Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong việc sàng lọc bệnh nhược cơ Duchenne Becker ở cộng đồng

Từ kết quả xác định đột biến ở bệnh nhân và sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, nghiên cứu của đề tài đã phát hiện được những người nữ lành mang gen bệnh trong các gia đình bệnh n

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH, CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS TRẦN VÂN KHÁNH

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ

THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009

(Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007)

8520

HÀ NỘI, NĂM 2009

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI NCKH CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN GÂY BỆNH, CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ở CỘNG ĐỒNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS TRẦN VÂN KHÁNH

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ Y TẾ

THỜI GIAN THỰC HIỆN: Từ tháng 11/2007 đến tháng 11/2009

(Quyết định phê duyệt số 4066 /QĐ-BYT ngày 25 tháng 10 năm2007)

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 470.000.000 đ

Trong đó kinh phí SNKH: 470.000.000 đ

HÀ NỘI, NĂM 2009

DANH SÁCH CÁ NHÂN VÀ ĐƠN VỊ THAM GIA

THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1- Tên đề tài: “Nghiên cứu phát hiện người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng”

2- Thời gian thực hiện: Tháng 11/2007 – tháng 11/2009

3- Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà Nội

4- Bộ chủ quản: Bộ Y Tế

5- Danh sách những người tham gia:

STT Họ Tên, Học hàm, Học vị Cơ quan công tác

1 TS Trần Vân Khánh Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN

2 PGS.TS Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN

3 PGS.TS Nguyễn Thị Hà Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN

4 PGS TS Nguyễn Thị Hoàn Bệnh viện Nhi Trung ương

5 ThS Nguyễn Thị Băng Sương Bộ môn Hóa sinh, ĐHY Huế

6 BS Đỗ Ngọc Hải Khoa Hóa sinh, bv Việt-Tiệp, Hải Phòng

7 BS.Nguyễn Thị Thanh Hải BSNT Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN

8 CN Nguyễn Thị Phương Thúy Bộ môn Hóa sinh, ĐHYHN

8 CN Nguyễn Hoàng Việt Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, ĐHYHN

TL HIỆU TRƯỞNG

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hùng

MỤC LỤC Trang PHẦN A- TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1 Kết quả nổi bật của đề tài 1

1.1 Đóng góp mới của đề tài 1

1.2 Kết quả cụ thể 2

2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 3

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt 4

3.1 Tiến độ 4

3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cúu 4

3.3 Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của Bản đề cương 4

3.4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí 5

PHẦN B NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đặt vấn đề 6

Chương 1 Tổng quan tài liệu 9

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 9

1.2 Đặc điểm của bệnh DMD 16

1.3 Cơ chế bệnh sinh và các dạng đột biến gen dystrophin 20

1.4 Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophin 30

1.5 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 38

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 40

2.1 Đối tượng nghiên cứu 40

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.4 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 49

Chương 3: Kết quả nghiên cứu 50

3.1 Kết quả tách chiết DNA 50

3.2 Kết quả tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 51

3.3 Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ RNA 52

3.4 Kết quả xác định người lành mang gen bệnh 58

3.5 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 68

Chương 4 Bàn luận 73

4.1 Qui trình tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 73

4.2 Xác định đột biến gen dystrophin 76

4.3 Xác định người lành mang gen bệnh 86

4.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh DMD 95

Kết luận 101

Kiến nghị 102

Tài liệu tham khảo Phụ lục

PHẦN A

TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1 KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Đóng góp mới của đề tài

- Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy - DMD) là bệnh lý cơ

di truyền có tần suất mắc bệnh khá cao (1/3500 trẻ trai), biểu hiện lâm sàng với yếu cơ nặng dần theo thời gian và thường tử vong ở độ tuổi 20 DMD là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm 60-65% Các nghiên cứu cho thấy đột biến mất đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) Tại Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố đều xác định đột biến mất đoạn gen ở mức độ DNA và ưu tiên sử dụng 19-25 cặp mồi khuyếch đại 19-25 exon trong hai vùng trọng điểm, trong khi đó đột biến có thể rải rác khắp 79 exon của chiều dài gen dystrophin; bởi vậy, các nghiên cứu này sẽ bỏ sót tổn thương Trên phân tử DNA, các exon nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn; để khuyếch đại 79 exon ở mức độ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon Ngược lại, trong cấu trúc mRNA của gen dystrophin, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau

Do đó, để khuyếch đại toàn bộ chiều dài của mRNA chứa 79 exon, người ta chỉ cần dùng

15 cặp mồi đặc hiệu

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA tại tất cả các vị trí của gen (79 exon), không chỉ tại hai vùng hotspot như các nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon) Song song, với việc chỉ cần sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu các tác giả đã tiết kiệm được rất nhiều thời gian, công sức và tiền của

- Hiện nay, bệnh DMD chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Các nhà khoa học trên thế giới cho rằng việc nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị và em gái, dì) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩn đoán trước sinh cho những người mẹ có nguy cơ

cao để tư vấn di truyền vẫn là biện pháp cơ bản nhằm phòng ngừa bệnh DMD và hạn chế

tỷ lệ sinh con bị bệnh trong cộng đồng

Từ kết quả xác định đột biến ở bệnh nhân và sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng,

nghiên cứu của đề tài đã phát hiện được những người nữ lành mang gen bệnh trong các gia đình bệnh nhân Trên cơ sở đó, các tác giả đã bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ có mang gen bệnh để phát hiện thai nhi có đột biến mất đoạn gen dystrophin và đưa ra lời khuyên di truyền: các thai phụ có thể giữ thai hay nên

hủy thai

Kết quả của đề tài nghiên cứu không chỉ mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, mà còn có tính nhân văn rõ nét

1.2 Tóm tắt kết quả cụ thể của đề tài

- Các tác giả đã chuẩn hóa tốt các qui trình kỹ thuật xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen (quy trình tách chiết DNA và RNA tổng số từ máu ngoại vi, qui trình RT-PCR tổng hợp cDNA, nested-PCR xác định đột biến, nhân dòng gen và giải trình tự gen, phản ứng multiplex PCR và kết hợp phân tích phả hệ); qui trình chẩn đoán trước sinh bệnh DMD (chọc hút dịch ối, nuôi cấy tế bào dịch ối, kỹ thuật tách DNA của tế bào ối và xác định giới tính thai nhi)

- Phát hiện được 20/40 bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn; trong đó 13 bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở vùng trung tâm (exon 43-60) chiếm 65%; 03 bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở vùng tận 5’, chiếm 15%; 02 bệnh nhân có đột biến kéo dài từ vùng tận 5’ đếnvùng trung tâm, chiếm 10% và 02 bệnh nhân có đột biến mất đoạn ở ngoài vùng hotspot,

chiếm 10% Như vậy, nghiên cứu này đã thành công trong việc xác định đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA tại tất cả các vị trí của gen (79 exon), không chỉ tại hai vùng hotspot như các nghiên cứu trước (gồm 19-25 exon) Song song, với việc chỉ cần sử dụng 15 cặp mồi đặc hiệu các tác giả đã tiết kiệm được rất nhiều thời gian, công sức và tiền của

- Từ kết quả xác định đột biến mất đoạn gen ở bệnh nhân, nghiên cứu tiếp tục được thực hiện để xác định người mang gen (thể dị hợp tử) đối với những người nữ có quan hệ huyết thống với bệnh nhân Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR định lượng, phân tích gen dystrophin của 48 thành viên nữ trong 30 gia đình bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn

đã phát hiện: 21/48 thành viên nữ là người lành mang gen bệnh, chiếm 43,8%; trong

đó số người mẹ dị hợp tử là 15/30, chiếm 50% và như vậy, 50% bệnh nhân DMD có đột biến mới phát sinh mà không phải do nhận gen bệnh từ người mẹ

- Các tác giả đã tiến hành chẩn đoán trước sinh cho 02 người mẹ đang mang thai trong số 15 người mẹ có kiểu gen dị hợp tử: 01 thai nhi là nam và 01 thai nhi là nữ, 02

thai nhi này không có đột biến mất đoạn gen dystrophin Hai người mẹ được khuyên có thể giữ thai

2 ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI

- Trên cơ sở những kết quả của đề tài, nghiên cứu sẽ được áp dụng trong chẩn đoán xác định đột biến mất đoạn gen cho những bệnh nhân DMD với giá thành, thời gian và công sức được tiết kiệm rất nhiều; mặt khác, những kết quả thu được sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát hiện các đột biến khác của gen dystrophin gây bệnh DMD như đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Từ đó, chẩn đoán bệnh DMD sẽ được chính xác và đầy đủ

- Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc phát hiện người lành mang gen, người mẹ dị hợp tử

và chẩn đoán trước sinh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế việc sinh con bị bệnh Những công việc này có ý nghĩa khoa học và nhân văn lớn, giảm gánh nặng về tinh thần và vật chất cho gia đình người bệnh, cho xã hội và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân

- Đây là nghiên cứu được tiến hành đầu tiện ở Việt Nam Bởi vậy, sau khi nghiệm thu kết quả của đề tài có thể được chuyển giao kỹ thuật cho các phòng nghiên cứu Sinh học phân

tử của các bệnh viện Sản và Nhi để có thể áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh DMD

và chẩn đoán trước sinh, tư vấn di truyền bệnh DMD

3 ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIEN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT

3.1 Tiến độ:

Thực hiện đề tài và nghiệm thu đúng thời gian qui định

3.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:

Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu của Bản đề cương đã được Bộ phê duyệt

3.3 Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của Bản đề cương:

- Các qui trình để thu được RNA tinh khiết từ máu ngoại vi, DNA từ tế bào nước ối; các

kỹ thuật RT-PCR, nested PCR, nhân dòng và giải trình tự gen, multiplex PCR đã được chuẩn hóa, có tính ổn định cao với mức độ tin cậy tốt

- Đào tạo 01 cao học, 01 Bác sỹ Nội trú bệnh viện và 01 nghiên cứu sinh:

+ Đỗ Ngọc Hải, Luận văn Thạc sỹ 2007, “Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen

dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne” Đạt loại xuất

sắc

+ Nguyễn Thị Băng Sương, Luận án Tiến sỹ Y học 2007-2010, “Xác định đột biến

mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” Đã bảo vệ luận án cấp cơ sở và đang chờ quyết định

của Bộ GD-ĐT cho bảo vệ luận án cấp nhà nước

+ Nguyễn Thị Thanh Hải, Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Nội trú Khóa 31

(2007-2010),“Nghiên cứu qui trình chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne“ Đang

triển khai

- Kết quả nghiên cứu của đề tài đã được công bố trong 05 bài báo của các tạp chí khoa học ngành Y và dự kiến đăng 01 bài báo ở tạp chí quốc tế (đang hoàn thiện)

+ Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Hà, Tạ

Thành Văn, (2008), Phát hiện người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne bằng

PCR định lượng, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 59 (6), 1-10

+ Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, (2008), Phát hiện đột biến làm thay đổi quá trình

hoàn thiện mRNA của gen dystrophin, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 54 (2), 19-23

+ Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn, (2009),

Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin ở mức độ mRNA, Tạp chí Y học thành phố

Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, 98-104

+ Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Lê Thị Hương Lan, Nguyễn Thị Hà, Tạ

Thành Văn, (2009), Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và phát hiện

người lành mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí

Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, 66-72

+ Đỗ Ngọc Hải, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Băng Sương, Nguyễn Hoàng Việt,

Nguyễn Thị Phương Thúy, Tạ Thành Văn, (2009), Nghiên cứu đột biến mất đoạn gen

dystrophin ở mức độ mRNA trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, Tạp chí Nghiên

cứu Y học, 61 (2), 16-23

3.4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

- Tổng kinh phí của đề tài: 470.000.000 đ

- Kinh phí đã chi và hoàn ứng: 450.000.000 đ

- Kinh phí còn lại: 20.000.000 đ (để nghiệm thu các cấp)

PHẦN B

NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)

là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146]

DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau Đây là một gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là protein dystrophin Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình

co cơ Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả

là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109]

Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định Dạng đột biến xóa đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60% Đột biến điểm

đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30% Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy đột biến xóa đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107] Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến xóa đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra xóa đoạn [7], [20], [69]

Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu

và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD Tuy nhiên

ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến xóa đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10] Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA

Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79 exon để xác định đột biến Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon Ngược lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau; do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129] Như vậy, việc xác định đột

biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất

Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng Theo nhiều nghiên cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66] Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh là

sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận [93], [107]

Ở Việt Nam, năm 2005, Nguyễn Thị Trang và cs nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu

có khả năng là người mang gen bệnh [20] Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện

người mang gen gây bệnh, chẩn đoán trước sinh ứng dụng trong sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker ở cộng đồng” được tiến hành với

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DMD

1.1.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh DMD

Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ

- Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu Gowers

rõ Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy Sự tiếp nối các động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến

- Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được Cuối cùng trẻ thường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96]

1.1.2 Xét nghiệm cận lâm sàng của bệnh DMD

1.1.2.1 Định lượng hoạt độ CK toàn phần

CK được Lohman phát hiện vào năm 1934 CK là enzym xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong

tế bào cơ Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ tiến triển Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104]

Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh Hoạt độ CK huyết thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới

160 UI/L) Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể loại trừ chẩn đoán DMD Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp Lý do của hiện tượng trên là vào giai đoạn cuối, khối cơ còn lại quá ít, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên lượng cơ thoái hóa cũng bị giảm [4], [91], [102]

1.1.2.2 Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ

Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằng cách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương pháp ghi điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiến triển trước khi có biểu hiện lâm sàng Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tả chi tiết hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103] Trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổi đặc trưng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho bệnh DMD, không có bằng chứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyền thần kinh cảm giác và vận động bình thường [34]

1.1.2.3 Sinh thiết cơ

Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34] Trong nhiều năm sau đó, phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác

Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi đặc trưng trên tiêu bản sinh thiết Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái

sinh rải rác Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, đây là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử sợi cơ; song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những thay đổi nhẹ về mặt cấu trúc [34]

Vị trí sinh thiết thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài của cơ tứ đầu đùi hoặc cơ sinh đôi ngoài [62]

1.1.2.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ Bởi vậy với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89]

Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker (BMD) Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với

ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28]

Người bình thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD

Hình 1.1 Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin

(Nguồn: Matsuo, 2002)

1.1.2.5 Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến

Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự xóa đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization

(FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) [90], [91], [107] Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4

số bệnh nhân vào điều trị tại bệnh viện [14]

sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, những người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh cho 50% số con gái của họ [96]

Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56]

Bảng 1.1 Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con

Tần số con với các genotyp khác nhau

XDXDlành

XDXdlành mang gen bệnh

XdXdbệnh

sàng nào của bệnh [16] Norman (1989) cho rằng khoảng 2/3 người lành mang gen bệnh có hoạt độ CK huyết thanh tăng [99].

1.1.5 Điều trị bệnh DMD

Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học Hiện tại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triển của bệnh Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể điều trị các triệu chứng, các biến chứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ

1.1.5.1 Điều trị nội khoa

Điều trị bệnh DMD chủ yếu phối hợp điều trị nội khoa và phục hồi chức năng nhằm trì hoãn sự tiến triển của bệnh Các thuốc điều trị nội khoa cho bệnh nhân DMD như prednison, prednisolon và deflazacort (thuộc nhóm steroid) hoặc aminoglycoside (kháng sinh) có thể làm chậm mức độ phá hủy

tế bào cơ Vật lý trị liệu có tác dụng làm chậm lại các biến chứng thoái hóa,

co rút cơ [92]

1.1.5.2 Liệu pháp thay thế gen

Mục đích của liệu pháp là đưa vào trong tế bào gen có khả năng tổng hợp protein dystrophin để protein này biểu hiện được ở màng tế bào cơ Hai phương pháp đã được thực nghiệm trên động vật là tiêm vào cơ những plasmid chứa đoạn gen dystrophin hoặc sử dụng vật truyền trung gian Tuy nhiên các phương pháp này gặp khó khăn: (1) trở ngại khi tiến hành đưa một gen lớn vào vật truyền trung gian, (2) đưa vào bộ máy di truyền ở bên trong tế bào cơ sau phân bào, (3) sự tồn tại của gen đưa vào cơ thể và sự thải ghép của

hệ thống miễn dịch Vì những trở ngại đó nên hiện nay các phương pháp này

vẫn chưa được áp dụng để điều trị bệnh DMD ở người [53], [96]

Trong vài năm trở lại đây, một hướng điều trị gen mới đã thu được nhiều thành quả, đó là việc chuyển từ thể bệnh nặng DMD sang thể bệnh nhẹ BMD Ở bệnh nhân DMD, đột biến gen dystrophin đã tạo ra mã kết thúc sớm hoặc làm thay đổi toàn bộ khung dịch mã, kết quả là protein dystrophin không được sản xuất Sau khi xác định được dạng đột biến của bệnh nhân, các nhà

khoa học đã chọn lọc xóa thêm một, hai hoặc nhiều exon của đoạn gen bị đột biến nhằm tạo ra một cắt đoạn lớn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được khung dịch mã và protein vẫn được sản xuất bán phần Phương pháp này đã được áp dụng để điều trị trên người và thu được những kết quả ban đầu đáng khích lệ [93], [144]

1.1.5.3 Liệu pháp điều trị tế bào

- Chuyển ghép nguyên bào cơ: kỹ thuật này được thực hiện bằng cách nuôi

cấy in vitro các nguyên bào cơ lấy từ cơ trưởng thành của một người thân

không mắc bệnh DMD, thường là người bố Các tế bào hình sao hiện diện trong cơ được xem là những nguyên bào cơ có nguồn gốc phôi thai nhưng ở trạng thái ngủ Trong quá trình sửa chữa cơ bị tổn thương, dưới các tác động khác nhau, tế bào hình sao sẽ tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào cơ Nguyên bào cơ nuôi cấy được tiêm vào cơ loạn dưỡng của người bệnh Các tế bào cơ không thiếu protein dystrophin sẽ thay thế các tế bào cơ bệnh lý, nhờ

đó chức năng của cơ được tái lập Trước khi thực hiện chuyển ghép nguyên bào cơ, bệnh nhân phải được điều trị ức chế miễn dịch để ngăn cản phản ứng thải ghép tương tự như trong điều trị ghép tạng và vì vậy, liệu pháp này có thể

có nhiều tác dụng phụ như nhiễm khuẩn, ung thư, [34] Hiện nay, phương pháp này chưa được áp dụng điều trị bệnh DMD một cách rộng rãi

- Phương pháp sử dụng tế bào gốc: những năm gần đây, tế bào gốc từ tủy

xương được nghiên cứu nhiều do không bị sự cản trở về vấn đề đạo đức và nguồn cung cấp dễ dàng Trong tủy xương, ngoài dòng tế bào tạo máu còn có nhiều dòng tế bào khác và các tế bào đó có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau như tế bào cơ hệ vận động, tế bào cơ tim, tế bào nội

mạc, tế bào thần kinh, Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy, khi tiêm trực tiếp

tế bào tủy xương vào cơ sẽ có một lượng nhỏ sợi cơ được tạo ra [143], [138]

