hiệu cao.

Tính tích hợp hệ thống

Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần trên dung dịch chuẩn quercetin nồng độ 200 àg/ml với các điều kiện sắc ký đã chọn, ghi lại giá trị thời gian và diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD, %) của diện tích pic và thời gian lưu Kết quả được trình bày trong bảng.

Bảng 3.2 Khảo sát tính tương hợp hệ thống sắc kí với quercetin

STT Thời gian lưu t (phút) Diện tích pic (mAU.s)

Giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích píc trong 6 lần tiêm lặp lại đều nhỏ hơn 2%, cho thấy phép thử đạt yêu cầu và hệ thống có độ thích hợp cao Do đó, phương pháp này đáp ứng tiêu chí về tính thích hợp của hệ thống.

Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy dung dịch quercetin với nồng độ từ 10 àg/ml đến 200 àg/ml, sau đó tiến hành phân tích HPLC theo các điều kiện đã nêu trong mục 2.5.1.2 Kết quả khảo sát được thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.4.

Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của quercetin

Nồng độ (àg/ml) Diện tớch PIC (mAU.s)

Hình 3.4 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của quercetin

Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ quercetin với hệ số tương quan R² là 0,9998 Khoảng tuyến tính này cho phép định lượng quercetin trong phytosome Do đó, nồng độ quercetin trong mẫu thử có thể được xác định bằng cách so sánh với đường chuẩn có nồng độ từ 10 μg/ml đến 200 μg/ml.

Kết quả bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin

3.2.1 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của phytosome bào chế

Tiến hành bào chế 3 mẻ phytosome cao hòe giàu quercetin theo quy trình mục 2.4.1.1 với công thức bào chế thể hiện trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Thành phần công thức bào chế phytosome cao hòe giàu quercetin

Tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của phytosome bào chế

Kết quả đo kích thước hạt, chỉ số phân tán và thế Zeta đã đánh giá các đặc tính của các hỗn dịch phytosome cao hòe giàu quercetin, như được trình bày trong mục 2.4.2.2 Thông tin chi tiết được thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Kết quả KTTP, PDI, thế Zeta của phytosome hòe giàu quercetin

Mẻ KTTP (nm) PDI Thế Zeta

Hỗn dịch phytosome cao hòe giàu quercetin có đặc điểm đồng nhất, không xuất hiện lắng cặn tiểu phân Kích thước tiểu phân của ba mẻ phytosome dao động từ 250-350 nm với giá trị PDI nhỏ hơn 0,5, cho thấy phân bố kích thước tương đối đồng đều Giá trị thế zeta của cả ba mẫu đều nhỏ hơn -60 mV, chứng tỏ hệ phytosome có tính ổn định điện động cao, giúp ngăn ngừa hiện tượng kết tụ hoặc lắng đọng trong quá trình bảo quản.

➢ Kết quả hàm lượng quercetin có trong phytosome cao hòe giàu quercetin

Đánh giá độ lặp lại của phương pháp được thực hiện bằng cách xác định hiệu suất 6 lần với mẫu phytosome cao hòe giàu quercetin, có hàm lượng quercetin toàn phần khoảng 26% Kết quả hàm lượng % quercetin toàn phần trong phytosome được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6 Hàm lượng quercetin toàn phần trong phytosome cao hòe giàu quercetin

Mẻ Hàm lượng quercetin toàn phần trong phytosome cao hòe giàu quercetin (%)

Hàm lượng quercetin trong phytosome cao hòe đạt từ 97,24% đến 98,84%, cho thấy sự nhất quán về mặt định lượng với khoảng biến thiên nhỏ và độ lệch chuẩn thấp Giá trị cao này chứng tỏ khả năng giữ lại hoạt chất hiệu quả trong hệ phytosome và mức độ đồng đều giữa các mẻ chế phẩm.

