Luận văn thạc sĩ xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khảm hướng Đích cd19 Để Điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử nghiệm hiệu quả in vitro

Dễ hướng tới việc ứng dung liệu pháp CAR-T trong điều trị ALL tại Việt Nam, nghiên cứu này đã được tiền hành với các mục tiêu cụ thể sau: ¡ Xây đụng các cầu trúc biếu hiện thụ thể khán

TRUONG DALIIOC BACII KIIOA IIA NOI

LUAN VAN THAC Si

Xây dựng các cấu trúc biểu hiện thụ thể

kháng nguyên khẩm hướng dich CD19 dé

điều trị lơ xê mi cấp dòng lympho và thử

nghiệm hiệu quả in viro

NGUYÊN THỊ PHƯƠNG THẢO

Thao.NTPCA190017@sis.husteduyn

Nganh Céng nghé Sinh hoc

Giảng viên hướng dẫn: TS I.ê Quang Hòa

Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm

TIA NỘI, 10/2021

Chủ ký của

GVIID-CỘNG LIÒA XÃ LIỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập — Tự đo— Hạnh phúc

BAN XÁC NHẬN CHÍNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

‘Ho va tén tac giả luận văn: N, jguyén Thi Phuong Thao

Dé tai nan vin: dựng các cầu trùc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khám hướng dích CD19 dễ diễu trị lơ xế mi cấp dòng, lympho và thử nghiệm hiệu quả

Nội dung Hội đẳng

yêu cầu chỉnh sửa Phần viết tắt, nên tách chữ viết tắt, chữ Đã chỉnh sửa phần viết tắt báo gồm tách chữ viết

tiếng Anh và dịch tốt chữ Tiếng Anh va dich Tiếng Việt thành 3

tiếng Việt thành 3 cộtkhác nhautrong danh mục viết tất, trang xiii

khảo trong Bảng - Dã bố sung tài liện tham khảo cho các thẳng

này, tin có trong Đăng nảy,

STT Nội dung Hội đồng,

yêu cầu chỉnh sửa

Tổng quan về ALI,

viết sọn lại hơn nữa,

có thê bỏ phân phân

Tải liệu tham khảo

can bé sung tài liệu

tiếng Việt về số liệu

mắc ALL và xem lại

cáo sử dụng thông

tin trên website

Phản hồi của học viên

Đã chỉnh sửa phẩu Tống quan vé ALL bao gom:

- Loại bỏ phần phân loại chỉ tiết của ALL, chỉ

nhắc đến tiêu chuẩn phân loại (tế bảo, miễn địch

vả sinh họp phân Lử) rong Chương 1, mục 1.1.4, đòng thứ 3 từ đưới lên, trang 4

- Đã mô tä về liệu pháp diễu trị nhằm dích trong,

Chương 1, mục 1.1.5, dòng thứ 3 từ dưới lên của

trang 5 đến dòng thử 7 từ trên xuống của trang,

6

- Dã bỗ sưng thông tin về số liệu mắc ALL, của Viên Huyết học “Truyền máu TW và Bệnh viện Truyền máu Huyết học trong chương 1, mục

1.1.1, dòng thử L9 — 23 từ trên xuống, trang 3

- Cách sử dụng thông tin trên website trong tải liệu tham khảo trong luận văn đúng với hướng

đẫn thủ tục bão vệ luận văn thạc sỹ (Áp dụng cho

các học viên báo vé tu thang 01/2020) do Phong

đào tạo thông báo quy dinh ngay 15/01/2020

+ Tai liệu tham khảo số 33, trong chương 1, mục

1.1.5, động thứ Ø tr đưới lên, trang 7

~ 'Tải liệu tham khảo số 47 vả 55, rong chương

3, muc 3.1, dong thir 7 tir trên xuống, trang 40

cy Nội dung Hội dẳng

sr yêu cầu chỉnh sửa âu cầu chính sũ Phản hồi của học viên

Giáo viên hướng dẫu

'T5 Lê Quang Hòa

+ Tai liệu tham khảo số 31 cho Hình 1.1, trong

Ngày 18 tháng 11 nấm 2021

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Phương Thảo

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG

PGS TS Tả Kim Anh

mĩ

LOI CAM DOAN

Tôi lá Nguyễn Thi Phuong Thao, học viên cao học khoá 2019A,, nã số học viên: CA190017, Trường Dai hoc Bach khoa Ila Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan

1 Đây là luận vẫn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng đẩn của

‘TS Lé Quang Léa

3 Công trình này không trùng lắp với bất kỳ nghiên cửu nào khác đã được

công bổ tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tĩn trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trưng

thực và khách quan, dã dược xác rhận và chấp thuận của cơ số nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật vẻ những cam kết này

Học viên Nguyễn Thị Phương Tháo

LOT CAM ON

cm xin bảy 1ô sự kính trọng vẻ lồng biết ơn sâu sắc tối T8 Lê

Quang Hỏa, người thay đã hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em trang quá trình

trghiên cứu và hoàn thành luận văn nay

Tm xin bảy tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS Tran Thanh Từng, Th8 Phạm 'Tiển Dũng củng các em sinh viên đang học tập và nghiên cứu tại các phòng thi

xrghiệm 306-B1 dã giúp đỡ cra trong quá trình thí nghiệm:

Đặc biệt là em xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ đã cấp kinh phí cho để tải “Nghiên cứu ửng dụng liệu pháp tế bào CAR-T trong điều

bạch cầu nguyên bảu Iympho cấp”, mã số: KC10/16-20 dé em có thể hoàn thành được nghiên cứu này

Tâm xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc đến gia định và những người thân đã luôn

ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho em lrong suối thời gian học tập

TOM TAT NOI DUNG LUAN VAN

Bénh lo xé mi cấp dòng lympho (AL.L) là một trong những bệnh tụ thự

'phổ biến nhật ở trẻ em trên thê giới So với liện pháp điển trị sử dựng kháng thé

dơn dòng, ngoài tính hưởng dịch cao, liệu pháp CAR-T có ưu diễm vượt trội là

cho phép điền trị hiệu quả ngay cả khi các liệu pháp điều trị khác đã thất bại I.iệu

pháp CAR-T đã được cấp phép để điều trị ALL ở Mỹ từ năm 2017 Dễ hướng tới

việc ứng dung liệu pháp CAR-T trong điều trị ALL tại Việt Nam, nghiên cứu này

đã được tiền hành với các mục tiêu cụ thể sau: (¡) Xây đụng các cầu trúc biếu hiện

thụ thể kháng nguyên khăm hướng dich CD19; (11) Thử nghiệm hiệu quâ in vitro của khối tế bảo CAR-T hưởng đích CD19

Các kết quả nghiên cứu thu được trơng luận văn này là đã xây đựng thành công

cấu trúc CAR-T hướng dich CD19 thé hé thú hai (CDISRCD137/pS) và thể hệ thứ

tư(CAR19-iCasp9-TL15/pSE), đã hoàn thiện được quy trinh tạo khối té haa CAR-

T như sau: sau khi dược phân tách bằng phương pháp ly tám tỷ trọng với Eicoll-

Paque va được hoạt hóa bằng bị từ DynabeadsTM Human T-Aetvator CD3/CD28,

2x10? PBMC được chuyễn nạp bằng hỗn hợp chứa I jag mRNA SB100X va 10 pp

plasmid pSB trén hé théng xung điện Amaxa 4Ð Nueleofecler; động tế bảo

CAR-T sau chuyển nạp được tăng sinh đặc hiệu với sự có ruặt của tế bào trinh điện kháng nguyên nhân tạo aAPC 1D2 đã được chiều xa (tỉ lệ CAR-T:aAPC là 1:2) và IL2 (50 U/mL) trong 28 ngay (7 ngày Bay môi trường một ti) Kết quả cho các

áo CAR-T dạt mức xấp xỉ 2,5-5x1 0°

† quả thử nghiệm iø viro cho Đây khối tế bào CAR-T: a có khả năng điệt các té bảo ung thư Daudi và aAPC 1D2 (CD19”) từ 70-80% ở tỷ lệ CD19?:CAR-

T cao nhất là 1:10, (ID có khả năng sinh các cytokine tiển viêm khi đẳng tụ

với các dòng tế bào ung thư CDI9! (31 ngímL, đổi với 1L2, 210 ng/mL

TEN-y và 64ngáuL đôi với TNF-a); (iii) có khả năng tăng sinh khi dòng nuôi cây

với tế bào Dandi và aAPC 1D2; fix) AP20187 ở nông độ 20 niM giúp điệt trên 97%

tế bào CAR-T thế hệ thứ Lư, mở ra khả nắng kiểm soát sự tăng sinh của tế bào

CAR-T trong cơ thẻ người bệnh

HỌC VIÊN

Ký và ghí rõ họ lên.

MỤC LỤC MUC LUC

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MUC BANG BIẾU

DANH MUC VIET TAT

ĐẶT VĂN ĐẺ

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN

1.1 Bệnh lơ xê mi cấp đông lympho (ALL)

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của liệu pháp tế bio CAR-T 8

1.2.3 Cac thé hé té bao CAR-T - 11

1.3 Quy trình công nghệ sân xuất tễ bào CAR-T trong điểu trị A11

1.3.1 Thu tế bảo đơn nhân máu ngoại vi (FBMC) và làm giản quân thể tế

1.3.2 Kích hoạt tế bảo ”L cu eeeeeirere saseese, T4

1.3.3 Chuyển gen tạo tế bào CAR-T áo, TẾ 1.3.4 Tăng sinh tế bào sau chuyển gen seceeeoieoaao TR

1.4 Thử nghiệm lâm sảng sử dụng liệu pháp CAR-T cho bệnh nhân mắc bệnh ALL

1.5 Tỉnh an toàn của liệu pháp té bao CAR-

1.6 Cách tiếp cận, tính mới, tính sáng tạo của đề tả

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

22 Phương nhân nghiên cứu

2.1 Phương pháp xây dựng các cấu trủc CAR-T hưởng dịch CD19, 28

„ Đảnh giá khả năng sinh các cytokin của khối tế bảo CAR-T khi đồng

3.2.6 Đánh giá khả răng kiểm soát tế bảo CAR-T bằng chát cảm ứng dimer

3.2.7 Phương pháp xử lý sẻ liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng dích CD19 dễ diều tri lo xế mí cấp

3.1.1 Tổng hợp gen nhân tạo cầu trúc CDi 9RCD137 - 40 3.1.2 Téng hợp gen nhân tạo cấu trúc iCasp9-TL15 41 3.1.3 Xây dựng vector biểu hiện câu trúc CDISRCD137/pSB (CAR-T thế