1.1.6 Phòng bệnh DMD

DMD là bệnh di truyền có tiên lượng nặng, làm hạn chế và mất khả

năng đi lại, dẫn đến tàn phế và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay, chưa

có phương pháp điều trị bệnh hiệu quả Những nhà khoa học quan tâm đến bệnh DMD đều nhận định rằng, cho tới khi chưa tìm được phương pháp điều trị có hiệu quả cho bệnh DMD thì việc nghiên cứu nhằm phát hiện những người lành mang gen bệnh (mẹ và chị, em gái) trong gia đình bệnh nhân, hoặc chẩn đoán trước sinh trên những người mẹ có nguy cơ cao giúp tư vấn di

truyền vẫn là biện pháp cơ bản để phòng ngừa bệnh DMD [93], [107]

1.2 CƠ CHẾ BỆNH SINH VÀ CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN GEN DYSTROPHIN 1.2.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophin

1.2.1.1 Vị trí của gen dystrophin

Hình 1.2 Sơ đồ NST X và vị trí của gen dystrophin

(Nguồn: www.ghr.nlm.nih.gov/gene )

Gen dystrophin nằm trên NST X, nhánh ngắn vùng 2, băng 1, băng phụ 2

1.2.1.2 Cấu trúc của gen dystrophin

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc của gen dystrophin (Nguồn: Yaffe, 2002)

Gen dystrophin là một phức hợp gồm:

- Bộ phận khởi động (promotor): cho phép gen hoạt động, khi đóng, khi mở

và sản xuất ra các sản phẩm protein đặc hiệu mô tương ứng Có bảy promotor đặc hiệu là: promotor não, promotor cơ, promotor tiểu não, promotor Dp260, Dp140, Dp116, Dp71 [139]

- Các exon: gen dystrophin chứa 79 exon, đây là các vùng của gen được phiên

mã có mặt trong mRNA trưởng thành, chứa đựng thông tin di truyền để tổng hợp ra protein tương ứng

- Các intron: là những đoạn DNA của gen xen kẽ giữa những exon, được sao

mã thành mRNA tiền thân, nhưng bị loại bỏ trong quá trình tạo mRNA trưởng thành [136], [139]

1.2.1.3 Chức năng của gen dystrophin

Gen dystrophin có chiều dài khoảng 2400 kb, gen sao mã ra mRNA trưởng thành có chiều dài 14 kb Phân tử mRNA này tổng hợp nên protein tương ứng là protein dystrophin [136]

1.2.2 Cấu trúc và chức năng của protein dystrophin

1.2.2.1 Cấu trúc của protein dystrophin

Là protein được mã hóa bởi gen dystrophin có trọng lượng phân tử 427

kD với khoảng 3685 acid amin Protein dystrophin nằm ở màng bào tương của tế bào cơ và được chia làm 4 vùng:

1 Vùng N-tận gồm 240 acid amin, là vùng gắn với actin

2 Vùng trung tâm rod có 2700 acid amin

3 Vùng giàu cystein gồm 280 acid amin

4 Vùng C-tận chứa 420 acid amin, có chức năng liên kết với màng tế bào Vùng 5’-tận, vùng giàu base cystein và vùng C-tận là những vùng tương đối quan trọng đối với chức năng của dystrophin Những vùng này là vị

trí bám của actin và phức hợp dystrophin-glycoprotein Glycoprotein Complex-DGC) Trong khi đó vùng rod được coi là vùng ít chức năng nhất [65], [107]

(Dystrophin-Hình 1.4 Cấu trúc mô phỏng của protein dystrophin và một số protein

tương tác với nó (Nguồn: www.jennyndesign.com )

1.2.2.2 Chức năng của protein dystrophin

Protein dystrophin có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ xương, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của cơ Nhiều protein màng tế bào liên kết với protein dystrophin tạo thành phức hợp DGC (Dystrophin-Glycoprotein Complex) Phức hợp này cho phép nối những sợi actin với khung xương ngoài tế bào xuyên qua màng sợi cơ [109] Đầu amin tận của protein dystrophin gắn với F-actin và đầu carboxyl tận gắn với phức hợp DGC tại màng sợi cơ (hình 1.4) Các thành phần quan trọng của phức hợp DGC bao gồm dystroglycan, sarcoglycan, dystrobrevin, syntrophin và NOS Sự đột biến xảy ra ở bất cứ vị trí nào trong các thành phần này đều gây ra bệnh loạn dưỡng cơ di truyền Phức hợp DGC sẽ bị mất ổn định khi protein dystrophin vắng mặt Sự mất ổn định này dẫn đến hoại tử dần dần các sợi cơ và tổn thương màng Phức hợp DGC còn có vai trò như một tín hiệu hóa học Sự mất tín hiệu này cũng góp phần gây bệnh [65], [109]

Khung xương ngoài tế bào

Vùng N tận Vùng giàu Cystein Vùng C- tận

Cấu trúc xoắn giống spectrin Vùng nối

Phức hợp Dystroglycan

Phức hợp Sarcoglycan

Khung xương ngoài tế bào

Vùng N tận Vùng giàu Cystein Vùng C- tận

Cấu trúc xoắn giống spectrin Vùng nối

Phức hợp Dystroglycan

Phức hợp Sarcoglycan

1.2.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh DMD

Sự thiếu hụt protein dystrophin làm mất tính ổn định của phức hợp DGC, từ đó sẽ gây ra bất thường ở màng tế bào với rách màng tế bào khu trú, tạo điều kiện cho ion Ca2+ đi vào tế bào Ion Ca2+ vào tế bào sẽ hoạt hóa các enzym protease, gây phân hủy các protein của sợi cơ và bộ khung tế bào Do vậy, màng tế bào bị tổn thương rộng hơn và ion Ca2+ lại ồ ạt đi vào tế bào tạo

ra một vòng luẩn quẩn và dẫn đến rối loạn cân bằng nội mô canxi Hậu quả cuối cùng là sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào [109]

Hình 1.5 Cơ chế bệnh sinh của DMD

(Nguồn: Rando, 2004) 1.2.4 Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin

1.2.4.1 Đột biến xóa đoạn gen dystrophin

Đột biến xóa đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD, chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD Những đột biến xóa đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD Những mất đoạn gen không gây lệch khung dịch mã có thể tạo ra protein dystrophin bị cắt ngắn ở giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là BMD Khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các trường hợp

có đột biến xóa đoạn [90], [106]