3.2.2 Dự kiến tiêu chuẩn cơ sở của của phytosome cao hòe giàu quercetin

Dựa trên kết quả đánh giá từ ba mẻ nghiên cứu, một số tiêu chuẩn chất lượng cho phytosome cao hòe giàu quercetin đã được đề xuất, như trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá đặc tính phytosome cao hòe giàu quercetin và đề xuất tiêu chuẩn chất lượng

Tiêu chuẩn chất lượng Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Đề xuất tiêu chuẩn

Tính chất của bột phytosome cao hòe giàu quercetin trước khi hydrat hóa

Bột khô, mịn, màu vàng nhạt

Tính chất của bột phytosome cao hòe giàu quercetin sau khi hydrat hóa

Hỗn dịch đồng nhất, không lắng cặn

Kích thước tiểu phân (nm)

Hệ số đa phân tán PDI

Không quá 0,500 Định tính Sắc ký đồ có 1 pic với thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic quercetin chuẩn Hàm lượng quercetin toàn phần trong phytosome (%)

3.3 Kết quả so sánh tác dụng trên máu in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

3.3.1 Kết quả so sánh tác dụng ly giải cục máu đông in vitro của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Thí nghiệm đánh giá tác dụng ly giải cục máu đông in vitro đã được thực hiện với các mẫu so sánh Kết quả của quá trình này được quan sát định tính và thể hiện qua các hình 3.5, 3.6, và 3.7.

Hình 3.5 Tác dụng ly giải cục máu đông của phytosome cao hòe giàu quercetin

Hình 3.6 Tác dụng ly giải cục máu đông của quercetin

Kết quả tỷ lệ phần trăm ly giải cục máu đông của mẫu thử và các mẫu đối chứng được thể hiện ở hình 3.7

Hình 3.7 Tỷ lệ phăn trăm ly giải cục máu đông của phytosome cao hòe giàu quercetin, quercetin ở các nồng độ khác nhau

Kết quả từ hình 3.7 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong hiệu quả ly giải cục máu đông giữa hai nhóm mẫu phytosome cao hòe giàu quercetin và quercetin ở các nồng độ khảo sát, đặc biệt là ở nồng độ cao Cụ thể, tại nồng độ 100 µg/ml, mẫu phytosome đạt hiệu quả ly giải trung bình cao nhất là 26,75 ± 2,89%, vượt trội hơn so với quercetin với 17,22 ± 1,73%, và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Ở nồng độ 50 àg/ml, hiệu quả ly giải của phytosome giàu quercetin đạt 22,63 ± 1,99%, cao gần gấp đôi so với quercetin (10,25 ± 1,12%) Tại nồng độ 20 àg/ml, mặc dù hiệu quả ly giải của cả ba mẫu đều giảm, phytosome vẫn cho thấy khả năng ly giải tốt hơn (12,44 ± 0,65%) với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, ở nồng độ 10 àg/ml, mức độ ly giải giữa các nhóm mẫu không còn chênh lệch rõ rệt và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.3.2 Kết quả so sánh tác dụng chống đông máu thông qua chỉ số PT của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Kết quả trên thời gian đông máu PT(s) của phytosome cao hòe giàu quercetin, quercetin thể hiện trong bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả chỉ số PT(s) của phytosome cao hòe giàu quercetin, quercetin Nhóm nghiên cứu

(n=3) PT(s) % tăng so với chứng âm

Phytosome cao hòe giàu quercetin 10 àg/ml 13,47 ± 1,28 ## 7,76 8,89

Phytosome cao hòe giàu quercetin 20 àg/ml 14,37 ± 1,65 # 14,96 7,22

Phytosome cao hòe giàu quercetin 50 àg/ml 15,63 ± 2,35 ### 25,04 11,6

Phytosome cao hòe giàu quercetin 100 àg/ml 16,87 ± 2,00 ### 34,96 16,28

p < 0,001 so với nhóm chứng âm Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể với # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 so với nhóm quercetin tương ứng Các kết quả không có ý nghĩa thống kê được ký hiệu là ns (p > 0,05), dựa trên phân tích phương sai một chiều ANOVA và hậu kiểm Tukey.

Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy, heparin làm tăng thời gian prothrombin 0,56% so với nhóm chứng âm DMSO 0,1%, nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Đối với quercetin, nồng độ 10 àg/ml làm giảm nhẹ thời gian PT 1,04% so với chứng âm, cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tuy nhiên, khi nồng độ quercetin tăng lên 20, 50 và 100 àg/ml, thời gian PT tăng lần lượt 7,20% (p < 0,05), 12,00% (p < 0,01) và 16,00% (p < 0,01) so với chứng âm Đối với phytosome cao hũe giàu quercetin, nồng độ 10 àg/ml làm tăng thời gian PT 7,76% (p < 0,05), 20 àg/ml tăng 14,96% (p < 0,01), 50 àg/ml tăng 25,04% (p < 0,01), và 100 àg/ml tăng 34,96% (p < 0,001) so với chứng âm.

So sánh giữa phytosome cao hòe giàu quercetin và quercetin cho thấy rằng phytosome làm tăng thời gian PT ở tất cả các nồng độ Cụ thể, tại các nồng độ 10, 20, 50 và 100 àg/ml, thời gian PT tăng lần lượt 8,89%, 7,22%, 11,64% và 16,28% so với nhóm quercetin, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

< 0,05 đến p < 0,001) Điều này cho thấy dạng phytosome giúp tăng hiệu quả tác dụng kéo dài thời gian đông máu của quercetin

3.3.3 Kết quả so sánh tác dụng chống đông máu thông qua chỉ số APTT của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Kết quả trên thời gian đông máu APTT(s) của phytosome cao hòe giàu quercetin, quercetin thể hiện trong bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả chỉ số APTT(s) của phytosome cao hòe giàu quercetin, quercetin Nhóm nghiên cứu

(n=3) APTT(s) % tăng so với chứng âm

Phytosome cao hòe giàu quercetin 10 àg/ml 36,23 ± 2,05 # 8,71 8,71

Phytosome cao hòe giàu quercetin 20 àg/ml 37,57± 2,21 # 12,73 8,58

Phytosome cao hòe giàu quercetin 50 àg/ml 37,90 ± 0,56 # 13,71 4,61

Phytosome cao hòe giàu quercetin 100 àg/ml 41,27 ± 2,30 ## 23,82 8,41

p < 0,001 so với nhóm chứng âm Ngoài ra, có sự khác biệt đáng kể với # p < 0,05; ## p < 0,01; ### p < 0,001 so với nhóm quercetin tương ứng Kết quả cũng chỉ ra rằng ns cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) thông qua phân tích phương sai một chiều ANOVA và hậu kiểm Tukey.

Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy heparin làm tăng thời gian APTT 40,63% so với nhóm chứng âm DMSO 0,1%, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) do độ lệch chuẩn lớn Đối với nhúm quercetin, thời gian APTT tăng dần theo liều, trong đó liều 10 µg/ml không làm thay đổi APTT so với chứng âm, trong khi liều 20, 50 và 100 µg/ml lần lượt làm tăng APTT 3,81%, 8,71% và 14,21%, với ý nghĩa thống kê bắt đầu từ liều 50 µg/ml (p < 0,05 đến p < 0,01) Đối với nhóm phytosome cao hòe giàu quercetin, tất cả các liều khảo sát đều làm tăng đáng kể thời gian APTT so với chứng âm, với các mức tăng lần lượt là 8,71% (p < 0,05), 12,73% (p < 0,05), và 13,71%.

So sánh với chứng âm, dạng phytosome của quercetin cho thấy thời gian APTT cao hơn ở tất cả các nồng độ, với sự khác biệt dao động từ 4,61% đến 8,71% và đều có ý nghĩa thống kê (p < 0,05 đến p < 0,01).

So sánh giữa nhóm thử quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin cho thấy thời gian APTT ở nhóm phytosome cao hòe giàu quercetin có xu hướng tăng cao hơn so với quercetin thông thường ở tất cả các mức liều được khảo sát.

BÀN LUẬN

Về khả năng ly giải cục máu đông của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin

Nghiên cứu này đánh giá khả năng tiêu huyết khối của quercetin và phytosome cao hòe giàu quercetin thông qua mô hình ly giải cục máu đông in vitro theo phương pháp của Prasad và cộng sự Kết quả cho thấy phytosome cao hòe giàu quercetin đạt hiệu quả ly giải cao nhất ở tất cả các mức nồng độ khảo sát, đặc biệt là tại nồng độ tối ưu.

