Luận văn Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time pcr Định lượng hbv dna trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm viêm gan b

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị r

TRAN THI NGUYEN DUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHẦN TỬ REAL-TIME PCR

THỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYET THANH

BỆNH NHÂN NIIẼM VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGANII CONG NGIIE SINIT IOC

Hà Nội, 2006

TRAN TH] NGUYEN DUNG

UNG DUNG KY TIIUAT SINILTIQC PIIAN TU REAL-TIME PCR DINIL

LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYET THANH

BENII NIIAN NITEM VIEM GAN B

LUAN VAN THAC SI

NGANH CONG NGHE SINH HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN :

TS.NGUYỄN XUÂN THÀNH

Ha Néi, 2006

Trang

11 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B, 3 1.2 Hiểu hiện lãm sàng của bệnh viêm gan B virut 4

IL Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và trên thể giới 5

LiL Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B, 7

HL2 Sự mã hoá của các gen cho kháng nguyên của IIBV và các phân

lyp cia HBV 10 H.3 Các dấu ấn của virut viém gan B 16

11.5 Khả năng và cơ chế gây bệnh của HBV 19

IV.1, C4c k¥ theat mién dich 22

1V.3 Kỹ thuật real time PCR dinh hrgng HBV DNA 27

` Vai trò, ý nghĩa của định hượng HBV DNA trong chấn đoán

và điển trị 34 CHƯỜNGH: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU — 35

1,1,1, Kỹ thuật tách chiết DNA 37

HL.L.2 Kỳ thuật miễn địch xác định các dấu ấn virút viêm gan B 39

TH.1.3 Kỹ thuật dinh long HBV DNA bang kj thuat ral time PCR 42

T Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time

PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân 47

1.1 Đánh giá độ nhạy của các cặp môi thiết kế 47 1.3 Đánh giá độ đặc biệu của các cặp môi thiết kế, 49

M Tìm hiển mối tương quan của nắng độ HBV ĐNA với các dấn ấn

Viêm gan virul là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy biểm Bệnh thường pập với các tân xuất cao ở các nước dang phát triển và là một vấn dễ

quan trọng của y tế cộng đồng

Mặc dù chương trình Liêm phòng vị rút viêm gan B (IIBV) đã làm giảm đáng

kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rat B, nhung HBV van còn là một mối hiểm hoa

lớn của loài người vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ lam cho ta lim

tưởng với một trường hợp rối loạn liêu hóa hay gặp, vả đa số trường hợp

không có triệu chứng lâm sảng ở những trưởng hợp viêm gan vị rút B min

tính mà chỉ cá xét nghiệm máu chúng la mới chân đoán được bệnh Dơ đó,

vai trỏ nủa xét nghiêm trong chấn doán viêm gan do vi rút Ð giữ một vai trỏ

cực kỳ quan trọng Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong

chan đoán viêm gan vị rút Ð, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau Lùy vào Lừng giải doạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lra chọn xét nghiệm thích hợp Có 5

xét nghiệm hay được dùng trong chin đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi

B trước dây là HBsAp, AntiHĐs, HBcAsg, AnHiHĐc, AnHiHBc TạM và AntiHHe [gŒ Các xét nghiệm nảy là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương

pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế

Vào những năm cuối thể kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chấn đoản gen nên

chúng ta đã có thể chẩn doán dược vị rút viêm gan B ở mức độ phân tứ (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử đi truyền của HBV là DA) Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của IIRV mà chúng ta cỏ thể giải quyết

được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cũ cũng như phân tích DNA

giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tỉnh trạng bệnh, khả năng điễn tiền của

IHBV như: Xác định được tỉnh trạng đang tăng sinh của vi rút trong những

trường hợp có dột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) dễ từ đó có quyết dịnh

điều trị đặc trị không Đó là xét nghiệm IIBV DNA, và kỹ thuật thường dùng

để xác định HBV DNA là kỹ thuật PƠR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA

đích rất nhạy và đặc hiệu, được sở dụng phố biến không chỉ ở Việt Nam mả

cả trên thể giới); Kỹ thuật định lượng vi rúi D trong máu để theo đối trong

diễu trị Nhờ xác định duce số lượng vì rút trước khi diều trị mà chung 1á có

thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để

có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả Hai kỹ thuật thưởng dùng để định

lượng vi rút viêm gan B 1a Real Time PCR (Khuếch dai DNA dich voi thoi

gian that) va BDNA (Khuéch đại tín hiệu) Trong đó, kỹ thuật real từme cho

kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian tư nghiệm ngắn Đây

là một kỹ thuật mới ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật này trong thực Lế còn chưa phổ biến Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này ấp dụng một cách rộng rãi

trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật sinh hoc phan tit real time PCR dink luyng Virut HBV

ĐÀNA trong huyết thanh bệnh nhản mắc viém gan siéu vi B

Mye dich:

1 Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trink ki thudt Real-time PCR

định lượng virúf viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân

2 Tùm hiểu mối tương quan của nông dộ HBV DNA với các đấu ấn khác của HBV.

1 BỆNH VIÊM GAN B VIRUT

1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan D

Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất

1uội trong các loại viruL gây viêm gan khác nhau Bệnh đã được mô tả từ thế

kỹ thứ năm trước công nguyên

Nam 1963, Baruch Blumberg va cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên

Au Loại khấng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu

Hành ở vài nước Chau Phi va Chau A và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,

bệnh nhân phong và hội chứng Down Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng

nguyên Âu và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách dầy dủ

Nam 1968, Prince Okochi va Murakami đã chứng minh rằng kháng nguyên

Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bê miệt viêm gan B hay HBsAg) dược

Tìm thấy đạc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B

Nam 1970, Dane và cộng sự đã xác định được hạt virul viêm gan B hoàn chỉnh

(ion) gợi là tiểu thé Dane

Nam 1972, Magnuis và Espmark tiếp lục nghiên cứu các thành phan kháng nguyên của vìruL viêm gan B: IIBcÁg, IIBeAg và các kháng thể tương ứng

1.2.1 Viêm gan B cấp

Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng

"Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm

sằng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:

Giải đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng, Trong giai đoạn này, khám

lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính

Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện

có ban hồng, mày day, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi

xuất hiện các biểu hiện lam sàng: sốt nhẹ, mệt mỗi, tiểu vàng, chấn ăn

Giai đoạn toàn phải: kéo đài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng

cá thể, Các triệu chứng của viêm gan l cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc

nặng hơn kết hợp vái vàng đa Trong trường hợp diển hình, gồm đau đầu, một vmôi, chán án, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những đấu hiệu sớm

xuất hiện 2-7 ngầy trước khi vàng đa trong các trường hợp có vàng đa, đầy bụng hoặc đau khu trú ö hạ sườn phải hay gập Nước tiểu trở nên sẫm ruàu và

phân nhạt màu hơn

Kháng nguyên IIBSs xuất hiện vài tuân sau khi nhiễm virut viêm gan B Một thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên IIBe Kháng thể IIBc cũng xuất

hiện sớm trong khi kháng thể kháng Hlös xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài

tuần trước khi HUsAg bién mat, bệnh khôi, kháng thé antiPre $1 và anti Pre S2 xuất hiện trước khi có anti Hs và là đấu hiệu tiến triển tốt của bệnh Sự tổn

tại dai đẳng của kháng nguyên Pre $1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của

1.2.2 Viêm gan B mạn

1.2.2.1 Viêm gan B man tin tai

"Thường không có triệu chứng, cố thể đi kèm với mệt mỗi, chấn an, dau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải

Tham kh4m lâm sàng bình thường hoặc cố vẻ thấy gan to nhẹ Những xét

nghiệm chức năng gan bình thường

1.2.2.2 Viêm gan B mạn hoạt động

Phân lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm

sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi đau hạ sườn

phải, vàng đa và ngứa khi có tác mật Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa Kham thấy gan to vừa đối khi dan, có thể thấy lách to

Viêm gan virut R mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai doạn cấp Các kháng nguyên

tổn tại lâu trong máu nh HBsAg, HBcAg và DNA virut cho thấy sự nhân lên

của virut vẫn tiếp tục Sau một thời gian nhất định (có thể từ vài tháng đến vài năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, IIBeAg có thể mất, xuất hiện

kháng thể kháng He, men transaminase trổ lại bình thường

II TÌNH HÌNH NHIEM VIEM GAN VIRUT B Ở VIỆT NAM VÀ

TREN THE GIGI

11.1 Tình hình nhiễm virút viêm gan B trên thế giới.

Trhất và không có nhiễm tự nhiên trên các động vật hoang dại, mặc dấu người

1a đã gây bệnh thực nghiệm trên loài chimpanzee và một số loài linh trưởng khác, và mạc dù nhiễm IIBV được phát hiện ở tất cá các dân tộc nhưng tần xuất của bệnh và tỷ lệ mang virut trên người lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý

và chủng tộc

TIiện nay, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính cố khoảng 2 tỷ

người đã bị nhiễm HBV, trong đó có khoảng 350 triệu người đang mang mẩm

bệnh mạn tính, 3/4 trong số này là ở Châu Á, 25% người nhiễm virut mãn có

thể sẽ thành viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phái Hàng năm

khoảng 1-2 triệu người tử vong do các bệnh có liên quan đến HBV như viêm gan cấp, tối cấp; lâu đài như xơ gan và ung thu gan Tỷ lệ nhiễm HBV thay

đổi theo từng khu vực địa lý dân cư cũng như ở các quần thể dân cư khắc

nhau Các nhóm nguy cơ cao (truyền mầu, tiêm chích, quan hệ tinh duc, tiếp xúc trong nghệ nghiệp) có tỉ lệ mang trừng tÔ lân cao hơn so với quần thể đân

cư nối chung và khá năng trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên khi đáp

1ng miễn địch suy giám

1L2 Tình hình nhiễm IIBV ở Việt Nam

ViệL Nam là một quốc gia nằm trong vùng lưu hành viêm gan cao Theo

‘TCYTG cing như một số gông trình nghiên cứu trong nước, có khoảng 5- 15% dân số Việt am đang mang IIBV và hàng năm khoảng 35.000 người tử

vong vi những bệnh có liên quan đến HBV.

TH.1 Hình thể và cấu trúc của virúi viêm gan B

HEV là một thành viên của họ Hepadnaviridac (c6 axit nhân là DNA) HBV

có trọng lượng phân tử khoảng 2.000.000 đalton

Quan sắt hu yết thanh người bị nhiễm IIBV bằng kính hiển vi điện tử, thấy có

3 loại hình thể

-_ Những hạtto 42-45 nanomet,

~_ Những vi cầu đường kính 20-22 nanomeL

-_ Những ống nhỏ đường kính 20-22 nanomet dài 40-400 nanomet

Các vi cầu và hình ống nhỗ là những bao ngoài rỗng của virut đứng lễ hoặc nối với nhau chính là phần kháng nguyên bể mặt HBsAg của siêu vi dược sản xuất thừa tại bào tương của tế bảo gan trong quá trình nhân lên của virt Các hạt này có rất nhiều trong huyết thanh, nổng độ vào khoảng 10-100ug/ml, gấp 100-1000 lần so với lượng virion,

Những hạt to chính là những virut hoàn chỉnh (hạt Dane), bao gồm lớp võ bọc

bên ngoài là kháng nguyên bề mặt HIsAg, tiếp đến là vỗ capxir được cấu tạo

từ kháng nguyên lõi (HIicAg), bên trong lõi chứa bộ gen virut.

