Luận văn Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện Đột biến gen btk gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính x

Bể tài liận văn: “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen bịk gây bệnh suy giảm miễn dich bam sinh thé khang có gammaglebulin máu liên kết nhiễm sắc thê giới tính X” Chu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACII KIIOA IIA NOI

NGO MANH TIEN

ÁP DỰNG KỸ THUẬT SINI HỌC PHẪN TỬ PHÁT IIỆN DOT BIEN GEN 87K GÂY BỆNH SUY GIÁM MIỄN DỊCH BAM SINH THE KHONG CO GAMMAGLOBULIN MAU

LIEN KET NITEM SAC TIM GIOT TINITX

LUẬN VĂN TIIẠC SĨ KỸ THUẬT

CIIUYEN NGANIL CONG NGIIE SINIIIIOC

HA NOI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG DAI HOC BACH KHOA HA NOL

NGO MANII TIEN

AP DUNG KY THUAT SINH HQC PHAN 'TU PHAT HIEN

DOT BIEN GEN BTK GAY BENH SUY GIAM MIEN DICH

BẮM SINH TIIỄ KHÔNG CÓ GAMMAGIORULIN MÁU

LIÊN KÉT NHIỄM SẮC THẺ GIỚI TÍNH X

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DÂN KHOA HQC:

PGS TS KHUÁT HỮU THANIT

HẢ NỘI - 2018

CỘNG HÒA XÃ HIỘI CHỦ NGIĨA VIET NAM

Độc lập — Tự đo — [lạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

1iọ và tên tác giả luận văn: Ngô Mạnh Tiến

Bể tài liận văn: “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen bịk gây bệnh suy giảm miễn dich bam sinh thé khang có gammaglebulin máu liên kết nhiễm sắc thê giới tính X”

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mai sd SV: CB160059

Tac giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng cham luận văn xác nhận tác

giả đã sửa chữa, bỏ sung luân văn theo biên bản họp Hội déng ngày 10/10/2018 với cáo nội dung sau

- Trang 1, phan mé dau, thay thé “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành

“Bruton tyrosine kinase”

- Trang 4, mục 1.2.2, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thinh “Bruton tyrosine kinase”

bảo mắm tạo máu” thành “tế bảo gốc tạo

n thân lympho”

ào proP” thánh “Tế bao hướng đồng,

B”, thay thé “té bao PreB” thanh “Tế bảo tiên B”

- Trang 10, muc 1.3.1, thay thé “Cytoplasmic tyrosine kinase” thanh “Bruton

- Trang 8, mục 1.2.3.3, thay thể

mnáu”, thay thể “Tế bảo đầu déng lympho” thanh “Té bao

- Trang 8 muc 1.2.3.3, thay thế “Tế

~ Trmg 14, mục 1.4.2.1, thay thể “suy giâm miễn dịch phối hop tram trong”

thành “bệnh suy giám miễn dịch kết hợp nguy kịch”

~ Trang 35, mục 3.3.1, bổ sung “các đột biến được thể hiện ở phụ lục 3”

- Trang 37, mục 3.3.1, thay thé “sự sau khác trong quả trinh dịch mã tao mRNA” (hanh “lam thay đổi các vị trí bảo hiệu cho việc cất chính xác

lơ đoạn

introng”

- Trmg 40, múc 3.3.1, bổ sung “Các đột biển vùng phép nối exon/intron

cần phải khẳng định thêm bằng thực nghiệm thông qua phân tích mRMA.”

- Trang 47, mục 3.3.3, bỗ sung “Trong số 31 bệnh nhân nghỉ ngờ mắc

bệnh XL.A, 04 bệnh nhân có biểu hiện lâm sảng ”

gay 08 tháng 11 năm 2018

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Ngô Mạnh Tiến, học viên lớp ao học khóa 16B-CNSH, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, chuyên ngành Công, nghệ Sinh học, xin cam doan:

Day là công trình nghiên cứu của tối trực tiếp thục hiện dưới sự hướng dẫn

của thầy PGS TS Khuất Hữu Thanh

Công trình này không trùng, lặp với bắt kỷ nghiên cửu nào khác được công,

bổ tại Việt Nam

Các số liệu và thông tín trong nghiên cứu là hoàn loàn chính xác và trung

thực, một phần đã được công bổ trên các tạp chi khoa học chuyên ngành với sự

đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phân còn lại chưa được at công bồ trơng bắt kì công trình nào khác

TỜI CẮM ƠN

Tời đầu liên, em xi được

cảm ơn chân thành đến người thấy khoa học,

PGS.TS Khuất Hữu Thanh - Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tịnh chi bio va ding

viên em trong suốt quá trình nghiên cứu đề hoàn thành luận văn

Fim xin chan thành cảm ơn B8 Ngõ Diễm Ngọc, trưởng khoa Di truyền và Sinh học phân tứ- Bệnh viện Nhi Trung Ương đã tạo đạo điều kiện chơ em hoàn thành nghiên cứu này

Tìm xin câm ơn các thấy cô bộ tuôn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực

phẩm, trường Dại học lách Khoa L1 Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quả

trình học tập và rên luyện

Trong thời gian học lập và nghiên cứu em đã nhận được sự giúp đỡ lận tình

đây động viên khích lệ của tập thẻ cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học

phân tử, em xin chân thành cảm on những giúp đỡ quý báu đỏ

Cuối cùng, pho phép cúm gửi lời cấm ơn chân thành tới gia dình, bạn bê dã

luôn quan tâm, cô vũ chơ tôi vững bước trên con đường, học tập vả nghiên cửu

Ngô Mạnh Tiến

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIET TAT

Burton's tyrosine kinase

Cộng sự

Deoxyribomuelerie acid Dideoxynucleoside triphosphale Lthidium bromide

Kilo base

Ko Dallon

Multiplex Ligation-dependent Kỳ thuật khuếch đại đa môi dựa

Probe Amplification vào phân ứng nỗi

Ribonucleic acid

Polymerase chain reaction Phan ứng chuỗi trùng hợp

Surface Immunoglobulin Khang thé bé mat

Single nucleotide Ba linh nucleotid don

polymorphisms

Suy giảm miễn dich

Suy giảm miễn địch bằm sinh

'Tư vấn di truyền X-linked agammaglobulinemia Hệnh suy giảm miễn địch bếm sinh

thể không gammaglobulin mau Bên kết nhiễm sắc thể giới tinh X

DANH MUC CAC BANG

Thanh phan phan ting PCR

‘Trinh ty cp méi phan ứng PCR khuếch dai gen #7 Trinh ty méi phản ứng PCR môi đơn,

Thanh phan phân ứng PC mỗi don

Kết quá xác định đột biển bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Danh sách đột biến mới trên gen BIKE

Kết quả xác định đột biển bằng kỹ thuật MI,PA, Kiểu gen của 31 bệnh nhân XL.A So ccc

Tỷ lệ các đột biên của gen BTK.

