Thực hành phân tích thực phẩm a báo cáo Định lượng Đường khử bằng phương pháp phân tích quang phổ sử dụng dns

Mục đích và nguyên lý của thí nghiệm Bài thí nghiệm được thực hiện để xác định định lượng đường khử trong một mẫu lỏng bằng phương pháp phân tích quang phổ sử dụng 3,5-Dinitrosalicylic a

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH THỰC PHẨM A

BÁO CÁO:

ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ SỬ

DỤNG DNS

HK 242 – LỚP L02 - NHÓM 03

GVHD: TS NGUYỄN THỊ NGUYÊN

DANH SÁCH SINH VIÊN THỰC HIỆN:

Tháng 3 năm 2025, Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục

1 Mục đích và nguyên lý của thí nghiệm 2

2 Các nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị trong thí nghiệm 2

2.1 Liệt kê các hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2

2.2 Rủi ro và cách loại trừ rủi ro khi sử dụng các hóa chất 3

2.2.1 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) 3

Cách hạn chế rủi ro 3

2.2.2 Phenol tinh thể 3

Rủi ro 3

Cách hạn chế rủi ro 4

2.2.3 NaOH rắn 4

Rủi ro 4

Cách hạn chế rủi ro 4

2.2.4 Potassium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O) 5

Rủi ro 5

Cách hạn chế rủi ro 5

2.2.5 Sodium metabisulfite (Na2S2O5) 5

Rủi ro 5

Cách hạn chế rủi ro 6

2.3 Rủi ro và cách loại trừ rủi ro khi sử dụng các dụng cụ và thiết bị 6

3 Tiến trình thực tế thí nghiệm Bước 1: Chuẩn bị tác nhân DNS 7

Bước 2: Thu thập số liệu để vẽ đường chuẩn 7

Bước 3: Ghi lại độ hấp phụ của mẫu phân tích 8

4 Kết quả thí nghiệm 9

4.1 Dựng đường chuẩn 9

4.2 Tính toán nồng độ mẫu phân tích 10

5 Nhận xét và biện luận thí nghiệm 12

5.1 So sánh với các nhóm khác 13

1 Mục đích và nguyên lý của thí nghiệm

Bài thí nghiệm được thực hiện để xác định định lượng đường khử trong một mẫu lỏng bằng phương pháp phân tích quang phổ sử dụng 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNSA), từ đó có thể đánh giá và đề xuất cách xác định hàm lượng đường khử phù hợp trong một mẫu thực phẩm bất kỳ

Nguyên lý chung: dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử (những loại đường

có nhóm aldehydo (aldoses) có thể nhường electron làm chất khử cho chất oxy hóa) với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm và có gia nhiệt, tạo ra acid 3-amino5-nitrosalicylic (ANSA) mà trong điều kiện kiềm được chuyển thành phức hợp màu nâu đỏ có độ hấp thụ tối đa 540 nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đồ thị đường chuẩn của Glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalicylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Hình 1 Phản ứng giữa D-glucose với DNSA tạo phức màu nâu đỏ

2 Các nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị trong thí nghiệm

2.1 Liệt kê các hóa chất, dụng cụ và thiết bị

 Mẫu (lỏng, chưa biết nồng độ): được chuẩn bị bởi cán bộ quản lý PTN.

 Bể điều nhiệt.

 Máy phân tích quang phổ UV + Cuvette nhựa.

 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA).

 Phenol tinh thể.

 NaOH rắn.

 Potassium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O).

 Sodium metabisulfite (Na2S2O5).

 Nước D.I + Bình xịt nước cất.

 Dung dịch Glucose 0.1%.

 Ống nghiệm: 20 cái + Giá ống nghiệm.

 Pipette 1 mL: 1 cái + Pipette 5 mL: 1 cái + Pipette 10 mL: 1 cái + Ống bóp.

 Becher 100 mL: 1 cái.

 Bình định mức 100mL: 1 cái

2.2 Rủi ro và cách loại trừ rủi ro khi sử dụng các hóa chất

2.2.1 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA)

Rủi ro: Có hại nếu nuốt phải Có thể gây bỏng mắt, niêm mạc và kích ứng da Có thể gây

kích ứng đường hô hấp

Cách hạn chế rủi ro

 Tránh tiếp xúc với da và mắt.

 Đeo găng tay bảo hộ/quần áo bảo hộ/bảo vệ mắt/bảo vệ mặt

 Chỉ sử dụng ngoài trời hoặc ở nơi thông thoáng.

 Hạn chế hít hơi Cung cấp thông gió tốt trong khu vực xử lý để ngăn ngừa sự hình thành hơi.

 Không ăn, uống hoặc hút thuốc khi sử dụng hóa chất này.

 Rửa tay và các khu vực tiếp xúc khác bằng xà phòng sau khi dùng hóa chất.

 Bảo quản trong bình kín và để ở nơi thông thoáng.

2.2.2 Phenol tinh thể

Rủi ro

 Nếu nuốt phải có nguy cơ thủng thực quản và dạ dày (tác dụng ăn mòn mạnh)

 Nếu vào mắt có thể gây bỏng, gây tổn thương mắt nghiêm trọng, nguy cơ mù lòa

 Nếu hít phải tác dụng kích ứng, ho, khó thở

 Nếu trên da gây bỏng nặng, khiến vết thương khó lành

 Tác dụng không mong muốn khác: Đau đầu, chóng mặt, bất tỉnh, …

Cách hạn chế rủi ro

 Không ăn, uống hoặc hút thuốc khi sử dụng sản phẩm này Làm sạch da kỹ lưỡng sau khi sử dụng sản phẩm.

 Đeo găng tay bảo hộ/quần áo bảo hộ/bảo vệ mắt/bảo vệ mặt

 Bảo quản ở nơi khô ráo Có hạt hút ẩm.

2.2.3 NaOH rắn

Rủi ro

 Đường mắt: gây đau rát mạnh và có thể dẫn đến tình trạng làm hư hỏng mắt.

 Đường hô hấp: ăn mòn, có cảm giác rát, đau cổ họng, hơi thở nặng nhọc, thở gấp Phá hủy nghiêm trong các mô của màng niêm mạc và đường hô hấp trên.

 Đường da: Gây kích ứng và ăn mòn da

 Đường tiêu hóa: Ăn mòn, có cảm giác bỏng rát Đau ở khoang bung, bị sốc và suy sụp.

 Ngoài ra, chúng còn độc hại với môi tường thủy sinh.

Cách hạn chế rủi ro

Khi làm việc với hóa chất

 Cần trang bị các phương tiện bảo hộ cá nhân khi làm việc với NaOH

 Bảo vệ mắt: kính bảo hộ lao động, kính che mắt, mặt.

 Bảo vệ đường hô hấp: sử dụng khẩu trang hoạt tính, nơi làm việc phải có hệt thống hút cục bộ.

 Bảo vệ tay, chân: dùng găng tay cao su chịu được dung dịch kiềm, mang giày bịt kín mũi.

 Thay đồ bảo hộ sau khi xong việc Rửa tay trước khi ăn và sau khi hoàn tất công việc.

 Tuân thủ các quy trình, thao tác khi vận hành và khi lấy mẫu.

 Có biển báo hóa chất ăn da ở khu vực có xút và tại các van thường xuyên thao tác.

Khi bảo quản hóa chất

 Không để lẫn với các acid mạnh, kim loại, các chất có thể cháy, thực phẩm và đồ ăn uống Bảo quản ở nơi khô, mát.

 Đóng gói trong bình, thùng, bao bì kín Vật liệu sử dụng thích hợp: composite, thủy tinh, PVC, PE, thép không gỉ Không sử dụng bình chứa làm bằng nhôm, thiếc hoặc kẽm.

 Không được để gần nguồn phát nhiệt, không được đặt dưới dây điện trần, không được

để gần các chất nổ.

 Không để các chất hữu cơ (rơm, vỏ bào, mùn cưa, giấy), chất oxi hoá, chất dễ cháy, nổ trong cùng một nơi với hoá chất.

2.2.4 Potassium sodium tartrate (KNaC 4 H 4 O 6 ·4H 2 O)

Rủi ro

 Có thể gây kích ứng da.

 Có thể gây kích ứng mắt.

 Gây kích ứng đường hô hấp nếu hít phải.

 Có thể gây kích ứng đường tiêu hóa nếu nuốt phải.

Cách hạn chế rủi ro

 Đeo kính an toàn, áo khoác thí nghiệm, găng tay

 Bảo quản hóa chất xa nguồn nhiệt Tránh xa các nguồn phát lửa Nối đất tất cả các thiết

bị chứa vật liệu Đừng hít bụi Mặc quần áo bảo hộ phù hợp Trong trường hợp thiếu gió, đeo thiết bị hô hấp thích hợp Tránh xa các chất không tương thích như chất oxy hóa, acid Khi bảo quản, đậy kín thùng chứa và giữ thùng chứa ở nơi mát mẻ, thông gió tốt.

