Luận văn nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người Đầu những năm 2000 tại miền bắc việt nam

Các biến dỗi trong vật liệu di truyền dột biến hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen của virút cúm A khác nhau khi cừng đẳng nhiễm trên một tế bảo trao đổi va lich hop - reassorlment da dan

NGUYEN LE KHANH HANG

NGHIEN CUU CAN NGUYEN CUA CAC VU DICH

CUM NGUOI DAU NHUNG NAM 2000

TAI MIEN BAC VIET NAM

LUAN AN TIEN Si SINH HOC

DAT VAN DE

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1.2 Hình thải và câu trúc virtil cir

1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng _

1.1.4 Cơ chế nhân lền của viiL

1.1.5 Tinh da dang vé vat lidu di truyền và sự tiên hóa của vừd cm Ä

1.1.6 Sự tiễn hóa của vưdúf cm B

1.3 Tình hình dịch cúm tại

NAD SẰẮĂẶĂAĂAMA

1.3.1 Dịch cúm mùa

1.3.2 Dich citm A/HSNI

14 Đặc điểm lâm sàng và sinh bệnh học

1.4.1 Thời gian ủ bệnh

12

14

14

1⁄5 - Dịch tế học bệnh cúm

1.5.1 Phương thức và thời gian lấy truyền

1.5.2 Xguôn bệnh và ö chứa

1.5.3 Tĩnh cảm nhiễm và đáp ứng miễn dịch

1.6 Biện pháp dư phòng và kiểm soát bệnh cúm - 55

1.6.1, Thuốc khang virit

16.2 Vide xin obit

1.7, Chan đoán trong phỏng thi nghiệm s55 55s vớ

1.7.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyen ovo sos se se vives vs vs tn vs vives

1.7.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền

1.7.3 Phương pháp phát hiện kháng thể

CHƯƠNG 2 ĐÔI TƯỜNG VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.3 Phương phản,

E8 n ằốẶằắé

2.3.2 Dinh typ virdt bang phân ứng ngần ngưng két hong céu (HI)

2.3.3 Pharong phéip (RT-PCR) oo ose cece ces cee tc tin ces vee at tin tes eee van ees ene

3.3.4 Phương pháp Real-time RT-ĐCH

2.3.5 Phương pháp xác định trình tự gen

2.3.6 Phương pháp xử Í# số liệu

CHƯƠNG 3 KÉT QUÁ VÀ BẢN LUẬN

và Miễn Bắc Việt Nam, 2001-

tự lun hành của vừi củm mùa tại Hà Nội, 2001-2005

3.1.2 Dịch cảm mùa tại Miễn BẮc, Việt Nam 2006— 2008

3.1.3 Dịch cứn lây truyền từ gia cầm sang người do virút cảm A/HSNI tại

miễn Bắc Liệt Nam, 6/2008 5/2009

3.2 Căn nguyên các vụ dịch cúm mùa, 2001 — 2008

3.2.1 Căn nguyên các vụ dịch củm tại ITà Nội, 2001-2065

3.2.2 Căn nguyên các vụ dịch cơm mùa tại miễn Bắc, 2006-2008

3.2.3 Dặc điệm di truyền học của virút cửm mùa, 2001-2007

3.2.4 Dặc tính kháng nguyên của virú[ củn theo mùa, 2001-2008

3.3 Căn nguyên gây viêm phổi nặng do virút A/HSN1 tại Miễn Bắc Việt

3.3.1 Một số đặc điẪm ChMN cà cà nà cọ HH HH HH tu Hư He ới

3.3.2 Phan lap virtit cứn /LIISN1 bằng phương pháp gây nhiễm trên lế bảo

KIEN NGII "¬ 118

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIA DA CONG BO CO

LIÊN QUAN ĐÉN LUẬN ÁN

TAL LIỆU THAM KHẢO

PUL LUC

Oytopathogenic cfẨoet (Tác đụng gây hủy hoại cho lê bào)

Enzyme linked immusorbent assay (1#ứ nghiệm hấp phụ miễn

dich gin enzyme)

Hemagglutination Inhibition Test (Phin img ite ché ngung két hồng câu)

Immunofluorescent Assay (Thứ nghiệm miễn dịch luỳnh quang)

Tn[luenza Like Tllness (Hội chứng Cơn) Kháng nguyên (4øfigenj

Tổ chức Y tế thế giới (World Ilealth Organization)

3.4

3.5

3.6

3.8

Các phân đoạn ARN của virit cũm và chức năng,

Nguồn góc virút củm gây ra các vu dai dich thé ky XX

Cac dot dich cum A/LISN] trên người tại Việt Nam san

Số bệnh nhân hội chứng cứm tại Miễn Bắc Việt Nam, 2001-

2008

nh nhân viêm phổi nặng nghỉ nhiễm virút cám A/TISNL tại

Miền Bắc Việt Nam, 6/2003-5/2009

Hệ thống mỏi sử dụng để phat hiện vật liệu di truyền virut cam bằng phương phap RT-PCR

Hệ thống mỗi và probe sử phát hiện viưút cứm A/HSNT bằng

phuong phap Realtime RI-PCR " eeeesieeetee Kết quả phân lập virút cúm theo mủa tại Hà Nội, 2001-2005

kg xác định sự lưu hành của vivút cúm theo mia tại Miễn

Kết quả xác dịnh sự lưu hành của các phân týp viút tại Miễn Bắc

Việt Nam 2006 — 2008 bằng phương pháp RT-PCR Căn nguyên các vụ dịch cúm theo mùa tại Miễn Bắc Việt Nam,

2006 2008 ¬¬—- visuie testis sersanens eet reeter ie

Số chủng virit cúm giải trình tự nueleotide gen ITA va NA tai

Miền Bắc Việt Nam, 2001 — 2007

‘Thanh phan vắc xin cúm tại Hắc lián cầu theo khuyến cáo của

TCYTTG, 2000-2010

Phân bồ các trường hợp mắc cứu A/HSN] theo giới

Phân bố các trường hợp mắc cúm A/TSN1 theo tuổi

Tỷ lệ tử vong/mac của bệnh nhân nhiễm virứt củm A/H5NI tại

miền Bắc, Việt Nam, 6/2003 - 5/2009

Sự phân bổ các trường hợp nhiễm vindi củm A/HSNI theo

tháng Kết quả phân lap virut cum A/HSNI tại Miễn Bắc Việt Nam,

xăm tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với tý lệ mắc vả tử vong cao [66] Cac

vụ địch củm xây ra thường do sự thay đổi tính kháng nguyên Virút cam A cé 6

chứa lự nhiên là các loài chữn hoang đại động vật có vú và người [TÔT, 132,

133] Các biến dỗi trong vật liệu di truyền (dột biến) hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen của virút cúm A khác nhau khi cừng đẳng nhiễm trên một tế bảo (trao đổi

va lich hop - reassorlment) da dan ti su thay doi khang nguyên: thay dỗi nhỏ kháng,

uguyén (antigenic drift) hoe thay déi lon khang nguy@n (antigenic shift) [19, 57)

Đô chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch lẽ lẻ hoặc đại dịch cúm Tịch sử đã ghỉ nhận các vụ đại dịch cúm xảy ra trong thé ly KX nw dai dich cam Tay Ban Nha xăm 1918 (A/IHNI), đại dịch cam Chau A năm 1957 (A/12N2), đại dịch com

Hồng Kêng năm 1968 (A/H3N2) là đo su trao đổi vật liệu di truyền giữa viút củm người va virut cium gia cam [62, 133] Giảm sát sự thay dỗi dậc tỉnh kháng nguyên của virút cứm sẽ cưng cấp các thông cần thiết cho mạng lưới giám sát củm toàn câu (Global Influenza Surveillance System - GISS) trong việc phát triển vắc

xia phỏng cúm để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xm cúm

Dich cúm gia cảm đo virút củm A/ITSNLI độc lục cao đã xuất hiện tại liân

Quốc tháng] 2/2003 và lan rộng sang một số nước Chau A dang 14 mdi quan tam lo agai hàng dâu Cuối nắm 2003, dich cum gia cam A/HSN1 đã xuất hiện tại Việt Nam Từ tháng 1/2004 dén nay, dich da xuat hign 6 61 tinh/thanh trong cả nước với

số gìa cằm đã tiêu hãy là hơn SỐ triệu con trong lông số 300 trigu gra cam mắc bệnh