Cầu trúc 3 chiều protem BTK

Sơ đỗ quy trình xác định đột biển gen 87% gây bệnh XLA

Anh dién di san pham POR khuéch đại gen BTK người bình thường Kết quả phân tích MLPA trên người bình thường,

Ảnh đột bién c.1735G>C (p.D$79H) trên gen 87K

Ảnh đột biến c.1908+3_11delinsC trên gen 87K”

Ảnh đột biến c.521-IG>A (p.IVS6-1G>A) trên gen B7X

Ảnh đột biến c.1578 1581 del (p.C527WfS*2) trên gen B7E

Ảnh diện di bệnh nhàn XUA-26 và X_LA-27 gen BTK

Kết quá phân tích MI.PA của bệnh nhân XLA-26 và XLA-27

Thân bố các dạng đột biến gen 87K _

ca 47

linh 3.11 Vị trí và tỷ lệ các đột biển gen 2 gây bệnh XLA ở oác bệnh nhân

1.1 Bệnh suy giảm miễn địch bAm sinh sec

1.2 Bệnh suy giảm miễn địch thé không gammaglobnlin mán liên lrết nhiễm sắc

1.2.3 Đặc điểm cận lâm sảng của bệnh XT,A 5

In ¬

1,3,1 Vị trí và câu trúc gen BTK

1.3.2 Câu trúc vá chức năng protein [#IK< "—

1.3.3 Đặc điểm di truyền và đột biến gen BK - 11

1.4 Chấn đoán bệnh XL/A on nneeeiereraerroroo.T2

1.4.1 Tiêu chuẩn lâm sảng occcvsvvvverrrevrrrrree sessed

1.4.3 Xét nghiệm sinh học phản tử phân tich gen 8#ZE L8

1.5.2 Tỉnh hình nghiên cứu tại Việt Nam BH 4

vi

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ

2.1.2 'Thu thập mẫu 225 555cc t2 11011111 cee

3.3 Hoá chải và thiết bị

2.2.1 Hòa chất

2.2.2 Trang thiết bị

3.3 Phương pháp nghiên cửu

2,3,1 Kỹ thuật tách DNA tổng sỐ cv dvesieerre

2.3.2 Phương pháp điện di DNA -

2.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 8anger bằng máy ABI 3130

2.3.4 Ky thuat Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

CHUONG 3: KET QUA VA BAN LUAN

3.1 Lựa ghọn kỹ thual phat hign dot bién gen TK

3.1.1 Kỹ thuật giải trinh ty gen Sanger essen

3.1.2 Ky thuat MLPA

3.1.3 Lựa chọn quy trình phát hiện đột biến gen B7”

3.2 Kết quá xác định đột biển gen 7K trên 31 bệnh nhân XLA

3.3.1 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình Lự gen

3.3.2, Kết quả xáe dinh đột biến bằng k¥ thuat MLPA

3.3.3 Dặc điểm đột biển gen 7 của 31 bệnh nhân XLA

MOD:

Bénh suy giảm miễn địch thé khong gawwmaglobulin mau liên kết nhiễm sắc thể giới tình X (X-linked ngammaglobulnemia bệnh XLA): là bệnh di truyền trên nhiễm sắc thể giới tỉnh X do đột biển trên gen Z7K khiến cho cơ thể không sản xuất

được protein Brulon tyrosine kinsse dẫn đến các tế bảo lympho B không t

hóa hoặc trưởng thánh Do vậy, giám khá năng sán xuất kháng thể, khiến cơ thể

thường xuyên bị các táo nhân gây bệnh tần công,

Bệnh nhân mắc XLA khi mới sinh thường khỏe mạnh như những trế bình

thường khác bởi trước 6 tháng đầu, trẻ được báo vệ bởi kháng thể tử mẹ truyền

sang Sau đó các nhiễm khuẩn lần lượt xuất hiện và tầng đẳn tân suất cũng như mức

độ nặng,

Việt Nam là nước nhiệt đới, trễ nhỏ thường dễ mắc các bệnh liên quan đến

đường hô hấp, tiêu hỏa, tái phát nhiễu lân làm cho bệnh suy piâm mién dich bam

ỗ bị

sinh (SGMDBS) đễ bị trừng lặp trong bối cảnh đa đụng nhiểm trùng ở trẻ em,

bỏ sót ở tuyển cơ sớ Sau khi các bệnh nhản nghỉ ngờ mắc bệnh XL.A được khám và

sang lac dựa trên các tiêu chuẩn lâm sảng và các xét nghiệm ban đầu, sẽ được chân

đoán xac dinh bang phan tich gen B7K bằng phương pháp sinh học phân tử dễ phát

hiện các đột biến gây bệnh Trước đây, các xét nghiệm bằng phương pháp sinh học

phân tủ được tiến hành tại gác trung lâm của nước ngoài, gây nhiều khỏ khẩn về vận

chuyền mẫu, chỉ phi cao, thời gian chờ dợi kéo dải, dặc biệt rất khó áp dụng cho các trường hợp có nhu câu chân đoán trước sinh cho các lần sinh con tiếp theo của các gia dinh cé tién sit sinh con mac bệnh

Việc xác định chỉnh xác đột biển gây bénh XLA dong vai trỏ quan trọng, trong,

việc chắn đoán xác định bệnh và thế bệnh đề định hướng điều trị hiệu qua Day là

tiên để cho công lác phòng bệnh bằng Lư vấn đi ruyên và cỉ

làm giám tỷ lệ sinh con mắc bệnh XL.A

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu dé tai: “dp dung

m đoán trước sinh giúp

kỹ thuật sinh hạc phân từ phát hiện đột biển gen BTK gây bệnh Suy giảm miễn

dịch bim sinh thể không có ganunaglobulin mẫu liên kết nhiễm sắc thể giải tink

x",

Mục tiêu của để lài

- Sử dụng kỹ thuật MLPA và giải trinh tự gen phát hiện các đột biển trên gen

B1 gây bệnh thiểu gammaglobulin trong máu liên kết nhiệm sắc thể X

tờ

CHL iG 1: TONG QUAN

1.1 Bệnh suy giám miễn dich bam sinh

Suy giảm miễn dịch bam sinh (SGMDBS - Primary Immunodeficiency): 14 một nhỏm các bệnh lý bất thường liên quan tới tình trạng suy giám hoặc thiếu hụt một hoặc nhiêu yếu tố trong hệ thông miễn dich [ldu hết mắc các bệnh này sẽ kéo đài suốt cuộc đồi, nên việc chân đoán chính xác bệnh trước khi áp đụng các biện pháp điều trị là rất quan trọng,

SGMIDHS được phân loại đựa thao loại tế bảo, vị trí tốn thương của hệ miễn

địch Những trể mắc bệnh suy giảm miễn dịch thường nhạy cảm với nhiều lắc nhân

nhiễm trùng khác nhau Biểu hiện lâm sảng đặc trưng của nhóm bệnh này là người

mắc bệnh nhiễm trùng nặng, tái diễn suốt đời với nhiều biển chứng nguy hiểm như

thất

tử vơng, tên thương các cơ quưnt, rối loạn phát triển thể chất và ảnh hưởng đến

lượng cuộc súng

Ti lê mắc các bệnh SGMDBS trong quân thể là 1/1200 (theo nghiền cửu của

tổ chứu SŒMDBS thể giới Je{Trey Modell Conter for Primary Trmunodeficiencics)

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh chia 5 nhom lon; SGMD thé dich, SGMD té bao,

SGMD két hợp nguy kịch, SGMD đỏng bỏ thẻ, SGMD dòng thực bảo

Nghiên cứu tổng kết trên toàn bộ 6 châu lục năm 2011 cho thấy, trong số

44762 bệnh nhân mắc SGMDI3S, cô tới 3163 bệnh nhân mắc bệnh suy giảm miễn

dich kết hợp nguy kịch (7,19%) và 2132 bệnh nhân mắc bênh SGMD thé X-linked

nhân, gia đỉnh người bệnh và toàn xã hội Báo cáo của Hội suy giảm miễn địch bam

sinh TefTrey cho biết cứ 1 bệnh nhân SGMDBS má bị bố sói chân đoán thì củủ phí hết §102.736/năm cho y tế vì cấp cứu, nhập viện nhiều lân Viện nghiên cửu sức

khỏe Hoa Kỳ ước tính ít nhất có 500.000 trường hợp SGMDBS chưa được chấn

đoán và như vậy thiệt hai về kinh tế do vẫn để bỏ sót chân đoán nhóm bệnh này gây

7a là trên $5U tỷ/năm [35]

1.2 Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm

sắc thể giới tính X (XLA)