Bao ngoài của virut (envelope) được cấu tạo bởi 3 chuồi polypeptide:

+ Chuỗi có kích thước ngắn nhất (trọng lượng phân tử 25 kilo Dalton, kDa)

được gọi là polypeptide chính do có nhiều nhất trong thành phần bao ngoài Đây chính là kháng nguyên HBsAg với 5 quyết định kháng nguyên khác nhau: a đặc hiệu chung cho nhóm, d/y và w/r đặc hiệu cho phụ typ (subtype)

+ Chuỗi polypeptide trung bình có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn (HBSAg) cộng thêm một đoạn có 55 axit amin (KN Pre-S2), trọng lượng phân tử 29kDa

+ Chuỗi polypeptide lớn có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi trung bình cộng thêm

một đoạn có từ 108-119 axit amin (KN Pre-SI và Pre-S2), trọng lượng phân tử

33 kDa, có tính sinh miễn dịch cao hơn so với HBsAg Chuỗi lớn là thành

phần quan trọng của hạt virut hoàn chỉnh

Vo capxit: được cấu thành bởi 2 loại chuỗi polypeptide, được gọi là

polypeptide lõi và tiên lõi Chuỗi polypeptide ngắn (polypeptide lõi), trọng lượng phân tử 22 kDa, chính là kháng nguyên lõi của virut, ký hiệu là HBcAg

(Hepatitis B core antigen) Chuỗi polypeptide dài (polypeptide tiền lõi), trọng

HBeAg) chính là một sản phẩm chuyển hoá của lớp vỏ capxit

HBV co b6 gen la phân tử DNA vòng mạch kép không hoàn chỉnh và có

chiều dài khoảng 3200 bases DNA này bao gồm hai chuỗi có chiều dài khác nhau: Chuỗi dài nằm ngoài, có cực tính âm (-), tạo nên một vồng tròn liên tục

có chiều dài cố định là 3,2 kb và mã hoá cho các thông tin di truyền của siêu

vi ARN thông tin và ARN tiền gen của virut được mã hoá từ mạch này Chuỗi

ngắn nằm trong, có cực tính dương (+), chiều dài thay đổi từ 50-80% chiều dài

mạch âm

Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo là sự ghép nối hai đầu 5` của hai sợi DNA trên một đoạn c6 chiéu dai 200 nucleotide, được gọi là vùng liên kết

Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 va DR2 gồm có 10-11 nueleotide, trong

đó DRI nằm ở đầu 5` của sợi DNA (-) và cũng hiện điện ở đoạn dư của đầu

3', còn DR2 nằm ở đầu 5` của sợi DNA (+) Hai trình tự này có vai trò chủ yếu trong việc khởi phát quá trình tổng hợp của các chuỗi DNA tương ứng

Thứ tự của các nucleotit được đánh số bat dau tir | tuong tmg 6 vi tri EcoRI

Chiêu dài bộ gen thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau

Chỉ có sợi DNA (-) mới được mã hoá Trên sợi DNA này có bốn đoạn gen

tương ứng với bốn khung đọc mở là các vùng mã hoá để tổng hợp các protein

của siêu vỉ Quá trình đọc mã được bất đầu từ bộ ba nucleotit AUG được gọi

là codon khởi đầu và chấm dứt bàng codon kết thúc TAG

Gen Š: bao gồm pre-SI, pre-S2 và vùng § mã hoá để tổng hợp các protein của

KN bề mặt (HBsAg) Vùng S và pre-S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng

pre-SI có chiêu dài thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau.

Đoạn gen § tổng hợp nén protein $ (Small) có chiều dai 24kd gdm 226 axitamin (aa) Protein nay gém hai thành phẩn là p24 và gp27 (gp: glycoprotein) Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đã số

Đoạn gen S và pro-S2 tổng hợp nên protein M (Modiurn) có chiều đài 33kd gém 281 aa Protein nay gérm lai logi glycoprotein gp33 va gp36, Vùng pre-

82 có vai trồ giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ

n6 liên kết với một loại albumin được trừng hợp trong huyết thanh người đồng

thời trên tế bào gan cững có các thụ thể để gắn với pH§A Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho các tế bào gan có khả năng để kháng

thể amlipre-S1 có thể trung hoà và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan

Cả ba loại protein này hiện điện với số lượng khác nhau trên bể mại của virion, trong đó protein 8 chiếm đa số, protcin M chiếm khoảng 5-10% trong

các virion và các hạt có kích thước 22nm Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của virion và các cấu trúc dạng ống nhưng chỉ chiếm 1-2% trong các protein

của hạt 22nm,

5' của gen C có hai codon khởi đầu cho quá trình đọc mã 'Irình tự nucleotide

nằm giữa hai codon này được gọi là vùng pre-C Nếu quá trình đọc mã được

bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 và dọc suốt chiều dài của đoạn

gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg Các nucleotide đầu tiền của vùng pre-

€ sẽ mã hoá cho việc tạo nên một đoạn peplide gồm 19 aa gợi IA peptide tin hiệu Peplide này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương của tế bão gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hoà lan được trong huyết thanh Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng nguyên hoà lan

Đây là một loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng

của nó chưa được biết rõ Tuy nhiên, sự hiện diện cúa IIBeAg có liên quan

đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân đôi cúa siêu vi

Nếu quá trình dọc mã bắt đấu từ codon AUG thử nhì ở vị trí 1901 và di suốt

đoạn gen C sẽ tổng hợp nên KN lối hay HBcAg Đây là KN cấu trúc của phần

nucleocapid Vì HBeAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không

được bài tiết ra khỏi tế bào gan Vì vậy, HBcAg không bao giờ hiện diện trong

huyết thanh

Một số trường hợp xảy ra đột biến ở đoạn pre-C tại vị trí 1896, guanosine

được thay thế bằng adenine, tạo nên một trình tự TAG là một codon kết thúc

Chính codon kết thúc này đã chấm dứt quá trình giải mã của vùng pre-C, cho

nên sự tổng hợp của HBeAg không thực hiện được mặc dù quá trình nhân đôi

của siêu vi vẫn tiếp diễn

Ching hoang dai Đột biến pre-C

Hình Š: Gen € gồm ving pre-C va C

Gen P: ma hoa téng hợp enzyme polymerase Gen P chiếm 80% chiều dài của

bộ gen Sản phẩm của gen P không chỉ liên quan đến cơ chế sao chép ngược

mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capsid bao bọc bên ngoài cầu trúc RNA

tiền genome

Hoạt động nhân đôi của HBV nho hoat tinh cla men DNA polymerase (P protein) nội sinh trong các viên kết siêu li tâm từ huyết thanh người chứa

