Luận văn Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time pcr Định lượng hbv dna trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm viêm gan b

Hiện nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những trường hợp có dột biến ở vùng trước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẢO TẠO TRUONG DAI HOC BACH KHOA HA NOI

TRAN THI NGUYEN DUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHẦN TỬ REAL-TIME PCR

THỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYET THANH

BỆNH NHÂN NIIẼM VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGANII CONG NGIIE SINIT IOC

Hà Nội, 2006

BOQ GIAO DUC VA DAO TAO

G DAL HQC BACH KHOA HA NOL

TRAN TH] NGUYEN DUNG

UNG DUNG KY TIIUAT SINILTIQC PIIAN TU REAL-TIME PCR DINIL

LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYET THANH

BENII NIIAN NITEM VIEM GAN B

LUAN VAN THAC SI

NGANH CONG NGHE SINH HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN :

TS.NGUYỄN XUÂN THÀNH

Ha Néi, 2006

MUC LUC

Trang

1 Bệnh viêm pan B virut, 3

11 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B, 3 1.2 Hiểu hiện lãm sàng của bệnh viêm gan B virut 4

IL Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và trên thể giới 5

TH Virf viêm gan B (HBY) 7 LiL Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B, 7

HL2 Sự mã hoá của các gen cho kháng nguyên của IIBV và các phân

H.3 Các dấu ấn của virut viém gan B 16

TIL4, Sức để kháng của HBV 18

11.5 Khả năng và cơ chế gây bệnh của HBV 19

IV.1, C4c k¥ theat mién dich 22

1V.3 Kỹ thuật real time PCR dinh hrgng HBV DNA 27

` Vai trò, ý nghĩa của định hượng HBV DNA trong chấn đoán

và điển trị 34 CHƯỜNGH: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU — 35

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

bệnh, theo đối điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc diều trị thích hợp Hiện

nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

TONG QUAN TAI LIEU

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

bệnh, theo đối điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc diều trị thích hợp Hiện

nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

TONG QUAN TAI LIEU

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

bệnh, theo đối điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc diều trị thích hợp Hiện

nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

TONG QUAN TAI LIEU

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

bệnh, theo đối điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc diều trị thích hợp Hiện

nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virul là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy biểm Bệnh thường pập với các tân xuất cao ở các nước dang phát triển và là một vấn dễ

quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dù chương trình Liêm phòng vị rút viêm gan B (IIBV) đã làm giảm đáng

kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rat B, nhung HBV van còn là một mối hiểm hoa

lớn của loài người vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ lam cho ta lim

tưởng với một trường hợp rối loạn liêu hóa hay gặp, vả đa số trường hợp

không có triệu chứng lâm sảng ở những trưởng hợp viêm gan vị rút B min

tính mà chỉ cá xét nghiệm máu chúng la mới chân đoán được bệnh Dơ đó,

vai trỏ nủa xét nghiêm trong chấn doán viêm gan do vi rút Ð giữ một vai trỏ

cực kỳ quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong

chan đoán viêm gan vị rút Ð, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau Lùy vào Lừng giải doạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lra chọn xét nghiệm thích hợp Có 5

xét nghiệm hay được dùng trong chin đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi

B trước dây là HBsAp, AntiHĐs, HBcAsg, AnHiHĐc, AnHiHBc TạM và AntiHHe [gŒ Các xét nghiệm nảy là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương

pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên

chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị rút viêm gan B ở mức độ phân tứ (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử đi truyền của HBV là DA) Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của IIRV mà chúng ta cỏ thể giải quyết

được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cũ cũng như phân tích DNA

giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tỉnh trạng bệnh, khả năng điễn tiền của

TONG QUAN TAI LIEU

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virul là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy biểm Bệnh thường pập với các tân xuất cao ở các nước dang phát triển và là một vấn dễ

quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dù chương trình Liêm phòng vị rút viêm gan B (IIBV) đã làm giảm đáng

kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rat B, nhung HBV van còn là một mối hiểm hoa

lớn của loài người vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ lam cho ta lim

tưởng với một trường hợp rối loạn liêu hóa hay gặp, vả đa số trường hợp

không có triệu chứng lâm sảng ở những trưởng hợp viêm gan vị rút B min

tính mà chỉ cá xét nghiệm máu chúng la mới chân đoán được bệnh Dơ đó,

vai trỏ nủa xét nghiêm trong chấn doán viêm gan do vi rút Ð giữ một vai trỏ

cực kỳ quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong

chan đoán viêm gan vị rút Ð, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau Lùy vào Lừng giải doạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lra chọn xét nghiệm thích hợp Có 5

xét nghiệm hay được dùng trong chin đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi

B trước dây là HBsAp, AntiHĐs, HBcAsg, AnHiHĐc, AnHiHBc TạM và AntiHHe [gŒ Các xét nghiệm nảy là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương

pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên

chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị rút viêm gan B ở mức độ phân tứ (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử đi truyền của HBV là DA) Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của IIRV mà chúng ta cỏ thể giải quyết

được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cũ cũng như phân tích DNA

giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tỉnh trạng bệnh, khả năng điễn tiền của

