Luận văn nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên transistor hiệu Ứng trường sợi silic và Ứng dụng ban Đầu trong phát hiện tế bào lưu chuyển của ung thư vú

12 NGUYÊN LÝ HOẠT DONG CAM BIEN SINH HOC SiNW FET 13 PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET - 131 Chế tạo sợi nano Silie bằng phương nhấp Top Down TP 132 Chế tạo sợi nano bằng phương pháp Botto

ĐẠT HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI PAI HOC QUOC GIA TP TIO CIT MINIT

BÙI HÀ QUỐC THẮNG

NGHIÊN CỨU CHẾ LẠO CÂM BIẾN SINH HỌC DỰA TRÊN TRANSISTOR HIỆU ỨNG TRƯỜNG SỢI SLLIC

VA UNG DUNG BAN DAU TRƠNG PHÁT HIỆN TE BAO

LƯU CHUYÊN CỦA UNG THƯ VỨ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

'Thành phá Hỗ Chỉ Mình - 2012

DẠI HỌC QUỐC GLA HA NOL ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ TP HÔ CHÍ MINH

BUI HA QUOC THANG

NGHIEN CUU CHE TAO CAM BIEN SINH HOC DUA TREN TRANSISTOR HIEU UNG TRUONG SOI SILIC

VA UNG DUNG BAN DAU TRONG PIIAT ITIEN TE BAO

LUU CIIVYEN CUA UNG TITU VU

Chuyên ngành: Vat ligu va Tinh kiện Nano

(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)

TAJAN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: ‘TS FONG DUY LILEN

Thanh phố Hỗ Chí Minh - 2012

si MUC LUC

CHUONG 1: TONG QUAN VE CAM BIEN SiXW FET ì c

11 DAI CUGNG VE CTC TRONG UNG THƯ VỨ ọ

114 ` nghĩa lâm sảng của CTC

12 NGUYÊN LÝ HOẠT DONG CAM BIEN SINH HOC SiNW FET

13 PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET -

131 Chế tạo sợi nano Silie bằng phương nhấp Top Down (TP)

132 Chế tạo sợi nano bằng phương pháp Bottom Up (BU)

14 UNG DUNG CUA CẢM BIÊN SiNW EEL

CHƯƠNG2:- CHẾ TẠO CẢM BIẾN SiNW FET

21 CHE TAO SiNW FET

CHUONG 4 UNG DUNG BAN DAU CUA SINW FET TRONG PHAT HIEN TR

44 XGHIEN CUU, SOITE BAO BANG KINH HIEN VI HUYNH QUANG 47

CHUONG 5: KET LUAN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN cseee

1

CHƯƠNG 1: TONG QUAN VE CAM BIEN SiNW FET

11 ĐẠI CƯƠNG Vii CTC TRONG UNG THU VU

1.11 _ Khái mệm về CTC Là các tế bào ung thu lưu chuyển trong

quả trình sinh phát ung ther va đi căn

1.12 _ Lịch sử nghiên cứu CTC: lẫn đầu tiên được phát hiện năm

1868 hởi bác sĩ Thomas Ashworth Mãi thời gian gắn đây CTC mới

+ _Transistor hiệu từng trưởng,

Transilor hiệu imng lrường sợi Silic (SỈNW EE'L) là loại có nhiều ưu việt trang các dòng transistor hiệu ng trường làm cảm biển sinh học vì:

nó tính siêu nhạy của cảm biến, tình chọn lọc đặc từng rất cao của cảm biến, lính đồng bộ và đa dạng của câm biển, Tình tự do chive săng

bề mặt, Tỉnh đích hạp (lah an chịp), tỉnh tượng thích và cô thễ cha cha

kết quả ngay tính tức thời

1.1.4 Ý nghĩa lầm sàng của CC

Nghiên cứu TC giúp tiên lượng thời kỳ bệnh: đánh gia khía cạnh sinh học của, thông tin đí truyễn và cơ chế quá uình sinh phát ung thự

