Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập Được từ Đậu tương lên men

Theo lỗ chức Y tẻ thế giới WHO, cứ 2 giây có 1 người chếi vì bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân ch

BỘ GIÁO DUC VA DAO TAO

TRUONG DAI HOC BACH KHOA HA NOI

ĐINH TIH THU TRANG

DE TALNGHIEN CỨU TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYM

FIBRINAZA CUA MOT SO CHUNG VI KHUAN PHAN LAP DUOC TY DAU TUONG LEN MEN

LUAN VAN TITAC 81 KITOA TIOC NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.NGUYEN LAN HUONG

HÀ NỘI - 2010

11.3 Cơ chế phân hãy Fiồrhn trong cơ (hŠ người co

12 Enzym fibtib8Z8 cuc "¬

13.1 Cấu tạo va tinh chai

13 Các ví sinh vật cả khả nang sink ting hop enzyme Fibrinaza

Binh Thi Thu Ts

112.6 Phương pháp khuyách đại DN-4 bằng phản ing chuéi polymerase

(Polymerase Chairs Reaction- PCR) iuesnenueneninianenenimnenenenenend 113.7 Xứ lý DNA bằng snayme gigi htenvcuueneneninenenmnanenaneneedd

11.2.10 Tách chiết và tinh sack DNA plasmid 42

1L2.11 Kiém tra plasmid mang sén phdm PCR mong mudn 44

TH.1 Tuyên chọn các chẳng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza 4Š

1IL.3 Định tên chủng vi khuẩn nghiền cửu „48 1IL.3 Nghiên cửu tạo chủng tải tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza Š2 HEIL, Tach DNA otha vi KhIẪN, co keneeeeoeoooeoeooS2 -HỊ 3.2 Nhân đoạn gen mã hóa enspm fibrinasa 53

1H1.3.3 Xử lý sản phdm PCR bang enzym gidi han 55

HL 3.4 Ghép néi gen mit hoa enzym fibrinaza va vector phT-226f |) 56

17.3.5 Bién nap vector tai t6 hop vao té hao F calt bang phương pháp sốc

nhiật #? 1H.3.6 Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa JiriwazA S8 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ác nenereeieserrrrieeosoeoue Ø2

B cai

EDTA EtBr

Ampieilin

Cp bazo Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleic acid

Escherichia coli Rthylene Diamine Tetraacelic Acid Tthidiurn bromide

Kilo bazơ Luria — Bertani

Phan ứng day chuyén polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

Ribomuclease Sodium Dodecyi Sulphate Tris — acelalc - EDTA Tris - EDTA

Tissue — type plasminogen activator (chat hoat héa plasminogen md}

Urokinase type plasminogen activator (Chit hoat hoa urokinase)

Rang 21 Thanh phan cdu tao cha vector pET-22b(+)

Bảng 22 Các hỏa chất sử dụng trong nghiên cửu

Bang 2.2 Thanh phan phan ing PCR khuyéch dai gen

Bang 2.3 Chế độ nhiệt cho phan ứng PCR

"Bảng 2.4 Thành phần phân ứng xử lý plasmnd bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phân ứng xử lý sân phẩm PCR bằng en=ym giới hạa

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chững nghiên cửa

"Bảng 3.3 1loạt lực của ensym tách chiết được từ các chùng bằng phương pháp do vòng thủu phân và phương pháp so màu

ảng 3.3 Tình thái khuẩn lạc và hình thái tổ bào của các chủng

Hình 1.1: Cúc sợi fibrin làm động tụ máu

Hinh 1.2 Quả trình hình thành fibrin

Hinh } 3 Cấu trúc vòng xoắn của nattokinase

Linh 2.1 Vector pET-22b( }

Linh 3.1 Linh thai khudn lac va té bao cha cdc ching nghién cit

Tinh 3 2 Két qua định tên bing b6 Kit APT SOCITB cata 3 ching T19, T21 va T23

Hinh 3.3 DNA tng sé ctta MT

Hinh 3.4, San phim PCR nhân đoạn gen mẽ hỏa Ñbrinaza cia ching M, T19, T21 vis T23

Hinh 3.5 Sén phim PCR nhân đoạn gen mỡ hỏa fibrinaza cha ching M1

Hinh 3.6 Kết quả xử lý bằng enzpm giới hạn

Hinh 3.7 Kết qua tinh sach plasmid

hình 3.8 Kết quả biển nạp vector tải tổ hop vio B coli

1Hình 3.9 Chọn dòng pET-226{ |) mang gen ngoai lai mất hóa enxym ftbrinaza

THình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mi héa enzyme fibrinaza bang

Trong những năm gẫn đây, bệnh tim mạch lả nguyên nhân hàng đầu gây lử

vong trên thế giới Theo lỗ chức Y tẻ thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chếi vì

bệnh tím mạch, cứ 5 giây thủ có 1 trường hợp nhồi mau co tim va cit 6 giấy thủ có một trường họp đột quy [46] Nguyên nhân chỉnh của các căn bệnh này do sự mắt cân bằng giữa hai quá trinh: quá trình đồng tụ máu và quá trình hòa tan các cụo máu,

đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đồng máu nhưng chỉ cỏ mỗi một

loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasrnin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trường đại học Dược Chícago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng (hủy phân fibrin (nguyén nhan chinh gay dng man) do vi kbudn Bacillus trong quả trình lên men đậu lương tiết ra Đỏ chỉnh là enzym fibrinaza, cnzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyển thống của Nhật Bản - Nato nên còn được gọi lả Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tai các bệnh viên trong cà nước những,

năm gần đây cho thấy, tý lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tìm mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Naffolcinase, Mattok, Fibrinaza tuy nhiên các sản phâm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tỉnh đến nay trên thể gởi đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các

chúng vi sinh vật sinh enzym íilrinaza cũng nh nghiên cửu đặc điểm của enzym nảy Bên cạnh đỏ để thu được cnzym fibrinaza có boại lục cao việc nghiên cứu để tạo chủng lãi lỗ hợp mang gen mã hỏa enzyrn fibrinaza là rải cẩn thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cửu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trướng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fiDrinaza, chưa có một nghiên cửu

nảo về tạo chúng tải tổ hợp của enzymn nảy Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương, déi dào đây là điều kiện thuận lợi đề chủng ta tiền hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiện Việt Nam

Binh Thi Thu Ts

Xuất phát từ các lý đo trên, chủng tôi tiền hành để tải "Nghidn cen tach dong

gen mã hảu engpm fibrinaga cũa một số chẳng vì khuẩn phân lập từ đậu tương

Eibin là một loại protein dạng sợi được polyme hỏa để tạo thành dạng lưới bao

quanh vết thương có tác dụng cảm mau Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay

còn gọi là fñbrinogen nhờ sự hoạt đông của thrombin Khi đó, ñbrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tô VIII đẻ tạo thành các cục mau Ngoai ra, fibrin con

tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tin hiệu, đông tu

máu trong mạch máu và polyme hỏa protein [34]

Hình 1 1: Các sợi fìbrin làm đông tụ máu [44]

11.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thê

Khi co the binh thudng fibrin ton tai ở dạng tiên chất không có hoạt tính, đó là dang fibrinogen Khi co thé bi ton thuong, dang tién chat fibrinogen hoa tan trong

máu sẽ được chuyển hỏa thảnh ñbrin không hòa tan trong máu tao nên cục máu

đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quả trình nảy có sự tham gia của

Khoa Công nghệ Sinh học § Lớp cao học k8§10

việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IHa của chúng lại với nhan và hình thành

fibrin dé cdm mau [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta va gramma) Trên chuỗi alpha và beta cỏ mội trình lự peptit ngẩn được gọi là fibrinopeptit Chinh cac chudi peplit ngắn này cản trở việc fibrinogen bi polyme hda bởi chính nó một cách tủy tiện [34]

+ Một số vấn tá chính tham gia vào quả trình chuyén héa fibrinogen thank fibrin

~ Nhóm yếu tổ liếp xúc: gồm các yêu tổ XI, XI, prekallikrein Các yêu tổ thuộc

nhỏm nảy hoại động không cân sự có mặt của ion Ca”” cũng như vitamin K

- Nhém yén té prothrombin: gdm cac yéu té ïI, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhm náy là cân sự có mnặt của vitaanin E để các yếu tỏ này gắn được với ion Ca

~ Nhẻm fibrinogen: gỗm Íbrìnogen, V, VIIL, XTIL Nhỏm này chin tác dựng của

thrombin, kém bên vững

Tên của mội số yêu lế chính tham gìa vào quá Irinh đồng máu:

1 Yếu tổ I: fibrinogen + Yêu tễ 3: potlrombin

1 Yêu tô 3: Itroboplastin của mê

Binh Thi Thu Ts

1 Yếu tổ VII: precanvertin

+ Yêu tổ VI: globulin A

1 Yéu t6 IX: globulin B

1 Yéu té X: Stuart — Power

1 Yéu té XE: globulin C + Yéu té XIE Hageman

+ Yéuté XIII ổn dinh fibrin

Quá tình chuyển hỏa fibrinogen thành ñbrin được mô tả đưới hình sau

Binh Thi Thu Ts

Qui trình hình thành ñbrin trong co thé điễn ra theo 3 giai đoạn:

- Giai doan tao thank phite hop prothrombinase: đầy là quá trình phúc lạp và kéo đài nhảt thông quả 2 cơ chế nội sinh và ngoại sinh lạo ra phức hợp protlrombinase Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu cỏ chấn thương thành mạch hoặc

các mô kế cậu Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chắn thương máu hoặc máu lấy ra

ngoài cơ thể tử lòng mạch

+ Cơ chế ngoại sinh: khi mạch máu bị tổn thương, máu tiếp xúc với vị aí bị

tốn Thương, Mô ở vị trí bị thương sẽ giải phóng ra yếu tổ HT và phospholipids Yên

tổ 1H, IV củng yếu tố VII và phospholipids mỏ sẽ hoạt hỏa yếu tố X tạo yếu tổ X

hoạt hóa (X,)

'Yếu lỗ X¿ cùng với yến tổ V, phospholipids mô và ion Ca” tạo thành phíc

hap prothrombinasc Phospholipid déng vai trò là chải nên còn ion Ca” làm câu nỗi

giữa các yêu tổ

+ Cơ chẻ nội sinh: đồng thời khi mảu tiếp xúc với vị trí bị tổn thương sẽ lảm

hoạt hỏa yếu tô XII và tiểu cần lảm giải phóng ra phopspholipid Yếu tổ XTI hoạt hóa yêu tố XI, yêu tổ XI sẽ hoạt hóa yếu tế IX Yếu tế IX cùng với phopspholipid tiển cầu và ton Ca”" sẽ hoạt hóa yếu tổ X Yếu tả X hoạt hỏa cửng với yếu tổ V„

phospholipids, Ca”" sẽ tạo thành phức hợp prothrombinase

Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo co chế nội sinh chậm hơn rất

nhiễn (1-6 phủúU) so với cơ chế ngoại sinh (l5 giây)

