Luận văn thạc sĩ xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng Đích cd19 Để Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả in vitro

TRUONG DALIIOC BACII KIIOA IIA NOI LUAN VAN THAC Si Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khẩm hướng dich CD19 dé điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu

Trang 1

TRUONG DALIIOC BACII KIIOA IIA NOI

LUAN VAN THAC Si

Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể

kháng nguyên khẩm hướng dich CD19 dé

điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử

nghiệm hiệu quả in viro

NGUYÊN THỊ PHƯƠNG THẢO

Thao.NTPCA190017@sis.husteduyn

Nganh Céng nghé Sinh hoc

Giảng viên hướng dẫn: TS I.ê Quang Hòa

Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm

TIA NỘI, 10/2021

Chủ ký của

Trang 2

GVIID-CỘNG LIÒA XÃ LIỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập — Tự đo— Hạnh phúc

BAN XÁC NHẬN CHÍNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

‘Ho va tén tac giả luận văn: N, jguyén Thi Phuong Thao

Dé tai nan vin: dựng các cầu trùc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khám hướng dích CD19 dễ diễu trị lơ xế mi cấp dòng, lympho và thử nghiệm hiệu quả

tiếng Anh và dịch tốt chữ Tiếng Anh va dich Tiếng Việt thành 3

tiếng Việt thành 3 cộtkhác nhautrong danh mục viết tất, trang xiii

cột (phần) cho đố rối

và đẹp mắt hơn,

Bảng 1.2 cần Việt Đểng 12 trang 23 đã được chỉnh sửa theo yêu héa, hoặc đưa vào câu của Hỏi dỗng bao gồm

danh mục viết tắt - Các từviếttất được chuyến vào trong danh mục

Thêm tải liệu tưmm viếtTất, bang xiii

khảo trong Bảng - Dã bố sung tài liện tham khảo cho các thẳng

này, tin có trong Đăng nảy,

Trang 3

STT Nội dung Hội đồng,

yêu cầu chỉnh sửa Tổng quan về ALI,

viết sọn lại hơn nữa,

có thê bỏ phân phân

Tải liệu tham khảo

can bé sung tài liệu

tiếng Việt về số liệu

mắc ALL và xem lại

cáo sử dụng thông

tin trên website

Phản hồi của học viên

Đã chỉnh sửa phẩu Tống quan vé ALL bao gom:

- Loại bỏ phần phân loại chỉ tiết của ALL, chỉ

nhắc đến tiêu chuẩn phân loại (tế bảo, miễn địch

vả sinh họp phân Lử) rong Chương 1, mục 1.1.4, đòng thứ 3 từ đưới lên, trang 4

- Đã mô tä về liệu pháp diễu trị nhằm dích trong,

Chương 1, mục 1.1.5, dòng thứ 3 từ dưới lên của

trang 5 đến dòng thử 7 từ trên xuống của trang,

6

- Dã bỗ sưng thông tin về số liệu mắc ALL, của Viên Huyết học “Truyền máu TW và Bệnh viện Truyền máu Huyết học trong chương 1, mục

1.1.1, dòng thử L9 — 23 từ trên xuống, trang 3

- Cách sử dụng thông tin trên website trong tải liệu tham khảo trong luận văn đúng với hướng

đẫn thủ tục bão vệ luận văn thạc sỹ (Áp dụng cho

các học viên báo vé tu thang 01/2020) do Phong

đào tạo thông báo quy dinh ngay 15/01/2020

+ Tai liệu tham khảo số 33, trong chương 1, mục

1.1.5, động thứ Ø tr đưới lên, trang 7

~ 'Tải liệu tham khảo số 47 vả 55, rong chương

3, muc 3.1, dong thir 7 tir trên xuống, trang 40

Trang 4

LOT CAM ON

cm xin bảy 1ô sự kính trọng vẻ lồng biết ơn sâu sắc tối T8 Lê

Quang Hỏa, người thay đã hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em trang quá trình

trghiên cứu và hoàn thành luận văn nay

Tm xin bảy tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Tran Thanh Từng, Th8 Phạm 'Tiển Dũng củng các em sinh viên đang học tập và nghiên cứu tại các phòng thi

xrghiệm 306-B1 dã giúp đỡ cra trong quá trình thí nghiệm:

Đặc biệt là em xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ đã cấp kinh phí cho để tải “Nghiên cứu ửng dụng liệu pháp tế bào CAR-T trong điều

bạch cầu nguyên bảu Iympho cấp”, mã số: KC10/16-20 dé em có thể hoàn thành được nghiên cứu này

Tâm xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia định và những người thân đã luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em lrong suối thời gian học tập