Hình 1-1 transidor hiệu ứng trường sợi Silic Hai điện cuc nguồn

và mảng được nổi với nhau qua kênh dẫn sợi Silic kích thước

nanomet Độ dẫn qua sợi được điều chỉnh bằng thẻ điền áp vào cực

cong 6 dé Silic (b) Sự thay đôi tỉnh cường độ dòng điện chạy qua

sợi Si loại P khi cỏ các phản tử bị bắt lại trên sợi Dòng điện giảm

khi đối tượng mang điền tích đương, cùng dẫu với điện tích hạt tải

chỉnh trong sợi, làm đồng điện qua sợi giảm Trong khi đổi tượng

mang điện tích âm bị bắt làm dòng điện tăng lên

'Khi tích hợp nhiêu SiNW FET

này trong một chip, và mỗi sợi

Silic được chức năng các phân

tử nhận biết những đối tượng

3

1⁄3, PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO SLNW FET

Cĩ hai phương pháp chế rạo chinh (top down và họtom tp) được ait đụng để ch tạo SÌNW FET

1.3.1 Chế tạo sợi nano Silic bằng phương pháp Top Down

Top down (TD) 14 phmong phap ché tao SINW FET ni dé Silic loại SOI

(Semiconductor On Instlator-SOT) đụa trên các kỹ thuật chủ yếu bao

sơm quang khắc nano (nanolithography), ăn mơn (ctchẳng), tạo đường,

đẫm (nctalhzation) để cĩ được câu trúc SINW EET mong rnnỗn

1.3.2 Chế Lxo sợi nano bằng phương pháp Bollom Up (BU)

1.à phương pháp lao sợi Silic hừ các các nguyên tử, phân tử ban đâu Cĩ thai hướng tiếp cận chính để chễ tao sợi nano theo phương pháp BU là: gương pháp lắng đọng hơi hĩa học (chemical vapor depositiom-

CYD) dựa trên cơ chế chuyển từ Lang Lhái hơi sang trạng thứn lỏng rồi cuối cùng du định ở trạng (hái rắn (vapor liquid solid- VLSỳ, Bốc bay

laser trong đĩ nguồn laser được hội tụ tại một vùng khơng gian nhỏ với

năng lượng cao làm bay hơi chất bán đẫn ban đầu đang ở thế rắn

1.4

NG DUNG CUA CAM BIEN SINW VI

SiNW FIT cĩ nhiều ứng đụng khác nhau mm: Phát hiện loại

trofein mong muốn đựa trên sự tuwng tác protein-protein Phat hién

DNA dựa trên quá trình lai hĩa chuỗi DNA Phát hiện sớm các bệnh ung thự thơng qua phát hiệu các tiomnarker, Giảm sát nhiễm virus bằng cách phái hiện loại vnus đĩ Nghiên cứu quả trình lương lác của các

phân tứ nhỏ cĩ các liên kết nentide Ghi nhận tín hiệu và chuyển đối tín

higu đĩ từ tê bào

4

2.1 CHẾ TAO SiNW FET

Dé ché tao SINW FET, qua nghiên cứu, phâu tích các tài liên, bài bảo chuyên ngành, trao đối với các chuyên pia hàng đân trơng lĩnh vực chế

tạo nano nói chung và chế lạo sợi nano nói riêng và lirn nghiên cứu tình tình thực tiễn tại PTN chúng tôi chọn phương pháp Top down để chế tạo sợi 8ï Để phát hện được các biomakers sợi nano Sỉ sử đụng phái lá các sợi củ chất lượng cao, ở đạng đơn tỉnh thể (single crsytalline Silicon), nén wafer Semiconductor On Insutator (SOI) được đừng

Chế tạo sợi nano Sỉ đằng kỹ thuật Top down, gốm các bước sau [Hin

11 Chế tạo điện cực kim loại để kết nổi sợi Sỉ ra mạch ngoài-hình thành câu trúc transistor hiệu ứng trường sợi

Hinh 2-2 Lop SiO; duoc tao trén lop Silic ban dau cé chiéu day 4Onm

Hình 2-3 Lớp SiN, 2Snm digc hinh thanh trén cau trie lop SiO

Phủ photoresist b,Chiếu sảng ©: Development

lớp S¡;N„ (b) là những nơi photoresist bi chiêu sảng sẽ cỏ màu tim; (c)

những phần màu tim bị rửa trôi trong dưng dịch thuốc hiện (developer)