Đột biến xóa đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và đầu tận 5’ của gen dystrophin [106] Các đột biến xóa đoạn gen được phát hiện bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75]

1.2.4.2 Đột biến điểm

Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30% Hầu hết đột biến điểm trong DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh nặng Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong việc xác định đột biến Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen dystrophin đã được xác định [106], [112]

1.2.4.3 Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn

Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên bệnh DMD trong hầu hết các trường hợp còn lại Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107] Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân DMD có đột biến nhỏ rải rác khó phát hiện [107]

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN DYSTROPHIN

Có nhiều phương pháp sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để phát hiện bất thường của gen dystrophin

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch phản

ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được

biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là

94oC-95oC trong vòng 30-60 giây

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép

các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng

lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase,

Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian

phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút [121]

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [94]

Hình 1.6 Các bước cơ bản của phản ứng PCR

(Nguồn: Vierstraete, 1999)

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, một DNA đích đã nhân bản thành 2n bản sao Đó là số lượng DNA đủ để có thể tách ra khi điện di và có thể phát hiện được sau khi nhuộm, đủ để có thể tạo dòng hoặc giải trình tự [6], [17], [81]

Các kỹ thuật PCR thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh DMD

* PCR đơn mồi (monoplex PCR): đây là kỹ thuật PCR kinh điển nhất Mỗi

phản ứng PCR sử dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA của tế bào [22], [138]

Trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen dystrophin, các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi để khuếch đại từng exon của gen dystrophin bằng phản ứng PCR, sau đó điện di sản phẩm trên gel agarose Mẫu bệnh nhân được tiến hành song song với mẫu đối chứng Nếu mẫu đối chứng xuất hiện vạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuếch đại, trong khi mẫu bệnh nhân không xuất hiện vạch thì bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn exon đó Ở Việt Nam, Nguyễn Đức Bách (2003), Đặng Thị Diễm Hồng (2004) đã sử dụng phương pháp PCR đơn mồi để xác định đột biến xóa đoạn gen ở bệnh nhân DMD Năm 2006, Nguyễn Thị Hoàn và CS đã khuếch đại 22 exon (1, 3,

4, 6, 8, 11, 12, 13, 17, 19, 20, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60) của

84 bệnh nhân DMD và phát hiện được 32 bệnh nhân (chiếm 38%) có đột biến xóa đoạn [1], [7], [8]

* PCR đa mồi (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời

nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhân các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau [114] Điều quan trọng nhất là phải thiết kế các cặp mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các mồi này không bắt cặp với nhau Tuy nhiên, rất khó

để đạt được các điều kiện như vậy nên phương pháp PCR đa mồi có nhược điểm là đôi khi cho kết quả không chính xác như PCR đơn mồi [41], [74]

Trong chẩn đoán bệnh DMD, do gen dystrophin có số lượng lớn exon (79 exon) nên để phát hiện đột biến xóa đoạn gen dystrophin, các tác giả thường sử dụng phương pháp PCR đa mồi hơn là phương pháp PCR đơn mồi nhằm tiết kiệm thời gian, công sức và hóa chất Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn là phương pháp được ưu tiên sử dụng

để phát hiện đột biến xóa đoạn gen dystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior (2005), Basak (2006), Sura (2008), Năm

2006, Trần Vân Khánh đã sử dụng phương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD Kết quả cho thấy tỷ lệ đột biến xóa đoạn gen dystrophin của bệnh nhân DMD ở Việt Nam là 38% [10], [32], [33], [43], [82], [125] Hiện nay, phương pháp multiplex PCR là một trong những phương pháp được sử dụng để chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen dystrophin ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein của trường Đại học Y Hà Nội

Hình 1.7 Phản ứng multiplex PCR xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin (Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Đại học Y Hà Nội)

* Kỹ thuật PCR lồng (nested PCR): nguyên lý của kỹ thuật nested PCR là sử

dụng 2 cặp mồi có trình tự nucleotid lồng vào nhau để khuếch đại đoạn DNA đích, nghĩa là cặp mồi thứ 2 có trình tự các nucleotid nằm bên trong cặp mồi thứ nhất Sản phẩm PCR được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR lần thứ 2 Phương pháp này làm tăng chất lượng và độ đặc hiệu cho phản ứng PCR [6], [18], [74]

* Kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR): trước hết, mRNA được chuyển

thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi được sử dụng hoặc là oligonucleotid oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), hoặc là các

hexanucleotid (trình tự gồm 6 nucleotid) để bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA Sau đó, cDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzym

Taq polymerase [110]

Đối với bệnh DMD, RT-PCR đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình xác định đột biến Như đã trình bày, gen dystrophin là một trong những gen lớn nhất của cơ thể (dài 2400 kb), có cấu trúc gồm 79 exon, sao mã ra phân tử mRNA dài 14 kb Trong cấu trúc DNA, các exon nằm xen kẽ với các intron có kích thước rất lớn [26]; do vậy, để khuếch đại 79 exon mang chức năng mã hóa protein từ DNA, người ta phải thiết kế 79 cặp mồi; nhưng nhờ phản ứng RT-PCR, phân tử mRNA được chuyển thành cDNA Trên phân tử cDNA, 79 exon nằm liên tục với nhau, không bị xen kẽ bởi các intron; vì thế, chỉ cần thiết kế 15 cặp mồi và sử dụng 15 phản ứng nested PCR (trong đó có

5 cặp mồi dùng cho phản ứng PCR lần 1 và 10 cặp mồi thiết kế cho phản ứng PCR lần 2), toàn bộ chiều dài của gen dystrophin sẽ được khuếch đại [129] Với 10 cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 2, 10 đoạn DNA chứa toàn bộ

79 exon được khuếch đại và mỗi đoạn có kích thước khoảng 1000-1400 bp Sau khi khuếch đại, các đoạn DNA được điện di trên agarose để xác định đột biến xóa đoạn gen Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giải trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phương pháp này để xác định dạng đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân DMD ở Singapore [129] Hiện nay, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn ở Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội cũng ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định đột biến điểm và đột biến xóa đoạn gen dystrophin

ở mức độ mRNA

1.3.2 Phương pháp Southern blot

Trong phương pháp này, DNA được phân cắt bằng các enzym đặc hiệu Sau đó, các đoạn DNA trong hỗn hợp được phân tách bằng điện di trên gel agarose rồi chuyển sang màng lai Bước tiếp theo, các đoạn DNA cần xác

