Luận văn thạc sĩ nghiên cứu qui trình tách chiết cao mộc nhĩ Đen auricularia auricular judae Ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Các nghiên cứu về Mộc nhĩ đen cũng đã chỉ ra rằng, polysaccharide phan lap tir Méc nhĩ đen là hoạt chất sinh học chủ đạo tạo nên các chức năng được lý trên Trên thị trường hiện nay, các

Để hoàn thành Luan văn Thạc sĩ này, bên cạnh sự cô gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhân được sự động viên vả giúp đỡ rât lớn của nhiều thây, cô giáo, gia đình và bạn be

Với lỏng biết ơn sâu sắc téi xin chan thảnh gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng — Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Ths Hoàng

Phuong Lan - Viên Hóa học Công nghiệp Việt Nam, là những người đã tận tình

hướng dân, định hướng vả giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn

thành Luận văn

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ nghiên cứu Trung

tâm Hóa Thực Vật — Viện Hỏa học Công nghiệp Việt Nam giúp đỡ, hướng dẫn

và tạo điều kiên cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới các thấy cô Viện Công nghệ Sinh

học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo

điều kiên giúp đỡ tôi trau đôi kiến thức chuyên môn và cuộc sông

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng môn lớp CNTP 2014B đã cùng

tôi đồng hành, cùng tôi trải qua những năm Học viên dưới mái trường ĐHBKHN

thân yêu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và

toản thể bạn bẻ đã luôn là điểm tựa tình thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi,

giúp tôi hoàn thảnh tốt Luận văn

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2016

Đoàn Thị Xuân Liễu

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hưởng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng

trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ

nghiên cứu, học viên, sinh viên đang làm việc tại phòng thi nghiệm Trung tâm Hóa Thực Lật— Uiện Hóa Học Công nghiệp Liệt Nam

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chỉ và trang web theo danh mục tài liệu tham

khảo của luận văn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

i, ngày 27 tháng 09 năm 2016

Đoàn Thị Xuân Liễu

MUC LUC

MỤO DỰ Guanaseyeseasemeiaansse G450)210/08/20030 09030008 eggexnauagz,anaulfff

1.1 Mộc nhĩ đen Aurieularia auricular-judae "

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân bồ của Mộc nhĩ đen

3 1.1.2 Thành phân dinh đưỡng s 2252222222226, tt col

1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cửu Mộc nhĩ đen 8 1.2.1 Tình hình sản xuất và nghiên cửu Mộc nhĩ đen trên thể gidi ee 8

1.2.2 Tình hình sản xuất vả nghiên cứu Mộc nhĩ đen ở trong nước 9 1.3 Polysaccharide trong Mộc nhĩ đen 55¿ 53222212 cx2+ M"

1.3.3 Hoạt tỉnh sinh học của ƒ-glucan ca Atta 1680 15 1.4 MỘT SÔ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLISACCARIT 19 1.4.1 Một số phương pháp chiết tách polysacearit phô biền on xen Ợ)

1.42 Định hướng lựa chọn phương pháp chiết tách polysaccharide từ Mộc nhĩ

21

ÔHneeonaeaseio

1.43 Một số sản nắn di chức năng chứa polysaccharide chiết xuất từ Mộc nhĩ

ĂNHotBottotiribsid10808/5159098010080/05890020M PECL SS eeepc end)

3.2.5 Tỉnh toán xác định hiệu suất thu hỏi polysaccharide trong quả thê Mộc nhĩ

2.2.6 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách polysaccharide từ Mộc nhĩ

2.277 Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất tách chiết và thu

nhận polÌysaccharide cesses TH HH 0 0.000 n0 ren 30

22/71 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liêu tới hiệu suất tách chiết

2.2.7.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tách chiết polysaccharide 30

2 2.7.3.Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất tách chiết polysaceharide 30 2.2.7.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ NL/ DM chiết hiệu suất tách chiết polysaccharide 30 3.2.7.5.Ảnh hưởng của tỉ lệ EtOH tới quả trình thu nhận polysaccharide 30 2.2.8, Nghiên cứu một số đặc tính của polysaccharide 3Ä 2.2.8.1 Anh hưởng của nhiệt độ đến đặc tính của polysaccharide ee

2.2.8.2 Anh hưởng của pH đến đặc tính của polysaceharide - 31

CHUONG II KET QUA NGHIEN CUU VA THAO LUAN

3.1 Xác định khối rong polysaccharide thé trong Méc nhi den Lao Cai — Viet

3.2 Kết quả lựa chọn phương pháp chiết tách polysaecharide từ Mộc nhĩ đen 33

3.3 Nghiên cửu các yêu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết polysaccharide tir Méc

TIỀN đME su enaeuaiaensosoa 4:25904144/9440225i004G.100 0e1x462604g014008200:G134203803148614000 44 35

polysaccharide mm ~

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất tách chiết polysaccharide 37

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất tách chiết polysaccharide 39

3.3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ NL/DM tới hiệu suất tách chiết polysaccharide 40

335 Ảnh hưởng của tỉ lệ dịch cô đấeEtOH tới quá trình thu nhận

3.5.1 Cảm quan sản phẩm -2 222222221272 cớ 45 3.5.2 Các chỉ tiêu hóa lý 5 : yaoi 45 3.5.3 Chỉ tiêu vẻ chất lượng, gõt/di2BiđlE từ Mộc nhĩ đen 46 3.6 Nghiên cửu một số đặc tỉnh của polysaccharide từ Mộc nhĩ đen đẻ tải (ĐT)

và so sánh với polysaccharide nhập khẩu từ Hàn Quốc 47 3.6.1, Anh hưởng của nhiệt độ tới độ bèn của polysaccharide asic AD 3.6.2 Anh huéng ctia pH tdi d6 ben etia polysaccharide oo 48

1L KÊT LUẬN ts6i5.0hguig124180616548546G00140à500%gg1/2u8 028380 ausgabaisssossza/Sf

tATTTEETHRUWETEỗO trunnt ntain00A01Lng28800008 888 , „582

Khối liên minh Châu Âu

Lipoprotein ty trong cao_High Density Lipoprotein

Kết tủa

Lipoprotein ty trong thap_Low Density Lipoprotein

Mộc nhĩ đen

Khỏi lượng phân tử

Nguyên liệu/dung môi Phương pháp

Polysaccharide Phong thi nghiém

Superoxit Dismutase Cholesterol tong_Total cholesterol Thí nghiệm

Dé tai

Bang 1.1 Thanh phan dinh dung trong 100g Mée nhi den khé 4

Bang 1.2 Ham lượng vitamin trong Mộc nhĩ đen và rau quả (mg/100g khỏi

Bang 1.3 Thành phần của polysaccharide Mộc nhĩ đen ll

Bảng 3.1 Khoi lượng naa trong quả thể Mộc nhĩ đen Lào Cai — Việt Nam nhac ¬ ms sos : 32 Bảng 3.2 So sánh hai phương phap chiét polysaccharide tir MND

Bang 3.3 Két qua phan tich cao polysaccharide ctia dé tai tai Vién Thue PI

Bang 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt đô tới hàm luong polysaccharide DT va so sanh

với chế phâm polysaccharide nguồn gốc Han Quoc n 48

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của pH téi ham luong polysaccharide (BT) va so sinh voi

Bang 3.6 Dic tinh polysaccharide (DT) va polysaccharide (Han Quoc) 50

ĐANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Bảo tử Mộc nhĩ đen hình bản nguyệt HH nhe 4 Hình 1.3: Cầu trúc phân tử polysaccharide (A, C, E) : =