- Giai đoạn tạo thành diưombi: prothrombinase theo cơ chế nội sinh và ngoại sinh cùng với ion Ca” sẽ xúc tc cho phan img chuyén prothrombin thanh thrombin

- Giai ấogn tạo diành /öm thưombin sau khi được hình thành đã chuyển ñihrinogen thành fibrin đơn phân Các ñbrin đơn phên tr trùng hợp thành fibrin ở dang soi, Mét mang lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yêu tổ XHI Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca”", Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu đông

Binh Thi Thu Ts

LL2 Co ché phan hity Fibrin trong co thé ngresi

Trang eơ thể người, ñbrin cỏ thể được thủy phân bởi plasmin Plasmin là một cnzym phân hủy protein, chủng có tác dụng làm tan các sợi fibrin và lắm lan các chất khác có tác dụng gây đồng máu như fbrinogen, yếu 6 V, VIII hay prothrobin

Do đỏ khi plasmin được hình thành bên trong cục đông máu nó có thẻ lâm tan cục đông, đông thời làm giảm khả năng đông máu Vị vậy, quả trình nảy cho phép đọn sạch những cục mmán đông hình thành ở các mẻ trong một số ngày,

Khi cơ thể bình thường thi plasmin tổn tại ở đạng không hoạt động lá

plaminogen Chỉ khi tế bào mạch bị tổn thương cơ thể sẽ giải phóng chất hoạt hỏa plasminogen dé chuyển hóa plasminogen thành plasmin, hoat hỏa hệ thống thủy

phan fibrin Chat hoat hia plasminogen 1a nham enzym đuy nhất chuyển chất xúc

(ac plasminogen tir dang bal hoal sang dang hoat déng Chat hoat héa plasminogen

gôm bổn nhóm chính

- Một nhỏm là chất hoại hóa plasminogen urokinase (urokinasc- type plasminogen activator, uPA): chal nay là sản phẩm chỉnh của thận, cỏ liên quan đến kháng thẻ urokinase và không kết hợp với tơ máu Bới vậy chất hoạt hóa nảy được

che rằng có thể có liên quan đến hoạt hỏa plasminogen trong pha lỏng của huyết

thanh, Chất hoạt hỏa plasminogen trokinase chỉ có thể hoạt hỏa plasminogen khi cỏ mặt của fibrin Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy

fibrin Trang huyết trang người, nông độ kháng thể nPA từ 2 đến 7 ng/ml [28]

- Loại thứ hai là chất hoat héa plasminogen mé (tissue-type plasminogen

aclivator, IPA): chất này có khả nẵng tương lắc với kháng thể chất hoạt hóa mô và

kết hợp với tơ mán Ở người và động vật khác, IPA đóng vai trò quan Irơng trợng hệ

thống tiêu hủy fbrin [37, 38] Đối với các trưởng hợp mắc bệnh khối huyết, đươi

tac dung của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành khôi huyết,

nên tránh được tỉnh trạng phản huyết ở những vũng khác trong cơ thể, tuy nhiên

hoạt tỉnh chọn lọc này chỉ là tương đối [26]

virus, nắm móc và các độc tổ ö trong mảu cũng tạo ra liên kết chồng, chéo quả tải

của fibrin Khi không có hiện tượng mắt máu hoặc các vết tưương he, cdc soi fibrin

liên kết chéo nảy sẽ luân chuyển trong máu và đính vào thành mạch máu, làm giảm

sự vận chuyển lưu thông máu, đẳng thời làm tăng độ nhét của máu gây ra huyết áp cao Những cục mảu đồng trong tim người làm cản trở su van chuyển máu tói các

mé co tim Nếu đông máu bị chặn lại, khả năng cung cấp oxy tới các mỗ này sẽ bị

cÄt giảm môi cách cục bộ (gây ra thiểu máu cục bộ), nguyên nhân chỉnh gây ra các con dan thắt tim hoặc nhỏi máu cơ tìm Niu hiện lượng này kéo đải có thể gây từ vong Các cục máu có mặt trong tìm có thể ảnh hướng tới não, lao ra sự thiểu máu

và oxy từng phẩn, thường gặp ở nhùng người có tuổi Như vậy sự tích ty fibrin & thành mnạch máu tạo ra các cục máu lắm tăng các chứng bệnh nghẽn mạch máu, gây

ra các bệnh về tim mạch đặc biệt quan trọng Người ta đã sử dụng những chất hoạt hóa như là mệt loại thuốc để chuyển hóa tạo tơ hưyết thanh plasmin có tác đụng

phân hủy ñbrin trong máu Tuy nhiên, những loại thuốc này đều tất đất liền và không hiệu quả trực tiếp Bản thân IPA và uPA cũng bị ức chế việc hoại hỏa lạ

plasmin Hơn nữa, các chất chống plasmm cũng đã được tim thấy là œ2-

macroglobulin ức chế quả trinh thủy phân fibrin lam gidm hoat lực của plasmin [ I0]

Thư vậy, quá trình phân hủy fibrin trong cơ thể người phụ thuộc rất nhiều và

khả năng tạo các chất hoạt hóa plasmin Những chất nay lich thích việc hình thành

plasmin Tuy nhiên, sự có mặt của plasmin chưa đảm bão cho việc phân giải fibrin

cũng như các cục máu đồng hiệu quả bởi có rất nhiều các chất kim chế quanh nó,

At kich thích cho quá trình chuyển hóa tạo thành plasmin thi it mà các chất ức chết hoạt lực plasmin thi nhiều [10]