HBV Gen P (Polymerase) duoc chia lim 4 vùng, mỗi vùng có một chức năng

riéng: Terminal protein, Spacer, RT domains va RNAase H (Xem hinh)

Trong do, vung sao ma nguye (RT domains: Reverse Transcription) chiu

trách nhiêm cho việc téng hop men RNA-dependent DNA va DNA-

dependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A — G (Xem hình cấu

tạo RT) HBV DNA có tỉ lệ đột biến rất cao vì men này hay bị sai sót trong

Hình 6: Cấu tạo gen P và vùng RT

Gen X: mã hoá tổng hợp protein có tác dụng chuyển hoạt hoá Gen X mã hoá cho một polypeptide có khoảng I45-I54 aa tuỳ theo tong phân týp Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó giữ vai trò chuyển

hoạt hoá trong quá trình nhân đôi của siêu vi Protein X còn có liên quan đến

sự điều hoà quá trình tăng trưởng của tế bào, cho nên có thể nó có vai trò trong cơ chế sin hung thư của tế bào gan bị nhiễm

Các phân týp của HBV:

Trước đây, HBV dược phân ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes) dua trén

việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bể mặt vi rút B, mỗi

phan typ déu cĩ chung phẩn quyết định kháng nguyên “4” và khác nhau tuỳ

theo su ghép cap của các quyết định kháng nguyên “đ” hoặc “y” ghép với “w""

hoặc “r° để tạo nên các phân týp như adw, ayw, adr, ayr Các kiểu huyết thanh

này cĩ thể phân loại thêm ra 9 kiéu (Subtypes) 14 ayw1, ayw2, ayw3, ayw4,

ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq- Nghiền cứu dịch tế cho thấy sự phân bố của

các serotypes khác nhau trên các vùng khác nhau trên thế giới Tuy nhiên, cho

dén nay cĩ rất ít đữ liệu về vai trỏ của HBV Scrotypcs

Những tiên bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thé ky 20

đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vỉ rút viêm gan B, va

từ đĩ một dấu Ấn (marker) mdi cla HBV ra đời là HBV genotype Tám kiểu gen của IV đã được xác định (Từ A đến ID đựa vào sự khác nhau trên 8%

của Lộn bộ Irình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố cúa các kiểu gen

khác nhau ở các châu lục, các xước khác nhau

Tuy nhiên sự phân loại các IIBV genotypes cĩ thể chỉ cần đựa trên trình tự

chuỗi (sequence) của một doan gen nảo đĩ của HBV như trên một phần trình

tự chuỗi của gen pre-S; S Cĩ nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và

dùng trong việc xác dinh HBV genotypcs như giải trình tự chuỗi

(sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LIPA (Line Probe Assay), phan tmg mién dich men (Enzyme-linked Immunoassay)

Mỗi phương pháp cỏ những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương,

pháp giải trình tự chuỗi cĩ thể xem như cĩ nhiều ưu điểm nỗi bật vì bên cạnh

việc xác định được trình tự chuỗi các Nueleotids trong bd gen cia HBV dé wr

đĩ sơ sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotypes mả cịn dựa

vàn kết quả giải trình tự nảy chúng ta có thể xác định được một số dạng đột

biến kháng thuốc của HRV để từ đó cá phát đỗ điều trị tối ưu

1H.3 Các đấu ấn của viru( viêm gan B,

Virut viêm gan H có cấu tạo phức tạp, có nhiều kháng nguyên, các đấu ấn sau đây đáng được chú ý ví nó có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh và trong nghiên

cứu địch tễ:

THL3.1 Kháng nguyên bẻ mặt virut viêm gan B (HBsAg):

Kháng nguyên bẻ mặt của virut viêm gan 1 (HDsAg), đây là maker (dấu ấn)

xuất hiện trước tiên sau khi bị lây nhiễm cố thể thấy trong huyết thanh ở giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thường nhiều ngây hoặc nhiều tuần trước khi có triệu chứng lâm sàng rồi giảm dẩn và biến mất thường từ 4-8 tuần tiếp theo Nếu HBság lồn lại sau 6 tháng sau khi khỏi bệnh được gọi là nhiễm trừng man tinh (bay 14 mang HBsAg mạn tính) rất nguy hiểm cho người khác Trong

viêm gan mạn IIBsAg cố thể tổn tại nhiều năm hoặc hết đời

Định lượng IIBsAg có giá trị tiên lượng cao: Nếu IIBsAg không giảm xuống đến mức 1/4 hiệu giá ban đầu trong 4-6 tuần đâu của bệnh thì bệnh nhân cổ

khả năng chuyển sang mạn tính Khi thấy có HsAa trong máu chứng tổ có ADN của viru trong gan, phản ánh tình trạng cấp hoặc mạn của bệnh viêm

gan và tất cả các trường hợp HBsAg dương tính đền được coi là có khả năng truyền bệnh Tuy nhiên vẫn cố khoảng 5-10% bệnh nhân viêm gan xét nghiệm

khong cd HBsAg (c6 thd ham lượng quá thấp hoặc bị kháng thể trung hoà),

IH.3.2 Kháng thé Anti HBs:

Là đấu ấn phản ánh tình trạng viêm gan D đã khỏi bệnh và/hoặc đã được miễn

nhiễm dối với HBV.