100 àg/mL, đạt gần 30% ly giải Quercetin cho hiệu quả thấp hơn đỏng kể, dao động từ khoảng 15% ở nồng độ cao đến dưới 5% ở nồng độ thấp

Phytosome cao hòe giàu quercetin cho thấy hiệu quả ly giải cục máu đông tốt hơn so với quercetin thông thường nhờ vào đặc tính dược động học được cải thiện Hiện tượng này có thể được giải thích bởi khả năng dược lý của quercetin, khi nó có khả năng tăng cường biểu hiện các enzyme tiêu fibrin quan trọng như tissue-type plasminogen activator (t-PA) và urokinase-type plasminogen activator (u-PA) Quercetin kích hoạt con đường tín hiệu p38 MAPK và yếu tố phiên mã Sp1 trong tế bào, góp phần vào quá trình ly giải cục máu đông.

36 nội mô người, từ đó thúc đẩy chuyển plasminogen thành plasmin – enzyme trực tiếp phân hủy fibrin, thành phần chính cấu tạo nên cục máu đông [63, 64]

Sinh khả dụng thấp và độ tan kém trong nước là những rào cản chính hạn chế hiệu quả của quercetin trong các mô hình sinh học.

Phytosome cao hòe chứa quercetin giúp tăng độ tan trong nước, ổn định phân tử và cải thiện khả năng thẩm thấu qua màng sinh học, từ đó nâng cao sinh khả dụng và hiệu quả tiếp xúc của hoạt chất với cục máu đông Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng quercetin dạng phytosome có khả năng xuyên màng mạnh hơn và phân bố mô tốt hơn so với quercetin thông thường.

Nghiên cứu cho thấy phytosome cao hòe giàu quercetin có khả năng ly giải cục máu đông vượt trội so với quercetin thông thường Điều này mở ra tiềm năng phát triển các chế phẩm chứa phytosome cao hòe giàu quercetin như một phương pháp hỗ trợ tiêu huyết khối và phòng ngừa biến chứng huyết khối trong lâm sàng.

Về khả năng chống đông máu in vitro thông qua chỉ số thời gian (PT) của

Đánh giá khả năng đông máu ngoại sinh được thực hiện thông qua chỉ số thời gian PT(s) của các mẫu thử, sử dụng máy đông máu STARMAX-1 Máy STARMAX-1 hoạt động dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng, khi các sợi fibrin hình thành trong quá trình đông máu.

Trong nghiên cứu, Heparin được sử dụng làm chứng dương với nồng độ 0,2U, tương tự như mô hình của Li và cộng sự (2013) [58] cũng như Lau và cộng sự (2009) [66] DMSO 0,1% được chọn làm chứng âm, cho thấy sự phù hợp trong thiết kế thí nghiệm.

Quercetin có khả năng kéo dài thời gian prothrombin (PT) bằng cách ức chế hoạt động của các yếu tố đông máu trong con đường ngoại sinh, đặc biệt là yếu tố VII và yếu tố Xa, từ đó làm giảm hiệu quả chuyển đổi prothrombin thành thrombin Thrombin là enzyme thiết yếu trong quá trình hình thành fibrin và đông máu Hơn nữa, quercetin còn ức chế trực tiếp hoạt động của thrombin, góp phần làm chậm quá trình tạo cục máu đông.

Nghiên cứu cho thấy quercetin có khả năng kéo dài thời gian prothrombin (PT) theo liều lượng, nhưng chỉ có ý nghĩa thống kê khi liều từ 20 µg/ml trở lên Phytosome cao hòe giàu quercetin thể hiện hiệu quả vượt trội so với quercetin thông thường, làm tăng PT rõ rệt và có ý nghĩa thống kê ở tất cả các liều Kết quả nghiên cứu của Jun và cộng sự (2016) cũng cho thấy quercetin có xu hướng kéo dài PT khi nồng độ tăng lên Do đó, phytosome cao hòe giàu quercetin là một lựa chọn tiềm năng trong việc cải thiện thời gian prothrombin.