Luan van cao hoc Dinh Thi Thu Trang

Năm 1980, tién si Hiroyuki Sumi tại khoa hỏa sinh trưởng đại học dược

Chicago (Mỹ) và các công sự đã tiền hảnh nghiên cứu để tìm ra hợp chất tự nhiên

co tinh chat lam giảm chứng nghẽn mạch gây ra nhỏi máu cơ tim Ông đã phát hiện

ra enzym thủy phân fibrin (fibrinaza) do vi sinh vật sinh ra và công trình được công

bổ đầu tiên vào năm 1987 Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cửu vẻ

enzym fibrinaza va mét trong số các nghiên cứu ấy đã chỉ ra răng: enzym fibrinaza

có hoạt tỉnh thủy phân fibrin cao gap 4 lan enzym plasmin trong co thé

Enzym fibrinaza la mét loai proteaza có khả năng tương tự như plasmin trong

việc làm tan cả c cục đông máu loại ñbrin trong huyết tương ~ nguyên nhân chính gay ra hiện tượng tắc mạch máu Fibrinaza được chiết xuất từ một loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản có tên là natto nên còn có tên là nattokinase

Binh Thi Thu Ts

Tibrinaza là enzym ngoại bảo, có khổi hượng M = 27,4— 41 kDa [44]

Điểm đẳng điêngI 8,6

Theo nghiên cứu của Kim W và các cộng sự năm 1996, pII tối ưu cho hoạt

tinh tiny phan fibrin của fibrinaza trong khoảng từ 7 đến 12 và hoạt tính của enzym

giảm rãt nhanh ở pH nhỏ hm 6,0 và lớn hơn II Enzym bn trong dài pH từ 7 đến

10,5 và thích hợp nhất là ở pH là 7,4 [20]

Kim W và các cộng sự (1996) cũng đà tiến hành nghiên cửu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bên vimg của cnzym thủy phản fbrin Di nhiệt độ thử nghiệm là tử 10°C đến §0°C Nhiệt độ thích hợp cho độ bẻn của enzym là dưới 40°C

Ö nhiệt độ trên 40°C hoạt lục của enzym giảm rất nhanh Theo một số nghiên cửu khác, hoạt tỉnh enzym cao nhật trong khoảng nhiệt độ từ 30°C đến 40°C và nhiệt độ tối ru là 37°C [20]

Cũng theo một số nghiên cứu, hoạt lực của enzym fibrinaza tăng khi môi

trường có tổn tại ion Ca” Deepak V đã nghiền cứu ảnh hưởng của nỗng đồ ion Ca” và thu được hoại lực fibrinazz lớn nhất tại nêng độ 0.5g1 [13]

Tibrinaza không chỉ thủy phân fibrin mà còn có khả năng phân hủy cả cơ chất

%1) (cơ chế tổng hợp) — một chất nhạy câm

plasmin II-D-VäH1.cu-Iys-pNA (8-2

với enzym hơn các cơ chất kháe nhau [27]

127 Cơ chế tác động của Fibrinaza

Titrinaza có thể làm Ian những prolcin loại ñbrin trong huyết thanh người một

cach trực tiếp Sự tác dựng của fibrinaza thoo ba con đường:

~ Con đường A, bản thân nó cản trở sự hình thành các cục mâu va lam tan các

cục máu đông (bản chất là fïbrin) đã tồn lại trang huyết thanh người

- Con dường B, ñbrinaza kích thích tạo thành cnzym urokinasc từ tiên tổ

prourokinase Urokinase sé tao nén cac phân tử plasminogen rỗi hình thành nên

enzym plasmix, va enzym plasmin 8 thay phan fibrin

Luan van cao hoc Dinh Thi Thu Trang

~ Con đường C, fibrinaza kích thích tạo thành các tiền tO t-PA, tiền tổ nay 1a tác nhân hoạt hóa enzym plasmin [27

Ngoài ra enzym fibrinaza còn có khả năng ngăn chặn sự sinh ra của các chất tic chế hoạt hóa enzym plasmin.Theo một số nghiên cứu, ñbrinaza có hoạt tính cao

Hình 1.4: Cơ chê phân hủy, fibrin của fibrinaza [10]

Hoạt tinh sinh học của ñbrinaza đã được nhiều nghiên cửu ứng dụng trên động

vat và người chứng minh Người ta đã đo được các chỉ số vẻ hoạt độ phân giải

fïbrin của euroglobulin vả hàm lượng sản phẩm phân giải fñbrin (FDP) tăng lên,

đồng thời hàm lượng kích thích tổ của plasnunogen tPA được giải phóng trong tế

bảo mảng trong của thành mạch và ở té bao gan cũng tăng lên khi có mặt ñbrinaza

I0]

13 Các vì sinh vật có khd nang sinh tong hop enzyme fibrinaza

Các vi sinh vat có khả năng tao ra enzym thủy phân co chat fibrin bao gém vi

khuẩn, xạ khuẩn va tao Streptomyces megasporus SD5, được phân lập từ suỗi nước

Khoa Công nghệ Sinh học 16 Lớp cao học k810

Binh Thi Thu Ts

nóng có thể cho enzym fibrinaza có khả năng chịu nhiệt Một số loại nắm cũng cho

thấy có thể sinh ra proteaza cỏ hoạt tính fbrinaza cao, ví dụ như Aspergillus ochracens 513, Fusarium oxysporum, Penicillum chrysogenum, Rhizopus chinesis 12, Ngoai ra Matsubara cùng các đồng sự (1998, 1999, 2000) đã tìm thầy hoạt

tinh fibrinaza trong tao bidn Codium divaricatum va Codium intricatum [27]

