Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập Được từ Đậu tương lên men

Theo lỗ chức Y tẻ thế giới WHO, cứ 2 giây có 1 người chếi vì bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân ch

BỘ GIÁO DUC VA DAO TAO

TRUONG DAI HOC BACH KHOA HA NOI

ĐINH TIH THU TRANG

DE TALNGHIEN CỨU TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYM

FIBRINAZA CUA MOT SO CHUNG VI KHUAN PHAN LAP DUOC TY DAU TUONG LEN MEN

LUAN VAN TITAC 81 KITOA TIOC NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.NGUYEN LAN HUONG

HÀ NỘI - 2010

11.3 Cơ chế phân hãy Fiồrhn trong cơ (hŠ người co

12 Enzym fibtib8Z8 cuc "¬

13.1 Cấu tạo va tinh chai

13 Các ví sinh vật cả khả nang sink ting hop enzyme Fibrinaza

14 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ensym Fibrinaza trên thể giới và tại

Nam - 20 1.5 Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu lạo chủng tái tổ hợp 22 ESA, Vector th M608 oes scssssatesiioavissencisiustanisveatianasinnind2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

11.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng à c6 111.1 Chùng ví khUẨẪN ng eeeeeiooe TỔ

11.12 Vectar pBT226(+) 26 1.1.3 Môi trường - - 27

TI.2 Phương pháp nghiên cứu se teiieniiririrseonaeoooeo.2Ð 1.2.1 Phương pháp ví sinh VẬT, co ceneeekiieieeeeeoreeeoeoo 2Đ 1.2.3 Phương pháp hóa sinh àocoeekieiiirosoaakieoeoall 11.2.4 Điện di DNA trên gel agarose 34

11.3.5 Tách chiết DA của vì khuẩn 35

Binh Thi Thu Ts

112.6 Phương pháp khuyách đại DN-4 bằng phản ing chuéi polymerase

(Polymerase Chairs Reaction- PCR) iuesnenueneninianenenimnenenenenend 113.7 Xứ lý DNA bằng snayme gigi htenvcuueneneninenenmnanenaneneedd

11.2.10 Tách chiết và tinh sack DNA plasmid 42

1L2.11 Kiém tra plasmid mang sén phdm PCR mong mudn 44

TH.1 Tuyên chọn các chẳng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza 4Š

1IL.3 Định tên chủng vi khuẩn nghiền cửu „48 1IL.3 Nghiên cửu tạo chủng tải tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza Š2 HEIL, Tach DNA otha vi KhIẪN, co keneeeeoeoooeoeooS2 -HỊ 3.2 Nhân đoạn gen mã hóa enspm fibrinasa 53

1H1.3.3 Xử lý sản phdm PCR bang enzym gidi han 55

HL 3.4 Ghép néi gen mit hoa enzym fibrinaza va vector phT-226f |) 56

17.3.5 Bién nap vector tai t6 hop vao té hao F calt bang phương pháp sốc

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

Luận vẫn cao học Dinh Thi Thu Trang

Chuong I

TONG QUAN TAI LIEU

L1 Fibrin

Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao

quanh vết thương có tác dụng cảm mau Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay

còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin Khi đó, ñbrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau Ngoai ra, fibrin con

tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu

máu trong mạch máu và polyme hỏa protein [34]

Hình 1 1: Các sợi fìbrin làm đông tụ máu [44]

11.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê

Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong

máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu

đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quả trình nảy có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

Binh Thi Thu Ts

Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong

gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ đậu tương

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

Binh Thi Thu Ts

Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong

gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ đậu tương

Luận vẫn cao học Dinh Thi Thu Trang

Chuong I

TONG QUAN TAI LIEU

L1 Fibrin

Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao

quanh vết thương có tác dụng cảm mau Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay

còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin Khi đó, ñbrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau Ngoai ra, fibrin con

tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu

máu trong mạch máu và polyme hỏa protein [34]

Hình 1 1: Các sợi fìbrin làm đông tụ máu [44]

11.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê

Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong

máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu

đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quả trình nảy có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

Luận vẫn cao học Dinh Thi Thu Trang

Chuong I

TONG QUAN TAI LIEU

L1 Fibrin

Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao

quanh vết thương có tác dụng cảm mau Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay

còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin Khi đó, ñbrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau Ngoai ra, fibrin con

tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu

máu trong mạch máu và polyme hỏa protein [34]

Hình 1 1: Các sợi fìbrin làm đông tụ máu [44]

11.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê

Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong

máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu

đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quả trình nảy có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10

Hình 1.1: Cúc sợi fibrin làm động tụ máu

Hinh 1.2 Quả trình hình thành fibrin

Hinh } 3 Cấu trúc vòng xoắn của nattokinase

Linh 2.1 Vector pET-22b( }

Linh 3.1 Linh thai khudn lac va té bao cha cdc ching nghién cit

Tinh 3 2 Két qua định tên bing b6 Kit APT SOCITB cata 3 ching T19, T21 va T23

Hinh 3.3 DNA tng sé ctta MT

Hinh 3.4, San phim PCR nhân đoạn gen mẽ hỏa Ñbrinaza cia ching M, T19, T21 vis T23

Hinh 3.5 Sén phim PCR nhân đoạn gen mỡ hỏa fibrinaza cha ching M1

Hinh 3.6 Kết quả xử lý bằng enzpm giới hạn

Hinh 3.7 Kết qua tinh sach plasmid

hình 3.8 Kết quả biển nạp vector tải tổ hop vio B coli

1Hình 3.9 Chọn dòng pET-226{ |) mang gen ngoai lai mất hóa enxym ftbrinaza

THình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mi héa enzyme fibrinaza bang

Binh Thi Thu Ts

Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong

gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ đậu tương

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

Binh Thi Thu Ts

Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong

gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ đậu tương

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

Luận vẫn cao học Dinh Thi Thu Trang

Chuong I

TONG QUAN TAI LIEU

L1 Fibrin

Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao

quanh vết thương có tác dụng cảm mau Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay

còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin Khi đó, ñbrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau Ngoai ra, fibrin con

tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu

máu trong mạch máu và polyme hỏa protein [34]

Hình 1 1: Các sợi fìbrin làm đông tụ máu [44]

11.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê

Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong

máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu

đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quả trình nảy có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate

Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

Hình 1.1: Cúc sợi fibrin làm động tụ máu

Hinh 1.2 Quả trình hình thành fibrin

Hinh } 3 Cấu trúc vòng xoắn của nattokinase

Linh 2.1 Vector pET-22b( }

Linh 3.1 Linh thai khudn lac va té bao cha cdc ching nghién cit

Tinh 3 2 Két qua định tên bing b6 Kit APT SOCITB cata 3 ching T19, T21 va T23

Hinh 3.3 DNA tng sé ctta MT

Hinh 3.4, San phim PCR nhân đoạn gen mẽ hỏa Ñbrinaza cia ching M, T19, T21 vis T23

Hinh 3.5 Sén phim PCR nhân đoạn gen mỡ hỏa fibrinaza cha ching M1

Hinh 3.6 Kết quả xử lý bằng enzpm giới hạn

Hinh 3.7 Kết qua tinh sach plasmid

hình 3.8 Kết quả biển nạp vector tải tổ hop vio B coli

1Hình 3.9 Chọn dòng pET-226{ |) mang gen ngoai lai mất hóa enxym ftbrinaza

THình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mi héa enzyme fibrinaza bang

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do

vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng