Luận văn a study of translation of english vietnamese subtitles in selected english films from the website kst net vn

lầm khẳng xác định kiểu gen trước kli điều Irị có thể tiên đoán khả năng đáp ứng, xác dịnh thời gian diễu trị và dự doán hiệu qua didu wi kháng vị rút PH 2] Tại Việt ram, nghiên cứu về

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOL UNIVERSITY OF LANGUAGES AND INTERNATIONAL STUDIES

DEPARTMENT OF POST-GRADUATE STUDLES:

NGUYEN THI THU HA

A STUDY OF TRANSLATION OF ENGLISI-VIETNAMESE SUBTITLES IN SELECTED ENGLISH FILMS FROM THE

WEBSITE KST.NET.VN

(Nghiên cửu cách dich phụ đề một số phim tiểng Anh trên trang

mang Kst.nct.vn)

M.A Minor Thesis

Field: Knglish Linguistics

Code: 60.22.15

Hanoi, 2012

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOT

UNIVERSITY OF LANGUAGES AND INTERNATIONAL STUDIES

DEPARTMENT OF POST-GRADUATE STUDIES,

NGUYEN TI THU IIA

A STUDY OF TRANSLATION OF ENGLISII-VIETNAMESE SUBTITLES IN SELECTED ENGLISH FILMS FROM THE

WEBSITE KST.NET.VN

(Nghiên cứu cách dịch phụ đề một số phim tiéng Anh (rén trang

mang Kst.net.vn)

M.A Minor Thesis

Field: English Linguistics

Code: 60.22.15

Supervisor: A/Prof Tran Xuan Điệp

TIanoi, 2012

1.2.3 Diễn biến tự nhiên

1.2.4 Chân đoán phòng thí nghiệm

1.3 Các đặc trưng của kiểu gen IICV

1.3.4 Kiểu gen HCV vai dap img và dự đoán đáp ứng với điều trị 21

1.3.5 Kiểu gen HCV với thời gian điễu trị

1.3.6 Kiểu gen IICV với liều lượng thuốc điêu trị 22

1.3.8 Gan nhiễm mỡ và môi liên quan đến kiểu gen ctla HCY 23 1.3.9 Kiểu gen và diễn tiến bệnh viém gan C mạn tính 23 1.3.10 Kiểu gen và ghép gan trong nhiễm HỢV

1.4 Tình hình bệnh viêm gan vi rút C và các nghiên cứu

CHIƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIHÊN CỨU

2.1 Déi tượng nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên cửu 25

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

2.4.1 Thu thập và bảo quan mẫu huyết thanh 227

2.4.2 Quy trình xác định Ani-HCV

2.4.3 Quy trùnh xác định tải lượng ví rút

2.4.5 Xác định kiểu gen HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen

2.4.6 Thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án

2.6 Dia điểm nghiên cứu

2.3 Phân bề kiểu gen phụ cla HCV

3.3 Mỗi liên quan giữa kiểu gen IICV với một số đặc điểm về dịch tễ học

xả cân lâm sàng 53

3.3.1 Mỗi liên quan giữa kiểu gen của HCV và tuổi tite SB 3.3.2 Mai lién quan pitta kidu gen của H(V và giới 54 3.3.3 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tiền sử phơi nhiễm HC V 55

3.3.4 Đặc điểm kiểu gon HCV giữa 2 nhỏm đổi Lượng có đẳng nhiễm

3.3.5 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV vả mức độ biến đổi chức

ning gan - %6

3.3.6 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng vi rút 59

KET LUAN VA KIEN NGIIL

TAT LIEU THAM KHẢO

PHU LUC

Acquired Immune Deficiency Syndrome

(lội ching suy giảm miễn địch mắc phải) Alanine Transaminase (men gan ALT)

Aspartate ‘lransaminase (men gan AST) BVBNDTƯ Bệnh viện Dệnh Nhiệt đới Trung ương

(Trưng tầm Kiểm soát va Phòng ngùa bệnh tật)

Gui off (Chứng ngưỡng) Deoxynueleoside triphosphate

Enzym-Linked Immunosorbent Assay (Thi nghiém mién dich gắn

Ethanol

Hepatocellular carcinoma (Ung thir té bao gan)

Hepatitis C virus (Vi nil viéin gan C) Human Immunodeficiency Virus

(Vi rút gây suy giảm miễn dich ở người)

Line Probe Assay (Thi nghiệm line dâu dỏ)

Optical Density (Mật độ quang học)

Polymerase Chain Reaction (Phan img chudi tring hop)

QHTDKAT Quan hệ tỉnh dục không an toàn

RI-PCR

TCMT

WHO

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

(Phân ứng chuối trừng hợp sao chép ngược)

Tiêm chích mã tuý

‘World Iealth Organization (TẾ chức Y tả Thé gị

DANH MỤC BẰNG

Bang 3.1: Phân bố bệnh nhân theo tuổi "— se 30

Bang 3.2 Dac điểm tiền sử phơi nhiễm viêm gan Œ ae đ2 Rang 3.3 Đặc diễm về tải lượng vị rút của mẫu nghiên cửu 43 Bang 3.4 Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và tuôi "—

Bảng 3.6 Mối liên quan giữa kiểu gen HC V và tiền sử phơi nhiễm HỢV 55 Bang 3.7 Đặc điểm phân bố kiểu gen IICV giữa 2 nhóm đối tượng có đồng

Bảng 3.8 Mỗi liên quan giữa kiểu gen của HỢV vả men gan AI 57 Tiẳng 3.9 Mỗi liên quan giữa kiểu gen của IICV và men gan AST 57 Bang 3.10 Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và Bilirubin toản phần 5E Bảng 3.11 Mỗi liên quan giữa kiểu gen của HC V và tải lượng vi rút 59

DANH MUC BIEU DO

Biểu đồ 3.1: Phân bố về giới cesses —

Biểu đồ 3.3 Đặc điểm phân bố kiểu gen HCV " 469

Biểu đồ 3.4 Phân bố các kiều gen phụ của HƠV 48T

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Mô hình cấu trúc của HCV sec TỔ

Hình 2: RNA của HCV a sia beavese si gaanna TỶ

Hình 3: Chu trình sống của HCV s2 222222212 T2 Hình 4: Sơ đồ tiến triển bệnh nhân nhiễm HCV 15 Hình 5: Tỷ lê kiểu gen HCV ở các khu vực trên thể giới " 19 Hình 6: Tỷ lệ kiểu gen HCV tạicác nước Châu Á 2Ö

Hình 7: Tỷ lệ kiểu gen HCV tại Việt Nam ‘ 21 Hình 8: Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới 24

Hình 9: Cây phát sinh loải của kiểu gen phụ la 50

Hình 10: Cây phát sinh loài của kiểu gen phụ lb "¬

Hình 11: Cây phát sinh loài kiểu gen HCV tri 2U,

MO DAU

Bệnh viêm gan vị rút C hiện nay dang là một vẫn dẻ y tế toàn cảu Theo ước tính của Tế chức Y tế Thể giới, tỉ lệ nhiễm ITCV trên thế giới khoảng 3,1%, tương

đương 170 triệu người, với số nhiễm mới 3-4 triệu người mỗi năm HY BE) Tang

chỉ phi y tế dành cho chan doan va điều trị cũng như phòng viêm gan vị rút C dự

đoán tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỳ USD vào năm 2024 Nếu

không điều trị, viêm gan vì rút Ở diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thư gan và

có thể dẫn đến tử vong E1! 1 Tị lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 15-20% sau 20

năm Tỷ lệ tng thư gan trên bệnh nhân nhiễm HCV chiếm khoảng 1,1-3,3%4 mỗi

năm, trong đó, tử vong lả 2,6-4% ©! G Viet Nam 5 10% dan sé nhiém LCV "71

Viêm gan vi rứt C là một bệnh nguy hiểm vị triệu chứng lâm sảng thường, không rõ ràng, 90% trường hợp không có triệu chứng, trong khi đó hậu quá của

bệnh đề lại thường rất nặng nẻ Có 50%-80% viêm gan vi rút C chuyển thành mạn

tính, 20%-25% bệnh nhân mạn tỉnh chiến tiền qua xơ gan va ung the gan #9, 9

đỏ, xác định chính xác tác nhân ITCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các

bác sĩ Vi rút viêm gan C được phân thành 6 kiếu gen ký hiệu bằng số từ 1 đến 6 và

phân ra các kiểu gen phụ kỷ hiệu bằng chữ a,b,c, ?Í Ngoài xét nghiện

thể kháng TICV, xác định số lượng vi rút trong mau dé chân đoán tình trạng nhiễm

lầm khẳng

xác định kiểu gen trước kli điều Irị có thể tiên đoán khả năng đáp ứng, xác

dịnh thời gian diễu trị và dự doán hiệu qua didu wi kháng vị rút PH 2] Tại Việt

ram, nghiên cứu về kiển gen HCV được tiến hành từ nấm 1994 'Ì tưy nhiên, từ đó đến nay, có một số nghiên cứu thực hiện trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu với nước ngoài và dược thực hiện ở nước ngoài Ngoài ra, số lượng nghiên cửu cỏn rất hạn chế Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu phân loại kiểu gen đựa vào trình tự đoạn

5? không mã hóa của bộ gen HƠV Nhưng hiện nay, việc phân loại theo hình thức

nay không chỉnh xác do vị rút thuộc kiểu gen 6 của HCV có trình tự đoạn nảy giống,

với các chủng thuộc kiến gen 1 nên cé sựr phân loại nhâm lẫn giữa hai kiểu gen này

8

Do vậy, các tác giả dã khuyến cáo sử dụng trình tự doạn core, B1 hoặc MSSB cho

phân loại kiểu gen của LICV

lệnh viện lệnh Nhiệt đới Trưng ương là cơ sở hàng đầu vẻ chân đoán, điều

trì các bệnh truyền nhiễm nói chung, đặo biệt là các bệnh viêm gan trong đó có

viêm gan vị rút Ở nói riêng, Vì vậy, nhụ cầu chẩn doan bệnh som va chinh xác cảng, cấp thiết Từ nấm 2010, chúng tôi đã tiền hành triển khai kỹ thuật xáo định kiểu gen 'H€V bằng kỹ thuật giải trình tự gen vùng core của HCV giúp chân đoán và điều trị bệnh Qua hơn 1 năm triển khai chúng tôi đã thụ được các kết quả nhật định Vì vay chíng tôi tiến hành đề tài “Xác định sự phân bỒ các genotype của HCU bằng kỹ

thuật giải trình tự gen 2 bệnh nhân đến khẩm và điều trị tại Bệnh viện Bệnh

Nhigt déi Trung ương năm 2010-2011" với các mục tiêu sau:

1 Xác định các kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và diễu trị tại Bệnh

viện lệnh Nhiệt đới Trưng ương bằng kỹ thuật giái trình tự gen

k Danh gia méi liên quan giữa kiểu gen HCV với một số đặc điểm vé dich té

học và cên lâm sàng,

CDC Sau nhiều năm nghiên cứu, lân đầu tiên trong lịch sử ngành Vỉ sinh học, một

tác nhân gây bênh mới được khám phá bằng kỹ thuật sinh học phân tử trước khi cỏ

được các hiểu biết về hình thái vị rút, cầu trúc protein, tính kháng nguyên, trước cả khi tác nhân này được nuôi cấy, phân lập thành công