Bằng 1.1: Vì khuẩn Bacilius sp phần lập được từ một số thực phẩm

lên men truyén théng [27]

Bacillus natio Natto, Nhat Ban Nattokinase

B amyloliquefaciens DC-A | Douchi, Trung Quốc Subtilisin DEF

Bactlhus sp CK Chungkook-jang, Han Quée | CK

Bactllus sp DI-4 Doen:jang, Hàn Quốc Subtilisin DJ-4

Bacillus sp DI-2 Doen-jang, Hàn Quốc bpDI-2

Racillus sp KARR Jocl-gal, Han Quốc Enzym joct-gal

Bacillus subtilis QKO2 Dâu nảnh lên men QK-I và QK-2

‘Vi sinh vat được nghiên cứu nhiều nhất vẻ khả năng sinh enzym fibrinaza đó

là loài Baeiffus Loài Racilfuz tông hợp ra fibrinaza đã được tìm thấy lẳn đầu tiên bởi Sumi và cộng sự vào năm I9§7 tử nallo Tương tự một số vi khuân khác được

phát hiện có khả năng sinh tổng hợp fibrinaza, cluing bao gim Bacillus amyloligusfueienz DC-4 tù một loại thực phầm làm từ đậu tương lên men có xuất sử

từ Trung Quốc tên là donehe, Bacillus sp CK tir nde chim đậu nành lên men của Hàn Quốc cỏ tên 4 chungkook-jang, cde chting Bacillus sp DJ-2 va DJ-4 tit mén doenyang va Bacillus sp KA38 ur cA muén lén men cé tén 1a jeot-gal cling ciia

Han Quéc [27]

Binh Thi Thu Ts

Các chủng ví sinh vật có khả năng tổng hợp fibrinaza đều được phân lập từ

đậu tương lên men như natto, douchi hay chungkook-jang

Ö Việt Nam, tương là sản phẩm lên men Iruyễn thống tử đậu tương rật được ưa

chuộng, Đã cỏ nghiên cửu của Đăng Thu Hương và Nguyễn La Anh (2005) về các

chủng, vi khuẩn phân lập tử Tương Bản có hoạt tính fibrinaza Nguyễn Lan Hương

vả cộng sự đã phân lập được 11 chủng vi khuẩn cỏ hoạt tính fibrinaza cao từ trong,

Subtilisin |M=28kDa,pI=8 pIi=6+z l0 Co chất tốt nhất lá

DFE pH=9,0,t=48 — t<S0trong 60 phot UPtilisim, khong: phan

trủy đông máu

CK M 28,2kDa, pH pH=7: 10,8 Co chal plasmin hoại

10 t<50 trong 60 phat HÀ cao gấp 8 lan

=1 fibrinaza của subtilisin

T=70

Carlsberg

Subtilisin | M-29ka, pH-l0, pH-4-I1 Tloat tinh fibrinaza cao

QK:2 t=55 trong 30 phút cơ chất là subtilisin

BK- I7 M-3I kDa Sử dụng phân lớn các

cơ chải

AMMP M= 21kDa; pH= 6, Tu tiên thủy phân chuỗi

=33 Aa fibrinogen trước

chudi BB vay

Tir Bacillus | M= 45kDa; pH= 7, pH=7-9 Có giá trị Km thấp khi

sp KDO-13 | t=60 t=50 phân giải fibrin

Từ M'ISkDa pH pH 68-88 Phân giải fibrin cing

Rechinensis | 10,5: 1-45 (-37 trong 24 gid đồng thời phản chúa các

chuỗi œ, B và y của fibrinogen

thường rất đất so với Ihu nhập của người dân Việt Nam Hơn nữa, nước ta voi

Enzym Íïbrinaza đã chứng lỏ là có tác dụng lâu dài hơn các thuốc chống đông, máu khác từ 8 đến 12 giờ bôi hai cơ chế tảc đụng: vừa ngăn ngửa sự đồng máu và

'vửa làm tan cóc khối máu đã đông,

Tiền sĩ H 8umi và các cộng, sự của ông đã thực hiện một thí nghiệm trên chó

để chúng mình điều này Họ đã tạo ra các cục đông máu trong cơ thể chó và sau đỏ cung cấp một lượng enzym fibrinaza vào cơ thể chúng bằng được miệng Phim chụp X-quang của những thành mạch máu đã cho thấy những con chó đã được uỗng

thuốc chứa fibrinaza đã trở lại tinh trạng vận chuyển máu trình thưởng (không củn những cục máu đồng) sau 5 giờ xử lý Trong khí đỏ, các cục máu đông trong cơ thể những con chó không được bể sung fïbrinaza vẫn hoản toàn kiiông có đấu hiệu hòa tan 18 giờ sau đỏ [33]

Các nhà nghiên cứu của phòng thí nghiệm nghiên cửu công nghệ sinh học thuộc công ty Dược phẩm JCR, Eơbc, Nhật Bản đã thử nghiệm thành công vẻ khả năng hòa tan các mạch mảu nghèn trong động mạch chuột bằng enzym fibuinaza

Những cơn chuột được xử ly bang enzym fibrinaza đã đạt được tốc độ đòng chảy của máu lä 62% trong khi xử lý bằng plasmin chỉ đạt 15,8% [16]

Môt nhỏm các nhà nghiên cửu khác từ trường Dạt học Oklahoma (Mỹ) vá trường Dược Miyazaki (Nhật Bản) cũng làm những thử nghiệm về hoạt tính thủy phân fibrin trên 12 người tình nguyện viên khỏe mạnh (6 ram và 6 nữ ớ lửa tuổi từ