Hình 1.4: Cầu trúc xoắn đơn và xoắn bậc ba của J-(1,3)-D-glucose so với các câu

Hình 1.5 Lién két B-1,3 glicoside va J-1,6 glieoside s22 14

Hình 1.6 Liên kết J-1,3 glieoside; B-1,6 glicoside va J-1,3:J-1,6 glieoside của

Hình 1.7 Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa polysaccarit từ 23

Mộc nhĩ đen sua a ssonseagaannannsennnnnnnncerensenn 2 Hình 2.1 Mộc nhĩ lung i khô "¬

Hình 2.2 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào 27

Hình 3.1 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu tới quả trình chiết Polysaccharide36 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ toi qua trinh chiet polysaccharide e 38

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết polysaccharide 39

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ NL/DM tới quá trình chiết polysaccharide 41

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dịch cô đặc/EtOH tới quả trình thu nhận polysaccharide 1 01111001201000001000000110eeaseooo 42

MO DAU

Ngày nay, nhu câu vẻ thực phẩm không chỉ dừng lại ở yêu cầu về số lượng, chất lượng mả cỏn hướng tới khả năng phỏng và hồ trợ điều trị bệnh cũng như tăng cường sức khỏe Xu hướng sử dụng vả sản xuất các chế phảm thực phẩm chức năng rất được quan tâm do chúng chứa những thành phân có hoạt tính

sinh học cao và/hoặc các chất có lợi cho sức khỏe Các hoạt chất sinh học nảy cỏ

thẻ được phân lập từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, nâm, vi sinh vật

Trong đỏ, việc tách chiết các hoạt chất sinh học từ nâm đặc biệt lả các loại nấm

ăn, nâm dược liệu hiện đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm

Mộc nhĩ đen, dieularia aurieulargudae được xem như một loại rau sạch cao cấp, được con người sử dụng rộng rãi như lả thực phẩm và được liệu

từ lâu Mộc nhĩ đen là một trong những loài nắm được ưa chuộng ở Việt Nam, không chỉ là một thức ăn lý tưởng mang lại các chất dinh dưỡng cân thiết cho cơ

thể người: protein, chất khoảng, vitamin, it chất béo, mộc nhĩ đen còn có thể dùng đẻ chữa trị một số bệnh rất hữu hiệu như: ly, tảo bón, giải độc gan

Ngoài ra chủng còn cỏ hoạt tỉnh chóng ung thư, điều hỏa miễn dịch, hoạt động hạ

đường huyết, giảm cholesterol trong mau, khang viém, chéng huyết khỏi Các nghiên cứu về Mộc nhĩ đen cũng đã chỉ ra rằng, polysaccharide phan lap tir Méc

nhĩ đen là hoạt chất sinh học chủ đạo tạo nên các chức năng được lý trên

Trên thị trường hiện nay, các sản phẩm Mộc nhĩ đen hầu hết đều nhập

ngoại từ Trung Quốc, Nhật Bản, cỏ giả thành cao Trong khi đỏ, tại Việt Nam,

nguồn nguyên liệu nảy rất dỏi đảo, phong phú, chủ yêu được bán dưới dang nguyên liệu thô, giá trị kinh tế cỏn thấp Bên cạnh đỏ, các cơ sở chế biến nam

hiện còn nhiêu hạn chẻ, chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm trích ly từ Mộc

nhĩ Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất hoạt chất sinh học vả tạo chế phẩm hoạt chất sinh học từ Mộc nhĩ đen làm nguyên liêu cho che biển thực phẩm, dược

phẩm là cần thiết, tạo tiền đề cho quả trình phát triển và khai thác hiệu quả hoạt

chat sinh hoc và nâng cao giá trị gia tăng của nằm và nằm dược liệu Nhận thây tiềm năng ứng dụng của chế phẩm chiết xuất từ Mộc nhĩ đen, tôi thực hiện luân

Auricularia auricular-judae ứng dụng trong sân xuất thực phẩm chức năng”

Đây là một chuyên đề thuộc đẻ tải cấp Bộ Công Thương, do Ths Hoảng Phương

Lan, Viện Hóa học công nhiệp Việt Nam lâm chủ nhiệm

Nội dung nghiên cửu gồm:

~ Lựa chọn phương pháp chiết tách polysaccharide từ Mộc nhĩ đen

~ Nghiên cứu một số yêu tô ảnh hưởng tới hiệu suất chiết polysaccharide

từ Mộc nhĩ đen theo phương pháp lựa chọn

~_ Xây dựng quy trình chiết xuất polysaccharide từ Mộc nhĩ đen

———————-—-

1.1 Mộc nhĩ đen Auricularia auricular-judae

Mộc nhĩ đen(Vân nhĩ, Mộc nhĩ, Nấm mèo, Wood Ear, Jew’s Ear),

Auricularia auricularjudae 1a loai nam duoc liệu, phát triển quanh năm ở các

vùng nhiệt đới Loài nảy được sử dụng rộng rãi trong âm thực và dược liệu Đông

A

Hình 1.1: Mộc nhĩ đen

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân bố của Mộc nhĩ đen

Mộc nhĩ đen lả một loại nằm, mọc trên cây, cảnh gỗ mục, cỏ hình dạng

trồng giỏng như tai người Mặt ngoài mảu nâu nhạt, có lông mịn, ngắn, mặt trong,

nhẫn, màu nâu sâm, đường kinh 2-12 em, thịt nam day 1-3 mm Chan nam

thường rất ngắn (ngắn nhất so với các loại nắm ăn thông thường), tai nắm cỏ

nhiều nếp cong, các gờ gióng như tĩnh mạch tai Nhiệt độ thích hợp cho Mộc nhĩ den phat trién tir 28 — 32°C, néu cao hon 35°C và dưới 15°C nằm kém phát triên,

năng suất thập

Đây là loại nâm có bảo tử mảu trắng ngả, trắng nhạt hoặc trong suốt, đải

16+ 18 ym, day: 6 + 8 tam, hình bản nguyệt,

_

Mộc nhĩ đen phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới, cân nhiệt đới, đặc biệt thích hợp ở các vùng nhiệt đới Tại Việt Nam, chủng phần bồ chủ yêu ở các tỉnh:

Điện Biên, Lai Chau, Lao Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng, Bac Kan, Thai Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Binh, Thanh Hỏa,

Đồng Nai, Cả Mau Trong khi đó, trên thế giới, chủng phân bố ở khắp các ving

ôn đới phía Bắc, bao gồm châu Âu: Nga, Pháp, Ucraina , chau A: Lao,

Campuchia, Trung Quốc, Thai Lan, An Dé va Bac My: Chile, Argentina

Hình 1.2 Bảo tử Mộc nhĩ đen hình bán nguyệt

1.1.2 Thành phần dinh dưỡng

Mộc nhĩ đen chứa nhiều đạm, it mỡ, it calo, có mủi thơm đặc trưng, Ngoải

ra, nỏ còn có các chất có ích cho cơ thể con người như đa đường, khoảng va sinh

tổ (Bảng 1.1) Do vậy, Mộc nhĩ đen không chỉ là món ăn quý mả còn cỏ giả trị

định dưỡng cao [1]

Bang 1.1 Thành phần dính đưỡng trong 100g Mộc nhĩ đen khô

Thành phân Hàm lượng (g/100g chất khô)

Năng lượng 370 kcal

1.1.3 Tính chất dược lý của Mộc nhĩ đen

Từ đầu thế kỷ XX, các nghiên cứu về Mộc nhĩ đen không còn chú trọng

nhiều vào đặc điểm sinh dưỡng, nuôi trồng mả chuyên sang nghiên cửu vẻ các thanh phan hỏa học, các hoạt tỉnh sinh học của nắm Các nghiên cửu đã chỉ ra

rằng Mộc nhĩ đen có khả năng kích thích sinh tổng hợp nhân tố tăng trưởng than

kinh (NGF - nerve growth factor), tte ché khả năng gây độc của ƒ-amyloid peptide, bao vé va chống lại sự chết tế bảo thản kinh gây ra bởi quá trình oxy

hỏa, hoạt động kháng u, tăng cường miễn dịch, chống lại sự gây déc tế bảo của

các tế bảo ung thư, hoạt động kháng khuan, tac dung hạ đường huyết, hoạt động

khang HIV Cho đến nay đã thông kê được một số nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt

tinh sinh hoe chinh nhu: polysaccharide, acid béo, phenol va va mét s6 chat khae I1