Vi rút viêm gan C là thánh viên của họ #Ïawiviridae, là một thê hình cầu cỏ

đường kính SŠ5-65 nm, vả cỏ các vỏ ngoải với các gai nhủ nhỏ khoảng 6 nm, bao

quanh mét cau tric nucleocapsid 30-35 nm cé cau tric déi ximg 20 mat 1 I6) E1

Hệ gen của HCV cỏ kích thước khoảng 9,6 kb cỏ chức năng như mRNA lam khuôn tổng hợp protein HCV phân lập được từ các bệnh nhân thuộc các khu vực

khác nhau trên thể giới có thể khác nhau về kích thước hệ gen Câu trúc RNA của HCV bao gồm hai đầu tận cùng 5° và 3' không mã hỏa, ở giữa là vùng mã hỏa cho

protein câu tric (C, El, E2) và protem không thuộc nhỏm câu trúc (NS2, NS3,

NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) Vùng 5' không mã hỏa (5'-noneoding viết tắt la 5°

NC) cé tinh ồn định rất cao, gồm khoảng 341-344 nucleotide Ít! È7Ì #1 Giữa các sợi HCV riêng biệt, giữa các kiêu phụ và kiểu gen khác nhau thi đồ tương đồng vẻ trình

tự 5`-NC tôi thiêu hơn 90% Vi vay, khu vực này thường được áp dụng đề xác định

nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR Ngược lại, trình tự của NSSB, khu vực core hoặc

EI thay đổi nhiều hơn, nhưng được coi la tiêu chuẩn vàng sử dụng đề xác định và

phân biệt các kiều gen HCV LứI E91

Gen mã hoa polyprotein

Glycoprotein v6 Prats Corfactors | RNA TT

Nucleocapsid Protein” helesse Protein khang

xuyén mang interferon

Hinh 2: RNA cia HCV **

Tương tự như tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tải bản vỉ nó không cỏ

đây đủ các nguyên liệu cân thiết Vì vậy, để tái bản, vì rút phải nhiễm vào tế bảo vật

protem câu trúc (protein vỏ vả protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid vả các proteim

không thuộc nhóm cau trac (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NSSA và NS§B) liên quan

đến quá trình tái bản của vi rút Các nghiên cứu gân day đã làm sáng tỏ chức năng

của nhiêu protein trong số này Tuy nhiên, vai trò của một vải protein cũng như một

số khía cạnh của quả trình tải bản vi rút và môi tương quan giữa protenm vị rút và tế

bao chủ vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ Nguyên nhân của việc nảy lả do HCVỀ

không thê gây nhiềm nhân tạo trên các dòng tế bảo hiện có tại các phòng thí nghiệm

trên thể giới Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kế

về vỉ rút nảy Một điệm quan trọng nữa lả vi rút này có khả năng biên thể nhanh và

tạo thành rất nhiều kiểu gen và kiểu gen phụ kháng thuốc Do vậy, hiện nay vẫn

1671

chưa có một loại vắc xin nảo có hiệu quả đổi với HCV

1.1.2 Chu trình tái bản của HCV ™!

Hình 3: Chu trình sống cia HCV

- Gắn vào tế bảo vật chủ HCV gắn vào tế bảo chủ nhờ các tương tác giữa lớp

võ protein của vi rút (protein 11 và 122) với các phân tứ là thụ thể bề mặt khám trên Tràng ngoài tế bào đích

- Xâm nhập vào tế bảo chủ và cởi lớp vẻ bọc, giải phóng RNA vi rat, HCV di

vào tế bảo địch chú yêu do cơ chế âm bảo nhờ thụ thể Khi HCV gắn lên bề mật thụ thể, các tế bàa đồng hỏa thụ thể sẽ hinh thành một túi mảng mống chứa ICV Sau khi vào trang tế bảo, HCV sẽ giải phóng hệ gen vào tế bảo chất của tế bảo chủ và bắt đầu quá trình tái bản

- Dịch mã hệ gen HCV thành protem vị rút: Khi được giải phóng, RMA của HCV duoc ding lam khuân để tầng hợp các protein của nó HCV sử đụng các thành

đôi hỏi một vải thành phản trong bộ máy địch mã của tế bào chủ Điều dó cho phép

LICV khối động địch mã hiệu quả ngay cá khi các điều kiện tế bào không thuận lợi Sân phẩm đầu tiên của quá trinh địch mã là một sợi polyprotein dài khoảng 3000

axit amin có chứa tất cả 10 protein vị rút cần cho quả trình tái bản của HCV, Đây la quá trình then chất đối với IICV vị nên không có các protein quan trọng này sẽ

không lao được các vị rút ruới

- Tải bản hệ gen HCV Quá trình tái bản xây ra nhờ envyine polymerase

N85, là một protein không thuộc nhóm câu trúc, tổng hợp RNA trên sợi khuôn

RNA gồm hai bước chính: 1) hệ gen vi rút được đừng làm khuên để tổng hợp sợi

RNA âm và 2) sợi RNA âm sau đó được dùng làm khuôn để lẳng hợp sợi RNA dương của HCV mới Hai sợi RNA mới tổng hợp có thể gắn với nhau hình thành