21 đến 55) và cíing cho kết quả lương tự như các thỉ nghiệm đổi với động vật [27]

Đặc biệt, tại trường Đại học Tottori (Nhật Bản), người ta đã sử dụng enzym fibrinaza nh la mal loại thực phẩm chức năng để chữa các bệnh do chứng nghẽn

mạch mắn gây ra ở ving day mỗi Các bệnh nhân nảy đếu để bị mủ sau khi cáo cục

Binh Thi Thu Ts

mau déng cn tré sw luan chuyển máu và lâm yếu các đây thản kinh của mắt Sau

10 ngày sử đụng cozym fibrinaza, các bệnh nhân nảy đã lấy lại đuợc thị lục và

không có một dấu hiệu bắt thưởng nao được quan sat sau 2 thang,

Gân đây, một nhóm các nhà khoa học người Hàn Quốc và Thái Lan cũng có công bố rêu một loại ran quả bản xứ của Thải Lan có chúa enzym thủy phản fbin Những loại rau nảy được đảnh giá là có khả năng chống oxy hóa cao Tử kết quả đỏ,

họ đưa ra khuyến cáo cho người dân ở đất nước đang có tỷ lên những người mắc các bệnh vẻ tim mạch gia tăng một cách nhanh chóng nh Thái Lan nên bố sung thực phẩm trong khẩn phân ăn hàng ngày tuy nhiên việc nắu rau chín quá 10 phút ở 100°C sẽ làm mắt hoạt lịc enzyme [38]

Cáo nha khoa học tại hai trường Dại học của Nhật Bản là Miyazaki va Kurashiki cũng đã nghiên cứu những ảnh turởng của cnzym ñbrinaza đối với huyết

áp ở cả người và đông vật Thí nghiêm trên chuột cho thầy huyết áp tâm thu đề piảm từ 166mmHs xuống còn 145 nưnHg chỉ sau 2 giờ đưa enzym fibrinaza vào cơ

thể chuột vả tiếp tục giảm cén 144 mmHg san 3 giờ, trung bình đã giảm được 12,7% Thí nghiệm đổi với người được thử với 4 tỉnh nguyện viên có bệnh huyết áp

cao Huyết án tâm thu của họ đã giảm từ 173,8 + 20,5mmnHe xuống 154,8 + 12,6 và

huyết áp tâm trương giảm từ 101,0L 11,4 mmlig xuống còn 91.2L 6,6 Như vậi

năng đồng này Mới đây, các quốc gia phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Hản

Quée, Singapor, Thai Lan cũng bắt đần quan tâm đến lĩnh vực được phẩm và thực

công ty Dược Sao Thái Dương, hay Nattospec của Dược phẩm Á Âu, Nattotech của

DETECH Tuy nhiền, nguồn enzym phân lớn vẫn nhập th Mỹ và Nhật Bản với giá

khá cao Do đó việc hoàn thiện nghiên cứu sản xuất fibrinaza từ nguên vi sinh vật

có ý nghĩa rất lớn trong việc chủ động nguồn enzym dùng để sản xuất các sản phẩm thực phâm chức năng chủa fibrinaza có tác dựng hỗ trợ và phòng chống các

bệnh lìm mạch

1.5 Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tao ching tal td hop

Các protein hay enzyme được lao ra trong tế bảo chỉ ở mức vừa đủ và cần phải được xử lý sau địch mã, có vậy chức năng của protcin mới được đám bảo và sinh lý của tế bào hay sinh vật mới được đuy trì ở trạng thái bình thường Do chủ được tạo

ra với hàm lượng rất thấp nên việc tình chế protein/enzym nội bảo thường khó khăn,

điều đó đưa giả thành sản phẩm lên rất cao

Một trong những liệu pháp để khắc phục sự thiếu hụt đó là sử dụng công nghệ

DNA tái tổ hợp Công nghệ nảy về lý thuyết cho phép con người tạo ra bất cử

protein nảo với một lượng không giới hạn

Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn những đoạn DNA có ngnễn gốc khác nhau vào trong vectz tách đỏng Những vector tach đỏng mang DNA tái tổ hẹp này có thể biểu hiện thành các protern lái tổ

Vector tách đồng phải có nhiễu điểm cắt đặc hiện duy nhất cho các loại enzym

giới hạn khác nhau, đẳng thòi mang các gen chỉ thị (chỉ thị màu hoặc chỉ thị Kháng

sinh) để dễ đàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp [4]

- Nguyên tẲc chon vector tach dong

Tach dong gen là một quá trình phức tạp, gồm nhiễu giai đoạn, mỗi giai doan

phụ thuộc nhiều yếu tô khác nhau Chọn vector tách dòng thích hợp có vai trò quyết định sự thành công hay thất bại trong tách dòng gan Để đảm bảo tách dòng gen thành công, khi chọn vector tách đồng cân chủ ỷ một số nguyên tắc:

Dựa vào kích thước và bản chất của đoạn DNA cân tách dòng lảm cần cứ chon vector Niên đoạn cải DNA có nguồn gốc từ gen của sinh vặt prolzaryod có thể chọn

plasmid, phage, comid, lam vector tách đàng, tùy thuộc kích thước của đoạn cài

DNA Sử đụng đoạn cài DNA có nguồn gốc lử các gen sinh vật bậc cao cân chọn

veclor lách đồng là phago, nhiém sắc thể nhân tạo nấm mnen, virus [4]

Khi chọn vector tách dòng cẩn lưu ý đến sụ tương đồng các vị tí cất đặc hiệu của các enzym giỏi hạn giữa đoạn cải DNA và vector tách đông, Nghĩa lá đoạn cái DNA vả veetor tách dòng phải có các vị trí cất đặc hiệu của củng một loại enzym

giới hạn (để đảm bảo quả trình cắt và nỗi doan DNA vao vector tach dang dé dang

Biển hiện gen tao sản phẩm protein tải tổ hợp là kỹ thuật quan lrọng, quyết

định sự thành bại của kỹ thuật gen Hệ thẳng các tẻ bào chủ thường được sử đụng, trong biểu hiện gen gồm: tế bao vi khuan, té bao nam men, tế bảo trứng động vật có

vú và Baewlovius Trong đó phổ biên tế bảo chủ phổ biến và ưa chuộng nhất trong, biểu hiện gen do 1a vi Khudn 2 coli

Mét sé uu didm khi chon 2 cof lam té bao cha

~ Vi khuẩn E cøk có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện prolcin lải

tổ họp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cây ở điển kiện thích hợp đã có sản phẩm prơtei

tái tổ hợp Khả năng tạo sản nhắm gen cao từ 50mø/1 đến 500mg/L

- Biểu hiện gen trong tế bảo E cøk có thể giảm được các chỉ phi cho công, nghệ và hóa chất, nên giá thành sản phẩm hạ

- Câu trúc bộ gen E cofi và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối day

đủ, tạo rên nhiều thuận lợi khi biểu hiện protein tái t hop 6B coli

Cá rất nhiều chẳng vi khuân Z coi được sử đụng trong biến hiện gen, trong

đó chủng Z coi? BL21 la một trong những chủng 7 coi được ua chuộng và sử

đụng rộng rãi đề triểu hiện các loại gen khác nhau [4]

15.3 Các nghiên cứu về chủng tái tế hợp

s#*ˆ Gen mã hóa ensym fibrinaca

Theo Nakamura và cộng sự thỉ gen mã hỏa enzym ñbrinaza của chủng -Baeiflus natto (aprN) có độ dài khoảng 1473 bp Trong đỏ vừng mang mã di truyền

bat dau bằng bộ ba mở đầu GTG, liếp theo là khung đọc mã mở (ORF- Open

reading frame) với I143 mncleolid và cuối cùng là kết thúc bằng ba bộ ba TẠA

TAG TAA [25]

Binh Thi Thu Ts

Doan gen này mã hóa cho chuỗi polypeptid gồm có 29 axit amin ở chuỗi tin

higu, 77 axit amin ở chuỗi propcptid (dạng không hoạt động) và 275 axit amin & chuỗi paptid (đạng hoạt động có hoạt tính enzym) [25]

+k Một số nghiên cứu tạo chủng tái tỄ hợp mã hóa enzym ftbrinaza biên có

Trang vài nắm gân đây, trên thể giới, đặc biệt là các nước Châu Á đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm tạo chủng tới (6 hop mang gen ma héa cnzym fibrinaza Doan gen can tach ding thudng đuọc tách từ các chủng vỉ sinh vật phân lập từ các

sản phẩm lên men truyền thông

Bằng 1 Mật số nghiên cứu tạo chủng tái t hợp mang gen mã hóa Ñbrinaza

VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN COU

TL1 Nguyén vật liệu, hóa chải và thiết hị sử dụng

111.1 Chũng tỉ khuẩn

Chúng vi khuẩn được chọn để tiễn hành các thí nghiệm cỏ:

~ Chủng MI, N, V là những chủng vi khuẩn được phân lập từ Natto Nhật Dản

- Cáo chủng T16, T19, T2l, T23, T26 là 5 chủng phân lập được từ trong Bân của Việt Nam

iy eeare 2EEn cm

Các hóa chất sử đựng cho để lài

Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Taq DNA polymerase MBI Fermentas (M@)

dNTP MMI Fermentas (MY)

Các loại cnzym giỏi hạn MBI Fermentas (My)

Td ligase MBI Fermentas (MY)

Peptone Merck (Bure)

Proteinase K Đức Cloruatrom Merck (Die) Isoamyalcohol Merck (Dito)

Tris base Merck (Dro)

Tris HCL Merck (Dire)

SDS (Nata dodecyl sulfat) Merck (ito)

+ Máy điện đi (Mỹ)

+ May soi gel UV, Bio-Rad (MY)

- Lay một vòng que cấy aạt 3-4 lân trên mặt thạch ở một góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cây từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng,

với các đường trước Lặp lại theo một hướng tht ba dé pha Jong hon nữa phan vi Ehuẩn dính trên que c¿

- Đặt vào nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để chơn ra các khuẩn lạc mọc riêng rổ

~ Tiên hành quan sát các khuân lạc này từ các phía (Eừ trên xuống, từ bên cạnh),

chủ ý vẻ kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dang mép, bé mat, d6 day, co nom hay không, độ trong, mảu sắc (trên, đưới, có khuếch tản ra môi trường, hay không)

++ Quan sát hình thái tễ bào

Tién hanh quan sal hink thai 1é bảo bằng phương pháp nhuộm Gram:

- Nguyén tắc: phương pháp nhuộm Gram đựa trên khá rằng bŠt màu của tế

bảo chất và màng tế bảo với thuối nhuộm tim kết tỉnh và iot mà hính thành nên hai loại phúc chất khác nhau

- Loại phức chất thứ nhất vẫn còn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử ly bằng côn Vi sinh vật có phức chất nay thuộc loại gram

dương

Loại phức chất thứ hai không còn giữ được mảu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng côn và bắt máu của thuốc nhuộm bỏ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm

- Cách tiến hành:

Binh Thi Thu Ts

Nhỏ 3l nước cất vô trùng lên phiền kinh sạch, đừng qne cấy vô trùng lây mật

phần nhỏ khuản lạc mọc riêng rễ trên đĩa petri chơ vào giọt nước, đản đêu vả để khô

Ho phiến kinh qua ngọn lửa đèn còn 3 lần để cố định vét bồi Sau đó nhuộm với tim trong 1 phút, rủa nước Tiếp tục nhuộm với dung dịch lugol trong 1 phút rồi trang nước Tẩy cổn 30 giây Cuỏi cùng nhuộm với fuchsin 1 phút rồi tráng nước, đề khô

và tiễn hành quan sát dưới kinh hiển vi ở vật kính 100x

Binh Thi Thu Ts

4.2.3 Phwong phdp héa sink

112 3.1 Xác định hoại tính bằng phương do ving thủy phân

s# Nguyên tắc:

Fibrin bi kết tủa bởi axit triclaaxelie (TCA), còn các sản phẩm thuỷ phân của

axit thủ không bị kết tủa, vi vậy khi fïbrinaza thuỷ phân fibrin sé quan sat thay vòng,

thuỷ phân trơng trên nên Irắng đục của hộp thạch có chủa fibrin khí để TƠA vào

# Tiên hành

1: 30 ml mai inrdng fibrin 0,4% bang dng đong bễ sung 0,6g agar ( 2%), dum

bằng lò vì sóng (hoặc bếp) Đỗ toàn bộ vào hộp pctri nhựa, khí bể mặt thạch đã khô tiến hành đục lễ, đường kinh mỗi lỗ thạch lá 7,5mm

Hủi 10001 địch cnzym vào các lỗ thạch chú ý không được hút trần ra

ngoài San đỏ để ở 37°C Irong 18 giờ rồi lây ra Đỗ TCA láng một lớp trên bê mặt thạch Dễ 30 phút rồi đỗ TCA trên bể mặt đi Dem quan sát đường kính vòng thuỷ

phân Hoạt tính enzym được so sánh dựa trên đường kinh, hoặc diện tích của vòng thuỷ phân

Kết quả

Công thức tính điện tich vòng thuỷ phân:

§=3,14*(D3⁄4 7,574) (mm?)

Trong đỏ: D- đuờng kính vòng thuỷ phân (mm)

8 - diện tịch vòng thuỷ phân (mm”)

11.2 3.2 Xác Äịnh baạt tính bẰng so mẫu

+ Nguyên tắc:

Fibrinaza trong điều kiện thích hợp vẻ nhiệt độ và pH (37C và pH= 7,4) sẽ

phân cắt các fibrin không tan thành các phân tử peptit ngắn hơn, có khả năng hòa

tan trong dung dịch

Binh Thi Thu Ts

mẫu đã pha loãng (100 lẳn) Dễ phản ứng trong lh ở 37°C rồi thêm tiếp 1ml TCA

để đình chỉ phản ứng Dem li tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút

1Iút lẫy địch trong đề tiến hành so mâu

Mẫu kiểm chứng

Che vao dng phancol 500ul dung dich fibrin va 1,3ml dung dich dém Tris-HCl

Đổ ở nhiệt độ 37° trong 10 phút rồi thém Il TCA 1,5M Thém tiép 200pl dich

enzym mẫu đã pha loãng Để trong 10 phút rồi tiễn hành tương tự như đối với mẫu

thí nghiệm

& Tiến hành sa màu

Lấy 1ml dịch trong để ly tâm ở bước trên vào ông nghiệm sạch thêm vào 5ml

Na:CO; 0,5M khuấy đến liên tục vả cho thêm Iml thuốc thử fahn 0,1M Dễ yên

hỗn hợp phản ứng trong 20 phút Sau 20 phút tiền hảnh đo cnờng 46 mau của dung dich trén may so mau 6 bude séng 660nm

Dung deéng chudn Tyrasin Muén tỉnh được hoat 44 clia enzym fibrinaza phải xây đựng đường chuẩn theo

tyrozin, rỗi sau đó dựa theo đường chuẩn này mà tính đương lượng tyrozin, túc là

mật độ quang cỏ được của lug tyrozin trong Iml đung dich tyrozin chuẩn

Phuong pháp và cách xây đựng đường chuẩn được thể hiện ở phụ lục Chúng tôi xác định được đường chuẩn để tính toán có công thức nữtu sau:

60- Thời gian điễn ra phản ứng (phủU)

Au- Giá trị OD của mẫu thí nghiệm

Age Gid tri OD ctia miu kiểm chứng

0,2- rong Enzym ding phan tmg (ml)

0,0152- Dộ tầng độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ứng với lăng nồng độ

tyrosine 1 pg/ml

1L3.3.3 Dịnh tên chủng vi khuẩn béng kit APE SOCLIB cha hing bioMérieux

APT 50 CHB due ding dé xac dinh Bacillus va céc chi liên quan Hộ Kit nay

là một môi treémg pha sfin cho phép 1én men 49 carbonhydrat trên bắng APT 50 CHB đã được nghiên cửu Trong quả trình phản tíng, carbonhydral sẽ được lên men tạo thành axit ~? làm giảm pH và thay đổi màu sắc chất chỉ thị Các kết quả sẽ cho

biết các thông tìn sinh hỏa vả sử đụng, phần mễm nhận dạng, đề xác định tên chúng,

Thành phần môi trường API 50CHE (10ml)