TONG QUAN TAI LIEU

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virul là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy biểm Bệnh thường pập với các tân xuất cao ở các nước dang phát triển và là một vấn dễ

quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dù chương trình Liêm phòng vị rút viêm gan B (IIBV) đã làm giảm đáng

kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rat B, nhung HBV van còn là một mối hiểm hoa

lớn của loài người vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ lam cho ta lim

tưởng với một trường hợp rối loạn liêu hóa hay gặp, vả đa số trường hợp

không có triệu chứng lâm sảng ở những trưởng hợp viêm gan vị rút B min

tính mà chỉ cá xét nghiệm máu chúng la mới chân đoán được bệnh Dơ đó,

vai trỏ nủa xét nghiêm trong chấn doán viêm gan do vi rút Ð giữ một vai trỏ

cực kỳ quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong

chan đoán viêm gan vị rút Ð, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau Lùy vào Lừng giải doạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lra chọn xét nghiệm thích hợp Có 5

xét nghiệm hay được dùng trong chin đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi

B trước dây là HBsAp, AntiHĐs, HBcAsg, AnHiHĐc, AnHiHBc TạM và AntiHHe [gŒ Các xét nghiệm nảy là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương

pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên

chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị rút viêm gan B ở mức độ phân tứ (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử đi truyền của HBV là DA) Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của IIRV mà chúng ta cỏ thể giải quyết

được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cũ cũng như phân tích DNA

giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tỉnh trạng bệnh, khả năng điễn tiền của

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

TI Vat lién nghién cim 35

TH Phương pháp nghiên cứu 37

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

Nhiễm vị rút gây viêm gan siéu vi B (HBV) hién nay 1a mét van dé site khée

lớn của toàn cầu, đặc biết tại các nước đang phát triển Người là ổ chứa duy

Trhất và không có nhiễm tự nhiên trên các động vật hoang dại, mặc dấu người

1a đã gây bệnh thực nghiệm trên loài chimpanzee và một số loài linh trưởng khác, và mạc dù nhiễm IIBV được phát hiện ở tất cá các dân tộc nhưng tần xuất của bệnh và tỷ lệ mang virut trên người lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý

và chủng tộc

TIiện nay, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính cố khoảng 2 tỷ

người đã bị nhiễm HBV, trong đó có khoảng 350 triệu người đang mang mẩm

bệnh mạn tính, 3/4 trong số này là ở Châu Á, 25% người nhiễm virut mãn có

thể sẽ thành viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phái Hàng năm

khoảng 1-2 triệu người tử vong do các bệnh có liên quan đến HBV như viêm gan cấp, tối cấp; lâu đài như xơ gan và ung thu gan Tỷ lệ nhiễm HBV thay

đổi theo từng khu vực địa lý dân cư cũng như ở các quần thể dân cư khắc

nhau Các nhóm nguy cơ cao (truyền mầu, tiêm chích, quan hệ tinh duc, tiếp xúc trong nghệ nghiệp) có tỉ lệ mang trừng tÔ lân cao hơn so với quần thể đân

cư nối chung và khá năng trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên khi đáp

1ng miễn địch suy giám

1L2 Tình hình nhiễm IIBV ở Việt Nam

ViệL Nam là một quốc gia nằm trong vùng lưu hành viêm gan cao Theo

‘TCYTG cing như một số gông trình nghiên cứu trong nước, có khoảng 5- 15% dân số Việt am đang mang IIBV và hàng năm khoảng 35.000 người tử

vong vi những bệnh có liên quan đến HBV.

vimt đang tiếp tục Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử,

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan virul là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy biểm Bệnh thường pập với các tân xuất cao ở các nước dang phát triển và là một vấn dễ

quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dù chương trình Liêm phòng vị rút viêm gan B (IIBV) đã làm giảm đáng

kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rat B, nhung HBV van còn là một mối hiểm hoa

lớn của loài người vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ lam cho ta lim

tưởng với một trường hợp rối loạn liêu hóa hay gặp, vả đa số trường hợp

không có triệu chứng lâm sảng ở những trưởng hợp viêm gan vị rút B min

tính mà chỉ cá xét nghiệm máu chúng la mới chân đoán được bệnh Dơ đó,

vai trỏ nủa xét nghiêm trong chấn doán viêm gan do vi rút Ð giữ một vai trỏ

cực kỳ quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong

chan đoán viêm gan vị rút Ð, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau Lùy vào Lừng giải doạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lra chọn xét nghiệm thích hợp Có 5

xét nghiệm hay được dùng trong chin đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi

B trước dây là HBsAp, AntiHĐs, HBcAsg, AnHiHĐc, AnHiHBc TạM và AntiHHe [gŒ Các xét nghiệm nảy là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương

pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên

chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị rút viêm gan B ở mức độ phân tứ (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử đi truyền của HBV là DA) Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của IIRV mà chúng ta cỏ thể giải quyết

được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cũ cũng như phân tích DNA

giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tỉnh trạng bệnh, khả năng điễn tiền của

bệnh, theo đối điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc diều trị thích hợp Hiện

nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

1.2 Biển hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của