định nằm trên màng được lai với các oligonucleic đặc hiệu có gắn chất đánh dấu như phóng xạ, chất màu huỳnh quang, biotin Các phương pháp xác định hình ảnh tương ứng được sử dụng để chỉ ra các vạch sản phẩm chứa các đoạn DNA cần phát hiện lai với oligonucleotid đánh dấu trên màng Phương pháp này cho phép xác định được những đoạn DNA có kích thước lớn chỉ với một nồng độ nhỏ trong hỗn hợp vốn khó có thể xác định được bằng các phương pháp khác như nhuộm ethedium bromide [12], [126]

Ứng dụng trong chẩn đoán DMD:

Ngoài việc phát hiện được đột biến xóa đoạn, Southern blot còn cho phép xác định các đột biến lặp đoạn gen dystrophin Ở bệnh nhân đột biến xóa đoạn, băng lai của các exon bị đột biến và đoạn dò đặc hiệu không xuất hiện trên phim Đối với các bệnh nhân đột biến lặp đoạn, có hiện tượng tăng cường

độ phát sáng của băng lai với exon bị lặp đoạn khi so sánh với mẫu đối chứng Ngoài ra, Southern blot còn được sử dụng để phát hiện người mẹ và chị em gái của bệnh nhân ở dạng dị hợp tử Prior (2005) đã sử dụng phương pháp này

để xác định đột biến xóa đoạn ở một bệnh nhân DMD, đồng thời phát hiện được mẹ và chị gái của bệnh nhân cũng là người mang gen bệnh [107]

Hình 1.8 Kỹ thuật Southern blot xác định đột biến gen dystrophin

(Nguồn: Prior, 2005)

Người mẹ (I-1) sinh một người con trai bị bệnh DMD (II-3) với đột biến xóa đoạn exon 50

và 2 người con gái (II-1 và II-2) Phản ứng Southern blot được tiến hành với 2 exon, 1 exon bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội là exon 19 và 1 exon mà bệnh nhân bị xóa đoạn (exon 50) Để tránh sai số, Prior phân tích kết quả dựa vào tỷ lệ đậm độ băng lai của exon 50:19

và so sánh tỷ lệ này của các thành viên với đối chứng nữ Kết quả cho thấy ở mẹ bệnh nhân (I-1) và II-1 có tỷ lệ đậm độ exon 50:19 giảm 50% so với tỷ lệ này ở đối chứng nữ, như vậy hai người nữ này ở dạng dị hợp tử Còn người nữ II-2 thì tỷ lệ đậm độ exon 50:19 tương đương với chứng nữ, chứng tỏ không mang gen bệnh

I II

1

Chứng nữ

Exon 19

Exon 50

I II

1

Chứng nữ

Exon 19

Exon 50

1.3.3 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Nguyên tắc:

Sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫu DNA dò (probe DNA) để phát hiện một trình tự đích Các mẫu DNA dò được đánh dấu huỳnh quang và sẽ lai với DNA đích trên NST ở kỳ giữa hoặc gian

kỳ Nhờ sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung, có thể phát hiện và định

vị được vị trí chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang [5]

Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh DMD:

FISH là một kỹ thuật giúp chẩn đoán hiệu quả các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh DMD nói riêng Để chẩn đoán đột biến gen dystrophin, Ligon (2000) đã sử dụng 2 loại probe:

- Các probe giúp xác định đột biến mất đoạn các exon của gen dystrophin gọi là cosmid probe có gắn chất huỳnh quang digoxingenin Khi có hiện tượng lai đặc hiệu xảy ra, digoxingenin gắn trên probe sẽ phát ra màu đỏ

- Loại probe thứ hai giúp định vị các NST X (vì gen dystrophin nằm trên NST X), probe này có gắn biotin Khi probe lai với NST X thì tâm động của NST X phát ra màu xanh [84]

Kết quả của nghiên cứu của ba gia đình được thể hiện ở hình 1.9

Hình 1.9 Hình ảnh xác định đột biến gen dystrophin nhờ phương pháp FISH

(Nguồn: Ligon, 2000)

nhân có 1 NST X (tâm động có màu xanh đặc hiệu) Trên NST X không xuất hiện tín hiệu màu

đỏ, chứng tỏ không có hiện tượng lai giữa probe và đoạn gen đặc hiệu, có nghĩa bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn exon trong khoảng 3-6

(B) FISH sử dụng probe cosmid đặc hiệu cho exon 12, áp dụng cho con gái của 1 bệnh nhân nam bị bệnh BMD Kết quả cho thấy chỉ có 1 NST X phát tín hiệu màu đỏ và 1 NST X không xuất hiện màu đỏ Như vậy người con gái này ở dạng dị hợp tử, mang 1 gen đột biến xóa đoạn exon 12

(C) FISH sử dụng probe cosmid đặc hiệu cho exon 44, xác định trên người chị của gia đình thứ 3 Kết quả cho thấy hiện tượng lai xảy ra ở cả 2 NST X, như vậy người chị này không mang gen đột biến exon 44

chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau (hình 1.10):

Hình 1.10 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

(Nguồn: Schouten, 2002)

- Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

+ Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai Đoạn này có khoảng 21-30 nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe

+ Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid của đoạn này giống nhau cho tất cả các probe Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR

- Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

+ Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’,

Sản phẩm khuếch đại của các probe được phân tách bằng điện di, số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản sao của đoạn DNA đích

+ Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho tất cả các probe Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe, + Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’

và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid không đặc hiệu với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau Do

đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di [115], [117] Chúng ta chỉ cần dùng duy nhất 1 cặp mồi nhưng khuếch đại được toàn bộ các probe khác nhau có trong hỗn hợp

Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau và chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu

với probe đó [115], [117]

Ứng dụng MLPA trong chẩn đoán bệnh DMD:

Hiện nay, MLPA là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn, lặp đoạn gen dystrophin Ngoài ra, MLPA còn giúp chẩn đoán người lành mang gen bệnh với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [66], [69]

Để chẩn đoán đột biến xóa đoạn và lặp đoạn gen, người ta thiết kế các probe gắn đặc hiệu với 79 exon của gen Trong mỗi phản ứng PCR, 40-45 probe đặc hiệu cho 40-45 exon của gen có thể được khuếch đại đồng thời với một cặp mồi duy nhất và chỉ cần tiến hành 2 phản ứng PCR, đột biến ở 79 exon của gen dystrophin được khảo sát với thời gian 8-10 giờ [117]