TOM TAT NOI DUNG LUAN VAN

Bénh lo xé mi cấp dòng lympho (AL.L) là một trong những bệnh tụ thự

'phổ biến nhật ở trẻ em trên thê giới So với liện pháp điển trị sử dựng kháng thé dơn dòng, ngoài tính hưởng dịch cao, liệu pháp CAR-T có ưu diễm vượt trội là

cho phép điền trị hiệu quả ngay cả khi các liệu pháp điều trị khác đã thất bại I.iệu

pháp CAR-T đã được cấp phép để điều trị ALL ở Mỹ từ năm 2017 Dễ hướng tới

việc ứng dung liệu pháp CAR-T trong điều trị ALL tại Việt Nam, nghiên cứu này

đã được tiền hành với các mục tiêu cụ thể sau: (¡) Xây đụng các cầu trúc biếu hiện

thụ thể kháng nguyên khăm hướng dich CD19; (11) Thử nghiệm hiệu quâ in vitro của khối tế bảo CAR-T hưởng đích CD19

Các kết quả nghiên cứu thu được trơng luận văn này là đã xây đựng thành công

cấu trúc CAR-T hướng dich CD19 thé hé thú hai (CDISRCD137/pS) và thể hệ thứ

tư(CAR19-iCasp9-TL15/pSE), đã hoàn thiện được quy trinh tạo khối té haa CAR-

T như sau: sau khi dược phân tách bằng phương pháp ly tám tỷ trọng với Eicoll-

Paque va được hoạt hóa bằng bị từ DynabeadsTM Human T-Aetvator CD3/CD28,

2x10? PBMC được chuyễn nạp bằng hỗn hợp chứa I jag mRNA SB100X va 10 pp

plasmid pSB trén hé théng xung điện Amaxa 4Ð Nueleofecler; động tế bảo

CAR-T sau chuyển nạp được tăng sinh đặc hiệu với sự có ruặt của tế bào trinh điện kháng nguyên nhân tạo aAPC 1D2 đã được chiều xa (tỉ lệ CAR-T:aAPC là 1:2) và IL2 (50 U/mL) trong 28 ngay (7 ngày Bay môi trường một ti) Kết quả cho các

áo CAR-T dạt mức xấp xỉ 2,5-5x1 0°

† quả thử nghiệm iø viro cho Đây khối tế bào CAR-T: a có khả năng điệt các té bảo ung thư Daudi và aAPC 1D2 (CD19”) từ 70-80% ở tỷ lệ CD19?:CAR-

T cao nhất là 1:10, (ID có khả năng sinh các cytokine tiển viêm khi đẳng tụ

với các dòng tế bào ung thư CDI9! (31 ngímL, đổi với 1L2, 210 ng/mL

TEN-y và 64ngáuL đôi với TNF-a); (iii) có khả năng tăng sinh khi dòng nuôi cây

với tế bào Dandi và aAPC 1D2; fix) AP20187 ở nông độ 20 niM giúp điệt trên 97%

tế bào CAR-T thế hệ thứ Lư, mở ra khả nắng kiểm soát sự tăng sinh của tế bào

CAR-T trong cơ thẻ người bệnh

HỌC VIÊN

Ký và ghí rõ họ lên.

Trang 5

22 Phương nhân nghiên cứu

2.1 Phương pháp xây dựng các cấu trủc CAR-T hưởng dịch CD19, 28

3.2.2 Phương pháp Iạo khối lế bảo CAR-T 35 2.2.3 Đánh giá khả năng tăng sinh của các khối tế bào CAR-T khi đồng mmôi cây với cáo dòng tế bảo ưng thư CD19! 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng dích CD19 dễ diều tri lo xế mí cấp dòng lympho ae

3.1.1 Tổng hợp gen nhân tạo cầu trúc CDi 9RCD137 - 40 3.1.2 Téng hợp gen nhân tạo cấu trúc iCasp9-TL15 41 3.1.3 Xây dựng vector biểu hiện câu trúc CDISRCD137/pSB (CAR-T thế

3.2 Hoàn thiện quy trình tạo tế bào CÁR-T

3.2.1 Nghiên củu ảnh hưởng của lượng PBMC đến hiệu q hiện CAN thế hệ thứ hai ở tế bảo T 46

3.3.2, Banh giả khả năng ting sinh và sự biểu hiện CA của các khối tế

ý với sự có xnặt của lế bảo trình điện kháng nguyên

nhân tạo đá đuợc chiéu xa (APC) 31

3.4 Thử nghiệm hiệu quả diệt tẾ bao ung thu, kha ning sink cdc cytokine va

ébao CAR-T hướng đích CD19

Trang 6

3.4.2 Danh giá khá năng sinh các cytokine ctia té bao CAR-T thé hé thir hai khi dang nuôi cdy vei cae déng 1é bao ung ther CD19 55