1.2.1 Định nghĩa bệnh XLA

Bệnh suy giảm miền dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc

thê giới tinh X (X-linked agammaglobulinemia —bénh XLA) là bệnh suy giãm miễn

địch đi truyện đo đột biên trong gen mã hóa Brulon tyrosine khrse liên kết nhiễm sắc thể giới tỉnh X, gây giảm gammaglobulin máu khiến cho cơ thể không sản xuất

duoc Bruton tyrosine kinase Thiéu Bruton tyrosine kiase (BTK), các tế bao

lympho B không thể biệt hóa hoặc trưởng thành được dẫn đến suy giãm các tế bảo

lympho B trưởng thành Bệnh nhàn XLA giảm khả nẵng chồng chọi với các tác

nhân gây bệnh, đặc biệt là ví khuẩn

1.2.2 Đặc điễm lâm sàng của bệnh XLA

Thông thưởng, trẻ sau sinh sẽ được hưởng khang thé IgG từ mẹ sang thai qua rau thai cho nén khi sinh trẻ có lượng kháng thé IgŒ tương tự kháng thé IgG

ca me, khang thé IgG vila ie cho sé gid còn 50% trong vòng 2 - 3 tháng sau

sinh Trế cũng, tự tổng hợp kháng thể IgG, tốc độ tổng hợp khang thể IạG của trẻ sẽ

cao hem tôc độ giảm kháng thể IgŒ của mẹ vào khoảng 4 - 6 tháng tuổi Kháng thé

Tạ trể sẽ tăng nhanh trong, 3 nắm đầu tiên dạt dến ngưỡng 60% so với người lớn,

sau đỏ sẽ tăng chậm lại vả đạt ngưỡng của người lớn vào lúc vị thảnh niên lo đặc điểm bệnh XLA có đột biển gen 7K, tế bào B của trẻ bệnh XLA không có khả xing tăng sinh, biệt hóa để tạo hong garuna globulin bảo vệ cho trồ, cho tiên ở giai

đoạn sau sinh hượng kháng thé IgG ty me cho con ở các trẻ này vẫn còn làm hàng,

rào tự nhiên đủ để bão vệ trẻ, chỉ sau 4 - 6 tháng tuổi khi TgŒ mẹ giảm thi trê mới

để bị mắc bệnh [39]

(Nguén: immunobiology Sth edition (2001)

Các biểu hiện làm sang trở nên rõ rang trong những tháng tiếp theo, khi

kháng thể IgG từ mẹ được chuyên hóa và tác dụng bảo vệ của chúng không con

hiện diện nữa Điểm nỏi bật của bệnh là tái phát do vị khuẩn đường hồ hấp và / hoặc

nhiễm trùng đường tiêu hóa, mặc đủ một số bệnh nhân cỏ thẻ không cỏ triệu chứng, trong những năm đầu đời Trong trường hợp hiểm hoi, bệnh nhân được chân doan SGMD thể XLA ở tuổi vị thành niên hoặc thậm chí ở tuổi trưởng thành đo thiêu các triệu chứng cho đền tuôi đỏ Phạm vi nhiém tring điển hình ở bệnh nhân SGMD the XLA bao gồm viêm tai giữa tải phát, viêm xoang, viêm phẻ quản, viêm phổi va

nhiễm trùng đường tiêu hóa Mặc dủ tỷ lệ mắc các loại nhiễm trủng khác nhau giữa

các nhóm thuần tập khác nhau cho đến nay được bảo cáo, cỏ vẻ như loại nhiễm

trùng chỉnh liên quan đến đường hô hap trên và dưới Sau đó các nhiễm khuẩn làn lượt xuất hiện và tăng dân tần suất cũng như mức độ nặng

1.2.3 Đặc điểm cận lâm sàng cña bệnh XLA

1

1 Nồng độ kháng thể trong máu ngoại vỉ

Trong huyết thanh, thảnh phân globulin miễn địch chiêm khoảng 20% tổng

lượng protein 5 lớp Globulin miễn dịch chỉnh là Globulin miễn dịch G (IgG), Globulin miễn dịch A (IgA), Globulin miễn dịch M (gM), Globulin mién dich D

(gD), Globulin mién dich E (gE) Trong dé, ba Globulin dầu có vai trò quan trọng, trong đáp ứng miễn dịch

Lap TgG là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch thứ phát IgG chiếm khoáng 70-75% tổng số glebulim miễn dịch của cơ thẻ người Có 4 dười lớp

cia IgG: IgGl, IgG2, IgG3 va IgG4 Mai dudi lop cia IgG có vai trò khác nhau

trong dap ứng miễn dịch của cơ thể, TgỢ là kháng thể duy nhất có thể qua được rau thai, vị thể thai nhì được hướng IgG của mẹ truyền cho

Lớp IgA chiếm khoảng 15-20% tang sé Globulin miễn địch có trong huyệt

thanh IgA bao gồm TgA trong huyết thanh và TgA Hết ra ngoài niềm mạc Có 2

dưới lớp của lgA: IzÄI và IsA2 Dò là phương tiện bão vệ tại chỗ của cơ thể, ngăn

căn sự xâm nhập của các kháng nguyên Chúng có trong mước bọt, nước mắt, và rất

uihicu trong sita rac Vi vay trê nhận được rất nhiều lgA niểu được bi me

Lớp IgM chiếm khoảng 10% tổng số Globulin miễn dịch có trong huyết thanh TgM có khả năng liên kết bổ thế mạnh nhất Đó là kháng nguyên xuất hiện đầu tiên khi có kháng nguyên xâm nhập, TgŒ sẽ xuất hiện muộn hơn và thay thế cho TgM

Các kháng thể trên có nhiều chức năng sinh học khác nhau trong đáp ứng miễn địch: chức nắng nhận biết kháng nguyễn, tác đông trực tiếp lên kháng rguyên và

bạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên dỏ Riêng Khang thé IgG, IgM con cỏ

vai trò hoạt hóa bề thể, tạo thành phức hợp tấn công mảng, chọc thủng vả dung giái các khing nguyên là tế bào, vì khuẩn Ngoài ra, các kháng thể gòn có khả năng tương tác với các tế bảo có thâm quyền miễn địch khác như bạch cầu ái kiểm, tế bảo mast, cdc dai the bao và bạch cầu trung tính và các tế bảo điệt tự nhiền (Mature

*killer) để củng tham gia tiêu diệt kháng nguyên

Đôi với bệnh nhân SGMD thê XLA, do có sự sụt giảm rõ rệt số lượng tế bảo

lympho B trưởng thành trong máu ngoại vi nên khả năng sản xuất kháng thể cũng bi

giảm nặng Bệnh nhân XILA thường có nồng độ IgG thấp dưới 2 độ lệch chuẩn so

với trẻ cùng lửa tuổi Nghiên cứu của Coley năm 2002 trên 82 bệnh nhân XLA tại

#2 trung tâm của Hoa Kỳ cho thây: đa số bệnh nhân có nằng độ IgG rất thập hoặc

không đo được khi được chấn đoán bệnh Chỉ có 10% bệnh nhân có Trồng đô trên

200 mg/dL [28] Cée nghién ctru của Eduardo Lopez trên 54 bệnh nhân XLA ở Tây Ban Nha va ctia Toyama trên 93 bệnh nhân ở Nhật Bắn cũng cho kết quá tuøng tự

Trong cơ thể, có rất nhiên té bao tham gia đáp ứng miễn dich: té bao lympho,

tế bảo đơn nhân, lế bào bạch cầu bạt trung tính, bạch cầu ái kiểm, bạch cầu ái loan,

duéng bao Tuy nhiên, vai trò chính được cho là của các tế bào lympho Mỗi tế bảo đều có đặc trưng riêng về mặt miễn dich da sự có mặt của các thụ thế trên bế

xuặi màng tế bảo

Các tế bào tiền thân dang lympho từ tổ chúc tạo mảu di tới tuyển ức, phân

chia, biệt hóa thành các lympho bảo chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch qua trưng,

gian lễ bảo: lympho T Té bas lympho T bao gém lympho T hé tg (T helper),

Iympho T dée (I cytotoxic), Lympho T gay quá mẫn muộn (TDTH) Lympho T ức

chế (Ts), Lympha T điều hòa ngược (TER) Trong đó, hai đưới nhóm lympho quan trọng là: lypho T hỗ trợ (đu ấn mảng tế bảo: CD4†), vai trỏ quan trong trong hoạt hóa và thúc đẩy hoạt động của các lympho T khác thông gua việc tiết ra