RNA sai déi, trong khi đó, , tế bảo cho răng RMA sợi đôi là báo hiệu nhiễm vị rút và

sẽ kích hoại hàng rảo phòng thủ của tế bảo đễ ngăn chắn quá trình tái bản và phả hay RNA vi nut, Hon nia, polymerase HCV khong thé doc duge tir RNA dang & dạng sợi đôi Vì vậy, để tránh hàng rào phòng thủ của tễ bảo và duy trì quả trình tái bản, HCV phải giữ cho các sợi RNA âm và đương tách rời nhau Lúc này cnzyme

helicase, nim trong vùng trình tự mã hỏa cho protein khéng thuộc nhỏm cấu trúc

13

N83, thực hiện nhiệm vụ bằng cách bám vào va tach cdc soi RNA ra trong suốt quá

trinh tải bản hệ gen

- Kết hợp tạo vi rút mới và giải phòng chúng ra khỏi tế bảo chủ: Các hạt vị rút HCV méi bao gém 3 thành phân chính là sợi đơn RNA hệ gen HCV, vé capsid va lớp vỏ bọc của vị rút Các vị rút mnới sau de duge chuyển tới mảng ngoài của tế bảo vật chủ, giải phóng ra ngoài và lây nhiễm cho các tế bào mới "71

1.2 Viêm gan vi rút C

1.2.1 Khái niệm F”I

Viêm gan vi rit C là bệnh do vị rút viêm gan C gây nẻu Nhiễm vi rút viên: gan C (HCY) oo th m đến viêm gan cấp tỉnh và mạn tính:

1.2.2 Dường lây nhiễm F41

HCV lay chủ yên qua tiếp xúc trực tiếp với máu người bệnh Đường lây

nhiễm vi rúi Œ chủ yêu gồm: Sử dụng chung kim liễm ở những người nghiên ra túy Dùng chung dao cạo, bàn chai ring, dung cụ cắt móng tay với người bị nhiễm

vi rút viêm gan C, kim chích xăm mình hoặc xỏ lễ tai không đảm bảo vô trùng, Người nhận máu, chế phẩm muáu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho nhiềm

TICV; Phơi nhiễm ở nhân viên y tế (L - 3%), Nguy cơ lây nhiễm vỉ rút viêm gan C

qua quan hệ tinh duc hiểm hơn so với viêm gan (5 - 10%): Mẹ truyền sang con

xây ra lại thời điểm sinh với những bà mẹ cỏ HCV RNA (+), khoảng 6%, Không rõ

đường lây nhiễm chiếm 30 - 40% trường hợp

Một người nhiễm LICV, có thê nhiễm đông thời vị rút viêm gan A, 13

1.2.3 Diễn biến tự nhiên ©”!

Sau khi bị nhiễm LICV, thời gian ú bệnh thưởng kéo đài từ 2 đến 26 tuần,

trung bình từ 6 đến 10 tuần

Giai đoạn cấp tính: Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cập tính thường không có biểu hiện bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện bệnh nhẹ (rất khó quan sát

14

bằng mắt thường) Khoảng 60 - 70% các bệnh nhân nhiêm không thẻ hiện triệu chứng, 20 - 30% có thẻ cỏ biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thẻ hiện một số triệu chứng không đặc hiểu như: biếng ăn, mệt mỏi, đau bụng Triệu chứng biểu hiện lam sang của bệnh nhân ở giai đoạn cấp tính viêm gan C tương tự như các

bệnh nhân nhiễm các vi rút viêm gan gây bệnh khác Do vậy, việc xét nghiệm các

bệnh nhân nay bang các thử nghiệm miễn dịch là điêu cần thiết để xác định bệnh

nhân nhiễm loại vi rút viêm gan nao Tuy nhiên, các thử nghiệm miền dich nay cho

kết quả Dương tỉnh 80% sau 15 tuàn kẻ từ khi có những biêu hiện bệnh lý Tỉ lệ trên

tăng dân theo thời gian vả tối đa là sau 9 tháng hâu như 100% các bệnh nhân nhiễm HCV đều có thể phát hiện vị rút bằng kĩ thuật miễn dịch

Do nhược điểm vẻ thời gian mà các kĩ thuật miền dịch tỏ ra không có hiệu

quả trong việc phát hiện sớm vi rút Tuy nhiên, do các kỹ thuật phát hiện HCV bing

sinh học phân tử còn quả đắt tiên, vi vậy, kĩ thuật miễn dịch vẫn được sử dựng phô

biển hiện nay

Giai đoạn man tinh: Sau giai đoạn nhiêm cấp tính, khoảng 15 - 25% bệnh nhân sẽ tự hỏi phục thông qua cơ chẻ loại thải vị rút HCV và cơ thẻ trở lại trạng thải

bình thường, Tuy nhiên, khoảng hơn 75% các bệnh nhân nhiêm HCV sẽ chuyên

sang giai đoạn mạn tính

Hình 4: Sơ đồ tiến triển bệnh nhân nhiễm HCV F9!

15

Trong giai doan nhiễm rnãn tính, bệnh nhân thường không có bắt kỳ một

biểu hiện bệnh ly nảo Giai đoạn này có thể kéo dai tir 20 - 30 năm hoặc có thể kéo

dài hơn Irước khi bệnh whan chuyén thank ung dur gan Ti 1é nhiém HCV chuyén

thanh xo gan 15 - 20% sau 20 nim, ti 1 cang, ting néu thoi gian nhiém cảng lâu, 71% bệnh nhân xơ gan nêu nhiễm hơn 60 năm Trong nhóm bệnh nhân xơ gan do HCV, mỗi nắm 1,4 - 3,314 chuyển sang ung thư gan và 2,6 - 4% tur vong 571

1.2.4 Chin doan phòng thí nghiệm

Chân đoán viêm gan C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức năng gan, siêu ân

san, sinh thiết gan các xét neliệm tìm HCV giữ một vai trỏ rất quan trong F848!