Quả thể Mộc nhĩ đen rất giau polysaccharide thé, chiếm 25,5% trong

lượng nấm khô Các chất nảy đã được chứng minh có tác dụng tốt đối với sức

khỏe, tác dụng hoạt huyết, tiêu viêm, tìm phỏi, thiểu máu, huyết áp, Các thành

phần monosacarit chỉnh ctia polysaccharide nam 1a glucose (72%), mannose (8%), xylose (10%) va fucose (10%) [2,3,4]

Các loài khác nhau, ở những khu vực địa lý khác nhau thì có hàm lượng chất béo tổng khác nhau (0,5 + 4.7%) Sự phân bố các acid bẻo cũng khác

nhau giữa các giỏng trong củng một loài Tuy nhiên, tất cả đều có đặc điểm chung 1a acid béo không bão hòa cao (S2 + 87%) trên tổng hàm lượng aeid béo Trong hầu hết nghiên cứu cho thây rằng, trong số các acid béo không bão hỏa thi

———————-—-

quan trọng cho việc phân loại hóa học và cũng hữu ích cho việc phân hỏa giữa các loài trong củng gióng [5]

Bang 1.2 Tỉnh chất dược lý của Mộc nhĩ đen và một số loại rau quả

(mg/100g khối lượng tươi) [6]

Mộc nhĩ đen là nguồn protein thực phẩm tốt cho con người Thông

thường, protein chiếm 10+12% hàm lượng chất khô và do đó vượt trội hơn nhiều

loại thực phẩm Phản lớn các loài nắm chửa tất cả các acid amin thiết yêu

Isoleuxin, Leuxin, Lysin, Metionin, Phenylalamin, Valin, Tyrosin, Trytophan, Alanin [6] Mộc nhĩ đen cũng là nguồn nguyên liệu giảu vitamin Ham long

riboflavin (vitamin B2) va acid nicotinic (niacin, vitamin B3, vitamin PP) trong

nâm tương đương trong nằm men Hơn nữa, nằm chứa nhiều acid ascorbic

(vitamin C) hơn, nhưng ít thiamine (vitamin B1) hơn so với nằm men Phản lớn nắm cỏ thể tạo ra ergosterol vả tiền vitamin D

Trong âm thực Châu Ả, tiêu biểu là Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc,

Trung Quốc, Mộc nhĩ đen là thực phẩm được ua chuộng sử dụng kết hợp trong

các món ăn nhiều nhất Hương vị đai, giỏn đặc trưng khiển nó trở thành thực phẩm được yêu thích và hương vị không the lẫn khi được kết hợp củng các loại

sup, cha nem, salad, món trộn

Bên cạnh giá trị âm thực của nó, Mộc nhĩ đen còn có tính chất dược liệu quan trọng vả đã được sử dung như một vị thuốc thảo được trong các bài thuốc của y học cỏ truyền Theo các bác sĩ y học cỏ truyền thi “loại nắm dược liệu nay

có tính ngọt bình, đi vào các kinh tỷ vị, đại tràng, can, thân; tác dụng làm mát máu, làm ngừng chảy máu do va đập, bị thương, chữa trị các bệnh trường phong

hạ huyết, nhuận táo, lợi trưởng vị, ly ra máu, đái dắt, đái ra máu, trị lở, bỏ khí,

bên cơ, hoạt huyết”

Nghiên cứu gân đây của khoa học hiện đại đã tìm ra những đặc tính mới,

các thành phần hoạt chất cỏ trong loại nằm nảy Giống như những loại nằm dược

liệu khác, Mộc nhĩ đen chứa ham hrong polysaccharide cao va day la nhimg

thành phần có hoạt tính sinh học chính (chéng ung thư, kích thích miễn dịch,

chồng đông máu, giảm cholesterol), mặc dù phenol cũng đã được chứng minh la

chất có vai trỏ chồng oxy hóa

Tac dụng chóng viêm: Khoa học nghiên cửu cho thay polysaccharide co trong Mộc nhĩ đen có hoạt tính kháng viêm, tương ứng với việc sử dụng Mộc nhĩ

den trong việc giảm nhẹ tỉnh trạng viêm hay bị kích thích của viêm mạc

Tác dụng chống oxy hỏa: Chiết xuất từ Mộc nhĩ đen cho thấy đặc tính

chống oxy hỏa mạnh với một mỗi tương quan tích cực giữa néng đỏ phenol và

khả năng chồng oxy hóa

Ngăn ngừa hiện tượng đông máu: Chiết xuất polysaceharide trong Mộc nhĩ đen ức chế sự kết dính tiêu câu vả tăng thời gian đông máu trong éng nghiệm và trong cơ thẻ sống Hoạt tỉnh chống đông máu của nó là do xúc tác của chất ức chế đông máu chồng lại hiện tượng máu đông,

Giảm cholesterol: polysaccharide trong Mộc nhĩ đen đã được chứng minh:

giảm mức độ cholesterol trong máu (TC), mite dé triglyceride va LDL va tăng

cường mức độ HDL trong máu, cũng như tỷ lệ HDL/TC và HDL/LDL

Bao vệ tim mạch: Củng với đặc tính chống oxy hóa nói chung

polysaccharide trong Mộc nhĩ đen cho thấy hiệu quả cao trong bảo vệ tìm mạch,

superoxide dismutase va giam lipid peoxy hoa

Một số bằng chứng cho thây uống thường xuyên Mộc nhĩ đen ở liêu lượng

nhỏ có thể tác dụng trong việc ngăn ngừa vả điều trị bệnh đột quy va dau tim

Tốt cho xương: Mộc nhĩ đen chứa hảm lượng cao protein, lipid, glucid, canxi, photpho, sắt, chất xơ và các vitamin nên rất tốt cho xương Các nhà khoa học khuyên cáo nên dùng Mộc nhĩ đen cho trẻ em để phát triển hoàn thiện về vóc dáng, dủng cho các bệnh nhân có bệnh về xương, khớp, giúp xương chắc khỏe Qua nghiên cứu, các nhà khoa học còn thu được một số bằng chứng cho thây vai

trò của loại nắm nảy trong việc điều trị bệnh tiểu đường vả một số căn bệnh nan

y như gan nhiễm mỡ, sỏi mật, sỏi thận, các bệnh ung thư thêm vào đỏ, một số nghiên cửu cũng chứng minh nỏ có thẻ đảo ngược quả trình lão hóa bằng cách tăng hoạt tỉnh cho SOD đề sửa chita DNA

1.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu Mộc nhĩ đen

1.2.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu Mộc nhĩ đen trên thế giới

Mộc nhĩ đen được ghi nhận lả loài nằm đầu tiên trên thế giới được nuôi

trồng vả nuôi trồng đầu tiên tại Trung Quốc năm 600 sau công nguyên Đâu thể

kỷ XX Mộc nhĩ đen đã được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại rất

nhiều nước trên thê giới Nhật, Pháp, Mỹ Tổng sản lượng Mộc nhĩ đen năm 1991

đã vượt quá 465.000 tấn (trọng lượng tươi), tăng 346.000 tắn tương ửng với

290% so với củng kỳ năm 1986 Sản xuất Mộc nhĩ đen hiện nay chiếm khoảng,

11% tổng nguồn cung cap nam trồng trên toàn thẻ giới [30]