Interleukin-2 và lympho T độc (đâu ân màng tế bào: CD L), có nhiệm vụ tan céng

trực tiếp các tế bảo cỏ kháng nguyễn lạ trên bề mặt và tham gia đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bảo

Các tế bao lympho B duce sinh ra ở tủy xương, trưởng thành ở các nang

lympho trong hach ngoai vì hoặc tây trắng của lách Các dâu ấn mảng tế bảo hưởng,

có ở lympho D là: CD10~, CD19+, CD20+, CD38+ Khi cdc lympho B được mẫn

câm sẽ biệt hóa thánh tương bào sản xuất kháng thé Vi vay, lympho B dam nhiém vai trò chính trong đáp ứng miễn dịch thể dịch

Các tế bào diệt tự nhiên - NK là một tiểu quản thể tế bào có khả năng diệt một

số tế bào đích: tế bảo u, tế bảo vật chú bị nhiễm virus Chúc năng quan trọng của tế

bao NK là kiểm soát ruiểu địch, bão vé cơ thể chẳng lại sự nhiễm virus Déu an

mảng tế bảo: CD16+, CDSG+,

Xét nghiệm tìm các đầu ân miễn dịch trên mảng tế bảo vào những năm 1970

đã mổ ra một thời kỉ mới trong nghiên cứu và ứng dụng của chuyên ngành miễn

dich học Dựa váo các dấu ấn trên tế báo lympho T (CD3+, CD4+, CD8+), lympho

Ti (CDI9+, CD20+) và các tế bảo diệt tự nhiên (CD56), các tổ chức SGMD toan

bệnh nhân SGMTD thành ba nhóm lớn: SŒMD tế bảo, SGMD thể

can da phan Ic

dich hay SGMD két hop

Với bệnh nhân XLA, tốn thương đo quá trình hình thành và biệt hóa của tế

bảo lympho niên khi xác định dấu Ấn màng tế bảo, chỉ có lynpho B (CD19+)

giảm <‹ 2%, các tế bảo lyrapho T, NK đều trong giới hạn bình thường [23]

1.2.3.3 18 bdo Lympho B

Bình thường, các tế bào lympho B wai qua quá trình biệt hoá và trở thành tương bảo, sân xuấi kháng thể Trong tuy xuong, 14 bao gốc tạo máu (hematopoietic stem cell) phat trién thanh tế bảo tiên thân lympho (Iymphoid precursorursor cell), sau đỏ tiếp tục biệt hoá thành tế bào hướng dòng B (pro-B cell), Hếp tục biệt hoá thành tế bảo tiên B (pre-B cell) réi than té bao B non (immature B cell), Té bao B

non tiép tue chin thém ở trong tủy xương hoặc sau khi đã rời tủy xương vào các mô

lympho ngoại vi tiếp tục biệt hoá thành tẻ bao B truéng thanh (mature B cell) Sau

dó, các tế báo lympho B trưởng thành trủ ngụ tại vùng võ ngoài của hạch ngoại vị, tủy trắng của lách, tạo ra các nang Ìympho

Hình 1.2: Sự phát triển và biệt hóa của lympho B trong bệnh XLA

(Nguén: Nature Reviews Immunoglogy, 2005)

Trong qua trinh biét hoa tir té bao tién B tai te bao B non có sự ảnh hưởng trực tiép ctia phite hgp Pre-BCR (Pre B-cell receptor signalling — preBCR) Phtre hop pre-BCR bao gém hai chuối Igịt giỏng hệt nhau và 2 protein chuỗi nhẹ VpreB va Ä14.1, cùng với các phân tử neo đậu CD79a va CD79B Có nhiều đột biển gây ra bất thường phức hợp Pre-BCR

Trong bệnh XLA, đột biển gen Bruton Tyrosin Kinase (B7K) gay ra bat thường trong quả trình tổng hop protein Bruton tyrosine kinase (BTK), mét protein quan trọng giúp hình thành phức hợp Pre-BCR Do vậy, khi bị đột biển gen 87K, các tế bảo lympho B sẽ bị dừng biệt hoá ở giai đoạn tế bảo Pre B trong tủy xương, dẫn đến sự vắng mặt của các tế bảo lympho B trong mảu ngoại vi va các mô

lympho ngoại biên Kết quả là sự sản xuất tất cả các loại kháng thẻ: IgM, IgA, IgG,

các kháng thẻ đặc hiệu với các căn nguyên gây bệnh đều bị suy giảm nghiêm trong Đột biển gen 87K là đột biến gen đầu tiên (năm 1993) gây bát thường Pre-BCR được tìm thấy, chiếm 85% trong số tắt cả các trường hợp không có gammaglobulin

mau tién phat

1.2.4 Dich té hoc

Tỷ lệ mắc bệnh tại Đức là 0,09 trên 100.000 dân [20], ở Mỹ là 11,25 trên

100.000 đân [7], ở các nước Đông Âu và Trung Âu là ] trên 1,399.000 dân [46]

Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 1: 100.000 đền 1: 200.000 tủy theo dân tộc.

Tại các nước chau A, rat ít nghiên cửu đưa ra tỷ lệ mắc bênh XLA do chưa

có nguồn dữ liệu khu vực cũng như dữ liệu của từng quốc gia

Tuy nhiên, do đặc điểm của bệnh SGMD thể XLA gây suy giảm miễn địch thể dịch nặng nên rất nhiều bệnh nhân bị nhiễm khuẩn nặng và tử vong trước khi

được chan doan xác định bệnh Vì vậy, đa số các báo cáo chỉ đưa ra số bệnh nhân

mắc bệnh không thực sự đây đủ

1.3, Cơ sở di truyền bệnh XLA

1.3.1 Lƒ trí và cấu trúc gen BTK

Năm 1993, lần đầu tiên hai nhóm nghiên cứu độc lập củng tim ra gen gây

bệnh XLA và giải thích được cơ chế bệnh sinh của bệnh, sau này được đổi tên đẻ

tưởng nhở bác sỹ Bruton, người đã tìm ra căn bệnh [42], [12] Đột biển ở gen 87K

gây nên giảm mat chức năng của protein Bruton tyrosine kinase khiến cho tế bảo

lympho B không thẻ biệt hóa hoặc trưởng thành và không sản xuất ra kháng thẻ

Gen BTK nam 6 cảnh dài của nhiễm sắc thẻ X ở vị trí Xq21.3 - q22 Gen

BTK dài 37,5 kilobase, chứa 19 exon Kích thước của exon thay đổi từ 55 đến 560

bp, và các intron từ 164 bp đền 9 kb [12]

1.3.2 Cấu trúc và chức năng protein BTKT

Gen BTK mã hỏa protein Bruton’s Tyrosine Kinase dai 659 acid amin, nang

77 Kilodaltons, voi nam khu vue chire nang: plekstrin homology (PH) domain (acid

amin 1 tdi 138), Tec homology (TH) domain (acid amin 139 téi 215), Src homology

3 (SH3) domain (acid amin 216 toi 280), Sre homology 2 (SH2) domain (acid amin

281 toi 377) and kinase (SH1) domain (acid amin 375 toi 659) [24], [16]

Pry taco mu

lm

re CAN x8

‘Stars Naar

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tric gen BTK

(Nguén: Akintunde Akinleye ,2013)

10

PHìm cannonica ste es eannonical ste

Gen BTK ma hoa cho protein Bruton Tyrosine Kinase (BTK), Protein BTK

là đại diện của nhỏm gia đình Tec của các protein khéng tham gia vai tro receptor:

tyrosine kinases No tham gia trong tất cả các giai đoạn phát triển của tế bảo lympho