1.2.4.1 Phương pháp gián tiếp - ñm kháng thể anti-HCV

Có thể tìm thấy kháng thể ant-HCV ở 70% trưởng hợp khi bắt dầu có triệu

chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan

© nhưng khẳng có triệu chứng Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cập

tính, dã lành bệnh (dào thái hét vi it) hay chuyển sang giai đoạn mạn tỉnh

Tìm kháng thé anti-HCV oo thé sit dung các kỹ thuật như rniễn đích điện hoả

phát quang hoặc kỹ thuật miễn địch HLISA

1.2.4.2 Phương pháp trực tiếp - tìm HCV RA

Phát hiện trực tiếp vi rút trong máu, một bằng chứng của nhiễm HCV và vi

rút đang tăng sinh Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khủ

nhiễm vi nit

1.2.4.3 Các nhương phân xác định lúểu gen

a RT-PCR: Kỹ thuật PCR phiên mã ngược được phát triển và ứng dụng đối với các vị rút có vật liệu di truyền la RNA từ những năm 1990 Dây là kỹ thuật chin

đoán nhanh, nhạy, đặc hiệu cho từng type huyết thanh, tuy nhiên do độ nhạy cao

tiên rất đễ xây ra dương tính giả nêu không kiểm soái được Lạp nhiễm của các lác

nhân ngoại lai.

b, Realtime RT-PCR: Đây là kỹ thuật sử dụng cặp môi và dẫu dò đặc hiệu cho

từng kiểu gen, sử dụng tin hiệu huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm phản ứng

theo thời gian Hạc mà không căn điện dĩ Nhiễn thử nghiệm realtime RT-PCR di dược phát triển sử dụng kỹ thuật TaqMan va SYBR Green 97),

e_ Kỹ thuật LIPA: Lá kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu, sản phim PCR duge

khuếch đại với cặp môi trong đó có một mỗi gắn biotin Lai san phim PCR gan biotin trên các vach đoạn đò kiểu gen đặc hiệu, san đó tiền hành lai sản phẩm PCR

dã cỏ với các que (strip) của bộ thuốc thử LIPA Trên mỗi strip có gắn sẵn các vạch

đỏ (probe) chuyên biệt cho từng kiểu gen của IICV Tuy nhiên, vi LÍPA phải thục tiện trên sản phẩm PP là kết quả cũa phán ứng nested PƠR nên khả năng bị ngoại nhiễm là khá cao và dây chính là lí đo giải thích dược tại sao có khá nhiều trường,

hop LiPA có kết quả không thể xác định được kiểu gen “I

d Kỹ thuật giải trình tự gen: Day là kỹ thuật chuẩn xác nhất, kiếm soát được

cóc sai sói, đâm bảo độ chính xác cao, khắc phục được các nhược điểm của cáo kỹ

thuật trên trong xác dịnh kiểu gen Dựa vào trình tự dã giãi mã, tiến hành so sánh độ tương đẳng với các trình tự kiểu gen chuân có trang Gene Bank đề xác định kiểu gen của HƠV Thêm vào đó từ bình tự gen iu được tá có thế có nhiều ứng dụng, tiếp theo như phát hiện, theo đời các đột biến, tạo cây để tìm hiểu mối liên quan,

cơn đường lây nhiễm của các kiểu gen ICV khác nhau trên thê giới

1.2.5 Diễu trị viêm gan vi rút C F1

Không phải trường hợp nhiễm HCV nảo cũng cân phải điêu trị đặc hiệu

Mục đích điều tri độc liệu viêm gau vị rút C là đảo thải hoặc giảm bớt lượng HƠV

trong cơ thể, đặc biệt là ở gan và giam thiểu hoặc loại trừ hoàn toan tinh trang viêm gan, do đó ngăn ngừa điễn tiến sang xơ gan, ung thư gan Cỏ 6 kiểu gen HCV của viêm gan Ở và mất kiểu gơn có thể có dap ứng điểu trị khác nhau Thời gian điều lrị

có thể thay đổi tùy theo kiểu gen và nỗng độ HCV RNA vào từng thời điểm: tuần 4,

12, 24, 48 và 6 tháng sau khi ngưng thuổ

giảm tác dụng phụ và giá thành điều trị

Chỉnh vớ vậy, việc xõc định kiểu gen HCV lỏ rất quan trọng trước khi quyết dinh

điều trị

Phõc đỏ điều trị viởm gan C được õp dựng hiện nay lỏ kết hợp khõng vi rỷt

interferon va ribavirin Tuy nhiờn, interferon đờ nhiờu tac dung phụ khừng mong

muốn, một số kiểu gen HCV dõp ứng khừng tết với mterferon, vớ vậy khừng đạt được kết quả điều trị như mong muốn hoặc nhiều bệnh nhón phải ngừng điều trị do

cõc tõc đụng phụ

Hiện nay, cõc nhỏ khoa học đọ tớm ra cõc loại thuốc khõng vớ rỷt viởm gan Œ

mới, cụ thể cụ hiệu qua hơn vỏ dụng nạp tốt hơn cõc phương phõp điều trị hiện cụ

Hai thuờe mới như telaprevir vỏ boeeprevir gón đóy đọ được cho phờp sử dụng ở

trội số nước

1.3 Cõc đặc trung của kiờu gen HCV

1.3.1 Kiểu gen HCV phón bỗ theo địa du F71

Cõo nghiởn cứu trớnh tự vỏ xõc định kiờu gen chứng minh cõc kiểu phụ liởn quan khõ chắt chế vỏ phón bố theo địa đư như sau: Kiểu 1a thường gặp ở Bắc, Nam

Mỹ vỏ Australia; Kiểu 1b thường gặp ở Chóu ằu vỏ Chóu ạ; Kiểu 2a thường gặp ở Nhật vỏ Trung quốc; Kiếu 2b thường gắp ở Mỹ vỏ Bắc ằu; Kiểu 2c thường gặp ở Tóy vỏ Nam ằu; Kiểu 3a thường gặp 6 Australia va Nam A; Kiểu đa thường gặp ở

Ai cập, Kiếu 4c thường gặp ở miễn trung Chóu Phi; Kiểu 5a thuờng gặp ở Nam Phu,

Kiểu 6 thường gặp ở Chau A (hớnh 5, bớnh 6, tớnh 7)

Hình 6: Tỷ lệ kiểu gen HCV tạicác nước Châu Á 161

20

Hình 7: Tỷ lệ kiểu gen HCV tại Việt Nam Í5%!