Phan lớn các chúng virút cum gay nén các vụ dai dich déu bắt nguồn từ miễn Nam Trung Quốc, nơi được xem là trung tâm địch (epicemer) [110, 111] Ching vivút cm A/HSNT độc lục cao (TPAT) lày truyền Lừ gia cằm sang người đầu liên

A/goose/Guangđong/1/96, với 18 trường hợp mắc, trong đó có 6 trường hợp tử

vong Tinh đến nay (5/20093, dã có 15 quốc gia và vùng lãnh thé xuất hiện viủt

cúm A/H5NI trên người với 436 trường hợp mắc và 262 trường hợp tử vong chiến

tý lệ 60% [146] Việt Nam là nước thử hai trên thế giới xuất hiện virút củm A/HSNI tiên người (36/13/2003) Kế lừ trường hợp mắc đầu Liên cho đến nay

(5/3009) tại Việt Nam có 111 trường hợp dược xác dịnh nhiễm cúm A/HSN1 với 5ó

ca tử vong, chiếm tỷ lệ 50,5% Dịch xây ra tại 36/64 tỉnh thành phỏ

Sự lưu hành đông thời vinút ofm theo mua (A/HINT, A/H3N2 và B) và iL

cúm A/H5NI tại Việt Nam cũng như một số nước khảc trên thể giới đã gây nên mỗi

lo ngại về khả năng xuât hiện chủng virút cảm mới, cớ khả năng lây truyền để đàng,

từ người sang nguời Vì vậy, giám sáL sự lưu hành của các chúng virit cúm mùa và

virút cứn A/HISNI cũng như theo dõi đặc điểm di truyền học, sự biển đổi tính kháng nguyên là hết sức cần thiết Xuất phát từ lý do trên, chúng tỏi tiến hành Trghiển cứu để tài:

“Nghiên cứu căn nguyễn của các vụ dịch cảm người đầu những năm 2000

tại Miễn Bắc Việt Nam ”

'Với mục tiêu:

1 Xác định căn nguyên của các vụ dịch cửm trong giai đoạn 2001-2009

3 Tìm hiểu đặc điểm di truyền học, tính kháng nguyên của các chủng virúl

cúm mùa (HN, LHAN2, B và vừút cửu /HồN] lưu hành trong giai

đoạn 2001-2009.

nguyên gây nên các dại dịch lớn trên toàn cầu Virút cam B và C chỉ lưu hành chủ

yếu ở người vả thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa vả nhỏ

'Viút củm A được chia thành các phân týp dưa vào câu trúc kháng nguyên bẻ

là HA (baemagglutinin) và NA (neuraminidase) Kháng nguyên 11A được biết

mm

đến với 16 phân týp khác nhau từ H1 đến H16, kháng nguyên NA được chúa thành 9

phan typ khác nhau từ N1 dễn N9 Như vậy, nêu ghép cặp l6 phản týp HA và 9 phan typ NA thi ting sé phan tỷp cứm A được biết đến lá 141 phân týp khác nhau

Viút cũm A gây bệnh cho người dược biết dễn chủ yếu là virút cúm có

kháng nguyên bê mặt là H1, H2, H3 và NI hoặc N2 Đâu những năm 2000, một

phân lýp củm uới có nguồn gốc từ gia cảm đã gây bệnh cho người, đó là viưút cúan AJHãNI Danh pháp quốc tế được quy định cho virut cúm À dược viết như sau: À/

noi phân lập/ mã số PUN/ năm phân lập/ phân typ kháng nguyễn (A/Việt Nam FIN30408/ 2005 (HSNT))

Vinit cim B cing duce thiết kế như vậy, tuy nhiên sự thay đối về kháng, 1rguyên bể mặt của vindi cảm B hầu như không quan sát được Vì vậy, viút cúm B

dược dặt tên không, có sự than gia của kháng nguyên bế mat HA và NA ( H/ Hong Kong/ 330/01)

1.12 Hình thái và cấu trúc virút cún

Virút cảm có hình đáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi cá

Tỉnh sợi kéo đài tới 200Ô run, đường kính trung binh tir 80-120nm Cae hat virit

cam A va B co vé ngoải bao bọc Vỏ ngoài virút cỏ bản chất là protem có nguồn gốc từ mảng tế bảo chat của vật chủ, bao gôm một số glycoprotein và một số protein đạng trần không được glycosyl hoa

Virit cm A

Hình 1.1 Mô hình cẫu trúc virút cúm

*Nguén: www.pasteur.ac.ir/ /flwvirus/influ_virus.him [89]

Trén bé mat v6 ngoai đỉnh các gai glycoprotein, đó là các kháng nguyên

haemagglutinin (HA) va neuraminidase (NA) Virit ctim C chi cỏ một gai

glycoprotein Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, cỏ vai trỏ quyết định trong việc

gắn virút vào tế bảo chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa virút vả tế

bào chủ đề giải phóng virút ra khỏi tế bảo nhiễm Tỉ lệ HA/NA là 4/1 (hình 1.1)

Nueleoprotein (NP) và 3 enzyme polymerase (PB2, PBI, PA) là thành phần của yêu của phức hợp ribonucleoprotein (RNP) xoan ở bên trong của vưrút (hình

1.2)

Protein MI nim dưới lớp lipit kép và liên kết với RNP của lõi virút, là

protein cé nhiéu nhat trong virion

Protein NS2 tạo thảnh phức hợp với protein M1 [98, 152], là môi lién hé can

Phân tử ARN don am

Protem câu trúc (NP) vả 3 tiêu đơn vị polymerase

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của virút cam

* Nguôn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge [91]

1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng

Genome của virút củm A, B gồm 8 phân đoạn và của virút củm C là 7 phân

đoạn ARN sợi đơn âm, có chiều đải khoảng 10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn ma hoa

cho 1 hoặc 2 protein câu trúc hoặc không câu trúc: ( 7 protein cầu trúc: PBI, PB2,

PA, HA, NA, NP và MI và 3 protein không câu trúc- nonstructureral protein: NS1,

NS2 và M2 đổi với virút cám A và NB đổi với viưút củm B - chi thay 6 te bao

nhiém virit ).

Bằng 1.1 Các phân đoạn ARN c

(kDa)

1 PH2 %6 — 2341 | Từm thấy trong qua tinh (ng hyp ARN long Gn Gn

RNA) Dong vei WO Kan enzyme phién mi: gin két,

2 PRI 83 2341 | kéo đổi, tham gia vào quả trình sinh tổng hợp virit

Thể hệ mới trong tế bào chú

3 PA 80 — 2233 | Từm thấy trong quá trình tong hợp ARN viion (v

RNA)

4 HA 64(70) 1778 | Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thuệ phân

(Haemage, thành HAI và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm

Intinin) trùng HA gãn với lế bảo mie chủ, dung hợp giải

phóng phức hợp ribonuclcoprulein (RNÙH), mở đầu

cho quá trình nhân lên cũn virit

5 NP 56 1565 | Là thành phần protein củ yếu của phúc hợp RNP,

(melecpr chứa một trong các kháng nguyên đặc hiệu týp, phản olein) tiệt 3 týp cúm A, B, C

6 NA 5160) 1413 | Phan ft cé cau imic tetramer, thay phan bing

(Neurami protease, cho phép vinit tiễn qua lớp niêm địch tới nidase) các tế bào của đường hồ hấp trong quả trình nhiễm

trùng

NB 12 Loại bỏ phân Lử sát sialic của phân lử HA lử các CM3 virion mới được tổng hợp, lâm lộ HA ra ngoài, tăng,

‘Kha nang nhiễm tring

? MI-M2 27 1027 | MI: là Kháng nguyên đặc hiện týp, có chức năng ổn

(natrix định cấu trúc viúl, điều khiển hoạt tính RNA-

protein) polymerase va tham gia vio qua teinh lắp rip virut

(70%)

‘M2: kénh ion

8 | NSI-NS2 | 31-13 890 _| La protein khong cam trie, Kat (hae qué lrinh (Ong hop

l, chỉ có trong lễ bào nhiễm

khả năng gây ngưng kết hồng câu, gắn vai the thé chia axit sialic tran bé mat té thảo, giúp virúL xâm nhập vào tế bảo Prolein HA tén tai dudi 2 dang: dang lién than

khơng phân tách là HA” hoặc dạng phan tach thanh HA] và HA2 liên kết với nhau

bởi cầu nếi disunfua (5-5) Sự phân tách chính là điều kiện quyết định để virút cĩ khả nắng gây nhiểm và do vậy, liên quan đến độc tinh và khả năng lây truyền của virut [116] HAI gốm 319-326 axit amin, HA2 gốm 221-222 axit amin Tủy thuộc vào phân týp IIA, số lượng các axit arin bị phân tách giữa ITAI và [A2 là từ I đến