Xuất hiện muộn 2-16 tuần sau khi không phát hiện được HBsAg

Kháng thể IgM anti HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp, còn kháng thể IgŒ anti

IIBS xuất hiện muộn hơn và tổn tại lâu hơn

Xuất hiện kháng thể an HBs là dấu hiệu bệnh đã được cải thiện, nó có tác dụng chống lái nhiễm HBV, Kháng thể an HBs cồn phát hiện được trong

máu ở những người có tiêm phòng vacxin viêm gan B,

1H.3.3 Kháng nguyên IIBeAg:

Kháng nguyên E (HBeAp) là kháng nguyên hoà tan, xuất hiện sớm sau HBsAg nhưng tồn tại lâu trong các thể nhiễm trùng mãn (đặc biệt là viêm gan mãn hoạt động) cổ liên quan đến sự có mật của vimt HBV nên nó phản ánh

mức độ lây nhiễm của người bệnh, đặc biệt ở phụ nữ mang thai có TIBsAg dương tính Xét nghiệm phát hiện HBeAg và kháng thể kháng lại 1IBeAg @mti

HRe) thường chỉ nên chỉ định ở những bệnh nhân đã có xét nghiệm HBSAg

dương tính

Sự biến mất của HBeAs và xuất hiện kháng thể ant He là đấu hiệu của bệnh đang lui dẫn Ngược lại, trong viêm gan mãn tấn công thường thấy HUeAg

Œ)

11.3.4, Khang thể anti HBe:

Sự chuyển huyết thanh antiliBe xay ra khi antillBe tir (-) chuyén sang (+) va TIBeAg từ (+) chuyển sang (-) Hiện tượng này phản ánh sự nhân đôi của siêu

vi đã giảm hoặc chấm dứt Sự chuyển huyết thanh antiHHe có thể xây ra một

cách tự nhiên hoặc được thúc đẩy nhanh chóng nhờ các phương pháp trị liệu

kháng siêu vi

Tuy nhie

điện của aniHBc chứng tổ

trong viêm gan B man tinh, sit hi

bệnh đã diễn tiến tương đối lâu, nhất là có thể đã chuyển sang giai đoạn xơ gan hoặc ung thư gan ngu yên phát

IgM anii IIBe xuất hiện sớm cồn IgØ anti IIBe xuất hiện muộn hơn

10.3.5 Kháng nguyên lõi HBcAg:

Kháng nguyên lõi (HHcAp) là thành phần bên trong lối virut, dược bao bọc bởi bao ngoài nên không có trong máu dưới dạng tự do, nó chỉ xuất hiện ở trong tế bào gan, vì vậy các kỹ thuật miễn dịch bọc thường không phát hiện được Bằng các kỹ thuật đặc biệt như mniển dịch huỳnh quang hoặc miễn dịch enzymme có thể phát hiện chủng trong nhân tế bào gan trên các tiêu bản sinh

thiết hoặc tử thiết

Khi trong một lế bào gan cổ IIBcAg bao giờ cũng có 1IBsAg trên màng tế bào

và nồng độ DNA polymerase luôn luôn tăng cao

11.3.6 Kháng thể anti IIc:

Là dấu ấn huyết thanh quan trọng nhất chứng minh bệnh nhân đã từng bị nhiễm 1IBV; là đấu ấn quý giá giúp phân biệt VGSV B trong giai đoạn cấp

tính hay mãn tính

Khang thé IgM anti IIBe xuất hiện sớm trong những tuần đầu của bệnh, cồn

kháng thể IgG ant Hlic xuất hiện muộn nhưng tồn tại lâu hơn

Sự có mặt của kháng thể anti HBc không cố tác dựng bảo vệ chống tái nhiễm

HBV

TH.4 Sức đề kháng của HBV

HBV cổ sức dễ kháng cao và cao hơn cả HAV, virut 06 thé tén tại ở nhiệt độ buồng trong 6 tháng, ở 1006 trong 20 phút, ở 58oC trong 24 giờ; không bị huỷ bởi ele TIBsAg rất bên vững, vẫn tổn lại sau 20 nam ở -20oC, dưới tác dụng nhiều enzyme và dung môi hữu cơ IIBV bị bất hoạt bởi [ormalin 5%/12

giờ, Cloramin 3%/ 2 giờ

Muốn huỷ virut hoặc IIBSAg phải khử trùng rất kỹ (đun si 30 phút hoặc sấy

khô, hấp ướt)

THL.5 Khả năng và cơ chế gây bệnh của IIBV

HEV có lính lây nhiễm cao, 0,01-0,001 ml huyết thanh nhiễm HBV đã có thể

TIEV là tác nhân gây viêm gan virut quan trọng nhất trong các virut viêm gan

Bà mẹ nhiễm HBV trong những tháng dâu ruang thai không làm cho thai nhí

bị đị tật, nếu bà mẹ nhiễm HBV ở 3 tháng cuối thời kỳ mang thai thà có 60%

có nguy cơ lây bệnh cho con Mức độ láy bệnh cho con cảng cao nếu người

mẹ mang đồng thời IIBsAg và IIBeÁg (có thể lây tới 100%) Nhiễm virut &

lứa tuổi nhỏ thường dễ tiến triển thành các dạng mãn tính nghiêm trọng Tần

suất tiến triển thành dạng mãn tính ở trẻ em nhiễm virut từ mẹ rất cao 40-80%

trong khi đố tỷ lệ này ở người trưởng thành lä 5-]0%

Virut có thể thải ra ngoài theo dịch tiết của các niêm mạc và sữa nhưng không thải theo phân Thực tế cho thấy HI3sAg có ở hầu hết các dịch sinh học: nước

20

bọt, dịch mật, dịch não tuỷ, dịch màng phổi, tỉnh dịch, dịch âm đạo, nước ối,

mồ hôi và nước tiểu

Quá trình nhân lên của virut viêm gan B:

#3ŠEfEEg — Srheteeaniflament Feleose

HBeAg ‘containing HESAQ

4 +

Hình 7: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan

HBV có ái lực đặc biệt với tế bào gan Sau khi bám vào tế bào gan, virut cởi

vỏ, chỉ có DNA xâm nhập vào nhân tế bào gan ở dạng siêu xoắn RNA- polymerase phụ thuộc DNA của tế bào chủ sẽ phiên mã sợi DNA (-) thành các

bản sao RNA hoàn chỉnh, trong đó có RNA tiên genome, để ra bào tương tế

bào gan tổng hợp các protein cho virut Dưới tác dụng của DNA-polymerase, RNA tiền genome thực hiện phiên mã ngược tổng hợp DNA sơi âm Khi DNA của virut được tổng hợp xong, RNA tiền genome bị giáng hoá trừ một đoạn

nhỏ khoảng 20 đôi baze từ đầu 5` sẽ hoạt động như một primer để tổng hợp

DNA sợi dương từ sợi âm mẫu, tuỳ thuộc vào mức độ hoạt động của DNA

polymerase mà DNA sợi đương cố độ dài thay đổi, các thành phần khác được

tổng hợp từ các RNA thông tin cùng lúc với sự tổng hợp DNA sợi dương Các

thành phân vừa được tổng hợp lắp ghép lại với nhau tạo bạt virut và giải phống khỏi tế bào gan Trong quá trình nhân lên của virut luôn có sự tổng hợp thừa thành phần vỗ virut vì vậy trong huyết thanh người nhiễm IIBV có cá 3 loại hal: hạt vì rút hoàn chỉnh, bạt hình cầu và hạt hình ống