3.2 Hoàn thiện quy trình tạo tế bào CÁR-T

3.3.2, Banh giả khả năng ting sinh và sự biểu hiện CA của các khối tế

ý với sự có xnặt của lế bảo trình điện kháng nguyên

3.4 Thử nghiệm hiệu quả diệt tẾ bao ung thu, kha ning sink cdc cytokine va

ébao CAR-T hướng đích CD19

3.4.2 Danh giá khá năng sinh các cytokine ctia té bao CAR-T thé hé thir hai khi dang nuôi cdy vei cae déng 1é bao ung ther CD19 55

3.4.3 Danh gid kha nfing ting sinh cia cac té bao CAR-T thé hé th hai va

thế hệ thứ tư khi đồng nuôi cây với các đong tế bảo ung thu CD19 ST 3.4.4 Danh gia kha nang kiém soat té bao CAR-T thẻ hệ thứ tư bằng chat

cảm ứng đimer hóa AP20187 ào 1 SD

1 Trình tự thiết kế của câu trúc CDI9RCTH37

2 Trình tự thiết kế của cầu trúc DGK-IL1S-P2A-iCasp9-T2A-Blas

3 Trinh ty cac oligonucleotide dé téng hợp gen cấu trúc CDI9RCD137 67

4 Trình ty các oHgonuclcodde để tổng hợp gen cấu tric PGK-HL15-P2A-

iCasp9-T2A-Blas

š Kết qúa giải trình cầu trúc CD19RCDI37

6, Kết quả giải Lrình tự câu trúc PGK-H.15-P2A-iCasp9-T2A-Blas,

TẢI LIỆU THAM KHẢO

ĐANH MỤC HÌNH VẼ

Tình 1.1 Quy trình sẵn xuất tế bào CAR-T 7 Hinh 1.2 Câu trúc chung của thụ thể khăm trén té bao lympho 10 Tình 1.3 Câu trúc của bến thể hệ tế bàn CAR-T 11 Hinh 1.4 Cơ chê hoạt động của hệ thông Sleeping Beauty - - 17 Hinh 2.1 Sơ đồ cấu của voclor pSB - 29

Tình 2.3 Chiến lược thiết kế và xây đựng các câu trúc CAR-T hướng đ dich CD19

30

Tlinh 2.3 Sơ đồ nguyên tắc phương pháp tổng hop gen gapless PCR 31

Hình 3.1 Kết quả điện đi sản phẩm “full length PCR tang họp gen nhân tạn cầu

1Iinh 3.2 Kết quả sảng lọc các khuẩn lạc mang plasmid pletl.2-CD19RCD137 41

Tĩnh 3.3 Kết quả điện đi sản pham “full length” PCR tang hop gen nhân tạo cấu

true iCasp9-IL15 " -

Hình 3.4 Kết quả sảng lọc các khuẩn lạc mang plasmid pJetl.3-iCasp9-IL]

Hình 3.5 Kết quả điện di sân pham cat plasmid pSB bing Ncol va Xbal Hình 3.6 Kết quả sảng lọc các khuẩn lạc mang plasmid CDISRCD137/pSB 44 Hình 3.7 Két qua dign di sin pham cat plasmid CD19RCD137/pSB bang Pmll va

Hình 3.8 Kết quả sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid CD19RCD137-iCasp9- IL15/pSB (CAR19-iCasp9-IL 1 5/pSB) - 45

Hinh 3.9 Ảnh hưởng của lượng PBMC được sử dụng trong một lần chuyển nạp

đến hiệu quả biểu hiện CAR ở tế bào T (n=3) 4 Tlinh 3.10 Tôi mn hóa lượng plasmid CD19RCDI 37/pSB cho một lần chuyển nạp

CAR-T thế hệ Qui hai va thé hé thứ tru 3) 49

Hình 3.12 Tỉ lệ tế bào CD3† biểu hiện CAR sống sau chuyên nạp với các câu trúc

plasmid CAR-T thế hệ thứ hai và thê hệ thứ tư (n=3) 50

Hinh 3.13 Số tế bào sống CD3' khi lăng sinh với IT.-3 (n—3) 30 Hinh 3.14 Sự tăng sinh của tế bảo CAR-T thê hệ thứ hai và thế hệ thứ tư theo thời

gáy tăng sinh trên các dòng tế bao CAR-T se 3A

Hình 3.17 Tí lệ tế bảo K562 bị ly giái sau 6 giờ đồng muôi cây với PHMC hoặc các khối tế bào CAR-T thể hệ thứ hai và thế hệ thứ tư 54

Tình 3.18 Ti 18 1 bao Daudi bi ly giải sau 6 giờ đồng nuôi cấy với PBMC hoặc

các khối tế bào CAR-T thế hệ thứ hai và thê hệ thứ tư - - 54

Hình 3.19 Tí lệ tế bảo aAPC 1D2 bj ly gidi sau 6 giờ đồng, nuồi cây voi PBMC

hoặc các khối tế bảo CAR-T thể hệ thứ hai và thể hệ thủ tư 35

Hình 3.20 Nong d6 IL-2 trong dịch nuôi sấy rà của tế bào CAR-T và PBMC với các

đông tế bảo ung thư, - 56 Hinh 3.21 Nông độ TEN-y trong địch nuôi cây của tế bảo CAR-T va PBMC vii các dòng tổ bao ung thir 56 Tlinh 3.22 Néng d¢ TNI-a trong địch nuôi cây ata té haa CAR-T va PEMC vai

khí đồng nuôi cây với tế bảo CD19* - 38

Hình 3.34 Khá năng tăng sinh của tế bảo CAR-T thể hệ thứ hai vá thể hệ thứ tư

*hi không có sự hiện điện của tế bảo CD19* - 38

Tình 3.25 Ảnh hưởng của nắng độ chất cảm ứng AP20187 din kha ning kiểm soái của tế bào GAR-T thể hệ thứ tư - - 60

xi

DANH MỤC BẰNG BIẾU

Bang 1.1 Phương pháp tăng sinh CAR-T

Bảng 1.2 Một số thử nghiệm lâm sảng sử đụng CĐ19R CAR-T điều trị ALL

Bang 2.1 Trinh ty cae oligonucleotide dé khuéch đại và sàng lọc

Bang 2.2 Thanh phan phân ứng overlap PCR

Bang 2.3 Thanh phin phan ting full length PCR

Tảng 2.4 Thành phần phần ứng

Bang 3.5 Thành phẩn phân ứng nổi

t san phan PCR va vector

Bảng 2.6 Thành phẩn phân ứng PCR sang lov gon muc liều

Bảng 27 Bảng chủ trình nhiệt của phân ứng PCR sang low

33

34

234

DANH MUC VLE’

Từ viết tắt | Tên đây đủ bằng tiếng Anh in day đủ bằng tiếng Việt

aAPC artificial Antigen Presenting - | Tế bảo trình điện kháng nguyên

Call nhân tạo

ALL Acute Lymphocytic Bệnh lơ xê mi cấp dong lympho

Leukemia

ADCC Antibody-dependent cellular | Độc tế bảo phụ thuộc kháng thể

cyloloxicily

CAR Chimeric antigen receptor Thu thé khang nguyén kham

CAR-T | Chimeric antigen receptor T | Tế bảo lympho T mang thụ thể

cell kháng nguyên khâm

cnc Complement dependent Bic ( bao plu thude bé thé

cR Complete remission Lai bệnh hoàn toàn

DNA DeoxyriboNuclere Acid Phân tử DNA mang thông tin di

HSV-TK | Herpes simplex virus tyrosine | Enzyme tyrosine kinase của

kinase virus gay bénh Lerpes

IR inverted termial repeats "Trinh tự lặp đầu cuối đảo ngược

MHC Major Histocompatibility Thức hợp tượng thích mô chính

Complex

MRD Minimal residual disease 'Tên dư tôi thiểu của bệnh

mRNA | Messenger RNA RNA thong tin

NA Not available Khang dé cap

Natural Kill “Tế bào giết tự nhiên

TCR T Cell Receptor Thụ cảm thế tế haa lympho T

TNE Tumor Necrosis Factor Yếu tế hoạt tử U

TSS Transcriptional start site Vị trí bắt dẫu sao chép

WHO World Health Organizatien — | Tỏ chức y lế thế giới

‘bao bach cau bất thường, ác lính Không giống các tế bảo máu bình thường, các tế

‘bao mau dc tinh không chết di mà có thể tăng sinh liên tục, lần át các đòng tế bảo

ấu bình thường khác, lâm cho chúng không thực hiện được chức năng bình

thường Thoo thống kê trên thể giới, tỷ lê mắc ATLI, hàng năm khoảng 1 đến 4 ca/ 100.000 dân tùy váo vững địa lý trong do tỷ lệ mắc mới của ALL gặp nhiễu nhất

ở lứa tuổi tù 2-5 tuổi Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc ALL hàng năm khoảng 41 trường hop trên T triệu người 0 tuổi đến 14 tuổi và khoảng 17 trường hợp trên 1 triệu người lừ

15 đến 19 tuổi, Trong năm 2021 tại Mỹ, ước tính có khoáng gâu 6000 ca mắc mới

và hơn 1500 người chét vi ALL Theo sự hiếu biết của chime tôi, chưa cẻ mệt

nghiên cửu có hệ thông danh gia ty 16 mac ALL hang nam tai Viét Nam Tuy nhiền, theo thông kê của Hệnh viện Nhi Trung Long, hàng năm có 150-180 trẻ được chân

đoán mắc bệnh bạch câu cắp, trong đó 2⁄3 là AT,

Điệu trị bệnh ALL là nhằm tiêu diệt các tê bào bạch câu áo tính và phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Liệu pháp điền trị chủ yếu hiện được sử dụng cho

ALL là hỏa trị liệu, thường chía thành 3 giai đoạn: cảm ứng, củng cố và duy trì,

Hạn chế của các liệu pháp hỏa trị liêu là hầu như không có khả năng chữa khôi tbệnh hoàn toàn mà chỉ hướng đến thuyền giãm toàn phân dễ có thể dược điểu trị

‘dy ghép tế bào gc tạo máu từ túy xương là

tiếp bằng liệu pháp ghép tế bảo gốc

quá trình thay thể tế bào gốc bất thường bằng những tế bão gốc khỏe mạnh của người hiển tặng Mặc dù, phương pháp này cũng cho thấy hiệu quả tốt trong diéu trị nhưng có hạn chế la cân phái tim được người hiển tặng có tế bảo rniễn dịch phủ

hợp với cơ thể của người bệnh Ngoài ra, liệu pháp sử dụng miễn dịch cũng đã

dược phát triển lá sử dụng khang thé don dòng trong diéu tri ALL Khang thé don động nhận biết các tế bào ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên

trên bể mặt tê bảo và sẽ tiêu diệt tế bào mp thư Hiệu quả điều trị của phương pháp

sử dụng kháng thể đơn động trong điều trị AI,L đã dược khẳng dink,

Gan diy, mt huong tiép cén khac dang được các nhà khoa học đẻ xuất là liệu pháp sử dụng tế bảo T mang thụ thể khăm nhân tao CAR (Chimeric antigen Teceptors) Nguyên tắc của liệu pháp CAR-T trong điều trị ung thư là nhằm tạo ra các tế bảo T mang các thụ thể nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên

đặc hiệu trên bê mặt tẻ bào trng thư từ đó kích hoạt khả năng phân giải tế bào ung

thự của tế bào T So với liệu pháp sử dụng kháng thể đơn đông, liệu pháp CAR-T

cũng có khả năng trị liêu trúng dích, nhưng vượt trôi vẻ tính hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay cả trong các ca đã điều trị thất bại

"Lại Việt Nam, củng với các tiến bộ vượt bậc của chuyên ngành huyết học

trong thời gian qua, các phác đồ hóa trị liện bệnh A1LL tại nước ta hiện da bat kip với trình độ thể giới, với rât nhiều biến thể tủy thuộc vào các tiên chí như tuổi bệnh:

nhân, đi truyền, triệu chứng lầm sảng, miễn dịch Như đã nói ở trên, ghép tế bảo gốc tạo máu hiện cũng được coi là liệu pháp hiệu quả để điền trị ALL Cho đến xay, rất nhiều cơ sở chuyên myành huyết học tại nước ta đã lâm chủ được kỹ thuật này, điên hình là Viện Huyết học _ Truyền máu Trung ương Gần dây, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM và Bệnh vién Trmg Uong Quan đội 10§ cững

đã ứng dụng thành công kỹ thuật này dễ điều trị cho các bệnh nhân bạch cầu tủy cấp và mãn tỉnh Tuy nhiên, cho đến nay, chua cò nhỏm nghiên cứu, Bệnh viện Trảo lại Việt Nam ứng đụng liệu pháp tế bào CAR-T đề điều trị ung thư nói chưng

và ALL nói riêng, Điều này có thể do liêu pháp CAR-T là công nghệ mới, cân thiết

'phải làm chú được nhiều bước công nghệ phức tạp như tạo cầu trúc biểu hiện CA, sản xuất vector ví rút đạt chuẩn ŒMP,

Tế hưởng tới việc ứng dụng liệu pháp CAR-T trong điều tri ALL tai Vist

Nam nghiên cứu “Xây dụng các câu (rúc biểu hiện thụ thể kháng nguyên khẩm

hướng đích CD19 để điều trị lơ xế mi cấp dùng lympho và thử nghiệm hiệu quả ít vo” đã được tiến hành với các các mục tiêu cụ thể sau:

1 Xây dụng cầu trúc biểu hiện thụ thé khang nguyên khám hướng đích CD19 nhắm tạo tế bào CAR-T dé điệu trị bệnh lo xê mi cấp déng lympho;

2 Thử nghiệm hiệu quả in vizo của khôi tế bảo CAR-T hướng đích CD19

tà

1.1 Bénh lo xé mi cap dong lympho (ALL)

1.1.1 Tình hình mắc ALL trên thể giới và Việt Nam

lệnh lơ xế mi cấp đóng lyrapho (ALL) là một trong những bệnh ung thu phd

biển nhất trên thế giới, chiếm khoảng 7594 tất cả các loại ưng thư máu ở trẻ em [1,

3] AT, xuất hiện khi quá trinh tao é bao tau trong tủy xương bị biển đối, tạo ra các tổ bào bạch câu bắt thường, ác tỉnh Không giống các tế bảo máu bình thường,

các tế bảo máu ác tỉnh không chết đi mà có thể tăng sinh liên tục, lần át các dòng

tế bảo máu bình thường khác, làm cho chứng không thực hiện được chức răng

tình thường Theo thông kẻ trên thê giới, tỷ lệ mắc AT, hàng năm khoảng L đến

6000 ca mắc mới và hơn 1500 người chết vì ALL [5]

“Theo sự hiểu biết của chúng tôi, chua có ruột nghiên cứu có hệ thống đính: giả tỷ lẻ mắc ALL bảng năm tại Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kẻ của Bệnh

viện Nhi Trung Tơng, hàng năm có 150-180 trẻ được chân đoán mắc bệnh bạch

cần cấp, trong đó 2⁄3 là ALL [6] Tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học, từ năm

2000 dén 2005 có 340 bệnh nhân người lớn dược chân doan mic ALL [7] Theo

số liệu thống ké trong vòng 5 năm từ năm 2010 đến 20141 tại Viện Huyết học —

“Truyền máu Trung Ương, số bệnh nhân mac ALT chiém dén 46,5% các bệnh về

xấu [S]

1.1.2 Sinh lý bệnh ALT,

Nguyên nhân bệnh ly cia ALT liên quan đến sự gia tăng và biệt hóa bất thường của một tập hợp các dòng tế bảo lympho Một số nghiên cửu trên trẻ em

đã chỉ ra rằng bệnh nhân mắc các hội chứng đi truyền như Down, thiếu máu

Taneoni, hội chứng Bloorn vẻ hội chứng suy nhược Nijmegen có nguy cơ cao mắc

ALL [9-12] Một số nguyên nhân khác gây bệnh ALL bao gốm tiếp xúc với bức

xạ ion hóa, thuốc trừ sâu, một số dung môi hữu cơ hoặc nhiễm vi rút như vi rút BpsieimBam [13-15] Đột biến nhiễm sắc thế (NST) liên quan đến việc chuyển

3

doan hoặc sắp xếp lại NST cũng là nguyên nhãn phổ biên dẫn dén ALL Hau hét các đột biển gen được tìm thấy ở người lớn mắc ALL cing tương tự như ở trẻ em nhưng có khác nhau đáng kế về sự phân bỏ và về sinh bệnh học [15] Ở trễ nhồ, 85% có tồn tại đột biến tải cầu trúc ở gen AZ/1, trong, khi đột biến đa bội và chuyển

đoạn NST chiêm tỷ lệ nhé [16] Ngược lại, ở trẻ vị thành niên, đột biến đa bội lại

chiếm tỷ lệ khá lôm (25%) trong khi các đột biển trên gen À7, chỉ chiếm 5% Bén cạnh do, có dến 25% các ca ở trẻ vị thánh niên mang đột biến trên gen lại TEE-

AME [L7]

Bệnh có thể gây ra nhiều đầu hiệu và triệu chứng khác nhau Song, hầu hết

các biéu hiện lâm sang của ALL là kết quả của sự thiếu hụt các tế bảo máu bình

mau

18 bao lympho ac tính, chưa được biệt hỏa ¢ t

thường, sự tích (u cil

ngoai vi va các vị trí ngoải tủy 1riệu chứng ALL bao gồm: mệt mới, chóng mặt,

khá thở, da nhẹt nhạt ALL eting thường có một số triệu chứng không đặc hiệu

Thư giảm cân, sốt, để mô hội đêm |18, 19] Các triệu chứng lâm sảng bao gồm: (1)

hội chứng thiếu mau, (ii) hdi chứng xuất huyết, G11) hội chứng nhiềm trùng; (1v) triệu chứng tắc mạch đe tang bach cau [20]

1.1.4 Phân loại AI,

Hiện nay ALL được phân thành nhiên nhóm, điển hình lä ALL đàng lympho Bva ALT dong lympho T, rong dé ALL dong lympha B chiém Lôi 75% các trường

hợp [21, 22] Lỗ chức Y tế thể giới (WHO) đã phân loại bệnh theo đặc điểm tế tảo, miền địch và bắt thường đi truyền sinh học phân tử cũng nhà tiển sử điều trị

120, 23]

Biéu tri ALL

Nguyên tắc điều trị dựa trên các tiêu chỉ: lâm sảng, miễn địch, đặc điểm dĩ truyền tế bào và sự dáp ứng với liệu pháp điều trị Các yếu tổ tiên lượng của ALL bao gểm: tuổi, số lượng tẻ bào bạch cầu, các bắt thường về di truyền, đáp ứng với

điều trị, tình trạng của bệnh trong và sau quá trình điều trị [23]

Diễu trị ALL là nhằm tiêu điệt các tế bảo bạch câu áo tính và phục hồi tuỷ

xương trở lại bình thường, Tiêu pháp điều trị chủ yếu hiện được sử dụng cho AI

là hóa trị liệu, thường chia thành 3 giai đoạn: câm ứửng, cúng cố và duy trì Giai

đoạn điều trị cảm ứng là nhằm đạt tới tỉnh trạng thuyền giảm bệnh Các đợt điều

trị tiếp theo có mục đích cũng cổ tình trạng của người bệnh hướng tới tiêu diệt

hoàn toàn các tế bảo ung thư, Cuối củng là giai doạn diều trị duy trí [rong giai đoạn này, bệnh nhân được điều trị ngoại trú với liêu thấp, kéo đài nhằm ngăn chặn

sự tải phát của bệnh Các loại thuốc dược sử dụng phổ biển bao gồm: daunorubicir,

L-asparapinase, 6-mercaptopurine, methotrexate, cyclophosphamide, prednisone,

dexamethasone Trường hợp một số bệnh nhân mắc ATLE, tái phát hoặc ở đạng bệnh

dai dẳng, liệu pháp diễu trị sẽ thường lả sử dụng các loại thuốc mới với liều lượng

cao nhu cytarabine, clofarabine, vincristine, va/hodc nelarabine Lan ché ciia cae

liêu pháp hóa trị liệu la hau như không cé khả năng chữa khỏi bệnh hoàn toàn mà

chứ hướng đến thuyén gidm toàn phân để có thể được điều Irị tiếp bằng liện pháp

ghép tế bào gốc Cây ghép tế bảo gốc tạo máu từ tủy xương là quả trình thay thế

tế bảo gốc bất thường bằng những tế bảo gốc khỏe mạnh của người hiến tặng Người bệnh sau klú thuyển giảm bệnh hoàn toàn có thể lựa chọn điều trị bằng

phương pháp ghép tẻ bảo gốc tạo máu dị thân (Allo-SCT) đề khỏi phục tủy xương

Đối với các bệnh nhân có tiên lượng xấu hoặc các bệnh nhãn bị tải phát bệnh/khó

chữa, Allo-SCT tử lâu đã dược coi là phương pháp diễu trị tiêu chuẩn và là cơ hội tốt nhất để có đáp ứng lâu dài Diễn hình lả thứ nghiệm LAL,A-94 đã cho thấy lợi

ich của Allo-SCT so với phương pháp hóa trị liệu thông thường ở những bệnh nhân

này [24| Tuy nhiên, bạn chế chũ yêu của phương pháp này là phải tìm dược người hiển tặng có tế bảo miễn dịch phủ hợp với cơ thể của người bệnh