Gan day Trung Quốc, Nhật Bản là những nước trồng nhiều Mộc nhĩ đen

nhất trên thế giới Các nước nảy còn phát triển nghiên cửu chiết xuất

polysaccharide tir Méc nhi đen vả đang cung cấp cho thị trường trong vả ngoài nước một số sản phẩm dang bột, dạng viên nén rất có giá trị về dinh dưỡng và

phỏng trị bệnh Đã có một số nghiên cứu tận dụng phê phụ phẩm nồng nghiệp va

công nghiệp chế biên đề làm giá thê nuôi cây nắm trên môi trường rắn xốp Điều nảy có ý nghĩa rất lớn vừa giảm thiểu được ö nhiễm môi trường, tận dung phe

chiết polysaccharide từ nâm lớn và nó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật

Bản Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học vả viên nghiên cửu đã góp phân

to lớn vào việc định loại, tách chiết, định lượng, định tính các thành phần khác

nhau của polysaccharide trong nắm Các nhà khoa học vả các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực ngày càng chú ý hơn đến việc sử dụng polysaccharide đề giải quyết nhiều vẫn đề liên quan đền đáp ứng miền địch, phỏng vả điều trị bệnh Năm 1983

Nhật Ban đã công bố nghiên cứu ứng dụng polysaceharide chiết từ Mộc nhĩ đen

trong điều trị chồng viêm ở chuột với hoạt tỉnh kháng viêm mạnh [20]

1.2.2 Tình hình sản xuất và nghiên cứu Mộc nhĩ đen ở trong nước

Mộc nhĩ đen là loại nằm được thu hải tự nhiên vả nuôi trồng từ lâu đởi Cho đến nay tại Việt Nam đang cỏ rất nhiều trang trại nuôi trồng nắm: Ba Vì (Ha Nội), Ninh Bình, Mê Linh (Vĩnh Phúc), Sapa (Lao cai), Thải Nguyên, Da Ning, Đồng Nai, Thủ Đức tông sản lượng dat hang trăm ngàn tan khô/năm Tuy

nhiên, nguồn nguyên liêu nằm nảy chủ yêu phục vụ cho nhu cầu chế biên thực

phẩm trong nước vả xuất khâu

Mộc nhĩ đen là một mặt hàng xuất khẩu cỏ giả trị cao, đứng thứ 7 trong số các loại nắm ăn được buôn bán trên thẻ giới Nước ta có nhiều tiêm năng đề phát triển nghẻ trồng nằm Trong những tháng đâu năm 2010, xuất khâu nâm các loại

tiếp tục tăng trưởng mạnh Theo sỏ liêu thống kê của Tổng cục Hải quan, trong năm tháng đầu năm 2010 kim ngạch xuất khẩu Mộc nhĩ đen đạt khả và tăng

trưởng cao, đạt 117,6 nghìn USD tăng 156% so cùng kỳ 2009 [31]

Ở nước ta, một số vùng phát triển nghẻ trồng Mộc nhĩ đen mạnh và tương

đổi én định như: Đông Nai (Long Khánh), sản lượng trung binh 1000 = 1200 tân nắm khô/năm Tại thảnh phó Hồ Chí Minh (Hóc Môn, Thủ Đức, Củ Chị, ), sản lượng khoảng 100 + 150 tan nam khô/năm Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

(Can Tho, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Trả Vinh, ), sản lượng đạt

khoảng 100 tấn năm khô/ năm Như vậy, nêu tính cả số nắm nuôi trồng rải rắc ở các tỉnh khác của phía Nam, bao gồm một vài tỉnh miễn Trung, thì tổng sản lượng Mộc nhĩ đen nuôi trồng hiện nay khoảng 1500 tân nam khô/năm [31]

———————-—-

nay chủ yêu là dạng truyền thống tức là sử dụng giả thẻ rắn đề trồng nắm thu quả

thẻ Hiện nay chưa có một công bồ kết quả nghiên cửu liên quan đến sản xuất

sinh khói sợi nảm Các nghiên cứu vẻ tách chiết hoạt chất nằm cũng không nhiêu, chủ yêu tập trung trên nắm dược liệu như nắm Linh Chi

Năm 2012, khoa Công nghệ hóa và thực phẩm trường Đại học Lạc Hồng

đã công bồ kết quả chiết xuất polysaccharide từ quả thẻ Mộc nhĩ đen sản xuất trà

nắm mẻo Ket qua cho thay tra nam mèo là loại trả giàu giá trị dinh dưỡng như

đạm, gluxit, khoáng, hàm lượng phenol tổng, là sản phẩm trả ít chất béo cỏ thể

cho người tiểu đường hay béo phì Đặc biệt là hàm lượng xơ hòa tan trong trà

nằm mèo có rất nhiều ưu điểm có thể phòng chóng được bệnh và hỗ trợ cho cơ

the trong việc đảo thải một số chất độc ra bên ngoải [31]

Hiện nay, đã có một số đơn vị nghiên cứu, ửng dụng sản xuất

polysaccharide từ các nguồn khác nhau phục vụ nhu câu nguyên liệu được, thực

phẩm hoặc thủy sản Ví dụ nghiên cứu gần đây là tách chiết B-glucan tir thanh té

bao nam men của Viện Công nghệ sinh học (2005) Hoặc trưởng Đại học Cân Tho (2011) nghiên cứu sử dụng chiết suất ƒ-glucan từ rong biên đề tăng sức dé

kháng của Tôm biên Tuy nhiên, hầu như chưa có đơn vị nào nghiên cứu sản xuất

polysaccharide từ Mộc nhĩ đen sử dụng làm thực phẩm chức năng [7,29]

1.3 Polysaccharide trong Mộc nhĩ đen

Polysaccharide là các cacbohydrate khối lượng phân tử cao Chúng được

xem như polyme ngưng tụ của các monosaccharide nói với nhau bằng mới liên

kết ơ hoặc ƒ glycosit Khi thủy phân hoàn toan polysaccharide sé thu được các

đường đơn (hay dẫn xuất của chủng) Trong tự nhiên hợp chất hữu cơ nảy chứa

10-15 gốc đường nhưng hầu hết thường chứa từ 80-100 gốc đường, nhiều loại còn vượt quả con số nảy chứa tới 3000 gốc đường, polysaecharide không có vị

ngot nhur monosaccharide hay disaccharide, nó tổn tại dưới hai dạng chỉnh:

- Dang không tan tôn tại chủ yêu ở dạng tế bảo

-_ Dạng hỏa tan tồn tại ở dịch bào được cầu tạo bởi các gốc axit galacturonic

trong đỏ một số gốc axit cỏ chửa nhóm thẻ CH;O-

nghiên cứu khoa học thì polysaccharide tỏn tại phổ biển nhất dưới bốn dang

là tỉnh bột, glycogen va cellulose va glucan (tồn tại nhiêu trong các loại nâm)

[78]

Đây là dạng chất tôn tại chủ yếu trong nấm như nấm Hương, Mộc nhĩ đen,

Vân nhĩ, Hầu thủ, Linh chí,

Phân tích thinh phan polysaccharide tir qua thé Méc nhĩ đen cho kết quả

có ba D-glucans (A, C, và E) vả hai axit heteropolysaccharide (D và B) Phương

pháp quang phỏ cho thấy polysaccharide có mạch chỉnh là j-(1,3)-D-glucans với

các nhóm phân nhánh khác nhau Các thanh phan monosaccharide chính của

polysaccharide 4 auriculariajudae la glucose (72%), mannose (8%), xylose

(10%) và fueose (10%) Trong đỏ thành phản duong ciia polysaccharide D va B

duge xac dinh la xylose, mannose, axit glucuronic va glueose, cỏn thành phan

ctia polysaccharide A, C va E la glucose (Bang 1.3) [2,9]