Hinh 2-5 Lớp S¡¿W„ bị ăn mòn tại nhữn;

tẩy trong khi những vùng không bị t

viing lép photoresist dd duoc lớp SiN, vén con giữt lại

Hinh 2-6 Céu trúc sau khi rita bỏ lớp photoresist

Hinh 2-8 (a) cơ chế ăn mòn dị hưởng wafer Silic <100> trong dung:

địch bazơ của kim loại kiểm; (b) kết quả sau khí ăn mòn dị hưởng tạo

sợi Silic

Hinh 2-9, Sau khi tẩy lớp Si.N, phỉa tren

200am

4000

a Mitt cla soit b Nhìn nghiêng từ tiên xuống,

Hình 2-10 (a) ăn mòn lớp SIO; hình thành sợi Silic, ( bì nhìn nghiêng

từ trên cao với nhiều sợi song song nhau, hai đâu sợi là vùng sẽ phủ

fot Paitin dmdigncye PMÙiớpđ#mđếnzueTflan

Hinh 2-11 Bước chế tạo điện cực gồm sảu bước nhỏ: (a) bước phủ photoresist, (b) chiéu ảnh sảng làm thay đỗi tỉnh chất của photoresist, (c) )

development rita tréi nhig phan photoresist bị chiêu (d) phủ lớp đệm

điện cực bằng kim loại Tỉ mục địch tao tiếp xtte ohmic, (e) phủ kim loại Plaun làm điện cực, (ƒQ liff off-tdy kim loại trén lép photoresist và

photoresist dé.

‘fot + phủ mảng cách điện SỐ, 4 development

Hình 2-12 Các bước thực hiện khí chễ tạo lớp cách điện thụ

động điện cực (a) mặt bền của sợi đã chế tao, „(8 „phủ

photoresist, (¢) chiều ánh sảng lên vùng photoresist cần tẩy đi,

(d) development tay lớp photoresist bj chiéu, (e) phủ lớp cách

điện SiO› bằng phương pháp e-beam (0 liff off hinh thanh cau

trúc có vách ngăn cách điện giữa hai điện cực

SiNW FET chế tạo xong như [Hình 2-13] Lúc này có thể kiểm tra các tích chất điện của SïNW FET trước khí tiễn hành bước chức năng hóa bể mặt hình thành cảm biến.

lepsio, thụ động điện cực

Vũng làm việc

Hình 2-13 Transistor được chễ tạo cỏ dạng như hình vẽ Ving

chỉnh giữa sợi Silic có chiều đài 10um, chiều rộng 2um_ là

vùng sẽ được chửc năng bŠ mặt làm cảm biên Hai đầu điện

cực lộ ra đề cằm nguằn điện, hai lớp cách điện hai bên điện

cure ngăn chăn dòng rò

2.2 CHUC NANG HOA BE MAT SGI NANO

SiNW FET được chế tạo xong để trở thành cảm biển phát hiện một đổi tượng nào đỏ phải qua bước chức năng hỏa be mặt sợi Sỉ

2.2.1 Biomarkers

Biomarker được định nghĩa là chất sinh học chỉ thị mang đấu hiệu cho một bệnh, một chất, một trang thai sinh học nào đỏ hoặc một trạng thái bệnh tật được biển hiện biomarker của chủng ta là cytokerotin, một protein biểu hiện của tế bào biểu mô cửa tế bảo trng thư vủ lưu chuyển

222 Thụthể

Thụ thể là chất đóng vai trò phát hiện chất cân phân tích, trong trường hợp này là các kháng thể anti-cytokarouin nhằm phát hiện cytokarotin của tế bào biểu mô ung thư vú

1E

22.3, Chất kết nối (Linker)

T,â chất liên kết giửa sợi SiHe và rác thụ thể Gintaraldehyđe được cham

vi nd có hai nhóm (CHO), một đân nổi với bê mặt sợi Silic, còn đâu kia nôi với anfi-cytolkeratim