Năm 2008, Marzese ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán bệnh DMD, tác giả tiến hành 2 phản ứng PCR Một phản ứng sử dụng hỗn hợp probe gọi là PO34, gắn đặc hiệu với các exon 1-10, 21-30, 41-50 và 61-70 Phản ứng PCR thứ hai sử dụng hỗn hợp probe gọi là PO35, có thể phân tích

exon 11-20, 31-40, 51-60 và 71-79 [90] Kết quả nghiên cứu của Marzese trên hai gia đình bệnh nhân được thể hiện ở hình 1.11

Hình 1.11 Kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến lặp đoạn (A) và

đột biến xóa đoạn gen dystrophin (B) (Nguồn: Marzese, 2008)

1.3.5 Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotid (ddNTP) do Sanger và CS phát minh Với các máy thế hệ sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng, không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây Đối với phương pháp giải trình tự tự động, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân

B

Mẹ của BN mã số 1

Chứng nữ

Đột biến mất đoạn

từ exon 45-50

A

Lặp đoạn Exon 47 Chứng

B

Mẹ của BN mã số 1

Chứng nữ

Đột biến mất đoạn

từ exon 45-50

A

Lặp đoạn Exon 47 Chứng

tích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích [73] Phương pháp này giúp xác định các đột biến khó phát hiện của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến nhỏ, đột biến lặp đoạn,

Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin của bệnh nhân DMD (Nguồn: Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội)

1.4 CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH DMD

Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh DMD, 100% bệnh nhân DMD tử vong Bởi vậy, xác định người mẹ mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh đóng vai trò rất quan trọng và là cơ sở đưa ra lời khuyên di truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh [92]

Chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán sau sinh của các bệnh lý di truyền nói chung hay bệnh lý DMD nói riêng khác nhau ở phương thức lấy mẫu Lấy được mẫu tế bào và DNA có nguồn gốc từ thai nhi trong chẩn đoán trước sinh

đóng một vai trò quan trọng Muốn chẩn đoán xác định thai bị bệnh lý di truyền phải dựa vào các xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tế bào (phân tích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào và phân tử (kỹ thuật FISH) [44] Hai phương pháp lấy mẫu xét nghiệm để chẩn đoán trước sinh là phương pháp xâm phạm thai và phương pháp không xâm phạm thai [108]

1.4.1 Phương pháp lấy mẫu xâm phạm thai

Phương pháp lấy mẫu này ảnh hưởng trực tiếp đến thai nhi và có thể gây tai biến cho thai cũng như cho mẹ (sẩy thai, rỉ ối, ) Để giảm bớt rủi ro trên, việc sàng lọc để xác định những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh sẽ giảm đáng kể số thai phụ phải thực hiện xét nghiệm xâm phạm thai

Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh DMD

Các yếu tố được sử dụng trong sàng lọc chẩn đoán trước sinh bệnh DMD là: phả hệ của gia đình, nồng độ enzym CK của thai phụ và thai phụ có mang gen bệnh hay không

* Sàng lọc dựa vào phả hệ:

Các thai phụ đã có con bị bệnh DMD được xếp vào nhóm thai phụ có nguy cơ cao, các trường hợp này phải tiến hành lấy mẫu để chẩn đoán trước sinh Theo quy luật di truyền, người mẹ dị hợp tử có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ [96]

Những phụ nữ không có con mắc bệnh nhưng gia đình có người mắc bệnh cũng được xếp vào nhóm có nguy cơ cao Bệnh nhân có thể là anh em

ruột hoặc anh em họ, cậu, cháu của người mẹ [122]

* Sàng lọc dựa vào giá trị CK huyết thanh mẹ:

CK là một xét nghiệm hữu ích trong sàng lọc các người mẹ có nguy cơ cao Các nghiên cứu cho thấy, CK tăng cao trong 2/3 trường hợp dị hợp tử bắt buộc [85], [99]

* Sàng lọc dựa vào kết quả phân tích gen của người mẹ:

Kết quả phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay không là yếu tố sàng lọc quan trọng nhất Nếu người mẹ ở trạng thái dị hợp tử, việc lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích phát hiện đột biến là điều không tránh khỏi, cho dù việc lấy mẫu xâm phạm thai sẽ ảnh hưởng an toàn đến thai nhi [85], [122] Nếu người mẹ không mang gen đột biến, có thể tư vấn cho gia đình không cần tiến hành chẩn đoán trước sinh vì các phương pháp chẩn đoán trước sinh hiện nay vẫn thực hiện quy trình lấy mẫu bằng kỹ thuật chọc hút dịch ối, ảnh hưởng không tốt đến mẹ và thai nhi

Sau quá trình phân tích sàng lọc, những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh DMD sẽ được tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích và xác định đột biến

Một số kỹ thuật lấy mẫu xâm phạm thai

Có nhiều kỹ thuật lấy mẫu tế bào thai theo phương pháp xâm phạm thai

* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được14 đến 20 tuần Dịch ối có

các loại tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu bì đường tiết niệu của thai nhi Những tế bào này sẽ được nuôi cấy với các môi trường thích hợp để thu được lượng tế bào thai nhi nhiều hơn; mặt khác, nuôi cấy tế bào dịch ối còn giúp loại bỏ tế bào máu của mẹ Tỉ lệ sẩy thai do chọc ối khoảng 0,5-1,0% [120], [123]

* Lấy mẫu nhung mao màng nuôi (Chorionic Villus Sampling-CVS): kỹ

thuật CVS được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 Từ năm 1983, CVS

đã trở thành một xét nghiệm phổ biến để chẩn đoán trước sinh trong 3 tháng đầu của thai kỳ [57] CVS được thực hiện vào vào khoảng tuần thứ 9 đến tuần

12 của thai kỳ [120] Lợi điểm quan trọng nhất của CVS so với chọc ối là có thể cho kết quả nhanh hơn, đồng thời có thể thực hiện vào giai đoạn sớm hơn của thai kỳ Các bất thường của thai nhi có thể được phát hiện vào giai đoạn sớm hơn, do đó việc quyết định chấm dứt thai kỳ sẽ được chấp nhận dễ dàng hơn về mặt tâm lý, kỹ thuật thực hiện và hậu quả Một bất lợi của CVS so với

chọc ối là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, chiếm 2-3% trường hợp; theo nghiên cứu của Viện Sức khỏe Hoa Kỳ, tỷ lệ sẩy thai ở nhóm chọc hút nhung mao màng nuôi tăng 0,8% so với nhóm chọc ối [51], [135]