Bảng 1.3 Thành phần của polysaceharide Mộc nhĩ đen

polysaccharide A, C, E, D, và B là 117, 144, 200, 30 và 50 Câu trúc không gian trong nước của A và E là chuỗi cứng chắc; C, D, B là chuỗi linh động xoắn bậc

ba

Một glucan A tan trong nước đã được phân lập từ quả thẻ Mộc nhĩ đen

Nó bao gồm một chuối chính của liên kết beta-(1,3)-D-glucose, hai trong số ba don vi glucose bi thay ra 6 vi tri C-6 béi mét đơn vi glucose duy nhất Glucan A

có khối lượng phân tử trung bình Mw từ 9 x 10” dén 1,6 x 10° trong nude Cac

giả trị độ nhớt [eta] trong nude cao hon so voi trong dimetylsulfoxit (DMSO)

Phân tich ctia Mw va [eta] cho thay, glucan A tan trong nước là chuỗi xoắn sợi don va trong DMSO la chuỗi bán linh động [10]

*CH,OH

Hinh 1.3: Cau trite phan tir polysaccharide (A, C, E)

(a): Ø-(1,3)-D-glucan (b): a-(1,3)-D-glucan (c): 1,3-f-D-glucan nhénh B-1,6-D-glucosit

f se

ee a

củ

Hình 1.4 Câu trúc xoắn đơn vả xoắn bậc ba của J-(1,3)-D-glucose so với các câu

trúc xoắn khác

Nhu da noi, polysaccharide ton tại dưới nhiều dạng, mỗi dạng đều cỏ

những đặc điểm và tác dụng cũng như dược tính riêng Đây là một loại chất rất can thiết cho cơ thể, con người có thẻ bố sung loại hợp chất nảy từ rất nhiều

nguồn khác nhau như: gạo, lúa mi, yên mạch, đưa các loại và các loại rau củ quả tươi Ngoài các loại thực phâm thông dụng, con người cỏ thẻ sử dụng thêm các loại thảo được từ thiên nhiên như các loại nằm được liệu (mộc nhĩ đen, nằm

hương, nấm hầu thủ, ), đông trùng hạ thảo, vv cũng là nguồn cung cap

nhiều hoạt chất này ở những dạng mang dược tính cao cỏ tác dụng lớn trong hỗ

trợ nâng cao sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, đặc biệt

làung thư [11]

1.3.1 Sơ lược về B-Glucan

P-glucan la mét polysaccharide ctia D-glucose dugc tao nên tử các liên kết

B-glycoside ƒ-gluean trong tự nhiên thưởng co trong thanh té bao thue vat, hat ngũ cốc, nam men, nam và ví khuẩn Với các dân chất (1,3) D-gluean, câu tạo

phan tir c thé chi la 1 mạch thẳng tạo bởi các liên kết 1—»3 hay cỏ thể “phan nhánh” bởi các liên kết 1+6 hay 1—4 Người ta thưởng gọi chủng là các (1,3/1,6)-B-D-glucan hay (1,3/1,4)-B-D-glucan [40]

_

nguồn gốc sinh vật của chúng Các (1,3) D-gluean của vi khuẩn thường là một

mạch thằng (vi dụ như curdlan của loài vi khuan Agrobacterium biobar) Cac

(1,3)-B-D-glucan cia nam thường là một mạch phân nhánh dạng xương cá với mạch nhảnh ngắn nói vào mạch chỉnh bằng day néi 1>6, (ví dụ như

schizophyllan của nâm Sehizophylhưm eommune) Các (1.3)-~-D-gluean của nằm

men có câu tạo tương tự như của nâm nhưng có mạch nhánh dài hơn Các (1,3)-

-D-glucan của thực vật bậc cao lả một mạch thẳng 1—>3 trên đỏ xen kế nhánh

14 [38][39]

Bang 1.4 Mot sé loai B-glucan

B-glucan

1.3.2 Tính chất của B-glucan

J-glucan không hòa tan trong ethanol, aceton nhưng lại tan trong NaOH

vả (CH;);§O, tan ít trong nước Sự hỏa tan nảy do sự giảm bậc trong cầu trúc hóa

học dưới tác động của chất oxy hóa mạnh Dung dịch nước của cac B-glucan 6

nồng độ cao có độ nhớt cao Do có câu trúc mạch xoắn đải nên dung dịch (1,3)- -D-glucan trong nude cũng có tỉnh chất tạo gel Mức độ hỏa tan và khả năng tạo gel của (1,3)-B-D-gluean phụ thuộc vào khối lượng phân tử và mức độ phân nhánh của chúng [41]

1.3.3 Hoạt tính sinh học của j-glucan

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng J-glucan với liên kết (1,3/1,6) cỏ hoạt tính

sinh học cao hơn ƒ-glucan với liên kết (1,4/1,6) Sự khác nhau về độ phân nhánh,

trọng lượng phân tử va bac cau trúc J-glucan sẽ ảnh hưởng đền tỉnh hỏa tan, hoạt động và hoạt tỉnh sinh học của chúng ƒ-glucan cảng phân nhánh mạnh hoạt tính

sinh học càng cao Một sỏ hoạt tính sinh học nỏi trội của ƒ-glucan như là khả

năng tăng cường miễn dịch, hoạt tính chóng khói u, chồng viêm, kháng khuẩn, hạ cholestrol, tri dai thao đường, ha đường huyết, Thông thường con người sử

dụng 100 mg một ngày dé hỗ trợ khả năng miễn dịch và làm giảm cholesterol

Neu ban dang điều trị và muốn bỏ sung ƒ-glucan vào liều thuốc của bạn, bạn có

thé bé sung 200-500 mg một ngày Nêu bạn mắc phải tiêu đường, ung thư hoặc

nam va sau đó giảm xuống duy trì ở liều lượng 100 mẹ thông thường Nó không

có tác dụng phụ nảo cả, ngay cả ở liễu cao và có thẻ sử dụng chung với thuốc

theo toa [43][40]

& Khả năng tăng cường miễn địcÌ:

Đặc tinh sinh học quan trọng được chú ý nhiều nhất của j-glucan lả khả

năng tăng cường miễn dịch Nó được xem là chất tăng cường miễn dịch tự nhiền

mạnh mẽ nhất mả khoa học từng biết đến Cơ thẻ người có các tế bào bạch cầu

lớn hay còn gọi là đại thực bảo (macrophages), bạch câu trung tính (neutrophils)

và các tế bảo khác được tìm thấy trong tất cả các mỏ của cơ thẻ Các tế bảo nảy

giúp diệt vi khuẩn, tế bảo lạ xâm nhập cơ thẻ, các tế bảo đã và đang chết, các tế

bảo đột biến và các chất độc khác trong máu Bạch cảu là những tế bảo quan

trọng nhất trong hệ thông miền dịch của cơ thẻ người Ví dụ, các tế bảo giết tự

nhién (natural killer-NK) giúp tiêu diệt các tế bảo ung thư vả các tế bảo nhiễm bệnh đi kèm Những tế bảo quan trọng trong hệ thống miễn dịch nảy bằng cách

nảo đỏ được kích hoạt và tăng cường bởi ƒ-glucan J-glucan giúp tăng cường

miễn dich bang cách kích hoạt các tế bảo đại thực bào, tăng gấp đôi số lượng của

chủng trong 24 giờ B-glucan hitu ich trong điều trị nhiều bệnh liên quan den

miễn dịch [43]

Tại Dai hoc Tulane tai New Orleans vào năm 1987, các nhà nghiên cứu cho thay B-glucan ting cường sản xuất interleukin-1 (IL-1) va interleukin-2 (IL-

