Luận văn nghiên cứu di truyền học một số tính trạng có Ý nghĩa kinh tế của nấm men saccharomyces spp

Cho nên, các phòng thi nghiệm trên thế giới vẫn không ngỉng nghiền cứn để có thể chữ động tạo ra được các nồi nấm men có khả năng tạo ra nhiều gân phẩm hon va dé đàng hơn trong việc Ihu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

TRƯỜNG DẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

A ‘LONG QUAN TAI LIEU

NAM MEN Saccharomyces VÀ VẤN ĐỀ ĐIỀU K

MỘT SỐ TINH TRẠNG CO ¥ NGIIA RINH TẾ

Saccharomyces spp

1 1 Đặc điểm sinh học của nan mien

1 2 Giá ứrị kính tế của nắm mien

WI DỊ TRUYỄN HỌC MỘT SỐ TÍN TRẠNG KINIL TỔ NẴM Mũ

TLL Tih trang hình thái tế hào

I} 2 Tính trạng chịu ethanol

II 3 Tính trạng chịu nÍ

1L 4 Tĩnh trạng chịu mặn

li 5 Tính trạng đường hoá tình bột

Il 6 Tinh trang chuyển hoá cốc loại đường

HL CAC PHUGNG PHAR TAO RA NOLNAM MEN MGL

UA Lai

fi Nguyen te chung

TII.I.2 Các phương phấp lai

17.2 Ding hep 16 bào trần,

HI.3 Biến nạp và ADN tái tô hợp

IV MỘT SỐ THĂNH TỰU VỀ VIỆC

B VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 VAT LIBU

Tb Cae néi nam men

KHIỂN Dĩ TRUYỄN

C' ĐIỂM SINH Tue VA GHA TRI KINH TẾ CA NẤM MEN

'FAO GIẲNG NAM MỊN

Thang

1 2 Hoá chất tỉnh khiết

I 3 Mây móc

1 4 Các loại mỗi trường nuôi cấy

II PHƯƠNG PUÁP

I1, Các phương phấp vì sinh vật học,

IL.I 5 Xác định khả năng lên men

ILE 6 X4e định lượng rượu có trong dich Jen nen

1I.1 7 Xác định khả năng đường hoá tính hội

I!.1.8 Xác định khả năng chịu nhiệt

H.L 9 Xác định khả năng chịu pH thấp

U.L J0 Xác định khả păng chịu côn

17.1 11 Xác định kha nan:

II.2 Các phương phấp di truyền học

1.2.1 Tâch hào tử hùng loại

11.2.2 Vi thao tác

11.2.3, Lai bia hot

11.2 Dung hop tẾ bào trần

C KẾP QUÁ VÀ THẢO LUẬN

1 ĐIÖU TRÀ SINH HỌC VÀ PHẦN TỊCH DỊ TRƯYÊN MẶT SỐ

‘TINIT TRANG CO ¥ NINA KINH TẾCỦA NẤM MIỄN

Saccharomyces spp

I.1 Khả năng sinh bào lử của các nồi nắn tren

1.2 Kha năng sống sót cửa các bào tử tích ra tì cần nội nấm men

I 3 Khả năng chịu cần của các noi nấm men

I 4 Khả năng chịu auuối của các nồi nấm men,

1 5.Kha nding chin nhigt dé cao (42"C) oda ndi nấm men TH,- 30

1.6 Kha nfing ehin pH thấp ( pH 2) của nồi nấm men TH, -30

1.7 Khả năng tích luỹ sinh khối của nồi nấm men TH , -30

II NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NẤM MIIN MỚI

Wa

ao giống nấm men bảnh mỉ có vỏ tẾ hào mông

1.1.1 Sơ đồ lại

II.1.2 Thụ nhận nồi lai nang gen cpr! tai bang indy vi thao tac

TLE So gánh khổ năng lên mien đường, tích lũy sinh khối pita

nồi lai va cha me

IÍ.E.1 So sắnh khả năng tạo sinh khôi giữa nòi nấm tren lại mang gen

zpm] vấi nồi cha mẹ trong điều kiện sâu xuất

T.3 Nghiên cún tạo giống nấm men chin edn

11⁄2.1 Cải tạo đi truyền nòi nấm mien dùng (rong sẵn xuất rượu vang

II.2.1.6 So gánh khả trăng chịu cồn, lên men và khả năng Ích lity

xinh khối giữa nòi lú với nồi nấn men bạn đầu ( VI, )

1.2.2 Tạo giống nấm mcn cho sẵn xuất cồn và nước giải khát có ga

1.2.2.1 Kết quả thụ nhận cáo nòi nấm men lai bằng máy vỉ thao tác

11.2.2.2 So sánh khả năn én men, kha ning tích lũy sinh Khối

giữa các nồi nấm men lá vải cha mẹ

1I.3 Nghiên cứu tạo giống nấm men Š cerevisiae

có khả năng đường hoá tỉnh bật

H.3.1 Chuyển gen đường bo tỉnh hột từ Š diastatieas va0 be urn

của Ä cerevisiae hằng phép Jai bao hod

1.3.1.1 Sơ đề tai hão hoà

H.3.1.2 So sánh khả năng cường hoá tỉnh hột, khả năng lên men

và khả năng dich ly sinh khối giữa nòi lai với nòi cha 1n

1L3.2 Tạo giống nấu suen cô khả năng đường hoá tỉnh hột bằng

kỹ thuật dung hợp tế bào trần

113.2.1 Sơ đồ dung hợp

1.3.2.2 KhẢ năng hình thành tế bào trần

1.3.2.3 Kết quả của các phéi dung hyp 86

I1 2.4 So sánh khả năng chịu nhiệt chịu suối, khả năng đường huá

nh bột, khả nắng lên men và khả năng ch lũy sinh khối

giữa cáo thể đụng hợp và cha mẹ,

D KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ,

Ð TÀI LIỆU THAM KHẢO

g4

85 BS

MỘT SỐ THUẬT NGỮ CHUYEN MÔN ANH -VIỆT

Ethanol tolerant character

Acid tolerant character

Phan tich bộ bến

: Thể phần ly

: Dung hợp tế hào trần

: Thể dung hợp + Lai bao hoa

inh trang chịu nhiệt

: Tính trạng chịu mặn

: Tỉnh trang chịu cần

: Tinh trạng chịu axit ( pH thấp )

Biomass accumnlation character: Vinh trạng tích lũy sinh khối Mating-type

: Nồi : Nang

: Hầu tử : GIÁ khuẩn ty

MỞ ĐẦU

Không có nhôm vi sinh vật nào lại gắn liền với tiến bộ và sự phỗn

vinh của loài người hơn là nắm men Đây chỉnh là nhúnn vi sinh vật quan

trọng nhất đã được con người sử dạng trong sẵn xuất và trong nghiên cứu

sin phẩm 1È nấm men chiếm gần

khoa học Theo lài liệu quốc tế (1984) c

70 % tông số các gân phẩm công nghệ sinh học trên toàn thế giới Về phương

diện nghiên cứu khoa học, nấm men chính Ià đối tượng thuận tiện để nghiên

cứu nhiều vấn đề cơ hân liên quan cđếu sinh vật nhân chuẩn như sự hiểu hiện của gen sự sao chép của ADN , sự chuyển chỗ, cấu trúc của nhiễm sốc thể,

cơ chế nguyên phân và giảm phân Có lhễ nói nấm rnen là đối tượng quan

trọng bậc nhất của công nghệ sinh hẹc hiện đại [{6, 115, L6, 117 |

Người la thấy rằng, nấm men nói riêng và ví sinh vật nói chung thậm

chỉ còn biến đổi thường xuyên hơn cà các sẵn nhằm do chúng lạo ra Chính

vì thế mà từ xưa đến nay, con người không ngừng lựa chọn, tạo ra những nôi

khắc nhau, lùy theo từng mục dich sử dụng Ngày nay, phương pháp lựa chọn có định hướng - nghĩa là tạo ra các điều kiện nuôi cấy và môi trường

đặc biệt ( như ni ð cao, độ mặn cao, áp suất thâm thấu cao ) dé chon

lọc những nôi thích hợp - đã được sử dụng ở nước ta và trên thế giới [ 20, 22,

Tuy nhiên, nếu chỉ tiến hành phân lập và giữ giống thì không thể thoả

muãn nhu cầu ngày càng tăng của sẵn xuất và nghiên sứu khoa học [ 13 | Mặt

khắc, cho đến nay trên thế giới chưa có nhiều công trình nghiên cứu về di

truyền học cáo tỉnh trạng chống chịu ở nấm men Còn ở Việt nain, các công

trình nghiên cứu theo hướng phân lích đi tuyền các tính trạng chống chịu và tạo giống nấm men bằng các phương pháp đi truyền học cũng chỉ đang ở giai

đoạn bước đầu [ 6, 8, 10, 11, 12, 17, 79 ] Việt nam lại là nước nhiệt đái có

thời tiết nồng âm kéo đài nhiều thắng trong nằm; có khu hệ vị sinh vật vô cùng phong phú; cho nên việc duy trì được những điền kiện nong muốn

trong suốt quá trình sản xuất ( chẳng hạn, bào đâm để nhiệt độ lên men luôn

luồn ở 28° - 30 °C; hay bảo đâm võ trùng cho quá trình lên men .) là khá

tốn kém Cho nên, việc nghiên cứu để tạo ra nồi nấn men mang những phẩm chất quí giá, chẳng hạn vừa có khả năng ch lũy sinh khối cao, vừa có

khả năng chịu nhiệt cao chính Tà cách để giảm bớt tốn kém do phải dùng nước để giải toã nhiệt độ sinh ra trong qué tinh [én men; hay nếu có được

néi nam men chịu cồn cao chịu pH thấp thì sẽ hạn chế được sự nhiễm của vi

khuẩn lạ từ bên ngoài vho môi trường lên men Nhằm góp phần nghiên cứu

số lính trạng có ý nghĩa kinh tế ở nấm

về sự kiểm soát di truyền đổi với mi

men như chịu nhiệt độ cao, chịu cồn cao, chịu mặn cao, chịu pH thấp tich

lity sinh khii, lén men cae loai duding để tạo cø sổ cho nghiên cứu tạo giống

nắm ren hữu ich cho sản xuất, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu đi

truyền học một số nh trạng có § nghìn kinh lỆ của nấm men Succharomyces spp ĐỀ lai nghiên cứu gồm hai nội dung cụ thể như san:

1 Phân tích di truyền một số tỉnh trạng chống chịu ( nhiệt độ cao : 42' C, độ

cần cao :14 -16 % v/V , độ mặn cao : 3 % NaCI w#v, pH thấp : pH 2 } và một

số tính trạng có ý nghĩa kinh !É trực tiếp ( khả năng tích Joy sinh khối, lên

xuen đường, .) Ở một số nồi nấm men nhập nội và phân lập ở Việt nam

2 Nghiên cứu cải tạo di truyền những ndi nến men dùng trong sản xuất men bánh mì, sản xuất cồn và sàn xuất rượu vang ; đồng thời nghiên cứu việc chuyển gen đường hoá tĩnh bột vào nấm men Suechuremryces cerevisine

A TONG QUAN TAI LIEU,

NẤM MEN Saccharayee VÀ VẤN ĐỀ ĐIỀU KHIỂN DI TRUYỀN

MỘT SỐ TĨNH TRANG CÓ Ý NGHĨA KINH TẾ

Saccharomyces là những ví sinh vật nhãn chuẩn đơn giản nhất có quá trình hữu tÍnh điển hình Nhờ vậy, chúng là đối lượng rất thuận tiện để nghiên cưú những vấn đề của di truyền học đại cương và nhất là đi truyền học

phân tử của các sinh vật bậc cao Saccharomyces chính là đết tượng sinh vật

được nghiên cứu rất đầy đủ về mit di truyền học llàng trăm gen có những chức năng khóc nhau đã được định vj trên bản đồ đi truyền gồm I7 nhiễm sắc

thể Thêm vào đó, Saecharomyess oũng chính fà đối tượng quan trọng của nhiều ngành sẵn xuất Irong công nghiệp vi sinh vật : sản xuất Inen bánh mủ,

lầm cồn, làm rượu, làm bía, sân xuất các chế phẩm enzym, sẵn xuất protein

đơn bào, chế hiến các phụ phẩm dầu hoa Ngày nay, dí truyền học nấm men

bao gồm cả di truyền học kinh điển và di truyền học hiện đại đã trổ thành nde

lÌnh vực rộng lớn của Dí truyền học, Ví sinh vật học và Sinh học phân tử Cứ

hai năm một lần lại có những hội nghị quốc tế về Di truyền học và Sinh học

nắn men được triệu tập [ 4, l6, 116, L17 ] Trong khuôn khế của luận ấn này

chúng tôi xin đề cập đến các thông tia liên quan đến một số đặc điểm sinh học, giá trị kinh tế và việc điều khiển di truyền của một số tính trạng có ý

Ta tình tế của n

nghia kinh tễ của nâm men Sqcclaronniycøs spp

1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ GIÁ TRỊ KINII TẾ CỦA NẤM MIIN

Saccharomyces spp

1.1.Đặc điểm sinh học

Nắm men là sinh vat don bào , nhân chuẩn ( eukaryotie ) Tế bào của

chúng có rạng hình tròn hay ovan và thường có kích thước 5 - 10 Nắm men có những đặc điểm hấp dẫn khiến cho có thể đến hành cáo thí nghiệm với chúng nhanh chóng và dé dàng như đối với các sinh vậi nhân sơ

{ prokuryotic ) Trước hết, chúng sình trưởng rất nhanh, có thời gián nhân đôi

ngắn ( khoảng 2 giờ ) Có nghĩa tà, hàng nghìn khuẩn lạc của nấm rnen có thể

được nuôi cấy trên các đổa pobi trong khoẳng hai ngày, Thứ li, nấm mien

tỒnh 1: Hàm lượng AIXN của một tẾ bào

Thit ba, nam men là đối tượng đặc biệt thuận tiện để phán tích di truyền vì cấ: pha đơn bội và lưỡng bội trong chủ tình sống là rõ ràng và có thể điều

khiến được, Như vậy, nhà nghiên cưú có thể dễ dàng thu được các đột hiển

lặn khi sử dụng các lế hào đơn bội , Còn phép tai tổ bợp di truyền, công cụ căn bẫn của nhà di truyền học , có thể được thực hiện một cách dễ đàng nhờ

tai bai thể đội biến đơn bội khác nhau để lạo ra một thể lưỡng hội [ lố, 115, F17, 129]

Nấm men Saccharomyces cf nhidt dé sinh trưởng tối ưu trong khoẳng

27 đến 33 °C và p]1 tối ưu là 4,5 đến 5,5 Tế bào phân chia theo cách

nang bie techie bin bao ti dun bdi, Tey nhién cfs 66 thé quan sit tha

nang chifa it hon ( f - 3 bao tir) hay nhiéu hon (5 -8 bRo th ) Trvdng hop it

hơn 4 bào tử có thể là do vài nhân Không tham gia vào quá trình hình thành

bão tử, hoặc hai nhân lạa lhành mội bàn tử Còn nang có chứa nhiều hơn 4

bào tử có thể xuất hiện do có thêm uuột lần phân chia nguyên phân sau khi

phân chia giảm phân hoặc chúng có thể được hình thành _ từ các tế bào mang

bai nhân lưỡng bội { 4, 27, 114, 115 | Trong môi trường :lnh dưỡng thông

thường, cấu bio tử đơn hội sinh trường và thường giao kết với nhau từng đôi

một để tạo thành các hạp tử lưỡng bội, Sau đó, các hợp từ này tiếp tục sinh

san vô tính theo cách nấy chải để lạo thành các đồng lưỡng bội Thông

thường, tế bào đơn bội nhỏ hón, có dạng hình cần, có kh năng giao phốt và không sinh bào tử; cồn !Ế bào lưỡng bội thì to hơn, có hình oœvan không có

khả năng giao phối và có khả năng sinh bào tử Người ta đã biết có ÌI nhất 5

gen kiểm soát quá trình giầm phan ở nấm men ; còn cấc giai đoạn riêng biệt

của quá trình lình thành bào tử do 19 gen kiểm soát [ 58, 61, 114, 121] Khi

nuôi cấy lâu đài trong phòng thi nghiệm, khả năng giao phốt của nồi đơn bội

giẫm nhiều và cuối cùng có thể dẫn đến bất thụ Các đội biến ở gen giới tính

huặc các biến đỗi ở các gen sửa đổi kiểm soát sự giao phối chính là nguyên

nhân của hiện tượng đíú Tuy nhiên, cũng có những nồi đơn bội có thể duy trí

5

được khả năng giao phối trong một thời gian dài Khã năng giao phối của các nòi nắm men liên quan chặt chẽ đến khả năng tiết ra pheromon giới dính để làm ngừng quá trình phân bào Chúng có bản chất là oligopeptit [ 27, 48, 55,

64 ]

Dựa vào cách hình thành thể lưỡng bội trong chủ Hình sống nà nắm

men được chia làm hai loại : nắm men đồng tản vA nam men di tan ( hình 2 )

Minh 2: Chu trinh séng chia Saccharomyres

Nam men dị tản là loại nếm men mà thể lưỡng hội được tạo thành do sự

giao phối của các bào tử hoặc lễ bào đơn hội có giới tỉnh khắc nhau , a hay et

Nam men dong thn 2 nấm men mà sự giao phối có thể xây ra giữa rủ bào tử

hay hai tế bào đơn bội hat ki Chính vỈ thế mà không thể duy tỉ được trạng

thái đơn bội ở loại nấm men này Giới tính cỗa tẾ bào đơn bội do ruột leeuL

MÁT kiểm soát Locut MAT có thể nuang một ong hai alen MATa lay MAT œ Trong các nồi nấm men đồng lần các tế bào chuyển đổ tinh a

sang giới nh œ và ngược lại một cách thường xuyên ở các thế hệ liên tiếp MÁT nằm cách tầm động 60 kb trên nhánh phải của nhiễm sắc thể số IIT, còn các bản sao không hoạt động của MATa hay MAT o nim tại cấc locul

HMR va HML ô hai phía của MAT Sự chuyển đổi giới nh được bắt đầu

bằng su cất bỏ ADN tại MÁT bởi HO endonucleaza Trình tự ADN tại MAT bị phân bây và được thay thể bằng một bân sao cửa một trong hai locat

len œ 1ƒ z x aken a } alen a

1.2, Gié tri kinh té clin nim men Saccharomyces

Hdn 6000 năm trước đây, người Ai cập đã biết lun nổ bội mỉ hằng nấm tnen có trong không khi [hậm chỉ trước đó nữa, người Suinmarian đã khắc

lên bia đá phương pháp lên men để làm cồn Ngày nay, nấm men đã được sử

dụng ở qui mô công nghiệp hiện đại Sẵn lượng nấm men hàng năm của

thế giới đạt gần hai miệu tấn; cồn cùng với các sẵn phẩm thu được từ quả

trình lên men có sử dụng nấm men đạt hơn hai triệu tấn và lợi Ích do nó

nuang lại lên đến hàng nghìn triệu đô la[ 116, 125 } Trong qui mô công

nghiệp, nắm men được sử dụng trong 3 ĨÏnh vực chính chính đây ( bằng | )

Bảng ( Các ứng dụng công nghiệp của nấm men [ 116 1

-ihức ăn -Lipit -Coenzym -Axitamin -Bia - Sử dựng sữa

giasúc -ptoein - Vitamin -Purin - Rượu vang - (E/iaglin)

hột (qmi trình

liệu Maltotrioza

~Glyeerol ( Sanarem)

-Ấ©U,

Phạm ví ứng dụng của nấm men hao gầm các ngành sẵn xuất chính như sau:

- Công nghiệp sẵn xuất men bánh mì

~ Công nghiệp sản xuất côn rượu vang và nước uống có cồn

- Sản xuất các sẵn nhầm đỉnh dưỡng cho người và thức ăn gin súc

- San xuAt vitamin, axil amin, axit nucleic

An diy, nfm men con duge sit dung để chế biến đầu hoả 11.4, 12]

Sã đi nấm men cố được những ting dung rộng rãi như vậy là do chúng

có khả năng chuyển hoá vừa nhanh chóng vừn có hiệu quả các loại đường

thành cồn và CO, ( ví dụ như các loại đường có trong dịch chiết ngũ cốc, dịch

Ở nấm men, quan hệ giữa hình thải lế hào và sự biến đổi rong vũ tế

bào đặc hiệt rõ rằng trong sự chuyển đổi từ đạng ““/Ế bảo nẤm mien” sang

dạng “ gửi khuẩn ty” và ngược lại Hình dạng té bao 16 rang [à được xác

định bởi tác động qua lại của các hoạt động điêù hoà và cấu trúc của tẾ bào

Nghĩa là sự xuất hiện của một dạng tế bào cụ thể chắc chấn phải là do sự tưởng tác của các củ chế biểu hiện của gen, cơ chế kiểm soát chu trình phân

bào, các quả trình sinh tổng hyp các thành phần vô tế bào Khi nghiên cứu

chu tình phân bào ở nan men Saccharomyces , Hartwell va cong sy đã thấy

9

có 35 gen khác nhau kiểm tra quả trình này Tuy rằng, đột biến ở các gen khác nhau gây ra các dang lễ bào khác nhau , nhưng lất cả đội hiến dé teu ảnh hưởng đến cấu trúc của vô tế bào Đột hiến gây ra dạng “giả khuẩn ly” chính là loại đột hiến ảnh hưởng đến cấu trúc và chúc năng của vỏ tế bào Nó

gây ta các (hay dỗi về lĩnh thái và thành phần hoá sinh của vỗ lế hào ở cúc nồi mang chúng Nhìn chung các thể đột biến “giả khuẩn ty” đều có vỏ tế

bào mỏng hơn , mẫn cảm hơn đối với nồi kier, chứa nhiều lipit và đường

arabinoza hơn Cho đến nay, ở phòng thí nghiệm của bộ môa Di Iruyền hoc,

trường Dại llọc Tổng Hợp Petersburg (Nga ) người ta xác định được 6 gen

lặn không liên kết gây ra dạng “giả khuẩn ty”, trong đó các gen rưụn Í - rpm

do Lê Đình Lương và công sự [ 138.139 140 ] xắc định còn các gen rm 4

- rpm: để do táo giá 1a.xA#ÄL[ L37 † xác định Thêm vào đỏ, người la cũng

đã xác định được là gen z2 và gen pad nim trên nhánh phải của nhiễm xấ: thể gõ IV [ 132, 134 ] Còn các nhà nghiên cửu ở phòng thí nghiệm Hoá -Sinh và Lý Sinh, trường Đại Học Tổng Hợp lowa ( Mỹ) thì đã xác định

tầng có đột biến ở 14 locnt gen khong liên kết khác nhau gây ra dạng “giả

khuẩn ty” ở nấm men Saccharomyces cerevisiae [ 25, 35.46, 49, 114 ]

RO rang nam men Saccharomyces fam tình đi truyền học rất bấp

để nghiên cứu các cơ chế kiểm soát hình thái tế bào [ 26 ) Mật khác, nấm men sinh sản nhanh chóng , tẾ baò của chúng lại chứa nhiều vitamin và axit aunin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô Cho nên, các phòng thi nghiệm trên thế giới vẫn không ngỉng nghiền cứn để có

thể chữ động tạo ra được các nồi nấm men có khả năng tạo ra nhiều gân

phẩm hon va dé đàng hơn trong việc Ihu nhận cde san phẩm eda cae fink vực

sản xuất khác nhan GO Viét nam, ndi ngin men Jai mang gen rpm I ( rengh

pseudo mycellium ) gay ra v6 méng da dude ing dung vaio sẵn xuẤt mcn

bánh mÌ và đã thu được kết quả tết [ 3, 5 ]

11.2 Tinh trang chin ethanol

= toni eink wav nhà ẩn số khổ nã S cà Saccharomyces thuộc loại sinh vật nhân chuẩn có kh năng chịu cồn

cao nhất Chúng cố thể mọc được trên môi trường chứa É - 14 % ( v lcần

Khả năng chịu cồn ở những nòi khác nhau là khác nhau và do nhiều pen

kiểm soát Tuy nhiên người ta đã thấy có nhiều gen ảnh hưởng đến sự phân bào khi có mặt của cồn trong môi trường Số lượng của những gen này ở

những nồi khác nhau không như nhau (ho nên việc lai các nồi đạn hội

khác nhau , lai nồi đơn hội với nồi lưỡng bài có thể tạo ra được nòi lại

lưỡng hội , đa bội có khả năng chịu cồn cao hen so vidi nồi cha mẹ Ngoài

ra, phương pháp gây đột hiến ( dùng tác nhân đội biển UV, đicthyRulnhal ) và dung hợp tế bào trần cũng đã được sử dụng để tạo ra các nồi có khả năng chịu

cồn cao hơn { 31, 38, 39, 57, G6, 81 112, 126 ] Với phương phấp chọn lọc

bằng cách thay đổi pH khi nuôi cấy liên tục, thay đổi điều kiện lÍ hoá của môi

trường người la cũng thu được nòi nắm men bền vũng hơn với côn [71]

Thêm vào đó, người ta còn ấp dụng một số phương phâp khác để nâng khả

năng chịu cồn của nấm men trong quá trình lên men, như: cho thêm snội gố phức chất chứa N vào môi trường , hoặc bổ sung cơ chất dần dần vào môi

Irường trong suốt quá trỉnh lên men , Panchal và Slewmi| LUO, 101 ] đã

chứng múnh rằng việc ứng ấp suất thẩm (hấu do nẵng độ cơ chất cao sẽ ngăn

cần việc tết cthanol từ tế bào ra môi trường, do đó làm cho tế bù bị độc và

giảm tốc độ lên men Một giải pháp khác đã được ứng dụng thành công để làm giảm tác dụng độc hại của cồn trong quá trính lên men lồ: ở giai đoạn ban

đầu, người la sử dụng nắm nen có kh năng chống chịu ấp suất thẩm thấu để

lên men đến 5 - 7% ( v/v) cồn, sau đó mới hổ sung nắm men chống chịu cần

để lên men tiếp tục | 72, 106, 101 | Một nhân tố khác là nhiệt độ cũng Ảnh

UW

hưởng đến tính chịu cồn của nắm men Người ta thấy rằng, nhiệt độ lên men

cao sẽ làm tăng tác dụng có hại của cồn đối với khả năng sống của KẾ hào

Đó là vĩ khi nhiệt độ lên men tăng lên thì sẽ làm tăng sự ch lãy cồn nội bào

Hơu nữa, nhiệt độ lên men tăng cao sẽ lun đừng sứ quá tình lên men

NghÌa là gây ra sự lên men không triệt để (còn nhiều cơ chất chưa lên men sốt

Tại trong môi trưỡng }, vĩ thế mà tạo ra nồng độ cần thấp hơn dự kiến [30, 70,

73]

Điều đáng chú ý là bản thân cồn cũng cớ tác dụng ức chế, thậm chỉ gây chết đối với tế bào nấm men Người ta cho rằng cồn tác động lên tế bào nấm

men thông qua việc phá hỏng ADN ti thể Người ta đã chuyển tỉ thể từ nồi

nắm men rượu vang chịu cồn sang nòi nấm men ở rong phòng thí nghiệm

không chịa cồn làm cho cáo nồi nhận có khà năng chống chịu với cần cao

hon [ 32, 70, 107, 127 ] Khi so sánh khả năng chống chịu cần của nồi nấm

men S cerevisae kiểu đại với thể đột biến hư hỏng cà 3 gen kiểm soát proteaza không bào ( đột hiến pep 4.3 ) Sugden và Oliver [ 118 ] đã thấy

răng : ở 25* C, cà hai nòi đều mọc như nhau trên mỗi trường có chúa 9 - 8%

{ v# ) cần Nhưng trong khoảng 30ˆ - 38” thì cùng một độ cần đã gây ức

chế mạnh hơn đối với sinh trưởng của thể đột hiến pep 4.3 Uó thể, đội hiến

pep 4.3 đã gây ta những thay đổi căn bắn trong ming cứa cñc thể đội hiến và fam cho chúng mẫn chm hon đối với cồn so với nồi kiểu dại Một biểu hiện

khắc của nh chịu cồn Ở nấu ren lại liên quan đến protein sốc nhiệt Người

ta da ching minh duge ting những nòi nấm: men có protein sốc nhiệt có l lệ sống sót đến 40% sau khi xử lÍ 36 giồ ỗ 24 #% ( v/v ) độ cần ; trong khi cũng

chính nồi này nhưng không có protein sốc nhiệt tì Ú lệ sống gói IÀ 0 %

Đồng thời, các nồi cổ prolein sốc nhiệt cũng có khẢ năng phục hồi sỉnh

trưởng nhanh hơn sau khi đã loại bổ cồn Từ đó người ta cho rằng việc tách

đồng các gen kiêm soát việc sinh ra protein sốc nhiệt và đưa nó vào nấm men

12

có thể là một trong những cách làm lăng khả năng chống chịu cần cho nấm

men [ 118, 131]

H.3 Tỉnh trạng chịu nhiệt

Nói chung, nam men có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 27 -

33° C.Tuy nhiên người i4 cũng đã phân lập được hằng loạt nòi nấm men có khả năng mọc ở 45° € và có khả năng lên men ở 42 *C [ 50, 80, 85 } Tính chịu nhiệt là khả năng của tế hào sinh trưởng được ở nhiệt độ cao ( 37 ° C hay

cau hơn } TẤt nhiên, nhân tế cơ bẵn xắc định giới hạn nhiệt độ cho su phat

triển của sinh vật chỉnh là cấu trúc di truyền của nó; nhưng cho đến nay,

người Ia vẫn chưa biết đầy đủ về bẵn chất đi truyền của tính chống chịu với

nhiệt độ cao, Ghaughran đã thống kẽ được hơn 25 giả thuyết đã được nêu ra

để giải thích về sự bền nhiệt hoặc khả năng sọc ở nhiệt độ cao Nhưng theo

thời gian, chÌ còn bốn giả thuyết được chú ý hơn cà [ 36, 37, 52 ]:

Ci) Tai nhiệt độ cao, các Hgi! chứa axit bếo no sẽ cố điểm néng chay cao hdn axit béo không no Cho nên, tế bào mang nhiều axit béo nơ sẽ có khả

năng bão toàn được nh nguyên vẹn của nó

(ii) Sinh tổng hợp nhanh những chất trao đổi thiết yếu để thay thế các chất trao đối kém bền nhiệt

( ði) Sinh vật chịu nhiệt có chứa các đại phân tử (enzymn, protein } bền nhiệt

(1? ) Sinh vật chịu nhiệt có chứa các cấu trúc và các cơ quan tử có khẢ năng

duy trì được các hoạt động chức năng ở nhiệt độ cao

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, Ở Š cørepidae việc tổng hợp

protein sốc nhiệt là cần thiết để nấm men chống lại tác dụng gây chết khi tẾ bào bị xử lý bởi nhiệt độ cao; đồng thời, protein sốc nhiệt cũng cần thiết cho

43

việc phục hồi tổng hợp protein thong thưỡng ở thời Ki phye hoi [91, 92, 112,

128),

đây, cũng đã có một số dẫn liệu đi truyền học cho thấy rằng khẢ năng sống của nấm men ở nhiệt độ cao ( 45 " C ) là phụ thuộc hệ gen tỉ thể | 70,85, R6 ]; đồng thời cũng đã có những dẫn liệu chững tô rằng ở nấm men,

tỉnh chỉn nhiệt ( 42” Ở ) là do gen nhân kiểm soát [ 8, 79 ]

1.4 Tink trạng chịu mặn

Cũng như cấc vì sinh vật khác, tế bào nắn men cũng cú hệ thống bảo

vệ để thích nghỉ với tác động của môi trường có muối Hằng nhiều nghiên

cứu khác nhau, người ta đã hiểu được rằng quá trình ch tụ cửa gÌycerol và

sự biến đổi của acetoin (hành 2,3-bulanediol_ trong tế bào nấm men chính là

do sự có mặt của muối đã ức chế việc sinh ra cồn trong suốt quá trình lên

men { 22, 78, L19 ] Một số tác giả khác thì thấy rằng để thích nghỉ với môi

trường có muỗi thì các tẾ bào nấm men đã tăng tổng hợp: các nhân tế bền

nhiệt Dong thời, khi sống trong môi trường muối thì các tế bào già hơn bị mắt các nhân lỗ bền nhiệt nhanh hơn so với các tế hào non, và việc hỗ sung,

glucoza s@ lầm tăng nhanh quá trình tổng hợp nhân tế bền nhiệt |75, 76,

111] Thêm nữa, người ta cũng đã biết được là khi sống trong điều kỉ

nồng độ muối cao, lễ bào nấm men đã tầng cường tổng hợp và lích lây

trehaloza để điều hoà áp suất thấm thấu bên trong tế bað; đồng thời tăng

cường tông hợp polysaocarit của vô lế bào để eho vỏ tế bào trở nên hền chắc

hơn [ 109, LI0 ]

(Gan đây, đã bắt đầu có các dẫn liệu di truyền học về mối liên quan giữa

cấu trác ADN và sự biểu hiện của tính trạng chống chịu mặn Masnfani và

được miững nồi nấm nen đơn hội có khà năng phát triển trên mỗi trường, có

chứa đến 10 % NaCH; và những nòi nẫn men lưỡng bội có khả năng mọc

trên môi trường có chứa đến I8 % NaÓI Bên cạnh đó họ cũng thấy rằng khả

năng chịu muối tăng lên luôn luận lun cho kích thuốc của tẾ hùo giẫm di

Phường phập dụng hợp tế bàn cũng đã được sử dụng để tạo ra nòi

nắm 1aen có khả nấng chịu mặn đến 5 2 NaCL { R7, 90 | Một số nghiên cửu

khác thì cho thấy rằng gen HIAL.-l kiểm soát tỉnh chịu mặn của nấn men HÁT! mã hoã cho mội phaein khoảng 32 KD liên quan trục liếp đến tính

chịu mặn Cien HAL~l đã được tách dồng vtễ giỗi trình tự, và gây đội hiển

im tìm hiệu quan hệ giữa cầu trúc của gen, câu trúc của protein đo nó mã

hoá và tỉnh chịu mặn của nấm men { 51 |

{I.5.Tính trạng đường hed tỉnh bội

Cho đến nay người la đã biết có khoảng 90 loài nấm men ít nhiền có

khả năng đường hoá tỉnh bột, Chúng thuộc I4 chỉ khá: nhau Nhưng chỉ có một số loài thuộc các giống Endomycopsis, Lipomyces, Pichia vd

Schwanniomyees Ta cô hoạt dnh cao bun ck Da có hai loài là

Suecharamyces diastaticns vi Hndonwyeopsis filnligena duige ngbién city ky

ảnh hưởng của nguồn cao họn về nguồn niớ lên việc tạo ra cozym

amylaza và thấy rằng sự tổng hợp enzym này bị ức chế khi nấm men sinh

trưởng trên môi trường cá chứa clhano]l hoặc sulphalaan và cao nẵn men

43,45, 53]

Kể tit khi © diastrtiens được phái hiện lần đần tiên vào năm 1952,

người ta đã dành nhiều cỐ gắng để xác dịnh số lượng gen thì gia vaio qua

trình phân giải tỉnh hội GiHiand đã phát hiện ra hai gen trội cần thiết cho

quá trình đó: S1 mi hed cho mattaza va $2 inf hoa cho amylaza Vé sau,

Lindegren ind Athém hai gen nữa: DX kiểm soái việc tổng hợp cnzym dexrinaza để thuỷ phần dexbin va glycogen, nhưng không thưỷ phân được

tinh hdl va amylopectin: con gen ST ma hoa cha amylaza để thuy phần tinh bột và amnylojsectin, nhưng không thuỷ phân đextrin hoặc glycogen Trang, lai gen nói trên (DX, ST ) thì chỉ một gen DX có khả năng kiểm soát việc thuỷ phân đường mafteza một cách chậm chap Người ta đã xác định được là hai gen DX và $T nằm trên các nhiễm sắc thể khắc nhau và phân ly độc lập

với nhau | 44, 1Ã1 }

Hon 20 năm sau, các nghiền cửu đi truyền về hệ enzym glucoamylaza

lại được tiễn hành trở lại một cách độc lập bởi hai nhóm khác nhận, Nhóu

thứ nhất, Tamaki [ I22 ] đã chúng ninh được sự tồn tại của 3 gen cần thiết để

Tn men tinh bot: STH, STA2 va STA3, Mai gen nằm rên một nhiễm sắc thể

khi: nhau Nhóm thứ lai [rat và Stewart [42] di dit tén cho các gen mã

hoá cho tlextrinaza là: THIXI DEX2 và DEXA Các nghiên cứu chủ thấy

rằng DEX3 alen vidi STA3, DRXI alen vái STA2 con DEX3 alen vai STAT

C ba gen STA đã được lách đồng và toần hộ SLUAIL đã được giủ trình tự nụcleotit §TA ( đài 2753 nucleotit và chỉ cố mội khung đọc mở lï nueleotit -

9 đến nuclcolit 2334 | 44, 122, 121 |

S diastaticus rất gần với S.cerevisiae vé mat di truyền học Vì các tế

hào đơn hội của chúng có thể lại được vải nhan, Sự khác biệt bản Bs

diastatiews có khả năng iẾt tạ giucomnylaza, còn 8 cerevisine thì không có

16

wave]

| v.Ld/aes 03 |

khả năng đó ĐŠTRVÌŠ cerevbsise có mang gen INHI có vai trò ức chế

việc tạo ra glucoarmylaza Như vậy có thể kí hiệu kiểu gen có khả năng tạo

đdiastaticws là STA inh Các nghiên cứu về phân tích lai Southern cho thấy

rằng hệ gen của hai loài này chứa các đoạn ADN có độ tương đồng rất cao

hé gen cia S cerevisiae [ 131, 132 |

Do khả năng tiết ra được glueoarnylaza- loại enzym mà

È_ mặt lý

thuyết có thể phân huỷ hoàn toàn tỉnh bột thành đường glucoza - cho nên

§ diastafieus đã được chú ý thích đáng Người ta đã chọn lọc được những, nòi tốt nhất về khả năng này, phối hợp chúng với nhau khi lên men, tối ưu hoá điều kiện lên men và cũng đã tạo ra các nòi lai có mang các gen SA khác nhau dùng để lên men còn từ tỉnh bột Tuy nhiên người ta cũng thấy ning, S diastaticus kém chiu cén, lên men chậm và trên thực tế ngay ở trong điều kiện lên men tối ưu cũng vẫn để sót lại hơn 20 % tỉnh bột không lên men được Nhưng nếu tỉnh bột đã được xử lý bằng ơ-amylaza thưởng phẩm trước khi dùng để lên men thì S điøsfafiews có thể biến đổi 97% tỉnh bột thành cồn Chính vì thế mà các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới

đã tiến hành ghép gen ơ-amylaz4v từ các sinh vật khác nhau vào với gen TA

roi dita vio S cerevisiae Năm 1988, người ta đã thu được các thể biến nạp

và œ-amylaza của chuột Một trong các thể biến nạp đó đã có khÄ năng chuyển hoá gần hết (93% ) 86 tỉnh bột có trong môi trường thành đường chỉ

trong khoảng hai ngày [45, 74, 124 ]

204-Người ta biết rằng thành phần chỗ yếu của vô tế hào nội nhũ của hại

lúa mạch - nguyên liệu chỗ yếu để làm bia - chứa đến 75 % ( 1-3,1-4 >P-

giuean Trong quá trình nấy mắm cũng như trong quá tình malt, enzym

B giucanaza của hạt sẽ phân hủy ƒ` giucan củu vũ tế bào nội nhũ để sau

đó , cấc enzym phân hủy tính bột, và enzym phân hủy prolein có thể thủy

phan tỉnh bột và các protein dự trữ của nội nhũ Nhưng, [— giueanaza của

bạt hầu như hị bất hoạt trong quá trình và nghiền mak, Cho nên để lại một lượng tổn f~ glucan có trọng lượng phân tử cao trong địch bia ; gây ra nhiều

khó khăn trong việc lọc dịch hia trước khí lên men va loc hia sau khí đã lên

men ĐỂ khắc phục khó khăn đó, trước đây người ta bổ sung chế phẩm enzyi (1-3,1-4 }-[l-giucanaza bền nhiệt tách ra từ các vì sinh vật khắc í ví dụ :

Buciltus subtilis, Aspergities niger, Trichaderma raesei ) vào trang quá hình nghiền mai hay bổ sung vào giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men Nhưng gần đây, để đạt mục đích đó, người là đã tạo ra các phân t ADN

tải tổ ligp từ các gen (1-3,1-4)-B-glucanara ofa Bucillus anyioligndfaclens và

Bacillus macerans réi đưa vào nắm nen S.cerevisiae Cac thé bién nạp của

nấm men đã tiết ra(1-3,†-4)-l-glucanaza bền nhiệt: Sau khi ủ 6Ù phút ở

70 C, pli 6 thienzym lữ các vi khuẩn cha inechicin ithen 5 % hoat tinh

trong khi đó enzym lai tiết ra từ nấm men vẫn giữ được 90 % hoạt tính

[96, 97, 98 ]

Một khía cạnh khác cũng cần phải giải quyết tà nghiên cứu Ảnh hưởng của các gen khác đến rự biểu hiện của gen glucoaaylưa Cho đến nay, chỉ mới thu được một số thông tín về vẫn đề đó như sau [45}

- Gen CDX 1: Khi 6 trạng thải đơn bội gen này dc chế việc tiết enzym

glupoainylaza từ trong lế bào ra môi trường nếu việu ức chế trao đổi các bạn

chưa được loại từ Nếu gen CDX I1 bị hư hổng thi enzym glucoamylaza sé

được tổng hợp một cách liên tục và được IIẾt ra môi trường

18

Š nồi chứ

- tiên ĐIA 16: Người ta biét rằng fen nay chỉ cĩ mặt trong 1nd

khơng phải cĩ mặt ở trong IẤI cÄ các nồi nẫm men S cerevisiae Nĩ ức chế sự

n của cả ba gen STA 1, STA 2, STA 3 Người ta đã chứng minh

được rằng khi cĩ mặt STA 1Ú, thì enzym glucoamykza khơng được tích lãy

hiểu h

đ hên trong tế bàn Như vậy gen này khơng liên quan đến việc vận chuyễn

glueoaruylaza từ trong tế bào ra bến ngồi mà liễn quan đến mộ vài giai đoạn

trước khi tiết enzym

- Gen MAT: Người 1a đã biết được rằng, hoại tính glasoamylea và khh năng lên men tỉnh bột của các nõi nấm men đồng hợp tử về gen STAI hoặc STA 3

nhưng dị hợp tử về locut MAT bị giảm đi rất nhiều Tuy nhiền, khả năng tạo ra cnzym glucoarnylaza của những nồi nấm nen đồng hợi: tử về cà bạ gen STA va MAT thì lại ngang bằng với nồi đị hợp tử Điều đĩ chứng tỏ tính dị hợp tử về gen MAT đã úc chế việc lạo ra enzym glucoamylaza

- tien INH 1: Người tacũng, biết rằng gen INH † tíc chế sự biển hiện của

các gen STA 1, STA 3 ở nấm men Ä cerzeisiae Kiểu tác động của TNIT I cĩ

về giống với kiểu tác động của SFA 10, nhưng tối quan hệ giữa bai gen này

vẫn eltra đưiặc xác định

Những thơng tỉn đĩ được têm tắt ở bằng sau đây | 45 ]:

Ring 3 Cđc gen cố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của glucoannylaz

CDXI Khicĩ mặtcủa CDXI, ghicoamylara chỉ được tiết ra khi sự ức chế

tran đổi cac hon hị loại trừ,

STAIQ Khícĩ mãi 5TAI0, gluceamylaza khơng biểu hiện được

chưa biết cơ chế táo động của nĩ,

MAT Trạng thấ dị hợp tử của MAT ức chế việc tan ra glncoamyhữa

chưa biết về ed chế tác động của nĩ

biết về cơ chế tác động của nĩ

19

11.6, Tinh trang chuyển haá cúc loại đư*ng,

n) Snccarozn

Phẫn ứng đầu tiên trong quả trình sử dụng tường sacearoza ð nấm

¡nen là việc dùng enzym ínvertaza để phân cất nó thành đường đơn

Enaym invertaza được mã hoá bải các gen trong hệ gen SUC Người ta đã biết là có õ gen không liên kết thuộc hệ này; gen SUC 2 đã được giải tình tự

Té bào nấm mến chỉ cần một bong sáu gen là đã có kha ning len men đường sucroza Số gen SUC ở các nồi nắm men công nghiệp thì chưa được

&c nhan vậ gỗ hẳn

biết rõ Những các nồi khác nhau thì chia sé gen SUC kl

sao của mỗi gen có ở mỗi ni cũng khác nhau Người ta đã xúc định được vị trí bẵn dé của 4 gen và biết rằng gen SUCG nlen với SUC 4 Đồng thời,

tring hầu hết các nài nắm men đều không mang để cã 6

người Ia cũng đã

gen SUC Các nghiên cứu dùng gen SƯC2 làm vật dò cho thay ring gen nay

tưởng đồng với các altn SUC hoạt động chúc năng khác Như vậy, có

nghĩa là sự hiện điện của các alen SUO ở các vị tí khác nhau trong hệ gen

của nấm men là do sự dời chỗ của gen này trong quá trình tiến huá của các

nỗi và các loài khác nhau { 34, 35 54 101 125 ]

b) Galacloza

(ialactoza cũng là một loại cơ chất của nấm men S cerevisiae hưng

việc sử dụng nó lại hị cơ chế sử dụng giueoza ức chế Nguời la đã hiết là có

T gen liên quan đến quá trình lên men galatoza Đó là GAI, 1, 2,1,4, 7 10 và

GAL 80, Cac gen GAL 3,4, 8Ú là các gen điều hoà [ 40, 41 ]

¢) Maltoza

29

Cho đến nay người ta đã hiết có 5 gen liên quan đến việc sử dụng

maltoza: MAI.1, 2, 3, 4 và MAI.6 [ 47, 125 ] Cong như đối vải các gen SUC, không có nồi nấm men nào lạt mang đủ cả năm alen trong tẾ bào của

mình Mỗi tẾ bào chỉ cần có một trong 5 gen nói trên là đã có khả năng lên men maltoza, Trong qua trình lên men dịch bia người ta thấy rằng những

nồi có Iuang nhiều bản sao của MAL2 hơn thì có tốc độ lên men nhanh

hơn Ngiữa là nó cố hiệu quả tiền lượng Dịch dùng để lên ¡men bia chứa

nhiều loại đường: sacearoza, ulucoza, Ẩruetoza, vuaHozA, taltolrioz và

đexurin, Cáo nồi nắn men hỉa điển hình thì có kh năng lên men lần lượi các

loại đường đó, nhưng không lên mien được dextrin J2o đó, những nòi nấm men lường bội dị hợp lứ về cấc gen dextrinaza đã được tao ra hằng cách lai [liệu quả liều lượng của gen đã biểu hiện Ở nồi nấm men mang een DEX

hoặc DEX2, những không biểu hiện ở nồi mang gen ‹lextrinaza B Ƒ 40,

116, 123]

1H CÁC PHƯƠNG PHAP TẠO NÒI NẤM MDN MỚI

THI Lai

HE.1.1, Nguyên lý chung

Cũng như đối với bất kỳ sinh vật nào khác, việc lai nẤm nen được

thực hiện với nhiền mục đích khác nhan, Người ta tạo ra nòi lại để sử dụng

vào sẵn xuất trong trường hợp chúng kết hợp được những tỉnh wang quí của cả hai nòi cha mẹ, hoặc khi nòi lai có biểu hiện ưu thể lai Trong nghiên

cửu, người ladùng đến lai khi cần xác định đặc điểm di truyền của một

tính trạng nào đồ { được qui định bởi gen nhân hay gen tế bào chất, phụ

21

thuộc vào một hay nhiêu gen ) Người 1a nhân tích sự phân ly trong thể hệ

con theo những tính trạng đi truyền rõ ràng ( cá: đấu chuẩn dĩ truyền } để

ấu trúc của hộ mấy di truyền của tế hàn, lai và phân

dựa then đĩ mà giải

tích lai chính là cơng cụ căn hẳn của nhà đi tuyển hục Mặc dù dĩ truyền học hiện đại của nấm men đã ra đối từ cuối những năm 70 nhưng nĩ khơng loại trừ di truyền học kinh điển của đối tượng này mà cả hai loại phương pháp được sử đụng phối hợp với nhan [ 4, 117, 141 ],

Việc kết hợp cáo tính chất của hai dạng cha mẹ vào một lẾ bào lủ cĩ thể

đạt được bằng hai cách Thứ nhất, tạo ra thể Imi lưỡng bội, đa bội Thể lai này

ngay từ đầu đá biểu hiện tắt cả các tính tạng trội của cà hủ dụng chà trợ

Nấm men sinh trưởng Iheo lỗi nẫy chi là chủ yếu, nên cĩ thể duy trì lâu đài

trạng thấi núi tiền và gử dụng chúng vào sẵn xuất Thứ hạ, việc kết hợp các

tinh Wang của hai đạng cha mẹ cĩ thể đạt được nhờ quả hình ấi tổ hạn xây

ra trong giảm phân Hiện tượng tái tổ hợp xây ra với lần số cao khi các gen kiểm sot các tính trạng đĩ nằm trên các nhiễm sắc thế khác nhau | 4 115

116, 141]

1H1.1.2.Các phương phap lai

+ Lai bằng mấy vi thà tấc: Dây là cách tạo ra thể lai trực tếp nhất

(nhưng khơng phâi là dễ dàng nhất Dĩ là đùng máy vi thao tác để đặt hai

tế bào thuộc hai đạng khác nhan cạnh nhau và theo đối pho đến khi chúng kết Hiền lại với nhau Phương pháp ghép đơi trực tiếp này dude Lindegren str

dụng thành cũng lần đầu tiên vào năm 1935 [ 48 |, Sau đĩ, nĩ Khơng ngừng

được cải tiến và sử dụng ở nhiều phịng thí nghiệm bén thể giới Cha đến

nay, nĩ vẫn cịn được sử dụng cĩ hiệu quả dễ bử các nội nấm men Š

cerevisine § lagos, S_ nwarwm, 5 rasei và % rowxử | 125 141 ].