6 Ngồi ra, vị Ini axit amin trên gen HA cĩ vai trị gắn với (hu thể tế bảo chủ cũng

đĩng vai trỏ quan trọng trong việc lây truyền virút cứm Viút củm gia cẩm gẵn vào

thụ thể trên tế bào chủ tại vị trí 2.3 (SAa- 2,3 Gal), virút cam người gắn vào thụ thể

trên tế bào chủ tại vi tri 2.6 (SAø- 2,6 Gal), trong khi virút cúm lợn gắn được cả

trị (SAn- 2,3 Gal) va (SAq- 2,6 Gal) [60] Vi tri axit amin trén gen LA gan thu thé

vị

nắm ở vừng ngoại biên các tiêu đơn vị phân tử, câu trúc cĩ tính đẳng dạng cao giữa

ode phan typ [114, 134]

Protein NA gồm 1413 nuoleotide mã hĩa cho 153 axit amin NA cĩ bản chất

là một cuzyme dỏng vai trở như một mắt xích quan trọng trong việc giải phĩng virút

từ tế bào nhiễm và lan trải virút trong đường hồ hấp Dột biến axit amin tại một số

vị trí nhất định (175, 295 ở NA NI hay 292 ở NA N2 ) được cho là những đồ

biển liên quan dén sự khang hoặc giảm dộ nhạy của thuốc kháng vinit (Oseltamivir

và Zanamivir) Sự đột biến nảy được cho là kết quả của qua trinh cạnh tranh sinh học [20, 53, 54, 59, 61] Để xác định ảnh hưởng của những đột biển nay, các thứ

thiệu sinh học trong phịng thí nghiệm (imvizo) như thử nghiệm ức chế neuraminidase (Neuraminidase Inhibition assay - NAT) hoặc thử nghiệm trên động,

vật (imvivo) được áp dụng, Nếu sự kháng thuốc nảy vẫn được xác định sau khi

virút nhân lên trên các động vật thí nghiệm chứng tổ những đột biển này cĩ trong

vật liệu đi tuyển của viút Ngược lại, nêu kháng xác định được đột biển này trong

quả trình nhân lên trên động vật thí nghiêm chứng tỏ đây lả đột biển tự nhiên [53, 94]

1.1.4 Cơ chế nhân lên của virút

Dung hop, edi vỏ

Hình 1.3 Chu trình nhân lên của virút cúm

* Nguén: Knipe, David M.; Howley, Peter M Fields Virology, Sth Edition -2007 [64]

Đầu tiên, virút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ gai glycoprotein HA Cac thu thé đặc hiệu cỏ bản chất lả các axit sialic (N- acetyl

neuraminic acid ~ NANA) Viút xâm nhập vảo bên trong tế bảo theo cơ chế nhập

bảo Mang tế bảo bao lấy virút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất

Bom proton trong endosome lảm pH giảm xuống 5, tạo điều kiên cho protein F

Mang endosome

Bom proton (H+) vao endosome

Hình 1.4 Sự dung hợp giữa màng virút và màng endosome

* Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge [91]

Sau khi hợp nhất mảng, nucleocapsid được vận chuyên vảo trong nhân tế

bảo Trong nhân soi ARN (-) ban dau được làm khuôn đề tổng hợp nên soi ARN (+) theo cơ chế bỏ sung [ cRNA (+)] nho enzyme RNA - polymerase phu thuộc

ARN etia virit Chính các ¢RNA (+) nay lai duoc ding lam khuén dé téng hop các soi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của virit Các sợi ARN (-) được tạo

thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ đài ( có độ dài đủ - full length ARN), không

được mũ hoá ở đầu 5° và không được adenyl hoá ở đầu 3' Cac ARN (-) mới này một phân được phiên mã tạo ra các mRNA (+) ngắn hơn Sau đó, quả trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác nhau xảy ra ở tế bảo chất Các protein này:

bao gồm 7 protein câu trúc PBI, PB2, PA, HA, NA, NP và MI vả 3 protein không câu trúc NSI, NS2 và M2 đổi với virút cúm A và NB đổi với virút củm B Các

protein NS1, M1 va NP duoc van chuyén vao nhan kết hợp với sợi ARN (-) moi

tổng hop dé hinh thanh nén nucleocapsid, sau dé được van chuyên ra tế bảo chất

10

Tại đây, các protein HA, NÀ, M2 dược chuyên qua lưới nội chất tới bô máy Golgi, tương tác với nhau, bao boc nucleocapsid, khéi đầu cho việc nảy chỗi của viút Hạt virion moi được lạo thành bằng cách mây chải từ màng sinh chat Phân tử NA phân cắt axit sialic giải phỏng virút ra khối tế bảo clrủ dễ bắt dầu một chu trinh lây nhiễm

smi ra khỏi tế bảo chú Kết quả của quả trình này là các biến đổi trong vật liệu dị

truyén (dét bién - mutation), hoặc có sự pha trộn các phân đoạn gen của virut cúm

A khác nhau khi cùng đồng nhiễm trên một tế bảo (trao đổi và tích hợp - reassortment) 118 qua cua nỏ là sự thay đổi kháng nguyễn: /hay đổi nhỏ kháng

nguyén (antigenic drift) hokc thay déi lon khang nguyén (antigenic shift) (binh 1.5)

Đó chính là nguyên nhân gây ra cáo vụ dịch lổ tế hoặc đại dịch cúm Những thay

đổi trong vật liệu di truyền của virút cúm A là động lực cho sự tiễn hóa của nó

‘Vat ligu di truyền của virut cl A vi cae phân đoạn rời kết hợp với dặc tính không én định, kém bên vững đã làm cho virút củm trở thành tác nhân sinh học nguy hiểm với sức khỏe cộng đồng Đại dịch củm xảy ra khi xuất hiện mệt virút củm A phân typ hoàn toàn mới, thoát khỏi sự bảo vệ của hệ thông miễn dịch dã có trong quần thể người

‘Virut cum A phan týp mới xuất hiện khi:

+ Có sự trao đổi, tích hợp vật liêu đi truyện của các virit cm Á đã biết

(reassortinent)

1 Có sự lây truyền chéo virút giữa các loài (Interspecies transmission) [39,

40, 106).

OG)

(Antigenic drift) (Antigenic shift)

Hình 1.5 Sự thay đổi nhỏ và lớn kháng nguyên của virút cam

Những giả thuyết trên đã được chứng mình khi nghiên cửu vẻ các virút củm

A gay dai dich trong thé ky XX:

Bang 1.2 Nguồn gốc virút cúm gây ra các vu đại dịch cúm thé ky XX [62]

HINI Cỏ nguồn gốc từ virủt củm gia cam, do đột biển tại các điểm quan

(1918) trọng liên quan đến khả năng thích nghĩ trên vật chủ là người (gen HA)

H2N2 Do trao đôi tích hợp (reassortment) giữa virút củm người và virút củm (1957) gia cầm: virút củm mới có gen HA va NA cia gia cam

H3N2 Do trao đổi tích hợp (reassortment) giữa virút củm người vả virút cúm (1968) gia cảm: virút cũm mới có gen HA vả gen PB] của gia cảm

HINI Virat củm mới tái tạo lại từ virút cúm A/HINT đã lưu hành vào đầu

(1977) năm có thể là do sơ xuất trong phỏng thí nghiệm

của virút củm B

Virút củm 13 chí lưu hành ở người và hãi cầu Khác với virút củm A, sự tiến hoa cia virút cúm T3 xây ra với Lần suất thấp |69, 76J Đến may, viút cúm B lưu

“hành trên thể giới dược chia thành 2 dòng; dòng B/Victoria/2/87-like virus và dòng,

T/Yamagata/16/88-iike virus, trong đó dẻng D/Victoria/2/87-iEke virus lưu hành

chủ yếu ở Đông Nam Á con dong B/Yamagata/16/88-like virus lưu hành trên khắp thể giới trong thể ký XX [103, 107] Sự trao đổi vả tích hợp vật liệu truyền của virút

cúm 13 chỉ xây ra khi bai đồng virit cảm T3 cùng lưu hành đồng thời Năm 2001, tại

xnột số nước Chau Âu cũng đã giủ nhận sự lưu hành đồng thời của 2 đông viúL cúm

1 này [149]

12 TINH HINH DICH CUM TREN THE GIỚI

Dại địch là dịch xảy ra trên một phạm vỉ rộng với ít nhất tại hai Châu lục

khác nhau và điễn biến nhanh trong một thời gian ngắn Đại địch cúm là một trong những đại địch đễ lại đầu ấn nhiều nhất, với tý lẻ tấn công tir 20-40% dan sé trên

thể giới và tý lệ tử vong rất đáng kể Các đại dịch củm xảy ra với chu kỳ từ 10-40

xăm 1 lân

Trang thế kỹ XX đã ghỉ nhận 4 đại dịch cúm trên người xây ra

Dại dịch cứm “Tây Han Aha” (1918-1919): gây ra do chủng viớt cùm

AJHINI, xuất hiện với 3 đợt địch Đầu liên, địch cúm xuất hiện ở Tây Ran Nha vào

mùa xuân năm 1918 [28], sau đỏ lan sang Châu Âu ( Miễn Tây mide Pháp) vào cuối tháng 8/1918 và bắt đầu lan ra toàn thể giới, đỉnh cao từ tháng 9-11/1918 Dợt địch thứ 3 xuất hiện vào mùa xuân năm 1919 Trong thời gian dién ra dich bệnh, ước tính 1⁄3 dân số Mỹ có biểu hiện bệnh, tý lệ tứ vong ước tính là 2,5% 'Tý lệ nảy ở

Nam My va Châu Âu là 0,3-1,0% Các trường hợp tử vong hậu hết ở nhóm tuổi từ

5/1957, căn nguyên dịch được xác dịnh là virút cùm A/H2N2 phân lập tại Nhật Bản _Dịch xuất hiện thành 2 đợt: đợt 1 xây ra tại Mỹ và Anh vào tháng 10/1957 vá đợt 2 vào tháng 1/1958 Trong thời gian điển ra dịch, ước tính có 70.000 trường hợp tổ

vong tại Mỹ và hơn 1 triệu trường hợp tứ vong trên toán thể giới Lửa tuổi mắc chủ yếu từ 5-19 tuổi [64]

Dai dịch cảm “Hồng Kông" (1968): sau 1) wien, viril etm A/H3N2 gy

dich xuất hiện đầu tiên tại Hồng Kông vao tháng 6/1968 thay thé cho vinit cum AJN) năm 1957 Dich đã lan truyền trên toàn thế giới vào mùa đông năm 1968,

1969 và 1970 với tỷ lệ tấn công khoang 40% đân số, tập trung chủ yếu từ 10-14 tuổi

[64

Dai dich cứm “Nga” (1977): đâu hiệu đầu tiên của vụ địch cũm được phát

hiện vào tháng 5/1977 lại Trung Quốc, sau đó lừ tháng 11/1977-1/1978 địch xuất

hiện tại Nga và lan sang Mỹ cũng như các nước khác trên thế giới trong mùa đông

tiếp theo Căn nguyên của dịch được xác định là virút cúm A/HIN1 (A/USSR/77)

có đô lương dồng cao với các chúng vivút lưu hành vào dầu những nắn 1950 Đối

cam A/HSN1, trong đó 1 trường hợp tử vong Việt Nam là nước thứ hai trên thé giới xuất hiện virst cúm A/IISNI trên ngudi, sau dé 1a Thai Lan, Indonesia, Campuchia

Dịch cùm A/1ISN1 trên gia cẩm đã xuất hiện tại một số nước Châu Á từ

tháng 6/2003 như: Việt Nam, Iadonesia, Thái Lan mặc đủ chưa có những thông báo

chỉnh thức lại thời điểm đó Và sau đó, lan truyền sang các nước khác trên thể giới

14

như Campuchia, Lảo, Nhật Bản, Hàn Quốc dẫn tới việc phải tiêu hủy hơn 100

triệu con gia cm tại các nước này, Virút củn gia cằm đã lan sang các châu lục khác

xửuy Châu Âu, Châu Mỹ, Trung Đông |64]

Tình đến nay, dã có 15 quốc gia vả vùng lãnh thổ xuất hiện viút cún A/IT5NI trên người với 136 trường hợp mắc và 262 trường hợp tử vong, chiếm tỷ lệ

60% [146]

1.3 TINH HINH DICH CUM TAL VIET RAM

1.3.1 Dich cim mia

Tại Việt Nam, héi ching cium (Influenza like illness - LL1) la một trong 26

bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyén nhiém gây dịch ở

nude la, Theo Niễn giám thống kê các bệnh truyền nhiễm 2001-2005, tỷ lộ hội chứng củm trung bình trong 5 năm (2001-2005) lả 2040,4/ 100.000 đàn, đứng đầu

trong 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất tại Việt Nam [1 - 5] Tỷ lệ mắc là khác nhau

giữa các miền Trong đó, Miễn Bắc và Tây Nguyên có lý lệ mắc cao, với ty lệ Irung,

bình 5 năm là 2739,5/ 100 000 dân ở Miễn Bắc vả 3840,6/ 100 000 dân ở Tây

Nguyên Miễn Bắc và Tây Nguyên có nhiều vùng núi cao, khi hậu 4 mùa nên hội chứng cúm tang nhiều vào mùa đông-xuân Tỷ lề này thấp hơn ở Miễn Trung là 2 156,3/ 100 000 dân, Miễn Nam là 904,6/ 100 000 dân Dây là 2 vùng đồng bằng ven tiiển Miễn Trung và Đồng bằng sông Mê Kông có khí hậu nhiệt đới, chỉ có 2 ruùa

khö và nưưa

Năm 1957-1958, địch cúm đo virút cúm A/TI2N2 và năm 1968-1969, địch cam do vinit cm A/ H3N2 đã xâm nhập vào Việt Nam và lan rộng khắp các tỉnh

Miễn Bắc Tuy nhiên, việc giám sat cam chú yếu dựa trên các đầu luệu lâm sing va

được chân đoán, báo cáo là hội chứng cúm

Từ năm 2006 đến ray, Viên VSDTTƯ đã bước đầu thiết lập và triển khai hệ thống giám sat cum trong điểm để phát hiện vả xác định các chúng virút củm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trong toàn quốc Theo số liệu giám sát cúm của Chương,

trình giám sal com Quéc gia, trong 2 nấm 2006-2007, lý lệ hội chứng cứm/bệnh

nhân đến khám tại các điểm giảm sát bệnh viện là 12,5% và tỷ lệ bệnh nhân hội

chứng cúm được xét nghiệm dương tỉnh với vị rút củm bằng phuong phap RT-PCR

là 18,4%

13.2 Dịch cúm A/HSNI

Cudi nim 2003, dịch cúm gia cầm A/HSNI đã xuất hiện lại Việt Nam Từ

tháng 12/2004 đến nay, dịch đã xuất hiện ở 6 tỉnh trong cả nước với số gia câm đãi

tiêu hủy là 50 triện con trong tổng số 300 triệu gia cảm mắc bệnh

Trường hợp mắc cúm A/IISNI trên người đầu tiên tại Việt Nam ngày 26

tháng 12 nắm 2003 là bệnh nhân tại Hà Nam Kể từ trường hợp mắc đầu tiên cho

dén nay (5/2009) tại Việt Nam cỏ 111 trường hợp dược xác dịnh nhiễm cúm

A/HãN với 56 ca tử vong Dịch xảy ra tại 36/64 tính/ thành phổ Diễn biến của

địch cúm À/H5N1 có thé chia ra thành Š đợt dich như sau:

Bang 1.3 Các đợt dịch cúm A/HSRI trên người tại Việt Nam

Những biểu hiện làm sang đầu tiên của bệnh nhân nhiễm cúm chí xuất hiện

sau giai đoạn ủ bệnh Những đâu hiệu này thường khó phân biệt với các bệnh nhiễm

16

trùng đường hô hấp khác như á cảm, hợp bảo dường hồ bắp Chính vì vậy, để phân biệt chấn đoán sớm những trường hẹp nhiễm virút cum, dic biét la virut cum A/HSNI, cân kết hợp các biểu hiện lâm sàng và các yếu tố dịch tễ có liên quan

1.4.1 Thời gian ủ bệnh

Trơng thời kì ñ bệnh, mặc đủ cơ thể đã nhiễm virúi nhưng chưa được xác

định lả nguồn lây nhiềm Thời gian ứ bệnh của các bệnh nhân nhiễm củm thường, từ 1-5 ngày, tủy thuộc vào nổng độ virút cfmp như tình trạng miễn địch của mỗi người

Thông có biểu hiện triệu chứng trong giai đoạn ñ bệnh

1.4.3 Thời gian khỏi phát

Đặc diễm lâm sàng bệnh củm mủa giữa trể em và người lớn hảu như không,

có sự khác nhau Người giả cò thể sốt cao, mệt mỗi không kẻm theo triệu ching đường hồ hấp, trong khi tré ốt cao kêm theo co giật |64]

Virat cam A/HSN1

* Triệu chứng toàn thân

Sốt thành con hay sốt liên tục cả ngày, nhiệt độ thường từ 38°C đến 40°C Bệnh nhận thường có cắm giác đau đầu, đau mỏi người, có thể thấy đau quanh hốc mắt Ö những bệnh nhân sốt cao đa nóng, đỏ, khi có suy hồ hập cá tím mỗi, đầu chỉ Trong trường hợp nắng, bệnh nhân có thể có rồi loạn ý thức

* Triệu chứng cơ năng

Ho: Ja trigu chứng xuất hiện sớm, thường là ho khan, một số trường hợp ho

gò đờm do nguyên nhân bội rhiềm thêm vĩ khuẩn.

Đau ngục: đau vùng tổn thương, tuy nhiền hảu hết các trường hợp không có đau ngực

Khó thổ: những trường hợp viêm phổi nhẹ, bệnh nhân không khó thở Tuy

nhiên, hẳu hết các trường hợp viêm phổi do virút cúm A/H5NI dêu có diễn biển nặng lên nhanh chóng Bệnh nhân thở nhanh nỏng, có thê có co kéo cơ hồ hấp

* Triệu chứng thực thế

Hồ hấp: tân số thở tăng, có co kéo cơ hồ hập hoặc không, Nghe phổi có ran

âm, ran nỗ vùng tốn thương,

Tim mạch: rạch nhanh, huyết áp bình thường, trường hợp nặng có sốc

nhiễm cúm A/HSN lả sốt cao, ho, khạc đờm, dau hong va thở nhanh Các triệu

chứng này này có xu hướng nhẹ hơn ở đợt dịch cín tại Hồng Kông răm 1997 và có

biểu hiện nặng hơn ở những vụ dịch cũm gản đây

Đạch câu máu: số lượng bạch câu bình thường hoặc giảm

1.4.3 Sinh bệnh học

Nhiễm trùng gây ra bởi virúL cú đầu tiên là viêm đường hỗ hấp wén Virdt

phat triển trên tế bảo biểu mô đường hô hấp và phả huý nhung mao, nơi được coi lả hàng rào bão vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thế trong hệ thẳng hồ hấp Kèm theo sự

xhân lên của vid, inlerferan được phái hiện trong giai đoạn cấp tính của bệnh trong

18

một thời gian ngắn là nguyên nhàn của sự nguy hiểm do nhiễm virút cảm

Nhiễm trùng gay ra bởi virút cứm A thưởng để lại những những dầu hiệu sinh bệnh học tại đường hô hấp đưới Các chứng viêm từanh quân, khi quản, phế quản cấp xuất hiện củng với triệu chứng viêm long dường hỗ hấp và phủ nẻ Nhiễm

trùng gây ra bởi viút cúm A/IISNI bao gồm triệu chúng máu khó đồng, thận hư,

tan hạch bạch huyết và tổn thương phối [124]

Nhiễm virit đường hô hấp dưới trên nên viêm phổi cấp có tỷ lệ tứ vong cao Viêm phối thường là tình trạng bội nhiễm vi khuân như Streptococcus pneumonia,

Staphylococeus aureus va Hemophilus mfluenca, trong, đồ § aureus là nguyên nhân

thường gặp và rất nguy hiểm, gây nên suy hồ hấp, thiểu oxy và diễn biển nặng trong vòng 2-3 ngày sau khi nhiễm bệnh Cha nghiên cứu cho thây đẻ là do té bao bị phá

huỷ bởi sự thâm nhiễm của viút số tạo điển kiện cho sự xâm nhap eda S aureus Ching 8 aureus sin sinh ra protease phan tach ILA thanh IIA] va IIA2 lam ting khả năng gây nhiễm eda mét sé ching virdt cum A Vi vay, cA virit clu va vi khuẩn cùng gây nhiễm vào tế bảo chủ gây rên tý lệ lữ vong từ 10-20%, có khi lên tới 42% [64]

1.8.1 Phương thức và thời gian lây truyền

Virút cứa được lây truyền từ người sang người theo đường hồ hấp: nước bọt

và các dịch tiết của bệnh nhàn củm trong quả trình nói, ho, khạc, hất hơi tạo ra

cae giot khi (droplet) hay cdc sol khi (aerosol) chtta hat virút và xâm nhập trực tiếp

vào niêm mạc đường hô hắp của những người tiệp xúc

Virút cum A/HSNI lây truyền từ động vật sang người qua đường tiếp xúc trực tiếp giữa gia câm nhiễm bệnh và người hoặc ăn thịt gia cảm đã bị nhiễm bệnh

Virút cửa nhân lên ở cả đường hô bắp trên và dưới Khu nghiên củu sự nhân lên của virút cứm A/1IK/68 (H3N2) trên 6 người tỉnh nguyện khỏe mạnh cho thầy

virứt nhân lên mạnh nhất vào khoảng 48h sau khi lây nhiễm và giảm xuống chậm dẫn từ ngày thử 6 đến ngày thử 8 Người ta vẫn phát hiện được vật liệu di truyền

của virút cúm ở các tế bảo và dịch tiết dườmg hồ hấp của những người bị nhiễm virút cúm trong nhiều ngảy ngay cá sau khi virút không còn được tìm thấy Virút cũm thường được tìm thay 1-2 ngày sau khi có những triệu chứng đầu liên và có thể tim thầy trang vỏng 13 ngày sau đó [64],

1.82 Nguồn bệnh va ỗ chứa

Virút cứu A có một hệ vật chủ rộng rãi Các loài gia cảm hoang dại, vịt và

cáo loại thưỷ cảm là các ố chira, nơi ân náu đầu tiên của 16 phân týp HA và 9 phân

typ NA đã biếL Một loại vật chi lu nhiên khác của virút cũn A đó là động vật có và

va người Một sở vụ dịch đã được ghi nhận có sự hiện diện của cáo loài động vật

kháo như động vật biến (cá voi, sư tử biến), chôn, đông vật nhai lại (nai, tân lộc)

không ngimg của virút cúm người, viút cúm gia cằm chỉ có những sự khác biệt nhỏ

trong cùng một phản typ Do vậy, các loài thuỷ cảm đại điện cho một ỗ chứa di trú không lỗ các gen của virút cúm À và tiểm năng lây truyền sang các loài khác Trong thực tế, quần thể các virút cúm gia câm có ý nghĩa rất quan trọng trong các vụ dịch cứm Dầu tiên lả sự sắp đặt lại giữa các virút cứm A của người và vướt củm không

phải của người và đó là nguyễn nhận của các vụ đại địch Thứ hai, sự biện điện của

một ở chửa động vật có khả năng duy trì sự tổn lưu của virút ở ngoài quản thể

người, vi vậy việc loại trừ virút cúm A trên người thông qua biện pháp tiêm chủng

Mọi cá thể du có thể nhiễm củm và mắc bệnh cm Ở người lớn, khi bị

nhiễm virtt cúm có thể có biểu hiện lâm sảng tử nhiễm trùng không triệu chứng tới

viêm phổi do viút tiên phát tiền triển nhanh dẫn tới tử vong Ở trẻ nhỏ, nhiễm virút cứm thường sết cao có thể kẻm theo co giật

Đôi Lượng có nguy cơ mắc cúm cao: người giả trên 6Š Luỗi, trễ em, phụ nữ cỏ thai, người mắc bệnh mãn tỉnh

ra kháng thể trung hoà đổi với vinit cúm ở dịch mũi [6⁄4]

Trưng nhiễm trùng tiên phái, cdc khang thé dic hidu voi hemagglutinin IgA,

IgM va IgG xuat hiện ở dịch mũi, trong đó chủ yếu là kháng thể IgA va IgM [78] Khang thể IgA có vai trô quan trọng trang ngắn chặn sự nhiễm virút, hoạt động của

nó điển ra tại hễ mặt màng nhày của bộ máy hồ lắp

‘Long nhiễm viút thử phát, kháng thể JgG hạn chế sự nhân lên của virút và interferon cing giúp cho sự Hỏi phục có hiệu quả [7B] Những ức chế không đặc hiệu tới virút củm cũng, được biết tới, dò không phải là kháng thể và vai trở của nó trong việc ngăn chặn sự nhiễm bệnh cững như hổi phục chưa rõ ràng

Ngoài m còn có vai lrò của đáp ứng miễn địch trung gian tế bào thông qua tế bảo lympho ‘I va cdc thực bảo tại các phế nang cũng dong vai tro trong quá trình thổi phục của bệnh

1.6.1 Thuốc kháng virút

Tiện nay, có 2 nhóm thuốc được sử dụng để dự phòng và điều trị cúm Đó là:

- Amantadine và Rimantadine (I'lumadine)

- Oseltamivir (Tamiflu) va Zanamivir (Relenza)

* Amantadine va Rimantadine (Flumadine): ngin cin su xan nhap cla virdt, bing

Amantadine dược sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Anh trong khi do

rimantadine đang được hưu hành rộng rãi tại Nga và các nước Châu Âu Vai trò của anantadine rất khó đánh gia vi trong giai đoạn nhiềm virúl cấp tính, thời gian rửân lên của virút ngắn Tuy nhiên, một vải thử nghiệm đã chỉ ra rằng cả 2 loại thuốc nảy riếu sử đựng ở ngảy đầu tiên của bệnh thì sẽ rút ngắn được thời gian trưng bình của giai đoạn sốt Nó được đánh giá là có hiệu quả hơn khỉ sử đụng thuốc nảy cho

những bệnh nhân bị bệnh tìm mạch hoặc bệnh viêm đường hồ hấp mạn tính khi có

nguy cơ nhiễm virút cúm

Tuy nhiền, sự kháng Thuốc cũng ru những phần ứng phụ sau khi dùng thuốc kháng virút là vẫn để đáng quan tam Theo Iayden & lay, Saito va cs cho thấy gần 1⁄3 số bệnh nhân đã xuất hiện sự kháng thuốc amantadine và rimantadine sau khi diễu trị 52, 104] Trong khi dó, tý lệ này là rất thấp đối những trường hợp chưa

điều tri thuốc: 0-3% ở Nhật Bán, 1% ở Mỹ, Anh [118, 119, 125, 156] Trong thời

gian gan đây, tại Châu Á và Mỹ đã nó sự tầng đáng kế các chủng virút cúm A/H3N2

kháng amantadine [17, 18, 97] Dac biét, virút củm H1N1/09 dai dịch trên thể giới cing nu tai Vist Nam hign c6 ty 1¢ khang thude cao (100%) Tuy nhién, virut cum A/HSNI vẫn được đánh giá là nhay câm với cae thuée & hdr nay [94]

* Oseltamivir (Camiflu) vé Zanamivir (Relenza): Ngăn cản sự giải phòng,

virtt khỏi tế bào nhiễm nhờ we chế hoạt déng cla enzyme neuraminidase (NA) Đây được coi là co chế hiệu quả nhất tác động vào virút Phần lớn các virút không yêu cầu một cơ chế đặc biệt để giải phóng, virút thể hệ mới ra khởi tế bảo nhiễm nhamg virút cứm thì quả trình giải phóng phải có sự tham gia trực tiếp của enzyme

neuraminidase Frvyme my lich axit sialic lit mang glycoprotein của vinit, gidi

phóng virút Nếu không có sự tham gia của enzyme này, virút sẽ bị giữ lại bên trong,

†ế bảo và không có cơ hội tấn công sang các tế bảo khác

Năm 1983, cầu trúc nguyên tứ ba chiều của neuraminidase được xác định

22

nhờ sử dụng tia X Cấu trúc của phức hợp neuraminidase và axit sialie được phat hiện đỏ là axit siahe chiếm giữ 2 trong 3 cau tao dang “tủi” trên neuraminidase

Oseltamivir và zanamivir được thiết kể dựa trên 2 câu trúc đó đề cạnh tranh vị tri

bám vào HA của axit sialic ngăn căn sự xâm nhập của virút vào tế bảo

Hình 1.6 Cơ chế ức chế neuraminidase tại một số vị trí axit amin

trên protein NA

*Nguôn: Collin và cs - Nahure [90]

Sự kháng thuốc zanamivir chỉ tìm thấy ở một trường hợp trẻ em bị suy giảm

miễn địch [71] Trong khi đỏ, những biêu hiện giảm độ nhạy hoặc khang thuốc tamiflu cia virut củm A cũng đã được xác nhận vả có chiêu hướng ngảy cảng tăng

0,7% - 4% ở người lớn, 4% - 8% ở trẻ em va gan day nhat thi ti 1é khang tamiflu 6

trẻ em sau khi điều trị thuốc đã tăng lên 18% [70, 72, 102] Vi vay, việc kiểm soát

những hạn chế nhất dịnh Thực tế cho thấy một số lượng dang kề các chúng củm A/TT5NI lưu hành gần đầy có hiện tượng kháng thuốc cùng như một số nghiên cứu tại Nhật Bản cho thấy những tác dụng phụ không mơng muốn của thuốc Vì vậy, cùng với việc sử dụng thuốc kháng virút thì biện pháp tốt nhất để phòng bệnh củm A/ISNIE là tăng cường hệ thống giảm sát, phát hiện, cách ly và điều trị ngay những

trường hợp mắc đầu tiên đi cùng với các biện pháp xử lý gia cầm nhiễm bệnh

1.6.2 Vac xin com

1.621 Vaexin clon mia (A/H3N2, A/HINI vi B)

Gây miễn địch được coi là biện pháp hữu hiệu để phòng cả virút cúm A va

B Tuy nhiên, việc gây miễn dich cũng đưa ra một số vân đề đáng lưu tâm đo virút cũm thay đổi liêu tục và hiệu lực của vac xin phụ thuộc vào sự phủ hợp giữa chủng san xuất vắc xi và chúng virút cúm đang lưu hành IDo đó, khối lượng vắc xin sản xuất hàng năm thường không đáp ứng đủ cho cộng đồng Việc Liêm vắc xim được ưu tiên cho ba nhóm dối tượng:

+ Nhóm đối tượng cỏ nguy cơ cao: người giả, người tản tật, người mắc bệnh

mạn tỉnh vẻ từn, phối, thận

+ Nhóm tiếp xúc với các tảo nhân gây nhiém: nhân viên phòng thi nghiệm + Nhớm người làm việc tại các địch vụ công cộng: nhân viên y tế, cảnh sát

ắc xin củn hiện tại có nhiều loại khác nhau

| Pae xin bat hoat (inactivated vaccine) bao gém cac loai sau [48]

- Vaccine toản bộ hạt virút bất hoạt sử đựng formalin hoặc Í1-

propiolactone

- Vae xin tiéu don vi hoặc kháng nguyên bể mặt HA và NA (subunit

hoc surface).

- Vac xin thành phản tách rời của virut: toàn bộ hạt vưút nhưng bị tach réi bing ether (split)

+ Véte xin song gidm déc lee (Live altenuated influenza virus - LATV): duge sản xuất bằng, hạt virút lai được tiến hành dựa trên việc sử dụng kháng nguyên HA,

NA voi các đột biến khác nhau Sau đó, lựa chọn các hạt virút không có khả năng, phái Iriên tại 37°C cây truyền vào tế bảo động vải hoặc phôi gả Vắc xin dược sử dụng bằng cach xông hơi qua đường mũi Vắc xin này có hiệu lực kém hơn các loại

vắc xin bắt hoạt và chỉ dùng cho người khoẻ mạnh trong độ tuổi từ S-49 [1 3, 83]

1 Vắc xin bất hoại bing céng nghé di truyén nguyc freassoriment vaccine): tái tạo các virút từ các phân đoạn gen có lựa chon khac nhau bang k¥ thuét di truyén

ngược (reverse genetic) [80, 81, 84]

Tiên lại, vắc xin cam mua dang dimg phé bién 14 vae xin bat hoạt đa giá, thành phân vắc xin bao gồm virút cảm A/IIINI, AJI3N2 va B

1622 VắẮcxin cm A/H5NI

Hiện nay, trên thể giới có rất nhiều loại vắc xin củm A/HSN] cho người của

các hang Sanofi Pasteur — Phap, Novarlis - Thuy Si, GlaxoSmithKline — Anh,

Sinovac — Trung Quốc, Baxtor — Mỹ dã được cấp giấy phép lưu hành |24, 36, 37,

49, 127] Tại Việt Nam, vắc xin củm A/HI5NI đã sản xuất ở quy mỗ phòng thí nghiệm và đã được thử nghiệm lâm sàng [9] Đây là vắc xim bất hoạt bằng công,

nghệ di truyền ngược: gen HA và NA thuộc virút củm A/H5N1 ( clade 1 hoặc clade

2), trong đỏ, gen HA được loại bỏ 4 axit amin được cho ring quyết định độc tỉnh

của virút tại khu vục phân tách HAI và HA2 Các gen còn lại ( PA, PB1, PB2, M, N8 và NE) là những gen của vưút cúm A/Puerto Rioo/8/1934 (H1N1) Vắc xin cúm

AATSNE sé 1a vac xin don gid, chưa có nghiên cứu nảo về khả năng phối hợp giữa

€ xin cm mùa (A/HTN1, A/H3N2 và B)

vắc xin cúm gia cảm (A/HSN]) và

Cũng với sự phái triển của khoa học kỹ thuật, bên cạch các kỹ thuật châu

cũng như trong cộng dông, hạn chế những thiệt hại về nhân lực cũng như về kinh tế

phần tích các mẫu bệnh phẩm sinh học này sẽ là một khâu then

do cúm gây ra V

chót để hiểu dược đặc điểm sith học của tác nhân gây bệnh này, kế cả về những, khia cạnh kháng thể sau khi lây nhiễm, quá trình khu trú và phat tan virut trong các

địch khác nhau của cơ thể

1.7.1 Phương pháp phát hiện khang nguyên

1.211 Thứ nghiệm chẵn đoáu nhanh (QuicRdes)

Pay là một thử nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của virút cúm,

và độ dặc hiệu kém, một số bộ sinh phẩm không phân biệt được typ huyết thanh A,

hoặc 13, không xác định được phân typ (111, 113, HH5 ), giá thảnh cao (từ 12 USD

25 USD/ 1 thử nghiệm) Theo tổng kết nghiên cửu của một số tác giả cho thấy độ nhạy trung binh 70 -75%, độ dặc hiệu trung binh 90- 99%; độ nhạy khi phát hiện virứt củm A cao hon virut cim B [21, 22]

Thử nghiệm nảy rất có hiệu quả trong sảng lọc vá điều tra địch cúm mùa ở

người (củm A/H1, H3, B ) nhưng không cỏ giá trị trong việc phát hiện cúm AISNE

~ Độ sinh phẩm phát hiện và phân biệt cam A và Ð 6 bộ

- B6 sinh phim phat hién nhưng không phản biệt căm A vả B: 3 bộ

© QuickVue Influenza Test

« FLUƠIA

«e ZstatFlu

121.2 Phân lập và định tập vừt

Yên cầu vỀ an toàn xinh học

Di virút củn mùa (cúm A/H3N2, A/HINI, E3 ) việc phân lập virút phái

được tiên hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2

Đôi với vir cúm gia cầm (cúm A/HSN1, H9N2 ) là virút nguy liểm mức

dộ 3 (theo phản loại của TƠYTTG) nên việc phân lập viướt phải dược tiến hành

trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cắp độ 3

Phân lập vừút dược coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giảm sắt của |22J Chúng

virút phân lập trong vụ dịch được nghiên cửu về các đặc điểm sinh học, sự biển đổi vật liệu dĩ truyền va tính chất kháng nguyên để có thể dự bảo được sự lan truyền

của một chủng vuút mới có dộc lực cao trong giai doan tiếp theo và cho sự lựa chọn

thành phần vac xin cum hang nim

lIiện nay, có 2 hệ thống phản lập được TCY'TTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiên chuẩn (Specifc Pathogenic Eree - SPE) 10-11 ngày tuổi và trên

dòng tế bảo thường trực thận chó ( Mardin- Darby canine kidney cells - MDCK)

* Phan lap virut trén tring: Virt cim được phân lập đầu tiên trên trứng gà xăm 1936 Sau khi cấy virút vào khoang niệu hoặc khoang ôi, trứng được ủ ở 33*C

niệu nhưng cũng những chủng virut củn A phải gãy nhiễm trên dịch ôi sau dó mới

thích ứng lên khoang niệu trúng gà Virứt cúm A/IISN1 thường gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm

* Phân lập trên tế bảo céim thy MOCK: Virat cam có thể nhân lên trên các dong tế bảo tiên phát như tế bào thận khi, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dang té thảo thường trực như MDCK, Vero MDCK là động tế bào thích hợp nhất để phân lập vizút củm trên người Khi phân lập virút trên các dòng tế bảo thường trực phải thổ sung trypsin (TPCK) — protease ngoại sinh Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng,

trypsin TPCK có ãnh hướng tới sự phân tách phân tủ HA thành HAI và HA2, đóng

vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của virút vào tế bảo cảm thụ Tuy nhiên, đối với các đòng tế bảo tiên phát thì protease là yêu tố nội sinh, vi vậy virút cứm vẫn có

khả năng nhàn lên tuả không cẩn phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy [88]

Ưu điểm của việc phân lập virit cúm trên tế bảo là đơn gián, thuận tiện, có

khã năng phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên, luỳ theo rục dich nghiên cứu dễ lựa chọn phương, pháp phân lập Phân lập trên trứng vẫn là lựa

chọn tôi ưu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thê giới vi nó có khá năng khuếch đại

xnột lượng lớn vướúi với hiệu gia cao |43, 89] Tuy nhiên, việc sản xuất vác xin rên

tế bảo MDCK và Vero cũng dang dược nghiền cứu [16, 63]

* Dịnh tứp viúf: viút sau khi phân lập được định týp ( xác định đặc tính

kháng nguyên ) bằng phân ứng ức chế ngưng kết hồng cau (HD)

121.3 Thử nghiệm mién dich hujnh quang (Immunofluorescent assay - LEA)

Thử nghiệm miễn địch huỳnh quang là kỹ th

cứm Tế bảo cám thụ sau khi gây nhiễm bệnh phẩm hoặc các tế bảo biểu mỗ đường

L có hiện quả trong chân đoán:

"hồ hap trong bệnh phẩm lâm sàng (kháng nguyên) sẽ được rửa và cổ định trên phiên kinh Kháng nguyên sau khi được có định sẽ được gắn với các khẳng thé don dong

đặc hiệu typ va phan typ Sau đó, kháng thé dơn dòng dược phát hiện bằng khang thé khang IgG chuột gắn huỳnh quang li'TC

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ Huật nhanh và nhạy, được sử

dụng thường xuyên trong các phỏng thí nghiệm chan doan vi sinh vật hoc Nhung

*kỹ thuật này đôi hỏi phải có chuyên gia trong việc thực hiện và đọc kết quả Mặt khác, thử nghiệm miễn địch huỳnh quang dòi hồi phải sử dụng lễ bảo đã được gây

nhiễm virủi củn hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm lãm sàng, đặc biệt với viưút cúni AJTISNI, nên các bước tiên hành thử nghiệm phải được tiến hành trong phòng thí

nghiệm an toàn sinh học bậc 3

1.7.2 Phương pháp phát hiện vật liện di truyền

L721 Phuong phip RT-PCR

Phuong phap RT-PCR (Reverse transcriptase — Polymerase chain reaction)

đã được áp dung và phát triển cho phần lớn các virút có vật liệu đi trưyền la ARN

Phuong pháp này có khả răng xác định nhanh sự nhiễu virút thông qua xác định

vật liệu di truyền cửa virút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vinut

of trong mâu bệnh phẩm lâm sàng Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc

hiệu cao và chính xác khi dược kiểm soát tót

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chấn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh đo việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phủ hợp dễ lẫy mẫu Phương pháp R1-PCE yêu câu trang thiết

bị và sinh phẩm với giá thành tương đổi cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi tác nhàn

ngoại lai

Cho tei nay, RT-PCR van được coi là phương pháp tối ưu để phát hiện virút

cứm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để khẳng định các trường hợp nhiễm cúm A/H5NI theo qui định của TCYTTG

1722 Phương phap Real time RT-PCR

Phương pháp Real time RT-PŒGR sử dụng cặp mỗi và chất hóa học phát

huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green T, molecular

.ARN, chẩn doán các virút gây bệnh như virut củn A/H5N1, RSV [33, 35]

Phương pháp Real time RT-PCR khéng can điện đi sản phâm như phương

pháp RT-PCR thông thưởng nên phương pháp Real time RT-PCR dược mổ lä như

một hệ thống “dong” Ưu điểm của phương pháp nảy là nhanh, nhạy, cỏ độ chỉnh xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [55] Tuy nhiên, phương phán Real lime RT-PCR yéu cầu trang thiết bị và simh phẩm với giá thành tương đối cao

1723 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã

ngược (RT-LAMT)

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vỏng phiên mã ngược

RI-LAMP (Reverse transcriptase — Loop - mediated isothermal amplification) la

¢w6l phương pháp mới dễ khuếch dại ADN trong diễn kiện dẫng nhiệt, do dó loại bó được sự thay đổi các chủ kỳ nhiệt trong phương pháp RT-PCR thông thường Phin ứng khuếch đại ADN thực hiện lại 63°C trong 60 phút và cô định sản pham tai 80°C

trong 2 phút trong hệ thống may Loopamp-real time LA-200 (Kyote — Nhat Ban)

Vi vậy, thời gian tiến hanh phản ứng sẽ được rit ngắn [79, 85] Irong một phan ứng đã sử dụng 6 loại mỗi bao gồm 2 mdi trong, 2 mdi ngoài và 2 mỗi đạng vòng đã lam tăng độ nhạy của phần ứng Phương pháp này cỏ thé phat hign virat cum trong,

giai đoạn sớm của bệnh [74] Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

nay cân được đánh giá thông qua một số lượng lén mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm Hiện nay, phương pháp này cũng đang được phát triển dé chin đoản nhanh

một số bệnh truyện nhiễm khác do virút như virút S4ƒRS-CoE, virút viêm gan T3,

virtt viêm não Nhật Bản [122]

1724 Phương pháp xác định trình tự gen

Tiện nay, các phương pháp xác định trình Li gen được thực hiện tên máy

30

phân tích trình tự chuỗi tự động như ABI PRISM 3100 - Avant, BechmanCounter (Mỹ) Nguyên tắc của phản ứng dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng các dideoxynucleotide Mỗi loại điđeoxynucleotide được đánh đầu bằng một

chất huỳnh quang có màu khác nhau

ADN sợi đơn

“HT 3` Sự xuất hiện của các đideoxynucleotide

EETHING ACHE LE SAC A (cac nucleotide mat géc -OH 6 vi trí

aoe @ ° sung (mẫu gen cân giải trình tự ở dạng

dáTTP @ LLLL L1 L1 L5 ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN

@ LLLLLLLILL LILL 5 có độ dải khác nhau Những đoạn ADN

Dost ABN nảy được điện đi qua mao quản từ nhỏ

a S 4s ‘ so ae

Trong qua trình điện 6 Trinhtr c đến lớn và các dideoxynueleotide được

di, đầu đọc laser sẽ A cima TO

thu được tin hiệu ƒ banđầàu = E phát hiện bởi đầu đọc laser Trình tự gen

Hinh 1.7 Nguyén ly giai trinh tu gen

Phương pháp xác định trình tự gen xác định đặc điểm di truyền học, xây

dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA va M của virút cúm, từ đó xác định

tần suất tiến hóa, các đột biên trên một số gen liên quan đền khả năng tăng độc lực

của viút, giảm độ nhạy của thuốc kháng virút cũng như phát hiện các yếu tỏ tiểm

tàng của sự trao đổi vả tích hợp của virút cum A/HSNI vả các chủng vưút củm đang lưu hành.

1.73 Phương pháp phát hiện kháng thé

16 lả phương pháp phát hiện kháng thé kháng virút cúm trong huyết thanh tbệnh nhân Có 3 phương pháp cơ ban được sử dụng là phân ứng úc chế ngưng kết hồng câu (HỊ), thứ nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELI8A) và phản ứng, trung hoà vi lượng (MN) Két quả được xác định dya vào việc phát hiện kháng thê kháng đặc hiệu vưúi củm (ELISA, MN) hoe sự biến động kháng thể (lăng gấp 4 lẫn) gia 2 mẫu huyết thanh (HD Chân đoàn huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu

vả có tác dụng rất bạn chế đổi với oác trường hợp lâm sàng, Tuy nhiên, nó cũng là

cơ sở cho việc chấn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di

Phân ứng ức chế ngưng kết hồng cau (HT) duoc Hirst GK phát hiện năm

1942 [56] Nguyên lý của phán ứng là kháng thể (KT) kháng HA đặc hiệu virút cúm (antheamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩu (A/H1, A/H3, A/H5,

Đ ) có khả năng ức chế ngưng kết hồng câu Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc thẳng cầu gả 0,5% được sử dựng trong phản ứng III để phát hiện Kt’ khang virút ofan mùa, hồng cầu nga 19% được sử đụng để phái hiện KT kháng viút cứm

AVHSNI [21, 22]

Phan ứng TT tương đổi đen giản, kinh tế, có thể áp đạng để phát hiện sự lưu hành của KT kháng đặc hiệu virut cúm với một số lượng mẫu lớn Phân lớn khang thể kháng HA đều được phát hiện bing phan ứng HI, vi vay đây là phán ứng đặc thiệu phân týp đối với chân đoán huyết thanh học cúm Tuy nhiên, phản ứng HT chỉ

có giá trị trong chân đoán cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chân đoán Mặt khác, theo những nghiên cứu gân đây cho thay phản ứng HT có độ nhạy thấp hơn số với phân ứng trung hỏa vĩ lượng [123]

1732 Phân ứng trung hoà vì lượng (Microneutralization test - MN)

Thân ứng trung hòa vì lượng — BLISA được Honnen và cs phát triển rằm

1988 |47] Nguyên lý của phân ứng là sử dụng kháng thể đơn đòng kháng đặc hiệu

nucleoprotein (NP) dé phát hiện sự có mặt của kháng nguyên MP trong tế bảo nhiễm virút ciun Str dung phuong phap Reed & Muench dé tinh gia tri liéu gây nhiễm

50% trén tế bảo (TCIDs;) [96]

Phân ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng

phat hién khang thé khang đặc hiệu virút cúm A/HSNI và kháng thế kháng các phân tỷp viút cảm gia cảm khác má phần ứng HI không cỏ khả năng phát hiện được [123] Phan ứng này đễ tiến hành vì không cân kháng nguyên tinh khiết Tuy nhiên,

ubuoc điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiên hành thí

nghiệm kéo đài ( 2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với viưút sống, dặc biệt là virút cảm A/HSNI, nên thí nghiệm phải tiền hành trang phòng thí nghiệm an toàn sinh

Thọp cấp độ 3

1733 Thứ nghiệm hấp phu mién dich gdn enzyme (Enzyme linked —

inunusorbent assay - ELISA)

¢ nghiém hap phụ miễn dịch gắn enzyme (HLISA) được Murphy va cs phát triển nam L980 để đánh giá đáp ứng kháng thé của những người tỉnh nguyện

tiêm ve xin eum A (77J Đây là thử nghiệm được sử dụng để phát kiện kháng thể

IgG va 1gM kháng virút cúm Kháng thể có trong huyết thanh bệnh nhân sau khi gắn với kháng nguyên đã gắn trên giá rắn sẽ được phát hiện bằng kháng thẻ khác Ở phương pháp trực tiếp, kháng thể phát hiện dược cộng hợp trực tiếp voi enzyme Còn trong phương pháp gián tiếp, kháng thể không được đảnh đấu má được phát thiện bằng khang thé khang IgG va IgM đặc hiệu loài cộng hợp với enzyme

Thử nghiêm ELISA được sử đụng rông rãi để phái liện kháng thể TgGŒ và

TgM kháng virút cứn [73, 77, 123] Kháng nguyên sử dụng cho thủ nghiệm này đã

được xử lý, bắt hoạt nên đảm bâo độ an toàn sinh học cao