2) ở chuột Mức độ huyết tương của IL-l và IL-2 được đo sau khi chuột được

cung cấp ƒ-glucan Kết quả cho thây, 1,3-J-glucan tăng cường tạo ra IL-] vả IL-

2 và việc tăng cường sản xuất lymphokine có thể được duy trì đến 12 ngày (Mức

lymphokine cao sẽ kích thích hệ miễn dịch) [43]

Năm 1989, tại Nhật Bàn đã tiêm thử nghiệm ƒ-glucan chiết xuất từ nấm

(Selerotinia) lên chuột, kết quả cho thay: B-glucan giúp tăng cường hoạt động

của tế bảo NK có trong lá lách Khi tế bảo NK gắn kết với J-glucan đã làm tăng

tỷ lệ gắn kết của tế bảo lympho và các tế bào bị hư hại cản xử ly Noi một cách

đơn giản, beta glucan giúp các tế bảo NK mạnh hơn vả hiệu quả hơn [43]

Đặc tính sinh học quan trọng của J-glucan lả khả năng phỏng chồng khỏi u

B-glucan gắn kết với các receptor trên bẻ mặt đại thực bảo và kich hoạt chúng

Khi ở trạng thái kích hoạt, chúng nhận ra và tiêu diệt các tế bảo đột biển và có

hoạt tính kháng ung thư một cách rõ rệt trên dòng tế bảo ung thư

'Yan và công sự viện nghiên cửu Ung thư Mỹ đã chỉ ra rằng các (1,3)-ƒ-D- glucan 6 dang héa tan gin ket voi cac bach cau tại thụ thẻ của receptor 3 (CR3),

lam môi cho receptor khởi đầu quả trinh mắt nhân gây độc tỉnh của các bạch càu khi bạch câu CR3 gắn két với khối u mặt ngoài bỏ thể 3 (iC3b) Như vậy, sự gắn

kết của các (1,3)-B-D-glucan vào CR3 của bạch cầu sẽ kích thích bạch cầu tiêu diệt các tế bảo khỏi u có lớp vỏ iC3b [42]

Các P-glucan lam tăng sản xuất đại thực bảo, bạch cầu vả các tế bảo tiêu

diệt ung thư của cơ thẻ cũng như tăng hoạt tỉnh của các tế bảo T-helper, làm tăng,

IL-l, and TNEu Các yếu tổ này có tác dụng trên việc ngăn cản sự phát triển khối

u trên động vật thử nghiệm Tại Đại học Joseph Fourier ở Pháp J-D-glucan từ

Laetisaria (một loại nâm Basidiomycete) da duoc nghiên cứu vẻ tác dụng đổi với

khỏi u rắn Sarcoma 180 ở chuột Các polysaccharide han chẻ mạnh mẽ sự phát

triển khối u với một tỷ lệ gần như 100% [43]

e Hoạt tính kháng khuẩn

Các nghiên cứu in vitro cho thấy một số -D-glucan cỏ tác dụng làm gia

tăng các hoạt tính chức năng của đại thực bảo kích thích tiết TNEø, làm hoạt hóa

chức năng kháng khuẩn của bạch cầu đơn nhân va bach cau trung tinh, lam tăng

đáp ứng miễn dịch bởi gia tăng sản xuất cytokin tiền viêm vả sản xuất chemokin Các đặc tính này giúp cơ thê chồng lại sự nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt các tác

chuột trước khi chúng bị nhiễm vi khuẩn chết người Mycobacterium bovis Những con chuột được điều trị với B-glucan cho thây con số tháp hon đáng ke của các vi khuẩn trong cơ thẻ và đặc biệt là trong lá lách và gan Các kết quả cho thấy B-glucan c6 tac dung bao vé chéng lai vi khuan Mycobacterium bovis [43]

d Hoat tinh ha cholesterol

Nghiên cứu thử nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu lâm sảng Chicago trén

268 người (đàn ông vả phụ nữ) cỏ hàm lượng cholesterol cao đã được cho sử

dụng J-glucan Kết quả chứng mình rằng các đổi tượng mắc phải hiện tượng tăng

cholesterol huyết (hypereholestemia) ở mức độ nhẹ đến vừa phải cỏ thẻ làm giảm lượng LDL vả cholesterol bằng cách hấp thụ một nhóm các sterol thực vật và beta glucan chứa trong thực phầm như là một phản của một chế độ ăn ít chất béo bão hỏa và cholesterol [43]

e Khả năng ha đường huyết

Năm 1989 tại Nhật Bản, một nghiên cứu những ảnh hưởng của việc cho - glucan vào chuột Brattleboro bị bệnh tiểu đường nhóm 1 Nhận thấy rằng p- lucan cỏ khả năng ức chế bệnh tiểu đường loại 1 và 2 (mellitus and insulinitis) -glucan cũng làm tăng lượng bạch huyết câu trong máu của chuột thử nghiệm

Thi nghiệm nảy đã tạo tiên đẻ cho các nghiên cửu trên người với bệnh tiểu đường

và rồi loan đường máu khác [43]

Nhật Bản năm 1992, một nghiên cứu nữa trên chuột vẻ bệnh tiểu đường nhóm 2 (imsulinitis) đã được thử nghiệm Tỷ lệ bệnh tiểu đường đã giảm từ

43,3% xuống còn 6,7%, tỷ lệ msulinitis đã giảm từ 82,4% xuống 26,3% chỉ đơn

giản bằng cách cho chuột uồng ƒ-glucan chiết xuất từ nâm Hương mà không điều

trị gi khác Hau hết tất cả các con chuột không bị mắc lại bệnh tiêu đường ngay

cả khi ngưng cung cấp chất bỏ sung, điêu nảy cho thấy ƒ-glucan không phải chỉ đơn thuần làm giảm mả còn đã chữa lành hẳn bệnh [43]

dài Số lượng té bào CD4 + của họ đã tăng mạnh cho thấy sự cải thiện các phản

ng miễn dịch, 85% số họ cho biết họ cảm thấy thê trạng khá hơn [43]

1.4 MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT POLISACCARIT

1.4.1 Một số phương pháp chiết tách polysaccarit phổ biến

Hiện nay cơ bản có hai phương phap chiét xuat polysaccharide tan trong nước từ quả thẻ nằm đang được áp dụng ở các nước phát triển là phương pháp

hóa học và phương pháp enzym

~ Phương pháp hỏa học: thưởng sử dụng công nghệ chiết xuất bằng nước

hoặc các dung môi khác nhau như etanol (EtOH), metanol (MeOH),

dichlorometane (DCM), natri hydroxit (NaOH) hay kali hydroxit (KOH), natri

hydrocacbonat (NaHCO5), hoac natri cacbonat (Na,CO3) cé ho&c khéng cé séng

siêu am hé tro dé chiét polysaccharide Sau đó tiên hảnh thu hỏi và tỉnh chế

Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phản tích chứa lớn hơn 20% glucan

tổng số Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp nảy đạt hiệu suất thu hồi 50-

80%, quy trình đơn giản, không tốn kém tuy nhiên thời gian tách chiết lâu

[2,3,11,22,23,24]

~ Phương pháp enzym: sử dụng enzym cellulase va pectinase de tach chiet

polysaccharide sau dé tién hành tỉnh chế Phương pháp enzym thích hợp với các

mau phan tích có chửa hảm lượng polysaccharide thấp Phương pháp này đạt hiệu suất thu hỏi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu vẻ thiết bị hiện đại, chỉ phí cao [25]