2.2.5 Sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 )

Rủi ro

 Nguy hiểm trong trường hợp tiếp xúc với da (kích ứng), nuốt phải, hít Nguy hiểm nhẹ trong trường hợp tiếp xúc với da (chất thẩm thấu), Mắt tiếp xúc (gây kích ứng)

 Tính oxy hóa mạnh, ăn mòn mạnh, biến đổi tế bào gốc, độc cấp tính mãn tính đối với môi trường thủy sinh

Cách hạn chế rủi ro

 Mang thiết bị bảo hộ cá nhân/bảo vệ mặt.

 Đảm bảo thông gió đầy đủ Tránh hình thành bụi.

 Không để dính vào mắt, da hoặc quần áo.

 Tránh nuốt phải và hít phải.

 Không ăn, uống hoặc hút thuốc khi sử dụng sản phẩm này.

 Cởi bỏ và giặt sạch quần áo và găng tay bị nhiễm bẩn, kể cả bên trong, trước khi sử dụng lại.

 Rửa sạch tay trước khi nghỉ giải lao và sau giờ làm việc.

 Khi bảo quản, cần đậy chặt bình chứa và để ở nơi khô ráo, thoáng mát và thông gió tốt Tránh xa acid.

2.3 Rủi ro và cách loại trừ rủi ro khi sử dụng các dụng cụ và thiết bị

Sử dụng các dụng cụ dễ vỡ (ống nghiệm, cốc, pipette, bình chứa dung dịch) không cẩn thận có thể làm rơi hay va chạm mạnh dẫn đến vỡ thành các mảnh vỡ có thể làm hại người thí nghiệm Phải thật sự cẩn thận và nhẹ nhàng khi cầm, nắm, đặt và di chuyển các dụng cụ này Ngoài ra, cần cất kỹ càng và hợp lý các dụng cụ thủy tinh, vứt bỏ các mãnh vỡ đúng nơi quy định Nếu dụng cụ thủy tinh cần được sữa chữa phải cất vào một nơi an toàn, cho đến khi được sửa chữa xong

Bể điều nhiệt và máy phân tích quang phổ có sử dụng nguồn điện, sử dụng các thiết bị này với dây điện bị hở hay nguồn mạch không kín là rất nguy hiểm vì dễ dẫn đến giựt điện, nên phải hết sức lưu ý đảm bảo không có chỗ rò rỉ điện, kể cả với ổ cắm điện, không được dùng với thiết bị mắc lỗi về điện mà phải báo cáo với người hướng dẫn (quản lý phòng thí nghiệm) để sửa chữa khi cần thiết

Riêng khi sử dụng với bể điều nhiệt, ưu tiên sử dụng nước cất để gia nhiệt trong bể, hạn chế sử dụng nước máy vì lâu ngày nước máy có thể làm rỉ sét bề mặt bên trong bể Khi thao tác mở hay đóng nắp bể, đưa giá ống nghiệm vào hay ra khỏi bể, cần sử dụng găng tay cách nhiệt để tránh làm phỏng tay hay vuột tay gây nguy hiểm

Máy phân tích quang phổ cần được bật lên ít nhất 15 phút để máy khởi động ổn định Khi sử dụng để đo độ hấp thụ, chỉ được cầm vào 2 bề mặt nhám của cuvette, và sau khi cho mẫu vào cuvette thì luôn phải lau sạch, khô 2 bên bề mặt trong của cuvette, cũng chỉ được dùng giấy chạm thấm nhẹ và hạn chế cạ giấy lên bề mặt trong Không sử dụng cuvette bị trầy

ở bề mặt trong vì điều này sẽ ảnh hưởng đến kết quả đọc độ hấp thụ và nghiêm trọng hơn là

dễ khiến kết quả bị nhảy số liên tục và dần làm hỏng máy Ngoài ra, không được làm rơi rớt mẫu trong lòng máy, và cũng không được để bất cứ thứ gì tiếp xúc với 2 bên thấu kính nơi ánh sáng truyền qua

3 Tiến trình thực tế thí nghiệm

Bước 1: Chuẩn bị tác nhân DNS

 Hòa tan NaOH (19.8g) và acid dinitrosalicylic (10.6g) trong 1416 ml nước D.I

 Thêm vào dung dịch trên các chất sau:

 Potassium sodium tartrate (KNaC4H4O6.4H2O): 306 g

 Phenol (C6H5OH): 7.6mL

 Natri metabisulfit (Na2S2O5): 8.3 g

Thực tế, tác nhân DNS đã được chuẩn bị sẵn bởi cán bộ quản lý PTN Nhóm chỉ cần quan tâm cách bảo quản tác nhân này bằng cách sau khi pha xong, chuyển trong bình thủy tinh bọc kín lại bằng giấy nhôm

Bước 2: Thu thập số liệu để vẽ đường chuẩn

- Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn và một dung dịch trắng cho vào các ống nghiệm riêng biệt theo hướng dẫn trong Bảng 1:

Bảng 1 Bảng chuẩn bị các mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu phân tích dùng trong thí nghiệm

- Đun nóng ống nghiệm trong nồi cách thủy đang sôi (bể điều nhiệt) trong 10 phút

- Làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng và ghi lại độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm

Bước 3: Ghi lại độ hấp phụ của mẫu phân tích

 Chuẩn bị mẫu phân tích theo Bảng 1 vào ống nghiệm (lặp lại ba lần cho từng mẫu).

 Nếu A540 nm của mẫu phân tích nằm ngoài A540 nm của mẫu chuẩn, cần điều chỉnh lại thể tích mẫu chuẩn (tính đến hệ số pha loãng) Có 2 cách pha loãng:

o Giảm thể tích mẫu phân tích và tăng thể tích nước cất cần lấy sao cho tổng thể tích lấy được trong ống nghiệm vẫn giữ ở 4 mL

o Tính toán để pha loãng mẫu phân tích riêng bằng cách định mức trong bình định mức 100 mL, sau đó mới lấy 1 mL mẫu phân tích đã pha loãng này vào ống nghiệm

Lưu ý:

- Phương pháp này định lượng tất cả các loại đường khử, không đặc trưng cho một loại cụ thể nào

- Độ hấp thụ cần được ghi lại trong vòng 20 phút sau khi mẫu được đun nóng và làm nguội

vì phức màu không ổn định

- Phản ứng xảy ra ở điều kiện kiềm Đối với mẫu có hàm lượng acid cao thì mẫu cần được trung hòa trước khi phân tích bằng phương pháp này

Bước 4: Tính toán

 Vẽ đường chuẩn của độ hấp thụ theo nồng độ glucose (mg/L).

 Dựa vào đường chuẩn, xác định nồng độ của dung dịch mẫu chưa biết.

4 Kết quả thí nghiệm

4.1 Dựng đường chuẩn

Do nồng độ Glucose trong dung dịch chuẩn là 0.1% (w:v) hay 0.1g/100mL, tức là trong 1 L (1 L = 10  100mL) dung dịch chuẩn có 10  (0.1  103) = 1000 mg Glucose, nên nồng độ Glucose trong ống nghiệm (ống mẫu chuẩn đã chuẩn bị) để điền vào Bảng 2 được tính theo công thức:

CGlucose trong ống nghiệm = (0.1 × VGlucose 0.1%

) × 10 × 1000 (mg/L)

4

Bảng 2 Kết quả thí nghiệm thu thập số liệu để dựng đường chuẩn

Nồng độ Glucose

trong ống nghiệm

(mg/L)

Từ đó, vẽ được đường chuẩn giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ quang ở bước sóng 540nm như sau:

Hình 3 Kết quả dựng đường chuẩn của thí nghiệm

Ta tìm được phương trình đường chuẩn: 𝑦 = 213,78× 𝑥 – 6,1762, trong đó:

 𝑥 là độ hấp thụ đo tại bước sóng 540 nm (A540 nm)

 𝑦 là nồng độ glucose (mg/L) có trong ống nghiệm

4.2 Tính toán nồng độ mẫu phân tích

Bảng 3 Kết quả đo độ hấp thụ của mẫu phân tích

Mẫu – Pha loãng mẫu: 100 lần

y = 213,78x + 6,1762 R² = 0,9969

0

50

100

150

200

250

300

Đường chuẩn của thí nghiệm

A540 nm 0,802 0,803 0,809

Dựa vào phương trình đường chuẩn ta tính được kết quả như sau:

Cglucose trong ống nghiệm = 213,780⨯A540 +6,176 (mg/L)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 0,2254g mật ong= ( Cglucose trong ông nghiệm ⨯ ) ⨯ 100 ⨯

(%) (w/w)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 100g mật ong =

Lần đo A540 nm

Nồng độ Glucose trong ống nghiệm (mg/L)

Trong mẫu phân tích ban đầu

Hàm lượng đường khử trong 0,2254g mật ong

(g)

Hàm lượng đường khử trong 100g mật ong (g)

Calculator

hoặc Excel

Nồng độ glucose trong ống nghiệm:

Cglucose trong ống nghiệm (1) = 213,780A540 +6,176 = 213,780 ⨯ 0,802 + 6,176 = 177,628 (mg/L)

Cglucose trong ống nghiệm (2) = 213,780A540 +6,176 = 213,780 ⨯ 0,803 + 6,176 = 177,841 (mg/L)

Cglucose trong ống nghiệm (3) = 213,780A540 +6,176 = 213,780 ⨯ 0,809 + 6,176 = 177,628 (mg/L) Nồng độ đường khử trong 0,2254g mật ong :

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 0,2254g mật ong (1)= 177,628⨯ ⨯ 100 ⨯

= 0,071 % (w/w)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 0,2254g mật ong (2)= 177,841⨯ ⨯ 100 ⨯

= 0,071 % (w/w)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 0,2254g mật ong (3)= 179,124⨯ ⨯ 100 ⨯

= 0,072 % (w/w) Nồng độ đường khử trong 100g mật ông:

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 100g mật ong (1) =

⨯ (w/w)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 100g mật ong (1) =

⨯ (w/w)

Cglucose trong mẫu ban đầu trong 100g mật ong (1) =

⨯ (w/w)

Khoảng tin cậy nồng đò đường khử trong 100g mật ông:

C =

s √∑ ̅ ̅

Với độ tin cậy 95%, bậc tự do n-1= 3-1=2, theo phân phối students ta tra được t2 = 4,303

√ ⨯

√ =0,571

Kết quả:

C= 31,633 % (w/w)

5 Nhận xét và biện luận thí nghiệm

Khi thí nghiệm hoàn tất, màu sắc dung dịch trong các ống sẽ thay đổi từ màu vàng sang màu cam hoặc màu đỏ, độ đậm của màu sắc phụ thuộc vào lượng glucose có trong ống nghiệm

Khi tính toán để dựng đường chuẩn, phương trình đường chuẩn cho hệ số tương quan

R2 = 0.9969 mang lại kết quả phân tích có độ chính xác cao, đang tin cậy, mặc dù vậy các điểm trên đồ thị để dựng có vẻ vẫn còn lệch tương đối so với đường chuẩn này, điều này có thể chấp nhận được

Sau khi tính toán, thu được kết quả nồng độ của đường khử trong ống nghiệm thì nhóm thấy rằng kết quả nồng độ mà nhóm thu được hoàn toàn nằm trong đường chuẩn đều nay đảm bảo rằng kết quả nhóm có độ chính xác dáng tin cậy vì:

- Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa tín hiệu đo được (độ hấp thụ) và nồng độ của

chất cần phân tích

- Nếu nồng độ mẫu nằm ngoài khoảng đường chuẩn, ta không thể chắc chắn rằng mối

quan hệ vẫn còn tuyến tính (hoặc theo đúng mô hình đã xây dựng) Khi mẫu nằm ngoài khoảng, hệ số hồi quy và độ lệch chuẩn không còn đảm bảo được độ tin cậy thống kê

- Điều này dẫn đến việc ngoại suy, thường kém chính xác và làm sai lệch kết quả Khi

mẫu nằm trong khoảng đó, phép nội suy được áp dụng , an toàn và đáng tin cậy hơn

nhiều so với ngoại suy

- Sau khi tính toán kết quả của mẫu phân tích, ta nhận thấy có sự khác biệt về hàm lượng glucose giữa 3 lần đo, tuy nhiên không đáng kể, nguyên nhân có thể là do:

+ Sai số dụng cụ, thiệt bị ( pippet, máy phân tích quang phổ, cuvette, )

+ Sai số do thao tác thưc hành thí nghiệm Trong quá trình lấy hóa chất bằng pipette

không cẩn thận để hóa chất bám lên thành dẫn đến sai lệch về tổng thể tích mẫu ảnh

hưởng kết quả nồng độ; cuvette khi rót mẫu xong có thể chưa được lau sạch hoàn toàn,

5.1 So sánh với các nhóm khác

Nhóm 1

Lần đo A540 nm

Nồng độ Glucose trong ống nghiệm (mg/L)

Trong mẫu phân tích ban đầu

Hàm lượng đường khử trong 0,2254g mật ong

(g)

Hàm lượng đường khử trong 100g mật ong (g)