3.4.3 Danh gid kha nfing ting sinh cia cac té bao CAR-T thé hé th hai va

thế hệ thứ tư khi đồng nuôi cây với các đong tế bảo ung thu CD19 ST 3.4.4 Danh gia kha nang kiém soat té bao CAR-T thẻ hệ thứ tư bằng chat

cảm ứng đimer hóa AP20187 ào 1 SD

1 Trình tự thiết kế của câu trúc CDI9RCTH37

2 Trình tự thiết kế của cầu trúc DGK-IL1S-P2A-iCasp9-T2A-Blas

3 Trinh ty cac oligonucleotide dé téng hợp gen cấu trúc CDI9RCD137 67

4 Trình ty các oHgonuclcodde để tổng hợp gen cấu tric PGK-HL15-P2A-

iCasp9-T2A-Blas

š Kết qúa giải trình cầu trúc CD19RCDI37

6, Kết quả giải Lrình tự câu trúc PGK-H.15-P2A-iCasp9-T2A-Blas,

TẢI LIỆU THAM KHẢO

Trang 8

MỤC LỤC

MUC LUC

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MUC BANG BIẾU

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN

1.1 Bệnh lơ xê mi cấp đông lympho (ALL)

1.2 Ligu phap té bao CAR-T trong didu tri ALL

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bio CAR-T 8

1.2.2 Câu trủo CAR-T 10 1.2.3 Cac thé hé té bao CAR-T - 11 1.3 Quy trình công nghệ sân xuất tễ bào CAR-T trong điểu trị A11

1.3.1 Thu tế bảo đơn nhân máu ngoại vi (FBMC) và làm giản quân thể tế

1.3.2 Kích hoạt tế bảo ”L cu eeeeeirere saseese, T4

1.3.3 Chuyển gen tạo tế bào CAR-T áo, TẾ 1.3.4 Tăng sinh tế bào sau chuyển gen seceeeoieoaao TR

1.4 Thử nghiệm lâm sảng sử dụng liệu pháp CAR-T cho bệnh nhân mắc bệnh ALL

1.5 Tỉnh an toàn của liệu pháp té bao CAR-

1.6 Cách tiếp cận, tính mới, tính sáng tạo của đề tả

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 9

LOI CAM DOAN

Tôi lá Nguyễn Thi Phuong Thao, học viên cao học khoá 2019A,, nã số học viên: CA190017, Trường Dai hoc Bach khoa Ila Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan

1 Đây là luận vẫn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng đẩn của

‘TS Lé Quang Léa

3 Công trình này không trùng lắp với bất kỳ nghiên cửu nào khác đã được

công bổ tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tĩn trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trưng

thực và khách quan, dã dược xác rhận và chấp thuận của cơ số nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật vẻ những cam kết này

Học viên Nguyễn Thị Phương Tháo

Trang 11

cy Nội dung Hội dẳng

sr yêu cầu chỉnh sửa âu cầu chính sũ Phản hồi của học viên

Giáo viên hướng dẫu

'T5 Lê Quang Hòa

+ Tai liệu tham khảo số 31 cho Hình 1.1, trong

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Thảo

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Trang 12

iCasp9-T2A-Blas

Trang 13

'T5 Lê Quang Hòa

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Trang 14

'T5 Lê Quang Hòa

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Trang 15

LOI CAM DOAN

Trang 16

MỤC LỤC

MUC LUC

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

Trang 18

MỤC LỤC

MUC LUC

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

Trang 19

Trang 20

'T5 Lê Quang Hòa

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Trang 21

iCasp9-T2A-Blas

Trang 22

Trang 23

MỤC LỤC

MUC LUC

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

Trang 24

LOT CAM ON

HỌC VIÊN

Trang 26

LOT CAM ON

HỌC VIÊN

Trang 27

iCasp9-T2A-Blas

Trang 28

iCasp9-T2A-Blas

Trang 29

MỤC LỤC

MUC LUC

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

Trang 30

LOI CAM DOAN

Trang 31

LOI CAM DOAN

Trang 32

LOI CAM DOAN

Trang 33

'T5 Lê Quang Hòa

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Trang 34

iCasp9-T2A-Blas

Trang 37

'T5 Lê Quang Hòa

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

Tiêu đề	Luận văn thạc sĩ xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng đích CD19 để điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả in vitro
Tác giả	Nguyễn Thị Phương Thảo
Người hướng dẫn	TS. Lê Quang Hòa
Trường học	Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Luận văn
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	75
Dung lượng	199,38 KB