Nghiên cứu cho thấy rằng 37 không chỉ có tác dụng chống đông hiệu quả mà còn tăng cường tác dụng theo nồng độ tốt hơn so với quercetin Điều này chứng minh tiềm năng cải thiện sinh khả dụng và hiệu quả chống đông của quercetin khi được sử dụng dưới dạng phytosome.

Về khả năng chống đông máu in vitro thông qua chỉ số APTT của

Phytosome cao hòe chứa quercetin đã được đánh giá khả năng đông máu nội sinh thông qua chỉ số thời gian APTT (s) Các mẫu thử được đo bằng máy đông máu STARMAX-1, hoạt động dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng khi các sợi fibrin hình thành trong quá trình đông máu.

Kết quả nghiên cứu cho thấy quercetin có khả năng kéo dài thời gian APTT theo liều lượng, với hiệu quả thống kê bắt đầu từ 50 µg/ml Phytosome giàu quercetin cho thấy tác dụng tăng APTT vượt trội so với quercetin thông thường ở tất cả các mức liều, nhấn mạnh sự cải thiện về sinh khả dụng và hiệu quả dược động học Quercetin kéo dài chỉ số APTT thông qua việc ức chế enzym trong con đường nội sinh, đặc biệt là thrombin và yếu tố Xa, cũng như ức chế biểu hiện các yếu tố khởi phát đông máu như yếu tố XIa Điều này giải thích tại sao APTT tăng đáng kể trong nhiều nghiên cứu in vitro sử dụng quercetin hoặc dẫn xuất của nó Phytosome cao hòe giàu quercetin cho thấy hiệu quả chống đông nội sinh vượt trội, có thể do tăng sinh khả dụng và cải thiện khả năng hấp thu Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Jun và cộng sự (2023), khi nồng độ quercetin tăng dần kéo dài thời gian APTT từ 35,6 ± 0,3 đến 57,2 ± 0,2 giây khi nồng độ quercetin tăng từ 10-50 µg/ml.

Mặc dù nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng chống đông máu của quercetin thông qua việc ức chế kết tập tiểu cầu qua các cơ chế như ức chế con đường tín hiệu PI3K/Akt, PLCγ2, MAPK, và thụ thể thromboxane A2 (TP), cũng như tăng cường hoạt hóa VASP qua cAMP, nhưng phần lớn các công trình hiện tại chủ yếu tập trung vào giai đoạn sớm của quá trình huyết khối, cụ thể là giai đoạn hoạt hóa và kết tập tiểu cầu.

Quá trình đông máu huyết tương, bao gồm cả con đường nội sinh và ngoại sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành lưới fibrin ổn định, củng cố cục máu đông sau khi tiểu cầu kết tập Tuy nhiên, hiện tại có rất ít nghiên cứu đánh giá trực tiếp tác động của quercetin lên các chỉ số huyết tương.

PT và APTT, vốn phản ánh lần lượt hoạt động của con đường đông máu ngoại sinh và nội sinh

Đề tài này nhằm khảo sát tác động của quercetin lên hệ thống đông máu huyết tương, cụ thể là ảnh hưởng của nó đến quá trình ly giải cục máu đông và thời gian đông máu thông qua các chỉ số PT và APTT Nghiên cứu sẽ làm rõ khả năng tác động của quercetin lên toàn bộ tiến trình đông máu, không chỉ dừng lại ở giai đoạn tiểu cầu Đây là một hướng tiếp cận mới, có giá trị khoa học và thực tiễn cao, giúp hiểu rõ hơn về tác động của quercetin và cung cấp dữ liệu nền tảng cho việc phát triển các chế phẩm chống huyết khối tự nhiên, an toàn và hiệu quả.

Phytosome là một phương pháp bào chế tiềm năng, tối ưu hóa hiệu quả dược lý của quercetin, đồng thời có khả năng cạnh tranh hoặc thay thế các chế phẩm dược liệu truyền thống trong điều trị và hỗ trợ các rối loạn liên quan đến huyết khối.