Liệu pháp nhắm trúng dich (Targeted therapy) 1a liu phap diều trị ung thư bang cách sử dụng các thuốc làm hạn chế sự tăng trưởng vá lan trăn của bệnh ưng

thự, thường được áp dụng tiên những bệnh nhân tp thư giai đoạn muôn, tiến triển

và di căn xa mà các phương, pháp diéu ti tai ché uhu phau thuat, xạ trị không thé thục hiện được Liệu pháp này hoạt động bằng cách tân công và ngăn chặn các gen hay protein chuyên biệt mà những gen và protein này được tìm thấy ở tế bào ưng thư hoặc những tế bảo có liên quan đến sự phát triển của khối u [25] Hai loại liệu,

'pháp nhăm đích phế biển nhất là thuốc phân tử nhỏ va kháng thé don déng Trong

đó, việc sử dụng kháng thể đơn động trong điều tị AI, đã được chứng mình là

cho hiệu quả điều trị cao |26| Kháng thé don dong nhận biết các tế bảo ung thư bằng cách liên kết đặc hiệu với các kháng nguyên trên bể mặt tê bào và sẽ tiêu điệt

tế bào ung thư thông qua các cơ chế tác động phụ thuộc vào vùng thụ thể Fe, bao gồm gây độc tế bảo qua trung gian kháng thể (ADCC) và gây dộc tế bảo phụ thuộc

bổ thể (CDC) [27] Ví đụ điến hình của phương pháp điều trị nay 14 Blinatumomab, xnột loại kháng thể đơn đòng đặc biệt bồi vì nó có thể gắn vào hai lắc nhân dích cùng một lúc Một phần của blinatamomab sẽ gắn với thụ thé CD19, vốn tồn tại

trên tật cả các đòng tế bao B (bao gồm cả các tế hào ưng thư bạch cầu và ung thị

hạch, nhưng lại không tổn tại trong tế bào gốc tao máu), Một phân khác của blinatumomab gắn với (D3, vồn là thụ thể kích thích hoạt động của tế bảo 'T Bằng

cách liên kết với hai thụ thế này, blinatumemab sẽ giúp các tế bảo T tiếp cận với

các tế bảo ung thư, qua dó thực hiện quả trinh ly giải các tế bảo ung thư [28] Một loại kháng thẻ đơn đòng khác cũng được dùng để điều trị ALL là Inotuzumab

ozogamicin (Besponsa) Dav là kháng thế nhận biết thụ thể CD22 và được công, hop vai calicheamicim, vẫn một chất gày độ é ban [29] Các tế bảo B (bao gồm

tế bảo ung thư bạch câu) thường mang thụ thế CD22 Do vậy, đựa vào liên kết đặc

tiiệu giữa phan kháng thể với thụ thể CD22 trên bế mặt tế bào B, calichearmicim sẽ gây độc tế bảo ung thư, Tuy nhiên, nhược điểm của liệu pháp này là người bệnh

cân được truyền thuốc qua đường tĩnh mạch thường xuyên, gãy bắt tiện cho người

bệnh và giả thành điều trị rất cao

Mội hướng tiếp cận mới là liện pháp sử dụng tế bảo T mang thụ thể nhân tạo

CAR (Chineric antigen receplors) Nguyên lắc của liệu pháp CAR-T trong dién trí ung thư là nhằm tạo ra các tế bảo T tự thân mang các thụ thể nhân tạo có khả

năng nhận biết các kháng nguyên đặc hiệu trên bẻ mặt tế bảo ung the tir dé kich

Thoại hoạt Lính ly giải lễ bào của lế bào T Liệu pháp CAR-T thường bao gồm các bước sau (Hình 1.1}: () tách tế bảo T từ máu ngoại vị, (¡) chuyển gen vào tế bào

T để biểu hiện các thụ thể khảm nhân tạo có khả năng nhận biết các kháng nguyên

đặc trưng của tế bảo ung thư; (11) nuôi cấy tăng sinh tế bào CAR-T; (iv) kiểm tra chất hượng của khối tế bảo CAR-T; (v) truyền các tế bào CAR-T ngược trở lại

người bệnh [30]

T cell administration

am sư 4

Tests of cel quality and sterility

viral vector Modified T cell and purification

(CAR-T cell)

Hinh 1.1 Quy trình sản xuất tế bao CAR-T [31]

Hiện nay, liệu pháp CAR-T thanh céng nhat la cac cau trac CAR nhan biet thụ thẻ CD19 Khi tổng hợp các kết quả của 11 thử nghiệm lâm sảng sử dụng liêu pháp CAR-T hướng đích CD19, Lorentzen và đồng tác giả đã thấy có đến 60/72

(83%) bệnh nhân ALL đã thuyên giảm hoàn toản bệnh [32] So với liệu pháp sử

dung kháng thẻ đơn dòng, liệu pháp CAR-T cũng có khả năng trị liệu trủng đích

nhưng vượt trội vẻ tỉnh hiệu quả Đối với ALL, liệu pháp CAR-T hiệu quả ngay

cả trong các ca đã điều trị thất bại [33] Đặc biệt, tế bảo CAR-T có thể tự tăng sinh

và tôn tại lâu dải trong cơ thê người bệnh đề diệt các tế bảo ung thư tái phát (nguyên

nhân chính khiển trị liệu ung thư hiện nay thất bại) do vậy giúp giảm kinh phí điều

trì

Tại Việt Nam, củng với các tiến bộ vượt bậc của chuyên ngành huyết học trong thời gian qua, các phác đỏ hóa trị liệu bệnh ALL tại nước ta hiện đã bắt kịp với trình đô thể giới, với rất nhiều biến thẻ tùy thuộc vảo các tiêu chỉ như tuôi bệnh:

nhân, di truyền, triệu chứng lâm sảng, miễn dịch Như đã nói ở trên, ghép tế bảo gốc tạo máu hiện cũng được coi lả liệu pháp hiệu quả dé diéu tri ALL Cho đến

#

nay, rat nhiều cơ sở chuyên ngành huyết học tại nước ta đã làm chủ được kỹ thuật nay Diễn hình là Viện Tuyết học — Truyền máu Trung ương đã bắt đầu triển khai

*kỹ thuật nảy từ năm 2006 Tính đến tháng 9/2018, đã có táng cộng 336 ca bệnh được thực hiện kỹ thuật nảy, trong đó cỏ 25 ca được phép từ nguồn máu đây rồn

cộng đồng Hiện Viện Huyết học — Truyền máu Trung ương đã thiết lập được một

Ngan hang Tế bào gốc với trên 3000 mẫu lễ bào gốc máu đây rồn công đồng, sẵn

éu trị các bệnh máu ác tỉnh nhu ALL Gan

sảng cung cấp nguồn tế bảo gốc dễ

đây, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM và Bệnh viện Trung Uong Quan đội 108 cũng đã ứng dựng thành công kỹ thuật này để điều trị cho các bệnh nhân bạch cầu tủy cắp và mãn tỉnh

Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nhóm nghiên cứu, Bệnh viện nảo lại Việt

Nam ứng dụng liệu pháp tế bảo CAR-T để điều trị ung thư nói chúng và ALL nói

riêng, Điều này có thể đo liệu pháp CAR-T lả công nghệ mới, cân thiết phải làm

chủ được nhiều bước công nghệ phức lạp như lạo câu inte biểu hiện CAR, sân xuất

‘vector vi rit dat chuan GMP

1.2 Liệu pháp tế bao CAR-' trong ditu tri ALL

1.2.1 Lịch sử hình thành và phát triỂn của liệu pháp tế bảo CAR-T

T,ịch sử của tế bảo CAR-T bắt đầu từ năm 1989 khi EsHtưr và công sự lần dầu tiên tạo ra câu trúc mã hóa thụ thẻ khám của tế bào ‘I (chimeric TCR gene) Câu trúc đi truyền này có thé được biếu hiện ở tế bào T của người và giúp tế bào

T thận điện và phân ứng với các kháng nguyên đích với dộ đặc hiệu cao, lương lự

như phản ứng kháng nguyên-kháng thể Ngoài ra, phần ứng của các tế bảo Ï

chuyến gen này không bị hạn chế bởi sự nhận điện phân tử MHC [34] Năm 1993,

nhằm kết hợp wu didm về tính đặc liệu của kháng thé va hoạt dòng gây độc tế bào của tế bào T CDST, nhóm nghiên cứu của 1/shhar đã nổi vùng biến thiên đơn chuối

(single chain variable region hay scFv) otia mét phân tử kháng thế với vùng hẳng

định của thụ thê tế bảo T (thường là chuỗi zeta của phức hợp TCR/CD3) [35] Tiếp theo các kết quả này, Dshhar và đồng tác giả đã tạo ra cấu trúc thụ thể kham (chimeric receptor gene) đầu tiên ở tế bảo T và đây chính là tế bảo CAR-T thể hệ

đầu Liên |36 Tuy nhiên, các tế bảo CAR-T thi

trị hạn chế trang thử nghiệm lâm sảng đo không thé gia tang lượng tế bảo CAR-T

è đầu mày chỉ cho hiệu quả điều

trong cơ thể [37] Da vậy, lê bào CAR-T thể hệ thử hai đá được phải Iriển vàn năm

8

1998, bằng cách gắn thém mét phan tit ding kich thich (costimulatory signaling

đomain) của CD28 hoặc 4-1 (CD137) vào giữa vùng sefv và chuỗi CĐ3L Việc

bố sung thêm phân tử đẳng kích thích này đã giúp kích hoạt tế bảo T một cách bên

vững, từ đó, tăng sự tiết cytokine và kuếch đại sự tăng sinh tế bào 1 khi tiếp xúc

với kháng nguyên [38]

Năm 2003 danh dau sự khởi đầu của liệu pháp CAR-T nhằm đến thụ thể CD19 trén té bao lympho I3 Nhóm nghiên cứu của Tiến sỹ Sadelain tại Trung lâm Nghiên cứu Ứng thư Memorial Sloan-Kettering lần đâu tiên chỉ ra rằng tế bảo

CAR-T nhắm địch khóng nguyễn CD19 ¢6 kha nang diét tế bào H áo tỉnh trên mô tình chuột SCID/Beigs Ngoài ra, việc đồng cảm mg bang CD80 va IL-15 cing giúp tăng sinh tế bảo CAR-T và tăng khả năng điệt tế bảo ung thư Vào năm 2009,

quy trinh công nghệ sán xuất tế bảo CAR-T nhắm địch khang nguyén CD19 lan đầu tiên được công bê; đựa vào đó, thử nghiệm lâm sang Pha I đã được tiến hành trên các bệnh nhân mắc bạch chu lympho mãn tính (CLL) va bach cau lympho cap tính (ALL) [39] Kết quả của cuộc thử nghiệm lâm sang nay lần dâu dược công bố vào năm 2013, chỉ ra sự thuyên giâm bệnh đáng kế ở những người bệnh tham gia,