+ Lai bằng cách sử đựng cốc đấu chuẩn di truyền Đây là phương pháp

được sử dụng thường xuyên nhất Vì, nếu như phương phập lai bằng máy

vi thao tác thường chỉ áp đụng để lai các nài nắm men đông tần thì phương pháp này có thể dùng để Tai cả các nồi nấm men dị lẫn và những đối tượng nàà lễ bào cña chúng rất ít khi kết hợp với nhau, Hằng phương pháp đãnh dấu

di truyền, người ta đã tạo dược thể lai ở một số loài nấm mà trước đó chưa phát hiện được gìai đoạn hữu tỉnh [ 4 ]

Nội dụng của phương pháp đánh dấu di truyền như sau: mỗi dạng cha

znẹ được đánh dấu bằng một đột biến nào đó Thí dụ, ở 5 eerevitiae, dạng

kién dai tạo nên khuẩn lạc oó mầu tẳng nhẫn Vậy thì, một đụng cha mẹ

được đánh dấu bằng đột biến tạo ra khuẩn lạc màu đỗ; cồn dạng cha ruẹ thứ hai được đánh dẫu bằng đột biến lạo ra khuẩn lạc xù xì Sau khi trộn lẫn

chúng với nhau và nuôi cây trên môi trường thạch dĩa, các khuẩn lực có tiều

trắng „ nhẫn mọc lên chính là thể lai, Trong trường hợp tần số xuất biện thể

lai thấp ( ví đụ L/100 000 ) thì cần đánh đấu cha mẹ bằng các đột hiến

khuyết dưỡng { đấu chuẩn hoá sinh ) để cho thể lại cô thể tự động tách ra

khỏi khối các tế bào đem lai ở trên môi Irường chọn lọc đặc biệt Nhờ vậy,

có Hhề thu được nồi lai ngay cả khi tần số xuất hiện của nó rất thấp | 4 |

Từ cuối những năm 1970, một số phương pháp mới đã được sử dụng,

để tạo ra cáo nồi nấm men mới Đó là kỹ thuật dụng hợp tẾ bào trần , kỹ thuật biến nạp và AI3N tái tỔ hop Các kỹ thuật này lạo ra khả năng to lớn và

nhiều hứa hẹn đo không bị ảnh hưởng hổi mức bội thể, khả năng sinh hào tử

và giới nh của lễ bào [115, 116, 117 |

[II.2.Dũng hợp tẾ bảo trăn

Bước đầu tiên trong kỹ thuật dụng hợp lễ bào trằn là việc bóc di toàn

bộ hay gần hoàn toàn vỏ tế hào nấm ¡nen bằng các euzvin phân giải ( được

23

chiết ra từ tuyến tiêu hoá của ốc sên hay từ một số vi sinh vat) TE bho trin được gi gìn trong môi trường có ấp suất thẫm thấu cao, thường là 0,8 - 1,2M

sorbitol Sau khi rửa sạch enzym phân giải, tế bao win của hai nồi khác

nhan được trộn lần với nhàn cũng với tác nhân dung hợp gồm

polyethylene glycol (PEG } và lon cansi Hoạt động của PDG chưa được biết rõ "Tuy nhiên, người ta đã biết là nó có tác đụng như một polycatlon lạo

nên quần tự nhỏ của các nhóm tế bào trần Trong qưá trình này có thể xây ra

sự trao đổi lẫn nhau của vật liệu tỉ tuyền do vỗ lẾ bào đã bị hóc đi Sau khi

dung bgp, san nhằm dung hop được đua vào môi trường đặc có chứa gorbitol

dễ tái tạo lại vỏ tế bào Tuy nhiên vì hệ gen của sẵn phẩm dung hợp là tổ

hợp của cả hai hệ gen cha mẹ nên nó thường rấtkbác với cA hai dang cha

me ban đầu, Bởi thế nên tương đối khỏ khăn nến muốn đưa một đặc lính

đạn lẻ từ thể cho vào thể nhận Nghiã là, kỹ thuật này không đô đặc hiệu để

én di truyền các nồi nấm men theo kiểu mà nhà chọn giống mong

muốn [ 112, 117, 126 |

TIL-3 Biến nạp và ADN tái tổ hợp

Đây là kỹ thuật cho phép khắc phục được tính không đặc biệu của các

kỹ thuật dung hợp tế bào trần và lai Và đây cũng chính là cách điều khiển gự

biển đổi kiểu gen cổa một nòi nấm men thể nhận bằng ảnh hưởng cổa mot

phân tử ADN riêng biệt tách ra từ thể cho, Phân tử ADN có thể được tách ra

từ các Ế hào của một nòi nấm men khác các loài khác các giống khác, của

ADN dược tổng hợp theo con đường hoá học; hoặc là các phân tử ADN lại

Các bước căn bản của quá trình biến nạp là: (Í) Tách chiết ADN từ các

nguồn khác nhau; (2) Nối các đoạn ADN thành một phân tử ADN có kha

24

năng hoại động chức năng; (3) Đưa phân tử ADN lai vàa bao Ihễ nhận { 129)

n hành hiến nạp, trước hết tẾ bào thể nhận phải

Ở nấm men, khi

được xử lý để trở thành tế bào trần Sau đó, ủ chúng với ADN tai tổ hợp

cùng với PBG và ion canxi Tiếp theo là việc rửa sạch tế bào thể nhận và

đưa vào môi trường thạch thích hợp để tái tạo lại vô tế bào và chọn lọc các

thể biến nạp mong muấn [ [L7 ]

Tuy nhiên, có một Rố vấn đề cần phải quan tâm khi muến ứng đụng

Kỹ thuật biến nạp và ADN tại t hợp để cải lao di truyền đối với các nồi nấm

men Thứ nhất, cần phải có các dấu chuẩn để có thể chọn lọc được các thể

biển nạp, Các gen tội - như céc gen STA 4 ndm men S diastaticus - c6 thé

được sử dụng trong việc chọn lọc thể biến nap cé kha nang dudng hod tinh bột Chỉnh vì vậy mà gen SIAI đã được tách dòng và biến nạp vo nấm

men $, cerevisiae [131] Thứ hai , cần phải quan tâm đến Ính Ổn định của

gen indi dua vào trong tẾ bào của thể biến nạp Các nhà nghiên cúu đã thấy

ring „ những plasmit khéng cé kha năng xen vào nhiễm sắo thể vật chủ thì rất

khó Ổn định Có 4 loại vector thường được sử dụng trong hiển nạp nắm men

(1) Ylp - plasmit xen : loại plasmil này không tự sao chếp trong 18 bào nấm

men mà lại xen vào nhiễm sắc thể của nó Vì thế, nó khá ổn định

(1 YRp - plasmit saơ clip : loại plasmit này eó mang đoạn khôi đầu sao chép

của nhiềm sắc thể cha nên ấn định được trong Kế bào Tà nhờ khả năng tự sao

chép

3) YEp - pÏasmit loại epizom : loại plasmil này có ¡nang đoạn kliổi đầu sao

chép của plasmmit 2 um của nấm men, cho nên cũng có khả năng dn định

như loại plasmit YRp.

(41 YCp - plamit có lâm động : loại plasmil này có mang đoạn tâm động và

cả đoạn khởi đầu sao chép Nhớ có tâm động mà plasmit này thường có một hoặc hai bẫn sao trong một tế bầo và phân ly giếng như một nhiễm sắc thể

phụ Một biến thê của YCp là niềm sắc thà nhân tạo của nắm men ( YÁC'}

: nổ cố mang cả đoạn tâm động lẫn hai gen kết thúc ( /elomer ở hai đầu đề

có thể sao chép như một nhiễm sắc thể ở dạng thẳng nhỏ [ 125, 129 J

Thứ ha, cần phải đặt gen đang nghiên cứa đưới sự điều khiển cửa đoạn khổi

động thích hợp cửa nấm men , đó là đoạn khởi động của gen alcohol

delydogeuaza I của nó Chẳng hạn, người ta biết rằng euzym œ- amyluza Ở

trong tuyển nước bọt cửa chuột có khả năng thủy phân tất tốt các liên kết

a 14 glucosil ở troltg các polysaocarit, vi dụ như tỉnh bội Cho nên gen mã

hoá cho œ- amylaza ở trong tuyến nước họi của chuột đã được lách đồng và

nối vào plaeauit pMS12 , ở phủa cuối của đoạn khởi động của gen aleohol dehydrogenaza | cửa nắm men { ở vị trí - 14 cha gen ADC 1) Phan tử

ADN li tổ hợp mối được tạo ra được đùng để biến nạp vào nòi nấm men có mang gen STA Vi thé, các thể biến nạp thu được trong trường hợi; này đã cố

thể tiết ra c& enzym glucoamylaza cha nấm xuen lẫn cnzy1n ơ- znylaza của

chuột Một trong các thể biến nạp đó đã có thể biến đối ?2,8 % tính hột có

tong mdi tường thành đường khử chỉ trong 2 ngày | 74, 95, 124 Ị Cũng

bằng cách tương lự màeã iaterferon bạch cầu của người lẫn kháng nguyên

bề mặt của virus viêm gan B đã được tổng hợp a trang 16 bho nấm men { 24,

64 |

Cố thể nói, ngày nay kỹ thuật biến nạp và ADN tất tổ hợp đang

được sử dụng một cách thường xuyên hàng ngày ở cấc phòng thí nghiệm:

sinh học trên thế giới và nó đã gdp phần đáng kể cả cho các nghiên cứu lý

thuyết lẫn cho việc tạo ra các nöi nắm men hữu ích cho boat động sản xuất

của con người { 67, 116, 117 ]

26

IV MOT SO THANH TUU VBTA0 GIGNG NAM MEN

Một mặt, chúng ta biết rằng nguyên liệu chủ yếu của ngành sân xuất nấm men công nghiệp là rí đường củ cải và rỉ đường mía Nguồn hydrad

cao hón chủ yếu trong các nguyễn liệu đó là saecaroza, mặc dù rÌ đường củ

cài có thể chứa đến 1,3 % raffinoza Ching ta cũng hiết rằng nhiều loại

đường khắc nhau như : sacearoza, gnocoza, fructoza, maltoza, maltouioza co

mặt trong dịch lên men bia Mặt khắc, trong tự nhiên, không có nòi nấm men nào lại mang đầy đủ tất cà các gen SUC! va các gen MAI tong hệ gen của mình; thậm chỉ có nồi nấm mien lại không lên men được mội vài loại đường ( ví dụ nòi nắm men 5% cerevisiae ding trong san xuất cồn không có enzym

mebbiaza để thuỷ phân ralfinoza, mặc đù nó rất thích nghỉ với việc sinh

trưởng Irong rỉ đường và lên men tốt các loại đường khắc có trong rỉ đường, cồn nồi nấm men & carisbergzmsis thì có khả năng thủy phần dường

tafTinoza ; hay nồi nấm men 220 sử dụng trung công trình này thỉ không có

nhau có

khả năng lên men maltoza ) Ngược lại, những nòi nấu men kh

thể có những nh trạng qui khác nhau VÌ thế, các nhà nghiên cứu đã tim

cách để phối hợp các phẩm chất có giá uị ô các nồi nấm men khác nhau vào aột nồi Chẳng hạn, người la đã la S cerevisiae va S carhbergensis va thu được nòi lai có được những phẩm chất quí của cả bai nồi cha mẹ, Nó sinh

trưởng tốt Ổ vỉ đường và tạo ra 7.43 % độ cồn, trong khi nồi Á cerevisiae

ban đầu chỉ tạo ra (85 % côn Khi lai S globosus vii S.carishergensis

thứ nhất lên men được cả saccaroza và malloza ; loài thử hai không lên men

cả hai loại đường đó, Trong số các thể tái lỗ hợp, người ta đã thủ được nòi

nấm tien có khả nẵng lên men được malteza nhưng không lên men được

27

saocaroza Chính đường saccarozacön lại đó đã lưu cho bia có độ ngọt [ 4,

135, HH ] Bing dung hop & bào trần giữa nài &: mướn về 9

diastaticus , ngudi ta da thu duge các nồi Tai có khả năng lên men dextrin và

lạo ra độ cồn cao hơn, có nức chống chịu tối hơn với những ảnh hưởng Ain lính của ấp suất thầm thấu [ 126 | Cũng với kỹ thuật đó, cúc tác giả khúo đã

thu được nòi lai giữa S cereeiside và S.mellis có khả năng lèn tien được dung

dịch có nồng độ giucoza cao { 49 % w/v ) và có khả năng chống chịu với ấp quất thẩm thiu cas [81.82] Con khi lai ndi ndminen S cerevisiae TH ( là nai niin men két cum tét, nhung kém chiu can ) vii noi & cerevisiae NI { là nồi kết cụm kẽm, nhung chịu cồn 161} người ta đã Ihú được nòi lú vừa kết cụm tết vừa có thể tạo ra đến 12,4 % ( v/v } cần [ I12] Các nòi nấm men bia đồng trong công nghiệp thường là đa bội, thậm chí lệch bội Vị thế

nà chúng thường sinh hào tử kém, cặc nang được lạo ra tiường chỉ có { hoặc

2 bào tử, và khả năng nống của các bào tử rất thắp Khi các sản phẩm dung

hợn được tạo ra từ các nồi nẵn mien bĩa nhớ thể thì lại thường có khả năng

sinh bào tử tốt và tỉ lệ các nang chứa bến bào tử khá cao Đặc điểm này tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân lích di truyền các nồi nấm unen bia [ 116 |

Bằng kỹ thuật hiến nạp và ADN tái 16 hợp, người la đã lạo ra được

những nồi nấm men tiết ra cả glucoamylơa của nấm men và cả œ-amylaza của chuột dàng để lên mien tỉnh bột với hiệu qué cao | 74 J Hay, người tà

biết rằng enzym ƒ glucanaza của hạt luá mạch hằu như bị bất hoạt trong quả tình ủ và nghiền MalL Cho nên, một lượng lớn B glucan co trong

lượng phân iử ca sút lại trong dịch bỉa ( không được thủy phân thành đường,

); VÌ thế ma gây ra nhiều khó khăn trong việc lọc dịch bìa trước klú lên men

và lọc bia sau khi đã lên men Trước đây người ta phải sử dụng chế phẩm

enzym (1-3,l-‡ )-f—glucanaza bền nhiệt tách ra từ các vi sinh vật khác ( ví

dụ : Hacillus sublilis, Asppergllins niụớ:, Tríchodernm reesei } vàn tong quấ

2

tinh nghién 1ualL hay bd sung vde giai dono

ối cùng của quá trinh lên men

dễ khắc phục khó khăn nói trên và để the được sẵn phẩm cố độ trong suốt

cao hơn Nhưng gan đây, người Ia đĩ tạo ra được nòi nắm tnen có khả năng Hết ra enzym {1-3,I-4 }[ pfuoansza bền nhiệt ĐỂ đạt mục đích đố, người

la đã tạo ra cấc phân tử ADN: tái tỔ hợp từ các gen {Í1-31-4)-J-glucamza

cia Bacillus amnyloliquefaciens va Bacillus macerans 183i đưa vào nẴn men

3.cerevisiae Phân từ ATTN tú tổ lrợp được tan ra theo so đồ san đây:

Sân phẩm của gen A

Ngiĩa là người ta dùng phần ứng dây chuyền polymeraza để nhân gen A -

đó chính là gen (1-3, 1-4) - -glueanaza của Ð ainyloliHsfucisus - bằng

cặp mồi thứ nhất ( mỗi số 1 và mãi số 2 ) và để nhân gen R1 - đó là gen ( 1-3, 1-4} - f-glucansza của Ù macerans - bằng cặp mỗi thứ hai { mồi số 3 và mài

số 4) Sau khi thu được sản phẩm của cả gen A lẫn gen lB người ta trộn lẫn

chúng với nhau, làưu biến tinh chúng và lại chạy phản ứng dây chuyền

polyrucraza với các môi gố ! và mỗi số 4 Nhờ vậy, người ta đã thu được phân

tử ADN tái tổ hợp Chúng được đàng để biến nap vio adm men Cac thể

biến nạn thu được đã tiết ra(1-3.1-4)-[L-glucanaza bến nhiệt: Sau khỉ ủ 60

phút ở 70" C, pH 6 enzym từ các vi khuẩn cha mẹ chỉ cồn íLhøn 5 % hoạt

tinh trong khi đó enzym lai tiết ratừ nÂm ren vẫn git được 90 2: hoạt

inh [ 28, 29, 97, 98]

Trong nhimg năm tới số lượng và chủng foai cae sin phẩm từ nấm men

sẽ cần lăng lên nhanh chống do việc sử dụng kỹ thuậi di truyền dễ đưa các gen xác định từ động vật, thực vật vào nắm men và dùng nấm men như

những " nhà máy hon " nhưng năng suất rất cao, để sẵn xuất các hoạt chẤU

mà trước đây chỉ lách chiết được với số lượng ÍLỏi và rất khú khăn từ cáo bộ

phận của động vật, thực vật như các cnzyint, honnon Tóm lại, đúng như tác giả Lê Dĩnh Lương đã viết: Am men chính là đối tượng quan trọng bậc nhật của công aghé sink hoc hin dai | 16]

30

| 1 | TH,-30_ [rung tam Vi sinh vật ứng dụng, ĐETH Hàn

s| TP Viện Công nghiệp thực phẩm Hà nội |

6 — | Nhà máy mì Chùa bộc, Hà nội ˆ "

7 [ba indy mi Tong Mai, angi Ì

9| TN2 nt

"1 : VIL w p Vang Thang Jong, Ha ni

lu2 | _ 239 Si Dai học ông hợp Leningrad, Liên xô

PỊ 236 nt "

H4 Ì MP Men thương phẩm của Pháp 2

is | MA Men thusn 3 pham cia Anh 7 "

16 | HL | MenthươgphẩmeiaHkln —

17 |AM 12- RD67 Ba hoe Tang hợp Kasetnart, Thu mm -

27 | V3 Banh men Hung Dang

2K TH Banh mến “Thanh Hoa ma

Cơm rượu CữAbồ Co ộ

Quả Táo ta

Vi thao tic , MM-1( Nga )

1⁄4, Các lại mãi trường nuôi cấy ( g/1)

Mũi trường đủ cố pepton

Là môi trường đủ được bổ sung thém 102 Pepton

33

Mãi trường lên men,

Là môi trường đủ được bề sung 10% (w/v ) đường,

Mãi trường tất thiểu