Ð từ tế bảo tiền B CD34+CD19+ tới tế bảo B trưởng thánh, tới tế bảo plasma thì không còn tác dụng, Proten BTK cũng thể hiện ở tế bảo erythroid precusors, myeloid cells, té bao mast, té bao mono, megakaryoeytes vả tiêu càu [5]

Protein BTK 1a mét trong nhiing Protein Tyrosine Kinase (PTKS) trong bảo

tương Cac enzyme Protein tyrosine kinases (PTKs) xtc tac chuyên hỏa phosphate

của ATP Phosphoryl hỏa dư lượng tyrosine điều chỉnh hoạt tính enZym vả tạo ra

các vị trí gắn kết các protein báo hiệu hạ lưu Hai nhỏm PTK có mặt trong các tế

bảo: các PTK receptor xuyên mảng và các PTK không phải receptor (nonreceptor)

Bởi vì PTK la thanh phan quan trong của con đường tín hiệu tế bảo, hoạt động xúc

tác của chúng được điều chỉnh rất nghiêm ngặt Trong vải năm qua, các nghiên cửu câu trúc có độ phân giải cao của PTK đã cung cap một cơ sở phân tử đề hiểu các co ché ma theo d6 cac thu thé PTK va receptor nonreceptor được điều chỉnh [27]

1.3.3 Dac diém di truyền và đột biển gen BTK

Bệnh XLA là bệnh di truyền liên kết nhiễm sac the X, do đó người me mang

gen bệnh sẽ di truyền gen bệnh cho 50% người con trai trên 1 nhiễm sắc thể X Một

số trường hợp hiểm gặp hon, 15-20%9% số bệnh nhân nam mang đột biển mới (de

novo), do dé người mẹ không phát hiện có dột biến gây bệnh trên nhiễm sắc thẻ XÃ

134]

Phát liệu đội biến trên gen B7K đóng vai trò quan trọng trong br van di truyền Đặc biệt trong các gia đình có tiên sử sinh con mắc bệnh XLA, việc phát hiện sớm người mang gen bệnh là điều kiện cần và đủ cho chẩn đoán trước sinh

giúp phòng bệnh và giãm lỹ lệ sinh con mắc bệnh

Công, bỗ gân đây nhất của ngân hang gen - Gene Bank: 900 đột biến (789 đã

được báo cáo) của gen Z7K Phân bẻ dạng đột biển của các đột biên này như sau:

sai nghĩa/võ nghĩa (350 dét bién), splicing (125 dét bién), regulatory (2 dot bien);

mất đoạn nhố (156 đột biến); thêm đoạn nhỏ (S3 đột biển); small indel (22 đột

biển), mất đoạn lớn (64 đột biến), thêm đoạn lám/ lặp đoạn lớn (15 đột biến) và

phức tạp (2 đội biến), Khoảng 35% đội biến điểm, dẫn đến str thay thé axil amin, Các đột biển thay thế axit amin nay được phát hiện chủ yêu ở vùng kinase, đặc biệt

là ở phân đâu Ơ của vùng kinase Một số đột biển thay thể axit amin cũng có thé

dược phát liện ở các vùng PH và SH2, trong khi vùng TH, SH3 iL phát hiện thấy

đột biến [26]

Những đột biến được tìm thấy trên cả exen va intron suél chiéu dai gen và là

những dột biến đã được chứng minh là làm giâm số lượng hoàn toàn hoặc mất chức

ning cia protein Bruton ‘Tyrosine Kinase [23] Tuy nhién, méi nim, con sé cae dét

biển được tìm thấy và công bố được lăng lên do số lương bệnh nhân được chấn doan ngảy cảng lớn và nghiên cửu được mở rộng ở các quần thẻ khác nhau trên toàn thế giới

1.4 Chấn đoán bệnh XLA

Các bệnh nhân nghỉ ngờ mắc bệnh XI,A được chân đoán đựa vào các tiêu chuẩn làm sảng, xét nghiệm co ban va chan đoán xác dịnh dựa vào phân tích gen

BIK.

1,4,1 Tiêu chudn lam sing

Năm 1999, hội đồng SGMD châu Au LSID (Liuropean Society for Immuno-

dolieicneie) và hội đồng SGMD Mỹ PAGID (Pan-American Group [or

Inuaunodeficiency) đã thông nhất và dưa ra tiêu chuân chân đoán cho các nhỏm bệnh SƠMD bẩm sinh Các tiêu chuẩn chin đoán này dựa vào lâm sàng, xét nghiệm cơ ban và xói nghiện phân tích dột biến gen Cho tới nay, dây vẫn là bản liêu chuẩn được áp dụng rộng rãi nhất trên toàn thể giới [10], [141

'Tiên chuẩn chấn đoán bệnh SGMD thể XUA

« _ Tiêu chuẩn chẵn đoán xác định (definiti?: bệnh nhân nam có số lượng

tế bản Ïympho B CD19+ <29 và íL nhật một tiêu chuẩn sau

+ Tim thay đột biến trên gen B7K

Không có Bik mRNA trong mẫu phan lich mARN eda bạch cầu hai trưng

tính và bạch cầu mone theo phương phap Northern blot analysis + Không có protein BTK trong tế bảo bạch cầu mơno hoặc tiếu câu

Ảnh, om trai củng mẹ của bệnh nhân, cậu và bác trai bên mẹ, hoặc chau

trai bên mẹ có số lượng tế bảo lymphoB CDI9+ <= 2%

« Tiêu chuẩn chẵn doán cé thé (pnrobabie): bệnh nhân nam có số lượng t& bao lymphoB (119+ < 2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:

¡- Xuất hiện các đợi nhiễm vĩ khuẩn tái điễn trong năm năm đầu đời

+ Néng dé IgG, IgM, va IgA < - 2 8D với nông độ ở trẻ bình thường củng

bảo lympho Ð nên số lượng bạch câu trung tính, bạch cầu ái toan, ái kiểm, hồng câu

và tiểu cầu không bị ảnh hướng Tuy nhiên, công thức máu vẫn có vai trỏ quan trọng, giúp xác định mức độ nhiễm trùng và có thể loại trừ một số bệnh suy giãm miễn dich bam sinh khác như: bệnh giảm bạch cầu hạt trung tỉnh, bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch

Một số trường hợp bệnh nhân XI.A đã có tiểu sử giảm bạch cầu bại trung, tính, đặc biệt trong đợt nhiễm khuẩn và được chân đoán nhằm với bệnh giảm bạch

câu hạt bảm sinh Vỉ khuẩn pseudomonas va ty cau là hai loại ví khuẩn thường gây

giảm bach câu hạt trưng tính nặng ở bệnh nhân XT.A [11], [21]

1.4.2.2 Phân tích dẫu Ấn mảng tế bào

Binh thường, số lượng tế bào iympho B đao đồng theo tuổi của bệnh nhân

nhưng trung bình chiếm 5-15% số lượng lễ bảo lympho trong mau ngoai vi [41] Tổi với bệnh nhân XLA, các tế bào lympho B không thể biết hoá thành các tế bảo lympho B trưởng thành nên số lượng tế bào lympho B ra máu ngoại vi rất ít hoặc thậm chi bang không