* Lấy máu cuống rốn qua da (Percutaneous Umbilical Blood

Sampling-PUBS): là phương pháp thu thập máu thai nhi, được thực hiện sau tuần thai

thứ 16 Ưu điểm của PUBS là tế bào lympho trong máu phát triển rất nhanh nên cho phép chẩn đoán gen rất nhanh chóng [120] Kỹ thuật này cũng rất có ích trong đánh giá chuyển hóa của bào thai cũng như các bất thường về huyết học Tỷ lệ sẩy thai do PUBS khoảng 1-2%, nghĩa là cao hơn so với phương pháp chọc ối [130]

* Sinh thiết mô thai: trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD, sinh thiết cơ

thai nhi được thực hiện dưới hướng dẫn của siêu âm vào khoảng tuần thứ 18 của thai kỳ để phân tích hóa mô miễn dịch các sợi cơ [119]

* Kỹ thuật PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis): kỹ thuật này được áp

dụng cho những phôi thai hình thành nhờ phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm nhằm giúp việc chọn lọc phôi không bị rối loạn di truyền (loạn dưỡng

cơ Duchenne, xơ nang tụy, hội chứng Down, ) trước khi chuyển và cấy phôi vào tử cung [61], [88]

1.4.2 Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫu không xâm nhập giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai nhi và người mẹ

Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:

- Thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ,

- Tách DNA tự do của thai nhi lưu hành trong máu mẹ

1.4.2.1.Phương pháp thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ

Sự xuất hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ là do tế bào máu thai nhi có thể đi vào tuần hoàn mẹ thông qua nhung mao nhau thai Những tế bào thai nhi có thể được thu thập một cách an toàn từ khoảng tuần thứ 18 của thai kỳ trở đi Hiện nay, với những kỹ thuật hiện đại, người ta có thể thu thập các tế bào này vào tuần thứ 12 của thai kỳ [100]

Có nhiều loại tế bào thai nhi xuất hiện trong máu mẹ, tuy nhiên nguyên hồng cầu được sử dụng nhiều nhất để phân tích và xác định bệnh lý di truyền nói chung Sau khi lấy máu mẹ, cần phải tiến hành các công đoạn gồm (1) làm giàu các tế bào thai nhi do số lượng của chúng trong một mẫu máu là rất hạn chế, (2) nhận diện tế bào thai nhi trong số các tế bào được làm giàu và (3) thực hiện các chẩn đoán di truyền học [64]

* Một số tế bào thai xuất hiện trong máu mẹ:

- Tế bào hồng cầu: Sự hiện diện của tế bào hồng cầu thai nhi trong máu mẹ

được chứng minh trong rất nhiều nghiên cứu [64] Tuy nhiên hồng cầu là những tế bào không nhân nên không có tác dụng trong chẩn đoán di truyền học

- Nguyên bào nuôi: việc sử dụng nguyên bào nuôi trong chẩn đoán trước sinh

có một số khó khăn nhất định Thứ nhất, hiện tượng nguyên bào nuôi đi vào tuần hoàn của mẹ không phải xảy ra ở tất cả các trường hợp mang thai Thứ hai, nếu hiện tượng này có xảy ra thì các nguyên bào nuôi cũng nhanh chóng

bị đào thải bởi tuần hoàn phổi [30] Ngoài ra, nguyên bào nuôi có nguồn gốc ngoài phôi, tức là một phần của bánh rau, do vậy nguyên bào nuôi có khả năng biểu hiện tình trạng khảm trong khoảng 1% trường hợp, do vậy nó không phản ánh chân thực bộ gen của thai nhi [59]

- Tế bào bạch cầu: việc sử dụng tế bào bạch cầu thai nhi trong máu mẹ cũng

gặp một số khó khăn nhất định Bianchi và CS đã phát hiện rằng các tế bào gốc tạo máu, các tế bào tiền thân lympho và tủy và tế bào lympho T của thai nhi có thể tồn tại trong máu một phụ nữ đến 6 năm Do vậy, nếu kỹ thuật này

thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thu nhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [36] Ngoài ra, việc nhận diện các tế bào bạch cầu thai nhi cũng gặp bất lợi là hiện nay chúng ta không đủ các loại kháng thể đơn dòng để phát hiện bạch cầu tương ứng [64]

- Tế bào gốc và các tế bào gốc tạo máu: phương pháp này có lợi điểm là tế

bào gốc có thể nhân lên nhanh chóng in vitro do vậy có thể cung cấp đủ một

lượng tế bào cần thiết cho các xét nghiệm di truyền học [64] Tuy nhiên các tế bào này lại có khả năng tồn tại lâu trong máu mẹ, do vậy, như trên đã nói, nếu

kỹ thuật này thực hiện ở các lần mang thai con rạ thì rất có thể sẽ thu nhận những tế bào bạch cầu của thai nhi trong lần mang thai trước [37]

- Nguyên hồng cầu: các tế bào hồng cầu có nhân (nguyên hồng cầu) của thai

nhi là loại tế bào có thể đáp ứng tốt nhất các tiêu chí của kỹ thuật phát hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ vì nó có đời sống tương đối ngắn, có hình thái đặc trưng và hầu như luôn hiện diện trong máu mẹ ở bất kỳ trường hợp mang thai nào [101] Do vậy, hiện nay người ta thường tiến hành tách, làm giàu các nguyên hồng cầu thai từ máu mẹ để tiến hành phân tích, xác định bệnh lý di truyền nói chung và bệnh DMD nói riêng

* Phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu mẹ:

Có nhiều phương pháp làm giàu nguyên hồng cầu thai nhi trong máu

mẹ, như kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu, kỹ thuật ly tâm theo gradient nồng độ, nuôi cấy tế bào, sử dụng cột avidinbiotin, [108]

Mẫu tế bào thai sau khi làm giàu được làm tiêu bản để nhận diện tế bào thai nhi

* Nhận diện tế bào thai nhi tách từ máu mẹ:

Do quá trình làm giàu nguyên hồng cầu chỉ cho sản phẩm có độ tinh khiết thấp nên việc tầm soát sau đó rất tốn công sức Zheng và CS [141] cũng như Ferguson-Smith [50] tìm ra phương pháp phát hiện nguyên hồng cầu bằng cách nhuộm kép nguyên hồng cầu với các kháng thể kháng hemoglobin thai nhi và huỳnh quang Parano (2001) phát hiện nguyên hồng cầu bằng cách nhuộm với kháng thể kháng hemoglobin đặc hiệu của thai nhi (anti-