đặc biệt là trên những bệnh nhận trưởng thành mắc B-A1LT, Cụ thể, toàn bộ 5 bệnh

nhân sau khi điều trị bằng liệu pháp CAR-T 19-28z đều đạt trạng thái MRD âm

linh Guinimal residual disease negative) Ngoai ra, sau khi duoc diéu ti, khong

còn phát hiện dược dột biển tái tổ hợp ác tính trên gen JGH của các bệnh nhân |40]

Dựa vào những kết quá nghiên cứu trên, liệu pháp sử dựng tế bào CAR-T' nhằm

dich CD19 đã được Cục Quản lý Dược va Thue phim My (EDA) céng nhận là

anét bước đột phá, mở dưỡng cho nhiều nghiên cứu và tiến bộ trong lĩnh vực nay [11] Đến năm 2017, FDA đã cáp phép cho liệu pháp CAR-T hướng đích CDI9 để

điều trị B-ALL ở người lớn và trẻ em [42]

'Theo dữ liệu đăng ký trên CellTrials.org, hiện cỏ 190 thứ nghiệm lâm sảng

dùng Lễ hảo CAR-T đang được thực hiện lại Mỹ và 7394 trong số đó nhằm tới điều trị ung thu mau; 27% nhằm tới các loại ung thư thể rắn Ngoài ra liệu pháp CAR-

T cững đã được cấp phép thủ nghiệm ở châu Âu như Anh (16 thử nghiệm), Di (LÔ thử nghiệm), Đức (6 thử nghiệm) và Tháp (3 thứ nghiệm) Ở châu Á, Trung Quắc

đứng đầu với 357 thứ nghiệm lâm sang, Nhat ban (3 tht nghiém) va Singapore (1 thử nghiệm)

1.2.2 Cấu trúc CAR-T

Thu thé khang nguyên khảm (CAR) là các cầu trúc thụ thể nhân tạo, được

thiết kế để cỏ cả chức năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích, từ đỏ truyền tin hiệu kích hoạt tế bảo T Hiện nay, công nghệ CAR-T đã phát triển đền thế hệ thứ tư, tuy nhiên, tất cả các cầu trúc CAR-T đều bao gồm 3 mô-đun: mô-đun ngoại

bao (ectodomain), mé-dun xuyên mang (transmembrane) va mé-dun ndi bao (endodomain) (Hinh 1.2)

Hình 1.2 Cẩu trúc chung của thụ thể khâm trén té bao lympho [43]

> Mé-dun ngoai bao:

Mô-đưn ngoại bảo của cấu trúc CAR-T gồm cỏ tin hiệu peptit dẫn đường (signal peptide), vùng nhận diện kháng nguyén (scFv), va “ving dém” (spacer)

[43] Tin hiệu peptit dẫn đường có nhiệm vu dan protein CAR di qua mạng lưới

nội chất đến biểu hiện trên bê mặt tế bào [44] Vùng nhận diện kháng nguyên bắt nguồn từ vùng siêu biên của kháng thẻ đơn dòng dang don chudi (scFv chudi nang

VH liên kết với chuỗi nhẹ VL thông qua linker (GGGG8)„) Vủng đệm “spacer”

là vùng nổi giữa seFv và vùng xuyên mảng, thưởng có dang “hinge-CH2-CH3 Fe”

của kháng thể IgG1 [45]

> Mé-dun xuyén màng:

'Vùng xuyên mảng có cau tạo bao gồm các chuối xoắn alpha, cỏ nhiệm vụ

giữ ồn định cho câu trủc CAR Hiện nay, mô-đun xuyên mảng của tế bảo CAR-T thường được xây dựng dựa trên vùng xuyên mảng của thụ thể CD3, CD4, CD8 và

10

CD28 Tuy nhiên, thiết kế dựa trên CD8 va CD28 được cho lả én định vả thường

được sử dụng nhất trong thiết kế tế bảo CAR-T [46, 47]

> Mé-dun néi bao:

Mô-đun nội bảo lả nơi thực hiện chức năng hoạt hóa tế bảo CAR-T Vùng

ê bảo T (CD247/CD3z) đi kèm với motifITAM

nay luôn có chuối zeta của thụ thể

(immunoreceptor tyrosine-based activation motif) [43, 48] Motif thường có dạng: Y-XX-L/I-X(6-8)—Y - XX -L/1(¥: tyrosine, X: amino axit bat ki, L: leucine, I: isoleucine)

Sau khi m6-dun ngoai bảo tương tác với kháng nguyên đích vùng nội bảo co

nhiệm vụ truyền tin hiệu đến nhân tế bảo nhằm kich hoạt hoạt động tế bảo CAR-

T Ngoài ra, tế bảo CAR-T cũng cần tin hiệu từ vùng đồng kích thích (costimulatory domain) dé cé the thuc hién day đủ các chức năng Vùng đỏng kich

thích thường được sử dụng là CD28, CD134 (OX40) và CD137 (4-1BB),

1.2.3 Cae thé hệ tế bào CAR-T

Công nghệ CAR-T hiện nay đã phát triển đến thẻ hệ thứ tư Sự khác biệt về

mặt câu trúc giữa các thế hệ CAR-T được trình bảy tỏm tắt trong Hình 1.3 dưới

đây

IfÔshesien “ngan Goren Graton

Hình 1.3 Cắu trúc cña bốn thé hé té bao CAR-T [49]

> Té bdo CAR-T thé hé thir nhat:

Te bao CAR-T the hé thir nhat co dic diém néi bật là sử dụng chuối CD3 zeta hoặc FceRIy làm mô-đun nội bảo Tuy nhién, thiet ke nay khien te bao CAR-T

11

không sản xuất đủ LL-2 cân thiết dễ đuy trì hoạt dộng, diệt tế bảo ung thư Vì vậy, việc sử dụng tế bảo CAR-T thể hệ thứ nhất trong điều trị thường yêu cầu bé sung TL~2 [S0] Hậu hết các nghiên cứu sử dụng CAR-T thế hệ đâu đều không đạt được kết quả như mong đợi

> Tế bào CGAR-T thế hệ thứ hai:

Tặc trưng của thể hệ thứ hai là sử dụng tín hiệu kép cho việc hoạt hóa tế bảo Tin hiệu đầu được phát di khi mô-đun ngoại bào tương tác với kháng nguyên đích Tin hiệu thứ hai được phát di bởi một phân tử đông kích thích CD28/B7/4-1BB

giủp tăng sự tổng hợp 1L-2 đề kích hoạt tế bào CAR-T một cách hoán toàn và tránh Tiện tượng “apoptosis” (chết tế bảo theo chương trình) Chính vì vậy, các thiết kế

CAR-T thể hệ hai đã tích hợp một phản tử đồng kích thích như CD28, CD134

(OX40) hoặc CD137 (1-1BB) vào cầu tric CD28 cé vai tré rit quan trong trong

@iéu chinh su tng sinh va tan tai cha é bao lympho T, đặc biệt là trong hình thành

tế bảo memory và tế bảo effector CD134 giúp duy trí sự tăng sinh vả tăng sự tong

hop IL-2 CD137 giúp đuy trí tín hiệu đáp ứng của tế bào T, đóng vai trò quan

trọng trong khã năng tổn tại của tế bảo T nói chung và hinh thánh bộ nhớ cho tế bảo T CD8+ [S1, 52] Bắt nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra công hiệu của các cầu

trúc dạng này, điển hinh như các câu trúc CAR-T scFvCD19-CD137-CD3È hoặc

scFvCD19-CTD28-CD3ÿ cho điều trị 1é bao B ac tinh [53, 54] Hon nữa, nghiên

cửu trên mô hình chuột (được cây ghép tế bảo ung thy B-ALL) da chi ra ring

CD137 hoạt động tốt hơn so với CD28 trang cau trie CAR Cu thé, té bao CAR-

T với cầu trắc seFvCP19-CD137-CD3ÿ tên tại íL nhất 180 ngày so với mức 150

ngày của cầu trúc seFvCD19-CD28-CD3E [47, 55]

> Tế bào GAR-T thá hệ thứ ba:

“tế bào CAR-T thể hệ thử ba có đặc trưng là trong cầu trúc có sử dụng đồng thời nhiều vùng đồng kích thích Một số thiết kế điển hình như CD28-OX40-CT3E

hoặc CD2E-CD137-CD31, với mục đích tăng cường hơn nữa khả năng sinh IL-2

và khả năng điệt tế bảo ung thư Nhiều thử nghiệm lâm sang sử đựng CAR-T thế

tệ thứ ba cho điều nrị ưng thư bạch câu lympbo E cấp tính hiện đang được tiến

thành trên thẻ giới {56, 57] Tuy vậy, các nghiền cứu sơ sánh về hiệu quả điều trị

giữa các câu trúc CATR thể hệ thứ hai và thủ ba đưa ra các kết quả trải ngược nhau.

Do dỏ, chưa thể kết luận liệu câu trủc CAR-T thể hệ thứ ba có thực sự hiệu quả

‘hon so với thể hệ thứ hai hay không [55, 58]

3> Tế bào GAR-T thê hệ thir te:

Tế bào CAR-~T thẻ hệ tư được tạo nên từ nên tăng thế hệ thứ hai Về mặt kỹ

thuật, CAR-T thé

vào tế bảo T của hệnh nhân Một câu trúc nhằm hiểu hiện thụ thể nhân tạo (CAR)

thử lư được tạo ra bỗng cách chuyển hai cấu trúc di truyền

và câu trúc còn lại nhằm biểu hiện các cytokine để hoạt hóa tê bảo CAR-T Một

trong các cytokine thường đủng lả 1L-12 Khi dược biểu hiện cảm ứng, IL-12 sẽ

giủp tăng sụ sinh tổng hợp II*N-, hoạt hóa té bao NK (Natural Killer cells), dai thue bao (macrophage) dé tham gia điệt lế bao ung the Ngoai ra, TL-12 cing giúp cải thiện hoạt động của các tẻ bảo lympho T CD4* và CD8*, gidm su chat té bao 'T theo chương trình [S9, 60] So với các câu trúc CAR-~T thể hệ thử hai, thể hệ thứ

tư có tính phức tạp hơn do phải chuyển đồng thời hai câu trúc vào tổ bào T của

bệnh nhân Ngoài ra, việc tầng, sự biểu hiện của IL-12 cũng có thể gây ra một số

hiệu ứng phụ

thân [61] Ngoài IL-13, II.~15 cũng đã được sử dụng trong một sẽ câu trúc CAR- 'T thể hệ thứ tư nhằm đích CD19 để điều trị B-ALL Chức năng miễn dịch khang

khải u của IL-L5 chủ yếu là đựa vào duy trì cân bằng nội sinh tổ bảo T CD8” va

n-target, aff-tumor”, gây độc cho phần mê khỏe mạnh của bệnh

giúp tăng thời gian lổn tại trong cơ thể người bệnh [63] Khi sử dụng vector

retrovirus dé đẳng biểu hiện cầu trủc CAR-T vả IL-15 trong tê bảo 1' của chuột,

Lanitis và công sự [63] đã chỉ ra sự đồng biến hiện IL-L5 không những giúp tăng cường khả nẵng xâm nhập và kiềm chế phát triển khối của CAR-T, mà côn nâng

cao ảnh hưởng của 1L-15 nội sinh dên sự phát triển của khối u Ngoài ra, việc

đông biếu hiện IL-15 còn cho phép giảm thời gian tăng sinh tế bảo CAR-T từ 28

Trgày xuống củn 2 ngày, mổ ra cơ hội giảm chỉ phí sản xuất tế bảo CAR-T [64] CAR-T đồng biểu hiện IL-15 cũng đã được chứng munh hiệu quá trong các thử

nghiệm lam sang Feng va cộng sự đã thiết kế các tế bào CAR-T nhằm đích CD

kết hợp với biểu hiện phức hợp IL-1 5/1L~15 Sushi (protex1L-15 liên kết với vùng

sushi [L-1SRa của thụ thể JL-15) [65] Trong thử nghiệm lâm sảng pha 1 (NCT04594135), các tế bào CAR-T này đã được thử nghiệm vẻ tính an toàn và

hiệu quả ở một bệnh nhậu mắc ung thư bach bạch huyết đã dĩ cắn hệ thân kinh trung ương, Trong thủ nghiệm này, các triệu chủng chèn ép hệ thân kinh trưng

13

tương đã giảm đóng kế sau 3 tuần diễu trị với tế bảo IL-15-CD5-CAR-T, và khối

mô mềm giảm đáng kể sau 8 tuần điều trị Hiện nay, CAR-T đẳng biéu hian IL-15

cũng đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sảng

NCT03221068, NCT04377932 nhằm điều trị nhiễu khổi u rắn (ung thư gan,

sarooma, u ngưyên bảo sợi) Mục tiếu của các nghiên cứu nảy là xác định liêu

lượng an toàn tối đa của lễ bảo CAR-~T và thời gian chúng tổn tại trong cơ thể

1.3 Quy trình công nghệ sản xuất té bao CAR-T trong điều tri ALL

‘Mat cách khái quát, quy trình sản xuất tế bao CAR-T bit dau bing viée thu

tế bào đơn nhân máu ngoại vì (PBMC) từ người bệnh thông qua “leukaphere:

‘Te quan thé té bao ban đâu, các tế bảo CI23* có thể được lâm giau ex vive va duge

chuyén gen nhăm biên hiện cầu trúc CAR hướng đích kháng nguyên là thụ thế của

tế bào ung thư Các tế báo T sau đó được lắng sinlt trong môi trưởng nuôi cây rôi được kiểm tra chất lượng trước khi được truyền lại vào cơ thể người bệnh

1.3.1 Thu tẾ bảo đơn nhân mẫu ngoại vị (PBMC) và làm giàu quần thể tế bàu

T

Cho đến nay, “leukapheresis” vẫn là phương pháp hiệu quá nhất để có được

lượng tế bảo T ban đâu đủ lớn cho các giai đoạn tiếp theo Phương, pháp này bao

gồm lây rậu koàn phần lừ người bệnh và ly lâm 1ÿ trong thir phan tách các thánh

phan máu Sau dó, phân lớp tế bảo PBMC (chứa lymphocyte vả monocyte) dược

hút ra dé str dung cho các bước tiếp theo Đây là cách tiếp cận phổ biến nhật hiện:

nay đo dã được FDA công nhận

1.3.2 Kích hoạt tế hảo

Trong điều kiện tự nhiên, tế bào T “naive” được kích thích tăng sinh và biệt

hóa nhờ các tế bảo Irình điện kháng nguyên (APC), thông qua tương lắc của thụ

thé té bao I TCR va phân tử MHC và các phân tử dễng kích thich nhu CD28,

CD137, va OX-40 nằm trên bê mặt tế APCs Dựa vào quá trình kích thịch tế bào

T trong tự nhiên, các phương pháp kích hoại và tăng xinh tế bảo T trong công rghệ

tế báo CAR-T đã được phát triển [66] Phổ biến nhất có thể kế đến (1) sử dụng

khang thé don dong két hop với imterleukin, (ii) bì từ gắn kháng thể kháng

CD3/CD28 (két hop vdi interleukin), va (aii) tế bảo trình diện kháng nguyên nhân

tao (aAPCs).

'Trong sin xuit té bao CAR-T, quan thé té bao thu duge sau “leukapheresis” thường được kích hoạt và tăng sinh bằng bị từ gắn anti-CD3/CD28 trước và sau khi tải nạp [67] Ngoài ra, các hạt bỉ từ có thể được để đàng loại bỏ khôi mỗi trường nuôi cây bằng nam châm [68]

1.3.3 Chuyén gen (gu té bao CAR-T

Chuyến gen là bước tôi quan trong trong sản xuất tế bào CAR-T, quyết định hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng, như giá thành sản xuất Hiện nay, có rất nhiều, 'phương pháp chuyén gen có thẻ được áp đụng vào tế bảo T nữnư tải nạp bằng vector

vi rit, transposons, hodc str dung hal nana, liposơme, kỹ thuật xung điện

(electroporation) Tuy nhiên, có hai loại phương pháp chính đã được thứ nghiệm

lâm sảng là tài nạp bằng vi rút và transncson-transposase kết hợp với kỹ thuật xưng

điện

3> Tải nạp bằng veclor vi rút

Tải nạp bằng vector vi rút hiện dang là phương pháp phổ biển dễ tạo tế bảo CAR-T Các vector vi rat bao gém retrovirus (lentivirus va y-retrovirus) và

adenovtrua có khả năng lây nhiễm nhưng không còn khả năng nhân bản Quy trình

sản xuất vector vị rút đạt chuẩn GMIP rất phức tạp và phái được thực hiện trong znôi trường vô trùng Dễ sản xuất một mẻ vector vi rút thường cân hai tuần Hầu hết thời gian trên được dành cho việc tao đủ lượng tế bảo vật chủ, có thé là 1II⁄K293T' hoặc PG13 để phục vụ quá trinh “đóng gói” vị rút Dầu tiên, các tế bảo

vật chủ được tăng sinh trên mỗi trường nuôi cây thích hợp đến liêu lượng nhật định

trước khi được chuyển nạp với 4 plasmid bao gém: (i) cau tric Gag/Pol ma hoa protein Gag va enzyme Pol ciia vi nit, (ii) cdu tric ma héa lép vé glycoprotein di

nguyên đã được thiết kế nhằm loại bỏ khả năng nhân bản; (ii) cu trúc mã hóa gen: rev trong Hường hợp sử dựng lentivirus; (iv) cấu trúc rnã hóa CAR và các trình tự

khảo nhằm đâm bảo hiệu quả phiên mã ngược, đóng gói và tích hợp gen chuyển

vào hệ gen vật chủ Khoảng 48 giờ sau tải nạp, các hạt vì rút chứa cầu trắc CAR

at dau được tạo ra Trong các ngảy tiếp thco, vị rút có thể dược thu hoạch theo

mẻ bằng cách thay mới mỗi trường nuôi cấy Sau đó, vector ví rùt được tỉnh sạch

và làm giàu bằng các bước lọc, loại bỗ săn lễ bảo và các tạp chất khác, lọc vô trùng

và bảo quản ở -80*C, Trước khi sử dụng, các vector vị rút dược kiểm tra chất lượng theo quy trình của DA [69]

Ưu điễm của phương pháp tải nạp bằng vector vị rút là hiệu quả chuyên gen cao và sự tích hợp cầu trúc CAR vào hệ gen vật chủ một cách ổn định IIai đặc trưng của retrovirus khiến chúng đắc biệt thích hợp để làm vector chuyển gen là: () phần lớn hệ gen vi rút cỏ thể được thay bằng một hoặc nhiéu transgene mong

muốn; (¡) khi chuyển nạp, bộ gen của vi rút được tích hợp vĩnh viễn vào hệ gen

của tế bảo vật chủ Vì những lí đo này, một số y-reevirns đơn giần như “Moloney mmurme leukemia vnus” (Mo-MLV) dã được ứng dụng thành công dễ phục vụ tải nạp gen Cáo lentivirus cũng thường được sử dụng và ngày cảng được lựa chọn

Trhiểu hơn so với y-retrovirus, điền hình như các veotor thiết kế dựa trên vị rút HTV Thông, thường, tế bảo 1 sẽ được hoạt hỏa bằng bị từ gắn kháng thể kháng K13,

CD28 (hoặc Dynabead CD3/CD2§) trước khi cha ủ với vector chuyến gen Sau

khí vị rút dụng hợp với màng lế bảo T, lồn vĩ rút mang cấu Irúc CAR sẽ dược chuyển vào tế bảo chất, đi chuyển đọc theo các vị ông, đến nhân tế bảo để thực hiện

quả trình tích hợp với hệ gen vật chủ Phương pháp này cho phép tạo tế bao CAR-

T với hiệu suất lên đến 6894 |70, 71]

Tuy nhiên, để đạt được những tiêu chỉ an toàn cao trong nghiên cứu lâm sảng,

voelor vì rút dược sử dụng phải được chứng núnh không có khả năng nhân bản, íL

gây độc tế bảo và it gây phản ứng miễn dịch Vỉ thể, giá thành săn xuất của phương

pháp này khả cao, tạo nên rào cần kin Irong việc sử dụng rộng rãi liệu pháp CAR,

đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam

đếu như “Sleeping Beauty” (SH) và “pigeyBac” thường sẽ dược chuyén true

hệ gen của tế bào vật chủ một cách ấn định [72, 73] Cơ chế của các phương pháp

xảy (Hình 1.4) là crzyme treisposase sẽ nhện biết và bám vao cde ving TTR

(invertedi termial repeats: trình tự lặp đâu cưổi dao ngược) tại hai đâu của cầu trúc

cần chuyển, sau đó cắt vã đản cầu trúc đi truyền vào hệ gen tế bào chủ (hệ thống:

“Slccping Beauty” sẽ cất và đán gen chuyển vào vùng trình tự giàu TA trong hệ gen vật chủ),

Hình 1.4 Co’ ché hoat déng ciia hé théng Sleeping Beauty [74]

So voi cae vector vi nit truyền thông, transposon có ưu điểm cơ bản là giá thành sản xuất thập hơn nhiều lần (do bản chất của các cầu trúc là các plasmid) vả

có tính an toàn cao hơn So với hệ thống “piggyBac”, “Sleeping Beauty” có lợi thể

hơn trong chuyên gen vảo tế bảo T do khả năng tích hợp ngẫu nhiên vào các vùng

trình tự giảu TA trong hệ gen tế bào chủ; trong khi đó, công nghệ “piggyBac” thường tích hợp gen chuyên vào gân vùng điều hoa gen (regulatory region) như

“Transcriptional start site” (TSS) va cac dio CpG [75]

Bằng cách sử dụng các dạng SB transposase cải tiền như SB100%, các nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả chuyên gen vảo tế bảo T lả tương đương so với các vector

vị rút [76] Thông thưởng, quản thẻ PBMC sẽ được kích hoạt trước khi chuyển nạp

bằng kỹ thuật xung điện với hỗn hợp hai plasmid (một plasmid mã hóa transposase

và một plasmid mã hỏa cấu trủc CAR) hoặc một hỗn hợp bao gồm mot plasmid

mã hỏa cầu trúc CAR vả một mRNA mã hóa SB transposase Lượng plamid mã hỏa CAR thường sử dụng từ 10 đến 20 ng kết hợp cùng với 5 jig plasmid hode 1

Hg mRNA mã hóa 8B transposase [77, 78]

Việc chuyên nạp sử dụng mRNA có một số lợi thế so với cách sử dung DNA hay vi rut, ví đụ như không cần phiên mã, khiển cho protein được biểu hiện nhanh chóng sau khi chuyển nạp Ngoài ra, RNA ở lại tế bảo chất mà không vào nhân tế bảo, khiển cho hiệu suất biểu hiện được cái thiện vả biểu hiện gen không lãu dai

Trong quy trình tạo té bao CAR-T bang céng nghé Sleeping Beanty, enzyme

én nap mRNA thay

transposase có thể được biếu hiện trong tế bào thông qua chuy

vi sử dụng DNA plasmid Qua dó, transposasc chỉ được biểu hiện trong thời gian

ngắn, tránh hiện tượng biển đối DNA chủ thế không đặc hiệu và loại bả hoàn toàn Trguy cơ hỏa nhập thể gen

Trong năm 2017, Monjezi và đồng tác giả đã công bỏ kết quả nghiên cứu sử

điện của các cầu trúc transposon dưới dang minicircle va SB transposase dưới dạng

mRNA [i cao hon whién lần so với kh sử đựng plasmid thông thường (49,89% so

với mức 12.8% khi sử dụng các pÏasmid truyền thống)

1.3.4 Tăng sinh tế bào sau chuyển gen

Các tế bào T có khả năng tăng sinh mạnh là những tế bảo ít bị biệt hóa hơn

Sự tăng sinh yêu cầu các lin hiệu kích hoại và môi trường tăng trưởng thích hợp

Sau khi tải nạp vi rút tạo tế bào CAR-T, tế bào thường được tăng sinh trong

các chai T-[Task, tải canh trường, hoặc các bioresetors Hiện nay, có nhiều lựa chọn

khảo nhau cho môi trường nuôi cây CAR-T, bao gồm hệ môi trường RPMT-I640

‘bé sung huyết thanh bỏ FBS truyền thông và các hệ môi trường mới sử đụng huyét

thanh người AB hoặc không sử dụng huyết thanh Trong các thử nghiệm lâm sảng

18 bao CAR-T cho đến nay, sự tăng sinh thường được thực hiện với thể tích tăng din, bat du tt nudi cay 1é bao sau chuyén nap rong các đĩa nuôi cây, sau đó cây

và tăng thể tích cho ngôi trong các tủi chuyên dụng

chuyền sang các chai nuôi cả:

hoặc các bioreactors Irong môi trường nuôi cAy, bi tl gan anti-CD3/CD28 thudng

18

được sử dụng phỏ biên nhất chơ tăng sinh lượng lon CAR-T (dược ap dung dai với sản phẩm Kymriah và liso-cel) Sau tăng sinh, bị từ được loại bỏ bằng nam châm [79] Tuy nhiên, việc sử đụng bị từ có nhược điểm là giá thành đất Tăng sinh sử dụng các tế bảo trình diện kháng nguyên nhân tạo hiện đang được ap dung

trong thủ nghiệm lâm sảng và được sử đụng cho cả cách tiếp cận tạo CAR-T bằng

tải nạp vị rút và tratsposorr-trarisposase kết hợp xung điện Các tín hiệu kích thích đùng dễ tăng sinh tế bảo T đã được tỏm tắt trong Bang 1.1

Bảng 1.1 Phicong phip ting sinh té bao CAR-T

Có thể sử dung với kháng thể đồng kích [hích kháng OKT3 (and-CD3 clonc)

CD2§ hoặc kích hoạt các cytokins (vi du: IL-2)

Vũng kháng Thể mục tiên kích hoạt kich thích đến tế

Kích hoạt và tăng sinh tế bảo CAR-T bằng kháng thể kháng CD3/CD28 đã

cho thay hoạt động chống khỏi u tốt hem và khả năng tên tại của tê bảo lâu hcm

Các bại từ này giúp tăng sinh mạnh mế các tế bảo CAR-T [66] và có thể được loại

bỏ bằng lục từ của nam châm liơn nữa, các hạt từ tính phú kháng thể kháng

CD3/CD28 oó thể tạo ra các tế bảo T ít biệt hóa hơn, có khả năng it giả hơn, khả

Trảng tăng sinh được năng cao và phần ứng chẳng khối u ứ vivo sớm hơn so với kich thích bang, OKT-3 va IL-2 liéu cao [80, B1] Trong các thử nghiệm lâm sảng

gân đây, việc sản xuất Kjmriah ( Tieagenleeleucel; CTL019)[82, 83]và

Lisocablagene maraleucel (liso-cel; JCAROI7) duoe sit dung caw hat tit tinh phi

khang thé khang CD3/CD28 [84], trong khi việc sắn xuất Vescarfa đ® (

Axicabiagene Ciloleucel; KTE-019) si dung kháng thẻ kháng CD3 với IL-2 [78]

19

Một sản phim nanomatrix (‘I Cell TransAct ™) két bop với CD3 va CD28

tái tổ hợp vả mỗi trường không chúa huyết thanh (TexMACS TM) được sử dụng để kích hoạt tế bảo trong quá trình sân xuật té bao CAR-T [85] Chiên lược kích hoạt

xảy hỗ trợ sự tăng sinh của các tế bào T CD4? với tý lệ CD4: CD trung bình là 2:

1 và cũng dẫn đến hoạt động phân giải tẻ bào thấp hơn khi so sánh với sự kích hoạt với chất kháng CD3/GD38 [85]

Tương lự, sự tăng sinh của tế bảo CAR-T bằng tế bào trình điện kháng

nguyên (APC) hoặc tế bảo trình diện kháng nguyên nhân tạo (+APC) cũng tạo ra một lượng lớn các tế bào T có khả năng nhân rộng ứ vwø sau đó [86] Từ đó, tế

bao K562 đã được biến đỗi gen trong nhiều nghiền cứu khác nhau để đồng biểu hiện các phân tử kích thích và kháng nguyên khối u [85] Khi dược chiếu xạ, tế bảo KS62 này có thể được sử đụng để tăng sinh số lượng lớn các tế bảo CAR-T

Ưu điểm của sử dụng đỏng tê bào K562 là không có sự biểu hiện của các phân tử HUA-A hoặc HL.A-B và cỏ thể sẵn xuất tuân thú theo quy trình thực hành sản xuất

tốt (GMP) có sẵn [85]

Nhóm nghiên cứu của T8 Cooper tại Đại học Texas, Mỹ đã công bộ kết quả

thử nghiệm pha T của lễ bảo CAR-T được chế tạo bằng công nghệ “8leeping

Beauty” [7] Câu trúc CAI được sứ dụng trong nghiên cứu này là CD19RCD2E

để chuyển nạp vào 2x10 té bao PBMC

duge chén vao plasmid “Sleeping Beauty

‘bang thiét bj Nucleofector IT cing voi plasmid ma hoa cho SB transposase Cac t6 bao T sau chuyển nạp được nuôi cây trong môi trường được bễ sung IL-2, IL-21

với sự có mặt của tế bảo trình diện kháng nguyên nhận lạo (arHilicial antigen

presenting cell hay aAPC) lá tế bảo K562 biểu hiện dồng thời C19, CD64, CDS6

va CD137 Sau 28 ngày nuôi cấy, lượng tế bào T được tăng sinh khoảng hơn 2000 lần, ương đó 84% có biểu hiện câu Wie CAR, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu vẻ liễu

sử dựng trong điều trị Giải trình tự bằng hệ thông 1lhmina (7,5 triệu trình tự thổ)

cho thay 99.9% cáo vị trí hòa nhập của cầu tric “Sleeping Beauty” 14 vao cae vi tri

dinucleatide TA va rai déu trên toàn bộ thế gen Hầu hết các vị trí chèn vào thể gen Tơi vào vùng không mã hóa, đo vậy nguy cơ gây đột biến phát sinh ung thư là rất thấp Khi kết hợp củng với cây ghép tế bảa gốc †ao máu, sau 30 tháng theo đối,

83% cáo bệnh nhân tự ghứp đã thuyên giảm hoàn toàn Điều đặc biệt là loàn bộ các

bệnh nhân tự ghép déu con sống, cho thấy tính an toản của liệu pháp tự ghép Tình

30

trung bình, tế bảo CAR-T tồn tại trong, các bệnh nhàn tự ghép trong 201 ngày, Bên

cạnh đó, nhóm nghiên cứu của TS Coopr còn sử đụng céng nghé “Sleeping

Beauty” để đồng biểu hiện IL-15 củng với câu trúc CAR CDI9RCD28 [64] Kết quá nghiên cửu cho thấy sự đồng biểu hiện 1L~15 giúp tế bào CAR-T có thể tên tại

lau hơn với kiên hình tương tự nhì các tế bào gốc memaory Dặc biệt các thử

nghiệm tiên lâm sảng trên chuột cho thấy các tế bào CAR-T CD19RCD28 đồng biểu hiện IL-1§ có thẻ dược sử dụng chỉ sau 2 ngảy nuôi cây (thay vi 28 ngày dễ đạt được liêu lượng tế bào CAR-T thông thường) mả vẫn đạt được kết quả điều trị Trong muốn Các kết quả khích lệ này cho thấy tính hiệu quả của công nghệ chuyển gen “Sleeping Beauty” cing như các ưu việt của việc dồng biểu hiện IL-15 củng với cấu trúc CAR-T

'Trong nghiên cứu này, tế bảo PBMC được kich hoạt với bị từ Dynalbeads

CD3/CD28 trước khi xung điện nhằm tăng hiệu quả chuyển nạp Sau đó, toàn bộ

tế bảo sau chuyển nạp được nuôi cùng với các tế bảo trình điện kháng nguyên nhân:

tạo aAPC 1D2 dược sản xuất từ dễ tài “Lạo dòng tế bảo K5632 trình diện kháng

nguyên nhân tạo cho liệu pháp miễn địch CAR-T hướng đích CD19” Các tế bào aÁPC 1Đ2 dược thiết kế biểu hiện CD19 cùng các phân tử đồng kich thich CD86, CD64, CD137L, va IL-15 bám màng nhằm tăng sinh đặc hiệu tế bào CAR-~T hướng

địch CD19

1.4 Thử nghiệm lâm sảng sử đụng liệu pháp CAR-T cho bệnh nhân mắc bệnh

ALL

Cho đến nay, hàn hết các thữ nghiệm lâm sàng tế bào CAR-T điền trị AT,

đều tập trung nhằm dich là thụ thẻ CD19, CD19 1a khang nguyên lý lưởng do nó

được biểu hiện mạnh trên bể mặt tắt cá các tế bảo Ö nhưng lại không biểu hiện trong Lé bao gốc tạo mau [88] Hon nữa, việc các tế bào Ð khỏe mạnh bị tiêu diệt

do hiện tượng “on-target, off-tumor” cd thé duge xt ly bang cách tiêm bé sung khang thể cho người bệnh Cáo kết quả thử nghiệm cho đến nay đều cho thây hiệu

quả của tế bảo CAR-T hướng đích CD19 trong digu trị ALL Trong ba nghiên cứu

sử dụng, ba thiết kế khác nhau, tỉ lệ thuyền giảm hoan toan lén din 70 90% ú cá

người lên và trễ em, một vải bệnh nhân trong số này đã được xếp loại “nghiêm trong vá không thể chữa khôi” trước khi tham gia thử nghiêm tế bào CAR-T [82,

88, 89] Một số kết quá thứ nghiệm lãm sang dược trình bảy tong Bang 1.2 dưới

Daopei Hospital CD137 9 Người lớn, 9 MRD ain

té cm tinh

Các kết quả thử nghiệm lâm sảng tại các nhóm nghiên cửu khác nhau có sự

tương đẳng cao về mặt thuyên giãm bệnh, tuy nhiên, thời gian tên tại của tế bào

khoảng 68 ngày và sự hội phục của tế bào B được quan sát thầy sau đó 189]

Gan day, cé 2 liệu pháp CD19R CAR-T điều tri ALL da duoc FDA thing qua là KyruriahT va Yescarla™ Kymriah™ duc chi dinh cho bénh nhan nhi va

thanh niên nhiễm ung thu bach cau lympho B cap tinh Yescarta™ duge chỉ định:

cho bệnh nhân trướng thành nhiễm ung thu lymphoma té bao B 1ém (large L cell lymphoma) Ty 1¢ phan ứng của bệnh nhân với hai liệu pháp điều trị trên ở mức

32

cao: 83% bệnh nhân có dẫu hiệu thuyén giảm chi voi mét lan tiém Kymriah™

[93]; trong khi, tỷ lệ đáp ứng với liệu pháp YescartaTM là 7294

1.5 Tỉnh an toàn của liệu pháp tế bảo CAR-T

Trong điều trị AI.L bằng liệu pháp tế bảo CAR-T, những vẫn dễ an toàn cần

hưu ý là hiện tugng “on-target, off-tumor”, hội chứng bão cytokine va nguy co phat

sinh các đột biến gây ung thư đo sự chèn câu trúc đi truyền vào thể gen của tế bào

1 Để giảm thiểu các tác đụng phụ này, cân tôi ưu hỏa cáo cầu trúc CAR, quy trình chuyển gen (vi dụ việc sử dựng transposon thay vi vector vi rủÐ) và sử đựng các loại thuốc chống phâu ứng viêm Một số phương pháp sau đây có thể được sử dụng

nhằm giám các tác dựng phụ của liệu pháp tế bảo CAR-T

- Chuyển đẳng thời 2 cân trúc CAR vào lế bào T, nhằm nhận biết 2 kháng nguyên khác nhau trên tế bào ung thư một phân tử CAR cúng cấp tin hiệu hoạt hóa (giống như thể hệ thứ nhất) và phân nì CAR còn lại sẽ cưng cấp tín hiệu đồng kích thích

Một ví đụ cho cách tiếp cân này là cầu trúc anti-CD19-CD3C (tín hiệu 1)/ami- PSMA-CD2E-4-1BB (tín hiệu 2) [94] Tuy nhiên, bạn chế của phương pháp nảy là

có thể giảm hiệu quả điều trị;

- Cảm ứng biểu luận CAR thông, qua thụ thể NOI'CH nhân tạo Nguyên tắc của

XOTCII nhân tạo trên tế bào CAR-T khi tương tác với

phương pháp này là thụ thể

1 kháng nguyên đặc hiệu trên tế bảo ung thơ sẽ cảm ứng sự biểu hiện của câu trúc CAR Sau do, phân tử CAR mới sinh sẽ tương tác với kháng nguyên đích và ly

giải tế bảo ung thư [95],

- Sử dụng chiến luge gen ty sat (suicide gene) trong, thiết kế tế bảo GAR-T nhằm

kiểm soát sự tầng sinh của lế bào CAR-T trưng cơ thể người bệnh, hạn chế hiện

tương “on-target, off-taror” hay phát sinh các tế bào T ung thư [96] Gon sự sát

được dụng phổ biển nhất la USV-1'K (herpes simplex virus thymidine kinase), Khi 'bể sung ganeiclovir (GCV), HSV-TK cùng với các kinase của người sẽ thực hiện quả trình phosphoryl héa GCV tao GCV-triphosphate, vốn có khả năng, kết thúc sớm quá trình kéo dai mach DNA va gay chết tế bảo theo chương trình Gắn đây,

hé théng iCasp9 (inducible caspase-9) da durac chtmg minh tính hiệu quả trong thử nghiệm lâm sảng tạo mâu Khi bổ sung chất dimer héa

AP20187 (chemical inducer of dimerization, CID), hai tiéu phan caspase-9 sẽ được

kết hợp lại thành một phân tử hoàn chỉnh, gầy tê bào theo chương trình

33

Nghiên cứu của Hoyos và công sự cho thấy céu trie CD19 CAR/IL-15/iCasp-9

giúp tăng hiệu quả điệt tế bào ung thư ø vo và có thể gây chết tế bảo CAR-T

theo chương trình khi cỏ sự hiện điện của AP20187 [97] Ưu điểm lén nhất của

iCasp9 so với HSV-TK lá thời gian tác động rất nhanh của AP20187 (tỉnh bằng

phúU) Do vậy, các nghiên cứu hiện nay đều có xu hướng sử đựng iCasp9 thay cho HSV-TK

- Chuyển nạp mRNA cũng có thể cải thiện tỉnh an toàn của liệu pháp tế bao CAR-

T, thông qua hạn chế thời gian biểu hiện phân tử CAR Tuy nhiên, hạn chế của biểu hiện CAR ở dạng mRNA là bệnh nhân sẽ phải truyền tế bảo nhiều lẳn dé dat

được hiệu quả điều trị Như đã để cập, một ứng đụng khac cla mRNA trong tăng

tỉnh an loàn của liệu pháp tế bảo CAR-T là biểu hign transposase & dang mRNA

thay vi DNA plasmid, Qua do, loại bỏ nguy cơ hỏa nhập thể gen

1.6 Cách tiếp cận, tính mới, tính sáng tạo của dễ tài

Khử phân tích các công trình nghiên cứu và các thứ nghiệm lâm sảng ứng

dụng tế bảo CAR-L để điều trị ALL, có thể nhận thấy là hầu hết

trúc CAR-T hướng địch là thụ thế CDL9 Các câu trúc CAR-T cho hiện quả điển

thuật chuyển cầu trúc đi truyền CAR vào lễ bảo T, hiện có 2 cách tiếp cận chủ yêu la: G) sit dung vecto vi rut và (ii) sử dụng công nghé Sleeping beauty Uu diém chủ yếu của việc sử dụng vectơ vi rút là hiệu quả ti nạp rất cao Tuy nhién, quy trình sân xual vevto vi rút đạt tiêu chuẩn MP là rất phức tạp với giá thành cau; trong khi đỏ, công nghệ Sleeping beauty lại sử dụng các plasmid vốn có thể được

thủ nhận dé dang tir 2 coli Đề lăng tính an toàn c

tạo tế bảo CAR-T, mRNA mã hóa SB transposase dược sử dụng thay thể plasmid rang gen mã hóa SI3 transposase truyền thông Một cách tiếp cận khác là đồng

ch tiếp can Sleeping beauly

biéu hién IL-15 cing voi cau tric CAR-T ciing 88 gitip té bao CAR-T ting sinh tét

và tôn tại lầu hơn trong cơ thể Để dám bảo tỉnh an toàn của liệu pháp CAR-T, cần

có mệt giải pháp để kiểm soát sự tăng sinh của tế bảo CAR-T trong cơ thẻ Các

cân trúc iCasp9 hiện đang được tra chuông do khá năng tác động rất nhanh của

AP20187, giúp điệt ngay các tế bảo CAR-T trong các trưởng hợp qué man căm

với các hiệu ứng phụ khi điều trị bằng tế bào CAR-T,

Với những, phân tích ở trên, đẻ tải nảy cũng được tích hợp những diễm ưu việt nhất của những nghiên cửu đã công bế về lĩnh vực CAR-T hưởng đích CD19 Đầu tiên, việc chuyển cầu trúc đi truyền vào tế báo T sẽ được thực hiện bằng công nghệ Sleeping beauty nhằm don giản hỏa quy trình sản xuất, giám giả thành Các

kết quả nghiên cứu của TS Cooper và cộng sự từ Dại học Texas đã chứng minh

tỉnh khả thi của liệu pháp CAR-T sử đụng công nghệ Sleeping beauty để chuyển cầu túc CAH vào tế bảo T Cấu tric Sleeping beauty CAR-I' sé co dang

CDL9RCD137 thay vi CD19RCD28 do CD137 đã được chúng mình là trụ việt hơn

so với CD2B về khả năng giúp tế bảo CAR-T tên tại lầu hơn rong cơ thể Ba điểm xrởi khác so với cáo nghiên cửu của của TS, Cooper và cộng sự là: (1) cầu trúc biểu, hiện CAR-T thê hệ thứ tư được tích hợp trên cing một plasmid duy nhật giúp đen

giản hỏa quy trình chế Lạo cũng như đâm bão khả năng kiểm soát hiệu quả su tang sinh của tế bảo CAR-T sau nay; (ii) st dung mRNA mi hoa SB transposase thay

vi plasmid mang gen m4 héa SB transposase dé dam bảo tính ồn định của cầu trúc

CAR-T, (iii) sử đụng cầu Irúc iCasp9 dễ kiểm soát sự tắng sinh cia 14 bao CAR-T

trong cơ thể, đắm báo tính an toàn của liệu pháp điều trị

Theo sự hiểu biết của chúng tôi, cho đến nay, chưa có công bố nào trên thể

giới thiết kế biên hiện CDI9RCD137 và iCasp9/IL-15 trén ctmg mét plasmid duy

nhật và kết hợp với mRNA mã hóa SB transposase cho quá trình chuyén nap Với

tảo hiệu năng cũng như tính an toàn của liệu pháp.