IV MỘT SỐ THỦ NGIIỆM CẨN TIHẾT ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN

MẮC VIÊM GAN SIÊU VI B:

Để tầm soát xem một bệnh nhân có bị nhiễm IIBV hay không, người ta không cẩn phải làm tất cả các dấu ấn huyết thanh gồm IIBsAg, antilIBs, IIBeAg,

antiHBe và aniHDŨc mà chúng ta chỉ cần tim HBsAg va antiHBe

TIBsAg (+) là tiêu chuẩn chính yếu để chấn đoán nhưng nếu IIBsAg {-) thì

antuHlic (+) cũng đủ chứng minh bệnh nhân đã tong nhiễm HDBV Do đó, khi

cả HBsAg và antiHBc đều (-), chúng ta có thể ít nghĩ dến VGSV B

Sau khi đã xác định bị nhiễm HBV, nếu muốn biết bệnh nhân dang ở giai đoạn nào của bệnh thĩ mới cần kết hợp thêm các dấu ấn cồn lại

HBsAg (4)

Viêm gan (cấp hoặc miãn) IgM antiHBe

ảm tính dương tính

Viêm gan mãn Viêm gan cấp

HBeAg va anti HBe

HBeAg (4) antiHBe (+)

Lây nhiễm cao Lây nhiễm thấp

hoge man hoặc (+) giả cổ đáp ứng VGSVB

Hình 8: Các hướng dẫn chẩn don dựa trên kết quả tâm soát ban du:

Đối với những người mang HBV và có dấu hiệu gan đang bị suy nhược do

hoạt động của HBV có thể được điều trị để giảm bớt những nguy cơ thiệt hại

lâu dai mà có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan, một số thử nghiệm để quyết định có nên điều trị hay không đó là: xét nghiệm men gan ALT; dau ấn

HBeAg va néng dd HBV DNA Trong điều tri cho bệnh nhân viêm gan B

mạn, những thử nghiệm trên cũng được áp dụng để kiểm tra sự phản ứng đôi

với điều trị Phản ứng tốt với cách điêu trị khi chỉ số ALT trở lại bình thường,

giảm số HBV DNA và HBcAa, tăng kháng thể anti-HBc trong huyết thanh

TV.1 Các kỹ thuật miễn dịch phát hiện dấu ấn virut viêm gan B

Các kỹ thuật miễn dịch có thể xếp vào hai nhóm chính

enzyme có thể được gắn vào hoặc kháng thể hoặc kháng nguyên

Các kỹ thuật EIA có thể chia lam 2 nhóm dựa trên bản chất của

hệ thống phản ứng:

= Nhém các kỹ thuật LHIA cạnh tranh: dựa trên nguyên lý

cạnh tranh giữa kháng nguyên trong mẫu huyết thanh với kháng nguyên đánh đấu enzyme dể kết hợp với một hượng kháng thể cố hạn được gắn vào một pha rắn (như thành ống nghiệm, giếng phiến dẻo, viên bí ) Trong thực hiện

kỹ thuật cạnh tranh không cần tới nhiễu bước

" Nhóm các kỹ thuật EIA bánh kẹp: trong kỹ thuật miễn địch gắn enzyme pha rắn (ELISA), kháng nguyên muốn tìm bị kẹp giữa một bên là kháng thể bắt giữ gắn cố định trên bể mặt đấy giếng phiến nhựa và một bên là kháng thể đánh dấu gắn POD

« Kỹ thuật miễn địch phóng xạ (IA): là kỹ thuật có độ nhạy cao

để phát hiện các dấu ấn viêm gan Kỹ thuật này có độ nhạy gấp

10 lần hơn sơ với kỹ thuật ngưng kết và 100 lần so với các kỹ thuật thuộc thế hệ thứ hai Phần ứng dựa trên nguyên lý cạnh

tranh hoặc bánh kẹp.

TV.1.1 Ky thudt xde dinh HBsAg

Xỹ thuật xác định HBsAp dựa trên nguyên lý của kỹ thuật bánh kẹp Sandwich

(Kháng nguyên - Kháng thể - Kháng nguyên ):

Ant-TIBs được phú lên trên bê mại các giếng của plate, nhỏ lên trên cộng hợp anU-HBs*HREO, sau đó nh tiếp mẫu có chứa HBsÁg, sẽ tạo phúc kháng thé

- kháng nguyên - khang thé*IIRPO

"Tiếp theo nhỏ dung dịch TMB, dung dịch chuyển dần từ không màu sang màu xanh + 2N II;§O¿, dung dịch chuyển dần từ màu xanh sang màu vàng, dọc

DŨ ở bước sống 450/650nm

Nếu mẫu không có HlsAg, sau khi nhỏ dung dịch TMI, dung dịch chuyển

sang màu xanh nhạt và khi + 2N HazSOa, dung dịch chuyển sang màu vàng

nhạt, do OD ở bước sóng 450/650nm

1V.1.2 K¥ thudt xde dinh HBeAg

Kỹ thuật xác định HBeAg dựa trên nguyên lý của kỹ thuật bánh kẹp Sandwich (Kháng nguyên - Kháng thể - Kháng ngu yên ):

Kháng thể Anti-HBe dã được phủ trên các giếng ở bản nhựa

Ré tiếp mẫu xét nghiệm có chứa dịch kháng nguyên HBeApg Kháng nguyên

TIEEAg có trong mẫu sẽ gắn với kháng thể anti-IIBe tạo thành phức hợp Anti-

Cuối cùng bổ sung cơ chất của enzyme là dung địch TMB không mau, enzyme sẽ thuỷ phân cơ chất làm mầu dung dịch chuyển đần sang màu xanh Sau đồ nhỏ tiếp 2N IIzSOx, dung dịch chuyển dẫn sang mầu vàng Đo OD ở bước sóng 450nm