Số lượng tế bào lympho B có thể xác định bằng xét nghiệm phát hiện dâu ân mang 18 bao bằng hệ thống phân tích dòng chây tế bảo - Flow Cytometry Nguyên

lý của kỹ thuật là sử đụng chum tia laser phát hiện ra các kháng thể gắn huỳnh

quang được gắn lên các đâu ân máng tế bảo máu Nhờ đỏ nhận biết các tế bảo mang các đầu ấn bé mặt (hay côn gọi là kháng nguyên bê mặU, giúp xác định chính xác loại và số lượng từng loại tế bào Dựa vào nguyễn lý nảy, các nhà miễn dịch học đã từng dụng để xác định số lượng các dòng té bao: lympho T (CD3+, CD4+, CD 84),

lyrapho B (CD191, CD201) và các tế bảo diệt tự nhiên (CD56I) và rất nhiều đưới

nhóm của tế bảo khác như các tế bảo đưởi nhóm khác Việc xác định được các dâu

ân miễn dịch trên màng tế bảo vào những năm 1970 đã mở ra một thời ki mới giúp

chứng mình được về bản chất và phân loại các thể của bệnh SGMD bằm sinh

“Theo tiêu chuẩn chân đoán của hiệp hội suy giám miễn dịch Mỹ và Châu Âu

xăm 1999, bệnh nhân XLA có số lượng tế bảo lyrmpho B dưới 2 % [L0] Hậu hết

các bệnh nhân XILA, đặc biệt là những bệnh nhân dưới 10 tuổi, đếu có rất ¡L lế bảo

14

B trong mau (<1% téng 6 lympho bao) Trong khi do, s6 long lympho T va NK

cla bénh nhan XLA binh thudng

1.4.2.3 Định lượng kháng thé

Do có sự sụt giảm rõ rệt sẽ lượng té bao lympho B trưởng thánh trong máu ngoại vi nên khả năng sản xuất kháng thể cũng bị giảm rõ rệt Theo tiêu chuẩn chân đoám của liệp hội suy giãm miễn dịch Mỹ và Châu Âu năm 1999, nẵng độ kháng thé IgA, lgG và IgM của bệnh nhân XLA thấp hon 2 độ lệch chuẩn so với trẻ cùng,

Nông dd IgM va TgA thudng dudi 0,2 g/L Dấu hiệu giãm TM là một dấu

hiệu quan trọng do giảm IgG va IgA có thể gặp ở trẻ chậm sản xuất globulin miễn

dich sinh lý Trong khi giâm IạM thường gặp trong bệnh cảnh suy giâm rniễn địch

‘bam sinh

1.4.3 Xứ nghiệm sinh học phân tứ phân tích gen BTK

1.4.3.1 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger

Giải trình tự DNA là phương pháp cho phép phân tích một cách chính xác

trinh tự nueleotid của từng gen hoặc của một vủng gen được quan tâm, được mỏ tả lân đầu tHên bởi Sanger và công sự vào năm 1992 |37| Nguyên lý của phương pháp

dựa trên sự nhàn lên của các sợi 2NA từ sợi DNA khuôn bằng phương pháp PCR,

trong đó sự tổng hợp của mỗi sợi DNA mới được dừng lại tại mọi điểm dọc theo chuối Chuối được liên tục kéo dai do sự kết hợp ngẫu nhiên của cac NTP, kèm theo sw cd mit cia DNA polymersase va mdi là các chuỗi oligonucleotid dai

khoảng 20 lp được thiết kẻ theo nguyên tắc bố sung voi ving DNA dich can quan

tâm Thông thường các đÑTP được đánh dấu 4 tau huỳnh quang khác nhau Đối

với phương pháp này, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quán Mỗi

khi có một vạch điện di đi qua, phân tử dNTP cuối cùng ở đầu 3' của đoạn DWA sẽ

phái m một màu huỳnh quang tương ứng, từ đỏ mấy sẻ nhận điện được các

15

auolcotid, từ đó biết dược trình tự của DNA dích Giải trình tự gen cho phép xác

định hàu hết các đột biến điểm, đột biến mắt đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn cúa gen Dối với bệnh XLA, 95% các trường hợp mắc bệnh cần phải giải trình tự gen B7K để phát hiện đột biến diễm Các vùng được giới trình tự bao gỏm: các vùng mã hóa trên

gen BTK, vùng ranh giới exon-intron, vùng cận promoter

1.4.3.2 Kỹ thuật khuếch dại nhiều doạn dấu dò phụ thuộc kết nỗi (Multiplex

ligation dependent probe amplification - MLPA)

Ky thuat MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) 14

phương pháp sử dụng nhiều phản ứng PƠR cho phép khuếch đại nhiều doan gene khác nhau với chỉ một cặp mỗi duy nhất Mỗi một đầu dỏ (probe) bao gồm Ì cặp

mỗi (primer), cặp mỗi này sẽ bắt cặp từ hai đầu của vúng gene quan tam, sau đó hai

cặp mỗi nảy sẽ được nối lại với nhau thành một Irình tự đích hoàn chỉnh Ứu điểm của các đầu đò phân đôi này là chỉ có các trình tự đầu đỏ sau khi ghép nói lại mới được khuếch đại chứ không phải mẫu DNA ban đầu Mỗi một đâu đè được thiết kế

có thêm uột trình bự DNA đặc biệt có độ đải định trước gọi là trình tự thêm (stufTer sequence) Khi điện đi trên máy, trình tự thêm này đảm bảo các trình tự đã được

khuếch đại có độ dài chính xác trên hân điện di Độ đài các trình tự thêm ở các đầu

đẻ là khác nhau, diêu này sẽ tránh dược các giới hạn phân giải trong phương pháp

snultiplex PCR Cac dau dỏ này cũng được gắn huỳnh quang nên cường độ của các

tin hiệu cỏ Kén quan đến chất lương của phân ứng khi

1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh XILÁ

5.1 Tink hink nghiên cứu trên thể giới

Bénh suy giảm miễn địch bẩm sinh thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (XLA) lần đầu tiên được bac sf Ogden Bruton người Mỹ

xô tả vào năm 1952 trên tạp chỉ “Pediahics” Ông nhận thấy sự thiểu hut

immunogiobulin ở một cậu bé 8 tudi Joseph S Holtoner bj viêm phối, viêm xoang,

viêm tai giữa kéo đài [9]

16

Năm 1986, nhóm nghiên cứu Ÿ khoa Harvard đã xác dịnh được vị trí gen

liên quan tới bệnh XLA có vị trí trên cánh dải của nhiễm sắc thể giới tính X, từ đó

nở hướng chân đoán trước sinh cho các ba me thé an [25]

Năm 1993, Nghiên cửu của David Vetrie vẻ cộng sự sử dụng phương pháp lai ghép tại chỗ đã vẽ bản để gen Z7K tại vị tri Xq21.3-q22, phat hién tyrosine

kimase trong tổ bảo chất có liên quan đến tiến trình lăng trưởng và biết hóa của tế bao B, su thiéu hut BTK đã được quan sát ở các bệnh nhân mắc bệnh XLA [12]

Năm 1993, nghiên củu của Tsukada và cộng sự đã mô tã protein BTK như là

amt tyrosine kinase bao tuong và gọi là BTK, biểu hiện trong tất cả các tế bảo của dòng 13 và trong các tế bảo tủy xương Ông cũng phát hiện ra rằng RNA thông tin

của gen 87K, biếu hiện của protein và hoạt đông của kinase đều bị giảm hoặc không,

có trong tế bào lễ bảo B trưởng thành và tế bào tiên B [42

Nam 1994, nghiên cứu của Yulko Ohla và cộng sự đã công bổ trinh tự DNA của 18 exon trên gen BTK ma héa protein BTK và các vùng xung quanh của chúng

Nghiên của đã chỉ ra môi Lương quan giữa các đột biến gen BTK [33]

Năm 1996 đến 2006, Nghiên cửu của Vihinen vả cộng sự đã xây dựng một

cũ sở đữ liên về các đói biên gen BTK bao gầm các đội biến xây ra trên cả 5 vững

của gen 7K thường gặp nhất là dột biến sai nghĩa Các dột biển xuất hiện rải rác

trong toàn bộ gen và thưởng ảnh hưởng đến cdc vi tri CpG tao thánh Arginine Cac

Năm 2005, Xghiên cửu của Hduardo va Wang phân tích số lượng lớn bệnh

nhân XLA cho thấy mỗi tương quan giữa kiếu gen và kiếu hình, đồng thời chỉ ra

mot sé đột biến có xu hướng đân đến độ tuổi chân đoán cao hơn, nông độ Globulin

xniễn dịch giảm ít hơn và số lượng tế bảo lympho 13 giám nhẹ hơn so với các đột

biển khác thầy [13], [49]

1.5.2 Tình hình nghiên củu tai Viet Nam

"Lại Việt nam, bệnh suy giảm miễn dich bằm sinh còn ít được nghiên cửu và chưa có một dữ liệu thống kẻ nào về số lượng và lÿ lệ mắc bệnh Nêu lấy tỷ lệ mắc bệnh là 1/1200 trong quân thẻ người Châu Á, Châu du, Mỹ, với số dân của Việt nam là trên 9O triệu, có thể ước tính được khoảng 75.000 người Việt nam mắc bệnh suy giám miễn địch bẩm sinh Mặt khác, ở nước ta có nhiều dân tậc thiêu số còn lập tue két hn cau huyết khả phố biến thi tý lệ mắc bệnh SGMDBS trong dân số có thể

cao hơn

Nat

bệnh nhân thiểu garmmag lebulin máu liên quan nhiễm sắc thể giới tính tại bệnh viện

Nhi Đồng ! Tp Hồ Chỉ Minh” Nghiên cứu được thựo hiện trên 4 bệnh nhân đã xác

2011, lác giả Tâm Thị Mỹ liền hành nghiên cứu đầu tiên vẻ “Đặc điểm:

đẻ cập dến phân tích đột biến ở mức raRNÀ mà không khảo sat vig promoter va

vùng intron [4]

Năm 2014, nhóm nghiên củu của bệnh viện Nhĩ Trung Tưng va bệnh viện Đại

học Y Hải Phòng công bố về 4 ca bệnh XLA dâu tiên được chân doàn xảo định gen

trén tap chi BioMed Central [1]

Các nghiên cửu phát hiện đệt biến gen BTK duoc thực hiện tại nhiều đơn vị

khác nhau và kỹ thuật phản tích gen mới đừng lại ở phân tích RNA mã chưa xác

định được hết các đột biến trên gen 7K Nghiên cửu ứng đựng kỹ thuật phân tử để

sảng lọc toàn bộ đột biến cho bệnh nhân XI.A có ý nghĩa hết sức quam trợng trong, việc điều trị và chẩn đoán trước sinh sau nay

18

CHƯƠNG 2: ĐÔI TƯỢNG VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cửu

- 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA thuộc 28 gia đình, tuải từ 2 tuổi đến

15 tuổi được khám, chân doan, diéu tri va theo dõi tại Bệnh viện Nhị Trung ương từ 01/2017 đến 05/2018

- 30 người bình thường làm mẫu đổi chứng xây đìmg quy trình phát hiện đột biển gen để đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật

3.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ

Năm 1999, hội đồng SGMD châu Âu ESID (BEuropean Ñociety for

Immunodeficiencies) va Hoa Ky PAGID (Pan-American Group for

Immunodeficiency) da théng nhật vả đưa ra tiêu chuẩn chan đoán cho các nhóm

bệnh SGMD bầm sinh |10|, [14] Cáo tiên chuẩn chân đoán tây dựa vào lâm sàng,

xét nghiệm cơ ban ya xét nghiệm phân tích đột biên gen Cho ti nay, day van la bản tiểu chuẩn được áp dụng rông rãi nhất trên toàn thế giới

«_ Tiêu chuẩn lựa chọn:

Bệnh nhân nam cỏ số lượng tế bảo lymphoB CD19L < 294 và ít nhật một tiêu

chuẩn sau:

+ Xuất hiện các đợt nhiễm vi khuẩn tái điển trong năm năm đầu đời

+ Nong dé IgG, TgM, va TgA thấp đưới 2 độ lệch chuẩn số với nông độ ở trẻ bình thường củng lửa tudi IgG thường dưới 200mg/dL, IgM, IgA, IgE rất

thấp heặe không định lượng được Trẻ dưới 6 tháng: Do có mặt cửa IạG từ

te nên TựÁ, TgM rất có ý nghĩa cho chân đoán sớm

+ Không có kháng thé khang héng cdu Anti-A va Anti-B trong máu và/hoặc

đáp ứng kém với vaccine

« _ Tiêu chuẩn loại trử

- Loại trừ những thế SGMDBS khác cũng pay giam IgG mau nhung sé hrong,

tế bảo lympho B bình thường hoặc hơi cao so với lứa luổi

ig

-_ Loại trừ các bệnh di truyền khác dã được chân doán xác dinh bắng xét nghiệm di truyền phan ti

- Bệnh nhân không chấp thuận tham gia nghiên cứu

2.1.2 Thu thập mẫu

- Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiên hành tại khoa Dĩ

truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhỉ Trung ương từ 122017 đến 05/2018

- Mẫu bệnh phẩm: Lây 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA của 30 người

tình thường và 31 bệnh nhân nghỉ ngờ mắc bệnh XLA, được thu thập và bảo quản

ð điền kiện nhiệt độ ŒC đến 4°C

2.2 Hoá chất và thiết bị

3.2.1 Hóa chất

Hóa chất tách DNA từ máu ngoại vị và từ dịch ôi sau nuôi cây

- QiaAmp DNA blood mruni kit (250 phần ứng/ kít (QLAGUN, Dức),

- 100% Ethanol (Merck, Đức)

Hóa chất cho PCR

- MgCh, đNTPs, Taq polymerase (Invitrogen, Hoa Ky)

- 19 cap mdi, bao gồm miỗi xuôi va môi ngược (Error! Reference source

ot found.),

~_ Nước khử ion (Invitrogen, Hoa Ky)

ø Hóa chất điện di

- Agarose (Invitrogeu, Hoa KY)

- Dumg dich TBE 10X (Invitrogen, Iloa Ky) (pha loang 10 lần khi sử dựng,

(1X): Tris 0,89 M, acid Roric 0,89 M, EDTA 0,02M

- 10X Blue juice TM (Leading dye) (Invitrogen, Hoa Ky)

- Ethidium bromide (EtBr) (Invitrogen, Hoa Ky)

- 100 bp DNA Ladder (1 ug/l) (Invitrogen, Hoa Ky)

© Héa chat tinh sach: Kit tinh sach

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Qiagen-puification Kit, Đức)

ø THóa chất giải trình tự gen: Sử đụng hóa chất giải trình tự gen cho máy Giải

trình tự ABT 3130 (Applied Bioaysterns, Hoa Ky)

BigDye ‘Terminator v3.1 (Applied Biosystems, [loa Ky) BigDye v3.1 Termination reaction kit (Applied Biosystems, Hoa Ky) POP-7 polymer (Applied Biosystems, Hoa Ky)

Running buffer 10X (Applied Biosystems, Hoa Ky)

Trình tự 18 cặp môi, bao gồm môi xuôi và mỗi ngược

~ Tô ví sống (Samsung, Han Quic)

- Cân phân tích (Mettler Toledo 10-g, Thuy Si)

- 118 théng 4ién di nim ngang (PowerPac 300, BioRad, [loa Ky)

- Máy lắc

- Pipettes: 20 pL, 200 pL va] mL (Hppendorf-Bure)

- Ong PCR 0.2 mL va 0.5 mL (Corning, loa Ky)

- Ong ly tm 1.5 ml (Corning, Hoa Ky}

- Diu cén ed ming loc 100 pl, 1000 pl, 10 pil (Labcon, Dic)

- Khay lạnh

~ Máy đo nắng độ DNA-Nanodrop 1000 (Thorno, Hoa Ky)

- Hệ thông máy khuếch đại gen (PCR Eppendoff, Biorad)

- Hệ thẳng soi gel (GelDoc, Biorad, Hoa Kỳ),

- May giải trình tự gone 3130 Genetic Anslyser (ABI, Hoa Kỳ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Qui trình tiến hành phân tích gen BLK tại Khoa Di truyền và Sinh học phân

tủ, bệnh viện Nhi Trung Ương theo các bước sau:

Kham va sing lọc bệnh nhân

"Thu thập 2rml mẫu múu củn bệnh nhần

tủa gen 87K pluit hiện các đột biểu điểm

————TL ——_—

Không có đột biến Có đột biến

Kỹ thuật ML.PA phát hiện các đột

biến mắt đoạn và lắp đoạn

Kết luận

2314 Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại ví

Quy trình tách DNA tổng số từ máu ngoại vi được thực hiện theo hướng dan

olla nha san xual kit tach DNA (Qiagen-DNA blood mini kil) theo quy trình sau:

Cho 20 ul Protease QIAGEN vàa mỗi ống ly tâm 1 5ml, sau đó cho tiếp

200 HÌ mẫu trrầu vào trorgr ẳng, Thêm 200 pl dung dich dém AL réi trén đều hỗn họp trên bằng máy lắc

trong L5 giây,

TÚ hẳn hợp trong máy ôn nhiệt ở nhiệt độ 56°C Gong 10 phúi, sau đỏ lây ống ra khỏi máy Gn nhiệt

Ly tam nhẹ hỗn hợp để trảnh dung dich đọng trên thành ống và nắp ống,

Thêm 200 Hì cổn Ethanol (96-100%), trộn đều và ly tâm nhẹ

Chuyển toản bộ hổn hợp trên vào cột lọc QLAamp, trành để hỗn hợp dinh vào thành ống và nắp ông,

Ly tâm cột lọc ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, bố địch nổi và

chuyển cột lọc sang éng 2 mi sach

~_ Thêm 500 ml dung dịch đệm AWI, ly tâm ỏng với tốc dộ 8000 vòng/phút

trong 1 phút Sau đỏ bð dịch nồi, chuyển cột lọc sang éng 2 m sạch khác

~_ Thêm 500 HÌ dụng địch đệm AW2, ly lâm ống với tốc độ 13000 vàng/phút

trong 3 phút Loại bở dịch nổi, chuyển cột loc sang dug ly tâm 1.5 ml võ

trừng

~_ Thêm 200 HÌ dung địch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong T phúi,

sau đó ly tâm với tốc độ B000 vòng/ phút trong 1 phút thu DNA tổng 36

2.3.1.2 Xác định nông độ DNA tổng số

~ Việc xác định nông độ DNA sẽ cho phép lính toản thành phan phan ứng PCR đạt hiệu quả tốt Nẻng độ DMA được xác định bằng máy Nano Drop của hãng

Therme ở bước sóng 260 nm va 280 nm

~ Tiên hành đo 3 lần với mỗi mẫu để tránh sai số

2.3.2 Phương pháp diện đi D4

Nguyên tắc:

Nguyễn tắc của phương pháp diện đi dựa vào đặc tính cầu trúc của các nueleic

acid Nueleic aeid là các đại phân tứ tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện

một chiều, các đoạn DNA có khỏi lượng và kích thước khác nhau sẽ dĩ chuyển

trong diện trường từ cực âm sang dương

Quy trình:

- Dung dich TBE 1X hod tan 1% Agarose duoc dun gối, để nhiệt độ hạ xuống Kkhoang 50°C 60°C

- Nhé 11] Dthidium Bromide, lic déu

- Đố dung dich agarose vao khay gel đã cải sẵn lược thích hợp Sau khoảng

30 phút khi gel đã đông cửng thị tháo lược, đặt khay sel vào bẻ điện đi, Đề

đệm TBE LX ngập cách mặt gel kheäng 2 mm

- Tra mẫu: mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu (Loading đyc) theo lỷ lệ

thích hợp, tra mẫu vào các giêng trên bản gel

- Tiến hành điện di với dòng diện một chiều, hiệu điện thể 100V, cường dộ đòng điện 60- 8Ú mA, quan sát sự dì chuyển cua vat mau bromophenol blue

để ngững vào thời gian phủ hợp (thường sau khoảng 60 phil)

- Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát đưới ảnh sáng tử ngoại Quan sát

thấy DNA hiện lên dưới đạng các vạch sáng, Ảnh điện đi được chụp trên

máy Biorad với ña UV có bước sóng 320 rmn

3.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger bằng máy ABI 3130

2.3.3.1 Phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ gen BTKT

Gen BTK gém 19 exon duoc chia thành 9 đoạn nhỏ như Hình 22 và khuếch đại bằng các cặp mỗi đặc hiệu Lảng 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ nhân doạn gen BTK

- Phan tng PCR khuếch đại 19 exon của gen BTK bao gém các thành phân

bong Bang 2.1

Bảng 2.1 Thành phần phản img PCR

'Thảnh phẩn phản ứng 'Thể tích /mdiu (ad) PCR multiplex master mix 2X 25

- Trinh ty méi trong Bang 2.7:

Bảng 2.2 Trình tự cặp mỗi phân ứng PCR khuếch đại gen BTK

EIR

EF L L 3 X2 949bp

72°C 5 phút

Quá trình PCR được thực hiện trên máy PCR Eppendott (Eppendoff, Đúc)

Sau méi chu kỳ phán ứng, từ 1x đoạn DNA cẩn nhân sẽ có 2x đoạn được tổng hợp,

sau n chu kỳ số có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiêu đại thực tế của đoạn

DNA được nhân bản bằng dùng khoảng cách giữa hai dẫu xuất phát của hai doan

môi

2.3.3.2 Tình sạch sân phẩm phân ứng PCR khuích dại

Kiểm tra sán phẩm PCR sau khi dién di trén gel agarose bằng phương pháp

điệm đi San đó, sản phẩm PCR được tỉnh sạch bằng kit tinh sach cia QIAGEN

(QTAquick PCR Purification Kil, Đúc) trước khi tiến hành giải trình tự gen Các

bước tiến hành tình sạch sắn phim PCR:

L_ Trộn 8O Hl đứng địch đệm B2 vả 20 ll sin phẩm DCR, trộn đều

+ Chuyển toàn bộ dung địch vào oột lọc

+ Ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút

1 Loại bô địch nỗi

+ Thêm 650 pl dung dich đệm W1 vào cột lọc QIAquidk colimn và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút

L- Bỏ dịch nỗi Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng rong 5 phúL

Chuyển cột lọc sang ông cppendorf 1,5 mÌ vô trủng,

+ Nho 50 ul dung dich dim buffer LB (10mM ‘In1s-Cl, pLL 8.5) ho&e muse (pH 7.0- 8.5) 1d nhiét dé phéng trong 1 phi, Sau a6 ly tan 4 13.000

vòng trong | phut San phẩm PCR tình sạch sé qua mang lọc xuống ông,

eppendorf 1.5 ml vô trùng,

3.3.3.3 Phân ứng PCR mỗi don

‘Trinh tự đoạn gene quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương,

phap Sanger: tao ra cac đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một mucleotide, kết thúc

bởi các dđNTP đã được đánh đầu huỳnh quang Đề tạo ra

các loại dẩN'TP khác nhau, chúng tôi tiến hành phán ứng PCE sử dụng hoá chất

c đoạn kết thúc bằng

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hoá chit cần

thiết của phân ứng nhân gene để xác định trình tự nbu ddNTPs, DNA polymerase

Do do chi can bố sung thêm DNA khuôn (à sản pham PCR tinh sạch) và mỏi phủ hợp Trinh tự môi cho phân ứng giải PCE giải trình tự gen (Bảng 2.3)

Bang 2.3 Trình tự mỗi phần ứng PCR mỗi đơn

Đoạn | Tên Mỗi xuôi (sensc) Tên Mãi ngược (anfisene)

GATACTAC “AC AGC A121 AAGTAAGA TAG AAG

AAGACATGCATAGTAGCITTC = Li6R | ACLCLIGGGAGAGTGAICGA

T4 T TAUCCAAACCTG + AR AGTATTTGTTAGTGC TAC

- Thành phản phản ứng PCR mỗi đơn Bang 2.4:

Bang 2.4 ‘Thanh phan phan eng PCR mai đơn