Phương pháp của tác giả Mizuno (1992) đã có từ lâu tuy nhiên sử dụng

dung dịch NaOH đề chiết polysaccharide sẽ lảm biến đổi đảng kẻ câu trúc xoan

kép ba của ƒ-glucan tạo thành các phân tử bắt hoạt

Như vây, không phải dé dàng đưa ra được phương pháp chiết tách

polysaccharide phủ hợp má không ảnh hưởng tới hoạt tỉnh sinh học của nó

Theo tác giả Yuan (1998), dựa trên phương pháp chiết tách của Mizmo

(1992) có sửa đổi để chiết polysaccharide trước tiên, bột Mộc nhĩ đen khô được

nghiền có kich thước nhỏ hơn 1mm sau đó chiết xuất với côn 85% ở nhiệt độ

sau khi chiết bằng etanol đem chiết bằng nước nóng 100°C, 3h đẻ thu được các

phần chiết thô Tỉnh chế tiếp bằng các kỹ thuật: kết tủa polysaccharide với

etanol, lọc thu cặn kết tủa hỏa tan trong nước, thảm tách, đông khô thu polysaccharide thỏ Phương pháp nảy chỉ sử dụng dung môi nước vả etanol đã rút ngắn thời gian chiết, hóa chất, bão dam cau tric không gian của ƒ-glucan, hạ giá

thành sân phẩm so với phương pháp của Mizuno, tuy nhiên thời gian chiết vân

kha dai (10 ngay)

Nhiêu nghiên cửu sử dụng sóng siêu âm hoặc sỏng siêu cao đề tách chiết

polysaccharide từ Mộc nhĩ đen Bột nâm được chiết xuất bằng nước nóng có hỗ

sóng siêu âm 6 125W trong 60 Hz trong 5 phút Sau chiết xuất tiên hành ly tâm,

lọc thu dịch lọc, cô đặc và kết tủa với etanol tuyệt đối 95%, lọc thu cặn kết tủa

hỏa tan trong nước, thảm tách, đông khé thu polysaccharide thé[3,4] Mặc dù, kỹ

thuật chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm không làm thay đổi câu trúc phân tử của

polysaccharide, nhung tạo ra các phân tử trọng lượng thấp nên hoạt tính sinh học

của chế phâm thu được kẻm hơn so với phương pháp chiết không hỗ trợ sỏng,

thể bị thay đổi trật tự sắp xếp cầu trúc [27]

Hiện nay sử dụng chất lỏng ion đề chiết tách polysaccharide phương pháp

mới nhất, không làm ảnh hưởng tới câu trúc vả hoạt tính của polysaccharide

Chất lỏng ion là muối hữu cơ có dang lỏng khi ở nhiệt độ dưới 100°C, ap suat hoi thấp, tính ôn định nhiệt cao, có khả năng solvate các phân tử phân cực cũng như

không phân cực Tuy nhiên, ứng dụng của chất lỏng ion vào công nghiệp chiết

tách còn khá mới và giá các chất lồng ion tương đổi đất [28]

Dựa vào phân tích thấy rằng sử dụng những phương pháp trên để chiết

tách polysaeeharide từ Mộc nhĩ đen đẻu cỏ những ưu nhược điểm nhất định Do

phương pháp chiết hợp lý, hiệu quả và kinh tế nhất

1.4.2 Định hướng lựa chọn phương pháp chiết tách polysaccharide từ Mộc nhĩ đen

Qua quả trình nghiên cứu thăm dò và tham khảo tải liệu, chúng tôi cỏ định

hướng sử dụng nước ở nhiệt độ thích hợp và ethanol để chiết tách, thu hỏi

polysaccharide Tuy nhiên, cần có nghiên cứu so sánh với phương pháp khác để

đưa ra phương án thích hợp nhât

Theo tác giả Mizuno (1992), để chiết polysaccharide trước tiên, Mộc nhĩ

den được phơi khô, nghiên nhỏ sau đó được chiết xuất với côn 80% ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ đẻ chiết và loại các chất trọng lượng phân tử thấp Phần nâm

sau khi chiết bằng etanol đem chiết lần lượt bằng nước nóng 100%, 3h; 1%

ammonium oxalate (100°C, 6h) va 5% NaOH (80°C, 6h) đề thu được các phan

chiét thé Tinh ché tiép bang các kỹ thuat: ket tia polysaccharide voi etanol

96%, loc thu cin polysaccharide thé, két tủa phân đoạn, kết tủa bằng axit axetat,

sắc ký trao đôi ion, lọc gel và sắc kỷ ải lưe [26] Thực hiện chiết polysaccharide

theo phương pháp nảy thời gian chiết khả dài >15 ngày), cần nhiều thiết bị tinh

ví, và rất nhiều loại hóa chất khác nhau, khá phức tạp, hiệu suất chiết thấp, nên

giá thành sản phẩm cao

Ở Việt Nam, các nhà nghiên cửu tại Viên công nghệ sinh học (2005) đã đưa ra quy trình tách chiết polysaccharide từ thảnh té bao nam men sử dụng

NaOH 3,3% ở 75°C trong 18 giờ, rồi tình chẻ tiếp bằng NaOH 3% 6 75°C, cén va

dietylete Quy trình này dùng kiểm hai lần đề chiết nên không thẻ tránh khỏi ảnh hưởng của kiêm tới sự biến đổi câu trúc xoắn kép ba của ƒ-gluean tạo thành các phân tử bất hoạt, do đó chất lượng sản phẩm cũng bị giảm đảng kẻ Giá thành sản phẩm khá cao [29]

Đề tải này chỉ dùng nước va etanol 95% đẻ chiết tách polysaccharide tir

Mộc nhĩ đen, chiết một lần, sử dụng phương pháp say déng khô, thời gian chiết khoảng 6 ngày Phương pháp chiết chỉ dùng những thiết bị đơn giản phủ hợp

điều kiện Việt Nam va dung môi thân thiện môi trường

nhĩ đen

Hiện nay, trên thẻ giới có nhiều nước sử dụng Mộc nhĩ đen làm nguyên liệu sản xuất thực pham chức năng, và đưa ra một số sản phẩm có giá trị Tiêu biểu như một số loại thực phẩm chức năng của Cộng Hỏa Séc

- Auricularia-MRL : dạng viên nang là sản pham céng ty Mycology Research Laboratories - MRL chtra sinh khỏi Mộc nhĩ đen, có tác dụng tốt cho hệ

tim mạch, giảm nguy cơ huyết khối Sản pham đã được công nhận chất lượng

đạt tiêu chuẩn Châu Âu cho sản xuất lương thực trong khối EU

- Auricularia: dang vién nang 1a san phim của MycoMedica phân phỏi bởi công ty TCM POINT s.r.0 chita it nhat 23% (230 mg/g) polysaccharide chiet

xuất từ quả thẻ Mộc nhĩ đen, có tác dụng tốt cho hệ thong tim mach, giảm nguy

cơ huyết khôi, chức năng chồng viêm, điều tiết mỡ máu Sản phẩm đạt tiêu chuẩn

Châu Âu

Tại Vương quốc Anh thực phẩm chức năng từ nâm thuốc châu Á rất được

ưa chuộng sử dụng với các tác dụng dược lý của nỏ Wood ear (hot-water extract) dạng viêm nang là sản phẩm của Mushroom Nutrition thuộc sở hữu của

công ty Pure Health Ltd chuyên cung cap nam được liêu chăm sóe sức khỏe từ

năm 1997 Mộc nhĩ đen được chiết xuất bằng nước nóng và sản phẩm có chứa

hơn 30% polysaccharide nấm (beta-glucans proteoglycans vả heteropolysaccharide) Có tác dung tốt cho hệ thống tim mach, giảm nguy cơ

huyết khối, chức năng chồng viêm, điều tiết mỡ máu, chồng oxy hóa, phủ hop

với người ăn kiêng Sản phẩm đạt tiêu chuẩn thực phầm EC

2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu thực vật

Mộc nhĩ đen, dạng khô (4uiewlaria aurieulargudae) được thu mua vào

thang 2/2015, tai Lao Cai Trung bình 100g nắm khô có 15 — 20 cải năm Đường kính tai nắm 5-10em, thịt nằm dày 1-3mm Tai nắm được rửa sạch, nghiên nhỏ

tủy vào yêu cầu nghiên cứu, sau đỏ bảo quản trong túi nilon ở nơi thoáng mát

NaOH (Merk, Đức vả Trung Quỏe)