Quy trình chức năng hóa bề mặt sợi nano Silic được trình bảy cụ thể

như [Hình 2-14] Sau quả trinh này, SINW ÈET có thé dùng để phưái

tiện tế bào ung thư vú lưu chayễn trang đưng địch đệm

1 Khử SiO; (2-7nm) trên bề mặt SÏNW để tạo liên kết Si-H bằng

cách

2 Tạo nhóm chức NH; (được bảo vệ)

3 Rữa chúp với đung địch chioroform trong 15 phút 6 50°C và rửa lại bang methanol hai lan ở nhiệt độ phòng, muỗi lần 5 phúi Mục dính lâm bên đơn lớp tert-butyf silylcarbamate đã gắn lên sợi và tẩy hết đừng mãi methanol ở bride 2

4 Loại bỏ nhóm chức t-BOC bảo vệ gốc amin bằng cách :

Khi phén tir tert-butyl zllylearbamate đã gắn vào sợi Si, nhóm NHI;

tị bảo vệ bởi nhỏm (BÓC nên chúng không (hỄ Lương tác và hình thành Hiên kết với các phân tử khác Ta cần làm lộ ra nhóm NIT, nay

bằng dụng dịch triluoroncctic acid (TEA) 5% (dung mdi methylene

chloride) trong 2 giờ

5 Lugng axit TFA của dự nằm trên bỀ 1nật sợi cần được rửa đi bằng dumg dich baza NHẠOH 1% trong Š pÏrút và sau đó rửa bằng nước,

Hình 2-14 Quy trình thực hiện chức năng hỏa bẻ mặt sợi Sỉ bằng

phương pháp xử lý trực tiếp trên bề mặt Sỉ tỉnh khiết

6 Glutaral hoa:

Day 1a bude bat can can thiét dé gin khang thé lén soi nano Silic

Giuaraldehyde cỏ nhỏm chức bioin (CHO) ở hai đầu Khi ngâm chip trong dich dich ghutaraldehyde 2% (dung môi là nước) trong 1 giờ Một đâu CHO của phân tử glutaraldehyde sẽ hình thành liên kết với nhóm NH; trong phan tt tert-butyl allylearbamate ở bước 4, một đầu còn lại sẽ liên kết với thu thé anti-CK trong bước tiếp theo,

7 Chíp sau khi được glutaral hỏa sẽ được ủ qua đêm trong ani cytokeratin hỗn hợp, bước này các kháng thể ani-CK đã gắng lên soi Si, các kháng thể này sẽ bắt cặp với các kháng nguyên CK của tế bảo UTV nhằm phát hiện tế bao,

13

CHƯƠNG 3: DANH GIÁ TÍNH CHẤT CẢM BIẾN SAU KHI CHẾ

TAO

3.1, TÍNH CHÁT HiNH THAI

Hình ảnh SiNW FET qua kinh hién vi kim loai hoe

Hình 3-1 Hình ảnh của SiNI FET ché tao duge (a) Hinh tong thé voi

độ phóng đại 5000 lan Chip cé 8 transistor, méi bén cé 4 transistor,

bao gom cac loai chia 8 soi, # sợi, 2 sợi và 1 sợi Silic (b) Transistor c6

8 sợi, (¢) Transistor cé 4 soi Silic, (d) Transistor cd 2 soi Silic, va (e) Transistor cé 1 soi Silic Chiéu dài của các sợi trong khoảng 9 + 0.3

sm và chiều rộng trong khoảng 1.5 30.13 mm, khoảng cách các sợi trong một transistor là 2um.

M

3.2, TÍNH CHẤT ĐIỆN:

3.3.1 Đặc Irưng I-V củu sợi Si

V và đặc trmg I-V với điệu thế cống nhân cực hệ đo hệ đo đặc bung

điện Aligem 4155

Phép kiểm tra được tiễn hành cho SỈNW FET có một sợi, hai

soi, bon soi va tam sợi Với (Vạ,) thay đối tử -IV đến IV, các kết quả

được trình bảy trong, các [Hinh 3 3 6] Cac Transistor c6 kénh din

ml syi Silic 14 19,8555 k02, hai soi 1A 26.2404 k62, bon sợi là 18.1151

4 va tam soi la 14.5173 kO Vide dién trở của đây không tỉ lệ thuận

với số sợi cho thấy điện trở tiếp xe giữ một giá trị đáng kế trong điện

32.2 Dac trung LV vot điện thế phân cực (bias)

Hình 3-7 (a-b-<-d) fim lượt là đặc trưng của các cảm biển một soi, hai soi, bén soi, tam sợi img voi các hiệu điện thể cổng, khác nhan,

thay đổi từ -šV, -1V, -3V, <2V, -1V, và 0V, Đỗ thị cho thấy khi V; càng

âm thủ đỏng điện qua sợi cảng tăng, thể hiện đúng sợi được chế tạo là sợi Silic ban din logi P đặc trưng I-V tăng khi tăng thế Vạ cảng âm, Chính đặc điểm này Eun cho sợi Silic có thể trở thành bộ phận chuyển đối tín ign trong cam bién sinh hoc dia trén cần trắc SỉNW FET vi đô dẫn điện của nó thay đối khi nhạy với điện tích bể mặt âm Cụ thể là khi có

một phân ni sinh học bám lên trên sợi sẽ lâm đỏng điện thay đối, giống

như dòng điện thay đổi lại mội Vạ nhát định nào đó ứng với các

*hác nhau,

17

CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG BAN ĐẦU CỦA SiNW FET TRONG

PHÁT HIỆN TẾ BÀO LƯU CHUYỂN CỦA UNG THƯ VÚ

4.1 CHUAN BI TE BAO

Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi tại Phỏng thí nghiệm Công nghê Sinh học Phân tử Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên Tp.HCM trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), đó là môi trường phổ biến để nuôi cấy tế bảo ung, thư vú Tế bảo được lẫy ra, bảo quản lạnh, và chuyển vẻ Phòng, thí nghiệm Công nghệ Nano, ĐHQG TPHCM để tiền hành đo đạc trong ngày

bị đo điện bên ngoài, sử dụng đề thực hiện các thí nghiệm

trong phát hiện tê bào ung thư vú bằng cảm biển SINH FET.

SINIW) vào thời gian thí nghiệm, trong quả trình dé dung dịch chúa Sự phụ thuộc dong dign ctia SiINW FET (loại chúa tắm sợi

TBUTV duge bom vao

ở mitc thấp, khí cho dung dịch vào dòng tăng lên khoảng 204 sau đỏ

giảm nhẹ và đều về khoảng 30A

20

4.4 NGHIÊN CỨU, SOI TE BAO BANG KINH HIEN VI HUYNH QUANG

Vì kết quả đo giữa hai lẫn dung địch có tế bào và buffer không có

tế bảo có sự khác biệt không đảng kể nên chúng tôi tiền hành soi té bao

đã nhuôm huỳnh quanh qua kinh hiển vi Quan sát qua KHV huỳnh quang

cho thấy các tế bào UTV chỉ chuyển động trong một khoảng nhỏ rồi dửng, lại Trong khí kích thước sợi Silic trong SỉNW FET (loai tam sợi) chỉ trong khoảng 32x10,Im nên khả năng t bào UTV gấp được vùng làm việc của

SiNW FET (vừng có khả năng kết cặp với các kháng thể trên sợi) là rất

thấp,

Hình 4-6 Hình ảnh t bào phân bỗ trén bé méit chip SINW FET duoc nhìn qua KHI lunh quang đồ phỏng đại 5000 lẫn Các đỏm sảng là các lê bảo UTV phát sắng các dom nhỏ trong hình vuông trắng là sợi Siic Với thit kế và kích thước đang được sử dụng của sợi Stlie như quan sắt được trên hình cho ta thay xác suất đề tẻ bảo nằm vào vừng lầm việc (vùng cỏ khả năng kết cấp với các kháng thể trên sợi SINH? là không lớn