IV.1.3 Kỹ thuật xác định anii HIBc

Kỹ thuật xác định AnH-IIBe dựa trên nguyên lý của kỹ thuật trung hoà Anti-

IIBe trong mẫu nghiên cứu bị ức chế bằng cách ủ với huyết thanh cố chứa IIBeAg nhưng không bị ức chế khi ủ với mâu chứa ant-IIBe, đặc tính của kháng nguyên được thừa nhận Quy trình phản ứng gồm các bước sau;

Plate có gắn Anti-HIe + mẫu chứa Anti-HBe + dung địch trung hoà (HDeAg),

tạo ra phức hợp Plate (Anti-HRe) và HReAg*Anti-HBe Nếu mẫu không chứa Anti-HBe, HBeAg trong dung dịch trung hoà sẽ phản ứng với Anti-HBe phi

trên plate và tiếp tục thực hiện các phản ứng sau

Platc (Anti-HBe*HBeAg) + Anti-HBc*HRPO, Tạo ra phức hợp Plate (Anti- HBec*HBRcAg*Anti-HBe*HRPO) Phức hợp này cộng với dung dich TMB không màu sẽ chuyển đân thành mầu xanh

Sau dé nid thêm 2N HạSO+, dụng dịch sé chuyén din thành màu vàng, đo OD

ở bước sóng 450nm

TYV.2 Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được địch là Phản

ứng chuỗi trùng hợp Phản ứng PCR là một kỹ thuật phế biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch dại (tao ra nhiều bản sao) mét doan DNA nhi enzyme polymerasse mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nim

men

Quá trình tổng hợp chuỗi DNA dựa trên nguyên tắc bổ sung của cdc hase nite,

bắt đầu từ đầu 3, cúa sợi DNA khuôn mẫu Việc gắn các nucleotide nhờ Taq

Polymerase có khả năng chịu được nhiệt độ cao Giai đoạn tháo xoắn, tách và

gần môi dược thực hiện nhờ thay đổi dội ngột nhiệt độ

Để thực hiện phản ứng PCR cần rất nhiều thành phần Những thành phần đó

bao gồm

- DNA mau chtta minh DNA cén khuếch đại

-_ Cập Primer xuôi và ngược

- Enzyme Tay DNA-polymerase dé copy vùng cần khuếch đại

- dNTP indi logi dé x4y dung DNA mdi

-_ Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho IYNA-polymerase

Phan ứng PCR được thục hiện trong chu kỳ nhiệt

Doan méi

Là một chudi oligonucleotide dai khoảng 20-30 nucleotide (khang qua 50

nuclcolidcs) có tình tự sắp xếp bổ sung đặc hiệu với trình tự các nuclcotide trên đoạn DNA cẩn nhân lên Một cặp mỗi xuôi và ngược sẽ giới hạn một

đoạn DNA đặc hiệu cẩn nhân lên, chúng xác định điểm bắt đâu và kết thúc

vùng cân khuếch đại

Nhiệt độ nóng chảy của mỗi được định nghĩa là nhiệt độ đưới lúc mỗi bám

vao DNA miu và nhiệt độ trên lúc mỗi tách ra khỏi DNA mẫu Nhiệt độ nóng,

chảy tỉ lệ thuận với chiều đải doạn mỗi Mỗi quá ngắn sẽ bảm nhiều vị trí trên

DNA miu dai và sẽ cho kết quả không rõ ràng Mặt khác chiều dai DNA bi

giới hạn bởi nhiệt độ cần nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy quá cao, vỉ đụ như

trên 80oC sẽ gây ra nhiều van đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt

độ đó Chiều dài tốt nhất cúa doạn mỗi lả từ 20-40 nuclcotide với nhiệt dé

nóng chây khoảng từ 60 — T5oŒ

Quy trình

Quy trình DƠR gầm 20 dến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gằm 3 bước:

(1) Giai đoạn tháo xoắn: Nhiệt độ tăng lên 94-960C để tách hai soi DNA ra

Thời gian: 1-2 phat

(2) Gan primer: Sau khi 2 soi DNA tach ra, nhiệt dộ được hạ thắp xuống để

mãi có thể gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn

mỗi và thường thấp hơn nhiệt nóng chảy (45-600) thời gian: 1-2 phút

(3) Tổng hợp sợi DNA mới Dưới tác dụng của enzyme Taq DA polymerase,

sợi DNA mới được tổng hợp có trình tự bổ sung với sợi DNA đích Nhiệt đô

kéo dải phụ thuộc DNA-polymerase TIhời gian của bước này phụ thuộc vio

cả DNA-polymerase và chiếu đài mảnh DNA cần khuếch đại

1V.3 Kỹ thuật rcal time PCR dịnh lượng HBV DNA

Kỹ thuật real time PCR dinh lượng hay còn gọi là PCR động đã cho phép hiển

thị và theo đối trực tiếp quá trình nhân bản DNA đang điễn ra theo từng chủ

kỳ nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang Dựa vào cường độ phát huỳnh quang mà có thể định lượng các đoạn DNA hình thành

Ưu điểm nữa của phương pháp này là do mối có tính phát quang nén có thể đánh dấu chúng với các chất nhuộm khác nhau nhờ thế có thể tiến hành nhân

các doạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR Tuy nhiên phương pháp

này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu đồ khác nhau cho các tình tự nhận biết khác nhau

Phương pháp này khác phục được một số hạn chế của phương pháp PCR thông

thường như:

- _ Không cần chạy điện di kiểm tra san phim PCR

- Có thể định lượng chính xác được sản phẩm PCR trong khi sit dung PCR thông thường việc phân biệt được dựa vào độ lớn của vạch thu

được sau điện di

~_ Độ đặc hiệu và độ nhay cao hơn Thời gian phát hiện kết quả phản ứng

ngắn

- C6 thé tién hành với nhiều đoạn DNA cùng một lúc trong cùng một ống nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu

Có 3 cách thông thường trong kỹ thuật real time PCR định lượng đó là:

1 Sử đụng đầu đồ thuỷ phân (TaqMan, Beacons, Scorpions)

2 Sử dụng cực đồ lai (Light Cycler)

3 Sử đụng tác nhân gắn lên DNA (SYBR Green)

Nguyên lý của kỹ thuật định lượng Realtime PCR:

Phương pháp sử dụng chất nhuộm mâu SVBR green: chấL nhuộm mau nay

được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với DNA sợi kép thì

cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao được tạo ra càng nhiều thì

tín hiệu phát ra của chất màu sẽ tăng lên theo tỷ lệ thuận ưu điểm của phương

pháp này là SYBR sẽ đính vào bất kỳ chuỗi phân tử DNA kép nào có mật

Phương pháp sử dụng đâu dò thuỷ phân (TeqMan): Kỹ thuật này sử dụng các

mâu đồ có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một oligonuleeotit trong đố một đầu được gắn với chất nhuộm phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với

chất nhuộm có vai trò làm tất sự phát huỳnh quang Khi có mặt đoạn DNA cần nhãn, mẫu đồ sẽ gắn vào DA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5”,

ở trạng thái này, không cố hiện tượng phát huỳnh quang Khi bất dấu tiến

hành quy trình FCR với sự hoại động fia enzyme tag-polymerase méi duge

đài mổi cho đến tận cùng của đoạn cần nhân Như vậy mẫu dò không ngăn cẩn quá trình PCR Các phân tử chất màu được bổ sung vào sẽ được giải phóng khổi mẫu dò ở từng chu kỳ PCR Như vậy hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ PCR và tỷ lệ thuận với sản phẩm được nhân

bản Cường độ phát huỳnh quang cũng phụ thuộc vào hàm lượng chất màu

Qua đó hoàn toần cổ thể theo dõi được quá trình PCR và định lượng được sản

phẩm

Phương pháp sử dụng đâu dò lai:

"Trong kỹ thuật này, một đầu đồ được gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu

3 vã một đầu đồ thứ hai được gắn với một chất nhận huỳnh quang Khi hai

đầu đồ này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng 1-5 nucleotide, chat phat

quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích thích chất nhận huỳnh quang

và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang, tín hiệu này có thể được xác định trong suốt các giai đoạn của phản ứng PCR Sau mỗi chu kỳ phản ứng PCR

nhiều dầu dồ lai dược tạo ra, kết quả là tín hiệu phat quang ngầy càng tăng

Hinh 9: So dé mot s6 phuong phap cia k¥ thudt real time PCR

Dong hoc ctia phan tig real-time PCR

Phản ứng PCR có thể được chia thành ba pha:

~ Pha log: Sau mỗi chu kỳ sản phẩm của phản ứng tăng gấp đôi, giai đoạn

này sản phẩm phản ứng tăng nhanh

- Pha tuyén tính: Thành phần phản ứng đã được sử dụng một phần, phản

ứng chậm lại và sản phẩm tạo thành bất đầu giảm

~_ Pha cao nguyên: Phản ứng bắt đầu dừng lại không có sản phẩm mới

được tạo thành.

Là chu kỳ mà tại đây tín hiệu huỳnh quang bát đầu xuất hiện Day là thông số

được sử dụng để tính toán, định lượng

Delta Rn: Là cường độ của tín hiệu huỳnh quang, biểu hiện độ sáng

+Rn là giá trị Rn của một phản ứng bao gồm tất cả các thành phần (các mẫu quan tâm); -Rn là giá trị Rn của chứng âm NTC (baseline)

Delta Rn là giá trị chênh lệch giữa Rn+ và Rn- Đây là giá trị biểu thị độ lớn

của tín hiệu huỳnh quang phát ra của phản ứng PCR

Ngoài ra, để thu được kết quả trong kỹ thuật real-time PCR, cần phải xây

dựng đường chuẩn dựa trên các nồng độ pha loãng của dung dịch chuẩn đưa

vào.

Cycle number

Hình 10: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa số chủ kỳ phản ứng real-time

và cường độ tín hiệu phát quang

Nguyên tắc xây dựng đường chuẩn:

Để xây dựng đường chuẩn, mỗi lần chạy real-time PCR cẩn phải xác định 5

điểm chuẩn của 5 nồng độ pha loãng dung dịch chuẩn khác nhau Đường

chuẩn phụ thuộc vào thể tích và nồng độ template đưa vào, Nếu nồng độ

template đưa vào càng cao thì đồ thị lên càng sớm, chu kỳ ngưỡng càng nhỏ,

và ngược lại Nếu thể tích đưa vào không bằng nhau thì sai số càng lớn và khó

hay không xác định được đường chuẩn

Mỗi một điểm chuẩn, một nồng độ gồm ba giếng, sau đó lấy giá trị trung bình

vì mỗi một lần hút pipet do thao tác kĩ thuật có thể không chuẩn nên sẽ dẫn

đến sai số Mỗi một mẫu kiểm tra cũng làm ba giếng, mỗi mẫu chứng âm (non

template control) cũng làm ba giếng.

IV.3 Neuyén tac thiết ké primer va probe trong ky thet real-time PCR:

Chúng tôi sử dụng phần mềm thiết kế mổi dựa trên cơ sở trình tự gen HBV

IDNA di biét, cdc doan gen bio tha, cdc doan gen dét biến

"Thiết kế probe trước tiên sau đó thiết kế các primer phù hợp với probe, không trùng lên nhau (Các amplicon của 50-L50 cặp base được liên kết chặt chế với

Tránh việc lặp lại của một loại nucleotit, đặc biệt đối với © và C, tránh

lặp lại quá 4 nueleotit

Không nhiều hơn hai G+C ở đâu 3”

Không có G ở dầu 3'

Kích thước của amplicon là 50- L50 bp (max 400)

span exon-exon junctions in cDNA

Thiét ké TagMan Probes

Tm cao hon ‘Tm cta primer 10°C

"Tránh việc lặp lại các loai nucleotit, đặc biệt đối với G

1làm lượng G+C 30-80%

Nhiéu Cs hon Gs

Không có G ở đầu 5'