1.3.2 Kiểu gen HCV với nguy cơ lây nhiễm ©!

Kiểu gen 1b thường gặp ở bệnh nhân được truyền máu, kiểu gen 3a thường gặp ở đối tượng tiêm chích ma túy Hiện nay nhiễm vị rút C kiểu gen 3a gia tăng do

số người tiêm chích ma tủy tăng lên, còn những người nhiễm HCV kiểu gen 1b thi

giảm do tiền bộ trong kỹ thuật truyền máu

1.3.3 Kiểu gen HCV với mô bénh hoc |!

Người mắc kiểu gen 1b có nguy cơ bị HCC hơn những bệnh nhân mang các kiểu gen khác do những người nhiễm kiểu gen 1b thường sớm hơn những người nhiềm kiểu gen 2 va 3 vải thập kỷ Điêu này cũng có the ap dụng cho kiểu gen 4 ở

vùng Trung Đông

1.3.4 Kiểu gen HCV với đáp ứng và dự đoán đáp ứng với điều trị "Š!

Thông tin vẻ kiểu gen rất quan trọng nó được sử dụng đẻ dự đoán kết quả điều trị Tỉ lệ đáp ứng kéo dài khi sử dụng Peginterferon kết hợp với Ribavirin

thường cao hơn ở kiểu gen 2, 3 so với kiêu gen 1

21

Kiểu gen 1 được xem như là kiểu gen khó khăn nhất với các liệu pháp diễu trị hiện nay Tuy nhiên tí lệ đáp ứng với điểu trị khi sử dụng mứerferon mới lả

pegmierferon kél hop voi ribavirm thì đường như tăng lồn rõ rệt, > 30% đáp ứng

kéo dải Kiểu gen 2 và 3 dáp ứng với diều trị hiện nay tốt hơn có thể lên đến 70% -

in nay ở bệnh nhân cỏ kiểu gen

2 tắt hơn bệnh nhân có kiếu gen 3, nhưng điều này cẩn thêm các nghiên cứu ngẫu

90%, Có một vải bằng chúng đáp ứng với điều tri

nhiền lớn hơn để xác định lại Lý do có sự liên quan giữa các kiểu gen và đáp ứng,

với điều trị cần só nhiều nghiên cứu thêm Nhưng người ta cho rằng vì rút thuộc cäc

kiểu gen khác nhau có thời gian sống khác nhau ru: kiểu gen 2, 3 lồn tại ngắn hơn kiểu gen 1, vi thể sự thải loại kiểu gen 2, 3 dễ hơn kiểu gen 1

1.3.5

iểu gen HCV véi thoi gian diéu tri"!

Kicu gen cũng là mộ u tổ cản để xác định thời gian cần điều trị Nói chung néu kiểu gen 1 thời gian điều trị khoảng 48 tuần, kiêu gen 2, 3 cần 24 tuần, tuy nhiên có những nghiên cứu đang thực hiện xác định khoảng thời gian điều Bị tốt nhất dựa vào cáo yêu tỏ nhất dịnh Một số nghiên cửu cho rắng những bệnh nhân có +iêu gen 1, nông độ vi rút cao nên điều trị 72 tuân thay vì 48 tuần đề đạt được tỉ lệ dap ứng cao nhất, Có một vài nghiên cứu đánh giá thời gián diều trị cho kiểu gen 2

là 12 tuần và kiểu gen 3 là 48 tuần

1.3.6 Kiểu gen HCV với liều lượng thuốc diễu trị 9

Genotype cing la một thông tin quan trọng để xác định liêu luong ribavirin

Với những người có kiếu gen 2, 3 liêu cho ribavirin là 800mg/ngày, ngược lại liễu

cho kiểu gen 1 đựa vào trọng lượng cơ thể thường 1000mg - 1200mg/ngày

1.3.7 Kiểu gen hỗn hợp của HCV FÉI

Một người có thể nhiễm hơn 1 loại kiểu gen Số liệu về kiểu gen hỗn hep thi hau như chưa dược nghiên cứu nhiều, nhưng một vài số liệu chơ thấy, nó cỏ thể ánh: trưởng tới đáp ứng điều trị và diễn tiến bệnh viêm gan vì rút C

1.3.8 Gan nhiễm mỡ và mỗi liên quan đến kiểu gen céa HCV ")

Tinh trang gan nhiễm mỡ thường thấy ở bệnh nhân viêm gan vi rứt C Gan

nhiễm mỡ gp phân váo diễn tiến của bệnh và đáp ứng kém với điều trị, mặc đủ cơ chế chưa được hiểu một cách rõ ràng Những người nhiễm HCV kiểu gen 3 có khả nang bị gan nhiễm mỡ nhiều hơn vả kiểu gen 3 là một yếu tố nguy cơ độc lập va đồng vai trò trực tiếp trong sự phát triển gan nhiễm mỡ

1.3.9 Kiểu gen vả diễn tiến bệnh viêm gan C mạn tính FFI

Về liên quan giữa kiểu gen và diễn tiền bệnh gợi y ring kiểu gen 1b liền

m bệnh nặng hơn so với kiểu gen 2, 3 Nhưng cần có nhiều

nghiên cửu hơn dễ xác nhận điều này

quan với mức độ điể

1.3.1 Kiểu gen và ghép gan trong nhiém HCV “1

Kiểu gen 1 (đặc biệt là kiểu gen 1) liên quan đến quá trình xơ hóa nhanh

hơn ở những bệnh nhàn đã ghép gan,

1.4 Tình hình bệnh viêm gan vì rút C và các nghiên cửu

Hiện nay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng đồng chơ thấy vi rút nảy là một mỗi lo ngại nghiêm trọng, Trên thể giới eó gần 200 triệu người (khoảng

394 đân số thể giới) dang bị nhiễm HCV và 3 - 4 triệu người mới nhiễm mỗi năm [1

nhân bị viêm gan, tỷ lệ có HCV trong máu là khoâng 11%, còn ở các bệnh nhân xơ

gam là 12,5 và ung thư gau là 894 DÌ

23

Hình 8: Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới ®7!

Năm 1996, nhỏm tác giả P Simmonds thuộc đại học Edinburgh, Anh đã giải

trình tự gen đề phân tích biến thể của vi rút viêm gan C ở các nước Đông Nam Á 8l,

Năm 2004, nhóm tác giả Tatsunori Nakano Nhật cũng giải trình tự gen phan

tích biến thể vi rút viêm gan C tìm hiểu lịch sử con đường lây nhiềm P°Ì

Năm 2005, nhỏm tác giả Hồ Tân Đạt tại trung tâm Y khoa MEDIC, thành

phô Hỏ Chỉ Minh nghiên cứu và xác định kiêu gen HCV của 327 bệnh nhân viêm gan C cho thấy kiêu gen 1 chiếm 58,4%, kiêu gen 6 chiêm 23,9% và kiểu gen 2

chiểm 13,1%

Năm 2010, Tomoaki Tanimoto củng công sự đã nghiên cửu 486 trường hợp

nhiễm HCV trên nhóm tiêm chích ma tuý tại Hải Phỏng Kết quả cho thầy tại vị trí 5*UTR-core kiểu gen 6e chiếm ưu thể 32,5%, tại vị trí NS5B kiểu gen 1a chiếm ưu

thể 42,6% I1,

24

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu của bệnh nhản dến khám và diễu trị viêm gan C tai Bệnh viện

Bệnh Nhiệt doi Trung tương từ ngày 1 tháng 12 năm 2010 đến ngày 30 thang 11

trăm 2011, được chân đoán nhiễm viêm: gam vì rút C nan tỉnh và có chỉ định làm xét

nghiệm xác định kiểu gen của HCV,

'Tiêu chuẩn chân đoản viêm gan vi rút C mạn tính: phát hiện đồng thời Anti-

TICY va IICV RNA tén 6 thang 7!

3.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Sinh phẩm, hóa chất

- Kít định lượng AST, ALT, Bilirubin eta BeckmanCoulter

- Kít xác định AntiICV Monolisa Anti-LiCV plus version 2, Biorad

- Kit đêm tải lượng vi rút CODAS AmpliPrep/COBAS TapMan LICV, Roche

- Primer

Bảng 2.1 Trình tự mỗi ©!

Vi tri nucleotide Mỗi Trinh tw nucleotide doan gen core :

và săn phẩm Se2 |5'-QQGAGGTCICGIAGACCGIGCACCAIG-3' 318344126bp]

- Hoá chất tách chiết RNA: Bé kit tách chiết RNA của hãng QIAGEN (Mỹ)

- Hoa chat ting hop cDNA: Bé kit MonsterScrip 1"-Strand cDNA cia hing

Lipicentre (My)

- oa chất thực hiện phản ứng PCR: Kit Invitrogen (My)

- Tloa chat điện đi

- Hoa chat tuth sạch: Bộ kít tỉnh sạch của hãng QLAGBX (Mỹ),

- Hoa chat giaii trink tz gen: B6 kit Bigdye 3.1 (ABD

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ: - Cac loai pipet (10 yl, 200 pl, 1000 yl)

- Các loại đầu côn tương ứng

- Ông máu không chất chống đông cho xét nghiệm anti-HCV, dink

type và đêm tải lượng vỉ rút

- Ong máu cỏ chống đông Ileparin cho xét nghiệm ASI, ALT va

Bilrubin

- Ong eppendorf cae loai

- Giá để mẫu

Thiết bị: Tủ lưu mẫu -20°C, -70°C, máy li tâm tốc độ cao, máy ly tâm nhỏ, máy

volox, đầu ELISA, may sith hod ir ddng (Olympus AU400), may PCR, bộ điện dĩ, máy đọc gel (Gel Doe-Biorad), máy giải trinh ty gen (3130 Genetic Analyzes-ABI)

2.3 Phương pháp nghiên cửu: Nghiễn cửu mỏ tả cắt ngang

26

3.4 Quy trình nghiên cửu

SƠ DÓ NGIIÊN CỨU

Bệnh nhân

<38 ban sao/mL (Loại khỏi

PCR sequence

Tỉnh sạch và đọc trình tự gen

Phân tích phả hệ

2.4.1, Thu thập và báo quản mẫu huyết thanh: các mẫu huyết thanh của bệnh nhân cỏ Anti-LIOV đương tính được báo quản ở -70°C tới khi làm xét nghiệm giải trình tự xác định kiểu gen và đếm tãi lượng vi rúL

2.4.2 Quy trình xác định Amti-HCV: Sit dung 66 kit Monolisa Ant-HCV plus version 2, Biorad

Anu-HCV PLUS Version 2 là thử nghiệm miễn địch gắn

men đựa trên nguyên lý kỹ thuật sandwich 1 bước nhằm phát hiện kháng thé TICV

trong huyết thanh hoặc huyết hương,

B/ Chuan bj hod chit:

- Cơ chat 1R9:10R8 hu trong tối sử đụng trong vòng 6h nhiệt độ phòng

- Dung dịch rửa: IR2: 19 nước cất, lưu ở 2-30°C sử dụng trong vòng 2 tuần

€7 Quy trình:

st danh sách mẫn và bảng sơ đồ mẫu

- Lẩy giá đỡ và các thanh xét nghiệm ra khỏi túi

- Cho 80 pl dung địch hoà loãng bệnh phẩm (R6) vào mỗi giếng,

- Cho 20 pH huyết thanh chúng âm (R3) vào các giếng A1, BI

- Cho 20 Lủ huyết thanh clrửng đương (R4) vào các giếng C1, DI, HI

- Cho 20 pl mau xét nghiệm lần lượt vào các giéng G1 Trén đều bằng cách tiút nhà lên xuống 3 lần

- Dậy giếng bằng tắm nhựa đẻ tranh sự bay hơi bè mặt

- Ứ 60 + 5 phút trong may 4.6 37°C

- Bỏ tắm nhụa, cho phiển vào máy rủa, rửa 3 lần không ngâm

- Cho 100 pl dung dich chat công hợp vào các giếng Đây phiển bằng tâm

nhựa và ú 30 _ 5 phút ở 372C

28

- Bỏ tâm nhwa, cho phién vao may ria, rita 4 lan

- Cho 100p1 dung dich co chat (10R8:1R9) vao mdi giéng TF ti 30 1 5 phút ở nhiệt độ phong 18-25°C

- Dimg phản ủng bằng 1001 đụng địch R10

- Đọc ở bước sóng 450/620rmn trong vòng 4-30 phút sau khi cho dụng địch dimg phan ung

D/ Nhận định kết quả: Việc khẳng dụnh sự có mặt kháng thể HCV của mẫu dược

sơ sánh với giá trị chứng ngưỡng,

OD (Cl) + OD (D1) + OD (LI) Gia tri rung bình chứng ngưỡng § ——H———

Dương tinh néu OD maiu> C.O Lam lại nên C.O -109 <OD mẫu <ŒO

2.43 Quy trình xác định tải hong vi rat: Sử đụng bộ kít COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCY aia Roche

AV Nguyén ly

Xet nghiém COBAS AmpliProp/COBAS TaqMan HCV 14 xél nghiệm

khuếch dai axit nucleic ding để định lượng RNA cửa virut viém gan C trong huyết

thưnh người Thiết bị COBAS AmpliPrep tr déng xi lý mẫu và COBAS TaqMan ta

đông khuếch đại và phát hiện

29

‘Xét nghigm COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV gdm 3 quả trình chính:

(1) Chuan bi mau dé tinh chiét duge RNA của HCV,

(2) Sao mã ngược RNA dich dé tao ra DNA bé try (CDNA), va

(3) Đông thời khuếch đại elDNA đích và phát hiện quả trình bị cắt của mẫu đò

gần 2 màu hưỳnh quang đặc hiệu với tác nhân đích

Xét nghiệm COBAS AmpliPrep/COHAS TagMan HCV cho phép bự dộng

chmẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch đại PCR cửng phat hién HCV RNA dich va HCV RNA chuẩn định lượng (QS) Thuốc thir Master Mix chứa đoạn mỗi và các

ie higu cho c& HCV RNA và HCV RNA QS Thuốc thứ Master Mix được

phát triển để đâm báo định lượng tất cá các kiểu gen HCV từ 1 đến 6 Các DNA

mau dé

khuếch đại được phải hiện nhờ sử dụng các rnấu dò đánh đầu đặc hiệu cho lác nhân

đích và Q8, cho phén phát hiện độc lập sản phẩm khuếch đại của IICV

HCV Qs

ừ mâu và từ

Xải nghiệm sử dụng HCV Q5 để định lượng RNA virút HCV HCV QS cho

phép bủ trừ ảnh hưởng, của những ức chế trong phan img PCR va kiém soát qua trinh chuẩn bị và khuếch đại, cho phép định lượng chính xác hơn lượng CV RNA trong mỗi mẫu HCV QS là một sẵu trúc RNA không lây nhiễm chứa những chuối HCV với những vị trí gắn mỗi giống hệt như RNA dịch HCV vẻ một vùng gắn mẫu

đỏ duy nhật cho phép sản phẩm khuếch đại của CV Q5 có thể phân biệt được với sân phẩm khuếch đại của tác nhân địch HŒV Q5 được thêm vào mỗi mẫu với số lượng xác định va trải qua toàn bộ quả trình chuẩn bị mẫu, sao mã ngược, khuếch

đại PCR va phat hiện mẫu dò đánh đâu Thiết bị phan tich COBAS TaqMan tinh

néng dé HCV RNA trong mẫu xét nghiệm bằng cách so sánh tín hiệu HCV với tin

hiệu HCV QS cho mỗi mẫu thử và mẫu chứng

B/ Chuẩn bị mẫu

Xét nghiện COBAS AmpliPrep/COBAS TagMan HCV sử dụng thiết bị COBAS AmpHPrep để chuẩn bị mẫu tự động bằng kỹ thuật tách chiết mẫu đùng hạt

30