Và một số hóa chất liên quan cỏ nguồn gốc Việt Nam, Trung Quốc

2.1.3 Dụng cụ và Thiết bị

~ Dụng cụ: Bình tam giác, bình định mức, ông nghiệm, pipet, đĩa peptri

~ Thiết bị: Cân điện EB-2800 (Nhật); Máy đo mật độ quang (Zuzi 4110ED Spectrophotometer, Đức); Máy cô quay chân không (Buchi - Đức); Máy ly tâm

(Hettich - Đức); Và một số thiết bị, dụng cụ cần thiết khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm [32]

Mẫu được sây tại 105°C trong thời gian 2-3h đẻ tách lượng nước tự do va

theo đối đến khi khối lượng không thay đổi thì dừng lại Độ âm của nguyên liệu

được tính theo công thức:

x100(%)

Trong đó

Gị: Khỏi lượng mẫu trước khi say (g);

Gy: Khéi lượng mẫu sau khi sẩy (g);

2.2.2 Định lượng polysaccharide bằng phương pháp phenol-sulfuric

Do polysaccharidee là một hỗn hợp của monosaccharide bao gồm nhiêu loại với

phân tử lượng khác nhau, do vây chỉ cỏ thẻ định lượng giản tiếp polysaccharide théng

qua monosaccharide Quả trình nảy chủ yếu được thực hiện theo phương pháp phenol-sulfurie của Dubois và cộng sự [33], sử dụng D-glucose làm chất

chuẩn Theo phương pháp này, cde monosaccharide, oligosaccharide (nêu còn trong sản phẩm) và polysaccharide sẽ bị chuyển hỏa thảnh các

monosaccharide dưới sự xúc tác của axit sulfuric vả nhiệt (tạo ra trong giai

đoạn axit hòa tan trong dung địch), các đường đơn sẽ bị chuyển hóa tiếp

thanh furfuran (nêu là đường 5C) và hydroxymethyl furfuran (nếu là đường

6C) Furfuran và dẫn xuất sẽ phản ửng với phenol tao ra chat mau vang Do

trong san pham polysaccharide cé thành phản chính là đường 6 carbon nén chất chuẩn duoc str dung la D-glucose Chat nay sẽ được đo độ hấp thụ màu

tại bước sóng 490 nm Khi hảm lượng polysaccharide cang cao, gia tri hap thụ mảu của phương pháp phenol-sulfurie ở bước sóng 490 nm cảng lớn Tủy

từng điều kiện, thành phần nguyên liệu ban đầu, phương pháp phenol-

sulfuric c6 độ chính xác đến + 2% [2,33]

Tiến hành:

> Hỏatan căn polysaccharide trong 100ml nước cất

> Lấy 05ml dịch mẫu trộn đều với 0,5ml dung dich phenol 5%, bé sung 2,5

ml dung dich H,SO, dam đặc, lắc đều các ông nghiệm

>_ Ủhỗnhợp ởnhiệt độ phòng đề hiện màu trong 30 phút

———————-—-

Mẫu đổi chứng dùng 0,5m] nước cất thay mẫu

Tất cả các thí nghiệm được lặp 3 lần rồi chọn giá trị trung bình

> _ Từ hiệu số giá trị OD giữa dich mau và mẫu đổi chứng sẽ tính được hàm

lượng polysaccharide cỏ trong mẫu bằng cách so sảnh với giả trị OD của chất chuẩn D-glucose

Xây dựng dụng đường chuẩn:

> Pha phenol 5%: Can 5g phenol, hỏa tan trong bình định mức 100 mÌ bằng nước cắt, sau khi phenol tan hét, thêm nước cắt đến vạch định mức

> Cân 1g D-glueose tỉnh khiết (chất chuẩn), hỏa tan trong bình định mức 1 lít bằng nước cất thu được dung dịch chuẩn với nỏng độ 1mg/ml

> Từ dung dịch chuẩn, pha thảnh dãy chuẩn với các nông độ: 0, 2:

100, 125, 150 (ng/m])

50, 75,

> _ Lấy0,5 ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các ông nghiệm 5ml

> _ Thêm lần lượt vào tất cả các ông nghiệ

5%, bổ sung 2,5 mÌ dung dịch H;SO; đâm đặc,

chuẩn 0,5 ml dung dich phenol

le đều các ông nghiệm

> Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phỏng đề hiện mảu trong 30 phút

> _ Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490nm

Kết quả xây dựng đường chuẩn:

Đường chuẩn polysaccharide được xây dựng nhờ chương trình Microsoft

Excel được thẻ hiện ở phụ lục PL1 Với trục tung là mật độ quang vả trục hoành là

néng độ chất chuẩn Phương trình thẻ hiện mối tuong quan gitta D-glucose va OD

490 nm là

y =0,006x + 0,0369 Trong đó:

y: Giá trị mật độ quang 6 490 nm (OD) x: Nong d6 D-glucose(,ig/ml)

R? = 0,9954 : hé sé tuong quan

Dựa vảo đường chuẩn, khoi hong polysaccharide cỏ trong mâu thí

nghiệm được xác định theo công thức:

_ xua 107

Cc

x

Trong đỏ:

X: Khối lượng polysaccharide có trong mẫu thí nghiệm (g)

xm.103: Khối lượng polysaccharide trong mâu thí nghiệm (g/1) x: Nông độ glucose trong mâu(ig/m])

n: là hệ số pha loãng (lan)

m: khối lượng polysaccharide thí nghiệm (g)

€: Nông đô mẫu thí nghiệm (g/1)

thi ta xác định được hàm lượng polysaccharide có trong sản pham polysaccharide

thô được tính theo công thức:

x Hàm lượng polysacchande(%)= —_—_—_— — —— x100

KL polysaccharide thô

Trong đó: X là khối lượng polysacaride cỏ trong mâu thí nghiệm (g)

KL polysacaride thé: Khối lượng polysacaride thé (g)

2.2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bồ trí ngẫu nhiên, lập lại ít nhất 3 lân Số liệu được xử

ly trén phan mém thông kê và thông kê toản học

2.2.4 Phương pháp định lượng polysaccharide tổng trong nguyên liệu Mộc nhĩ đen

Quá trình định lượng polysaccharide trong nguyên liệu được thực hiện như mô tả bởi Yuan [3] Theo quy trình này, 100g bột Mộc nhĩ khô được chiết

với 1000 ml etanol 85% ở 25°C trong 48 giờ Quá trình được tiền hảnh 3 lần, phản bã nắm còn lại được chiết 4 lần với 3000 mÌ nước cat ở nhiệt độ 100°C

trong 3 giờ cho mỗi lân chiết Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, chiết bằng

CHCI;: n-C;HạOH theo tỉ lệ 1:4 để loại protein, cô đặc trước khi kết tủa bằng

etanol 95% theo tỉ lệ dịch cô đặc/etanol là 1⁄4 Tiến hảnh ly tâm thu kết tủa, rửa sạch một lần với etanol 95%, thảm tách, đông khô thu bột polysaccharide, dem cân xác định hàm lượng

2.2.5 Tính toán xác định hiệu suất thu hổi polysaccharide trong qua thé Mộc nhĩ đen khô

a Hiệu suất thu hồi polysaccharide được tính theo cỏng thức sau: