Luận văn biểu hiện gen mã hoá kháng thể kháng cd20 và thử nghiệm Để phát hiện cd20 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư lympho không hodgkin

‘Tao gen tai tổ hợp mã hòa cho scFv từ gả gây miễn dich Tạo phage biểu lộ scEv và sảng lọc các seEv có khả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích TAO KHANG THE scFv KHANG CD20 ‘Tach do

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI _ TRUONG DAI HOC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIEU HIEN GEN MA HOA KHANG THE KHANG CD20 VA THU NGHIEM DE PHAT HIEN

CD20 TRONG HUYET THANH CUA BENH NHAN

UNG THU LYMPHO KHONG HODGKIN

LUAN AN TLEN SI SINH HOC

Hà Nội - 2014

DẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI - TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thu Thùy

BIEU HIEN GEN MA HOA KHANG THE

KHANG CD20 VA THU NGHIEM DE PHAT HIEN CD20 TRONG HUYET THANH CUA BENH NHAN

UNG THU LYMPHO KHONG HODGKIN

LUẬN ÁN TIÊN SĨ SINH HỌC

Lời cam đoan

Tôi xin cam doan: Luận ủn là công trình nghiên cửu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học cia PGS TS Trần Minh Đạo và

PGS ‘TS Lê Quang Huấn,

Cáo số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bả

trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu cũa mình,

Hà Nội ngày tháng — nằm 2014

Nghiên cứu sinh Phạm Thu Thùy

Loi cam on

"Trước hết, tôi xim bay to lang biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS T5

Trần Minh Đạo — Giám độc bệnh viện 198 — Bộ Công an và PGS TS Lê Quang

Huấn Trưởng phòng Công nghệ Tẻ bảo Động vật Viện Công nghệ Sinh học 'Viện Khoa học Việt Nam đã tận tỉnh hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận án tiến sĩ

'Tôi xin chân thánh cắm ơn PGS.1.5 Nguyễn Thị Hồng Vân Trưởng bộ

mên Di truyền học, các thây cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học —

Trưởng dại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội dã chỉ báo tận tỉnh

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.5 Lã Thị Huyền, các cô chủ, anh chị và

các bạn công tác tại phỏng Công nghệ Tẻ bào Dệng vật Viện Công nghệ Sinh học

— Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

Tôi xin chân thành căm ơn các cô chú, anh chị và cáo bạn đồng nghiệp Khoa

Vĩ sinh — Bệnh viên 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và lạo điều kiện đuiện lợi để tôi hoàn

thành luận án

Tôi xin chân thành câm ơn Khoa giải phẫu bệnh — Học viên quân y, Trưng

tâm Ung bướu - Bệnh viện 198 và Viện chăn nuôi đã cung cấp mẫu thi nghiệm cho tôi

Cuỗi cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia dinh và tất cả những người thân,

bạn bẻ đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội ngày thang — năm 2014

Nghiên cứu sinh

Phạm Thư Thùy

Mục lục

Trang phụ bia

Lời cam đoan

Tười câm ơn

'Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các băng, biểu

Danh mục các hình

MG DAU

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TAI LIEU

11 UNG THU MAU

1.11 Đại cương ung thư máu

112 ‘Tinh hình ung thư máu trên thế giới vá Việt Nam

113 Các phương pháp chân đoán và điều trị ung thư mầu

114 Bệnh ung thr lympho khang Hodgkin (Non-Hodgkin

lymphoma) KHANG NGUYEN CD20

Cau inte gen va protein CD20

Chức năng của CD20 trong cơ thể

King nguyên CD20 ~ mục tiêu phần tử trong điều trị tnp thư

và ung thư máu

1.24 ‘Tinh hình nghiên cứu kháng nguyên D20 tải tổ hợp

KHÁNG THẺ PHAGR-SCFV 1.3.1 Kháng thể

1.32 Khang thé don dong (mAb)

133 Kháng thé don chuối (kháng thé scFv)

1.34 Khang thé phage-scEv

1.3.5 TỨng dụng mÁb trong chân đoàn bệnh ủng thư máu

13.6 Tinh hinh nghién edu va san xudt mAb dic higu khang nguyén

CD trên thể giới

1.4 KHẢNG THÊ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CD20

1.4.1, Cơ chế hoạt động của kháng thẻ đặc hiệu CD20

1.42 Một sé mAb đặc hiệu CD20 đang được sử đụng trong điều trị

1.43 Tình hình nghiên cứu mAb đặc hiệu CD20 bién nay

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨI/

21 VẬT LIỆU

21.1 Sinh phẩm

213 Hóa chất và trang thiết bị

22 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU

221 Các phương pháp thao tác với DNA VÀ RNA

2.2.1.1 Tách chiết RNA từ máu của bệnh nhân và tủy g¿ đã gây miễn

dich

2.21.2 RT-PCR nhân bản gen mã hóa kháng nguyên CD20 và kháng

thể scFv đặc hiệu CD20

2.2.1.3 Gắn sản phẩm PCR váo vector tách dòng pCR2.1

2.2.1.4 Biến nạp plasmid vào tế bảo # coli

2215 TáchDNA plammidtừ vi khiânE coli

3216 Tạo vectcr tái tả hợp chứa doan gen CD20

2.2.1.7 Tách dòng gen anf/CD20Fa mã hóa kháng thể seFv-Cụ2

2.218 Điệndigelagarose

2.2.19 Thu doan DNA tu gel agarose

22110 Tinhsach DNA va cit, gin DNA

2.21.11 Phương pháp nhân gen bing PCR

2.2.1.12.- Xác dmhuìnhtựnueleolide

2.22 Cúc phương pháp thao tác với protein tải tỏ hợp

2.2.2.1 _ Biểu hiện gentrong tế bảo E coli

2.22.2 Tỉnh sạch protein tai 16 hop

Giây miền dịch ga bang khang nguyén CD20

Ki thuat phage display

‘Tao khang thé phage-sol*y tu thu vién Griffin.1 Sang loc khéng thé phage-scFv dic hiệu kháng nguyên đích

ELISA

Xác dịnh khả năng liên kết của kháng thể seFv-Cn2 với C20

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

TAO KLANG NGUYEN CD20 TAL TO LIGP

Tach chiét RNA téng sé ti mau bénh nban ung thy lympho

KET QUA GAY MIEN DICH GA BANG CD20 TAO RA

THU NHAK GEN MA HOA sel'v KHANG CD20 TU' GA

‘Tao gen tai tổ hợp mã hòa cho scFv từ gả gây miễn dich

Tạo phage biểu lộ scEv và sảng lọc các seEv có khả năng gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích

TAO KHANG THE scFv KHANG CD20

‘Tach dong gen anfiCL220 mã hóa soFv

'Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+VantiCD20 Tải tra một số điền kiện biển biện seFv

Tỉnh sạch kháng thể seFv đặc hiệu CD20

Khả răng liên kết của seEv với kháng thể cộng hợp

D6 ôn định của sel'Y tỉnh sạch TAO KUANG TI! sel'v-Cp2 KILANG CD20

Tach dong gen amiCT220fa mã hóa scFv-Cg2

Sang lọc hệ vector biểu hiện scFv-Cg2

Nhân dòng các vector biểu hiện soFy-Cn2

Biểu hiện kháng, thể scFv-C„2 trong hệ vector

Chọn vector biểu hiện soifv-Cụ2

'Fối ưu một số điều kiện biểu hiện scFv-Cu2

Tỉnh sạch kháng thể seFv-Cw2

Độ Sn định của scEFv-Cn2 tình sạch

Khả năng liên kết của seFv-Cn2 với CD20

THỦ NGHIỆM seFv-Cu2 PHÁT HIẾN CD20 TRONG TIUYT THANH BỆNH NHÂN NIIL

3.6.1 Phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhân bang Westem blot

3.6.2 "Phát hiện C120 trong huyết thanh bénh nhan bing ELISA

3.6.2.1 Lựa chạn độ pha loãng huyết thanh

3.6.3.2 Thử nghiệm seFv-Cg2 phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh

nhân bằng HLLSA

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ

93

96

100

101 102

AML

HAMA

Đanh mục các kí hiệu, các từ viết tắt

Antibody dependent ecllular cytotoxicity

Amibody drug conjugate acquired immune deficiency syndrome

Acute Lymphocytic Leukemia Acute Myelogenous

Leukemia Cluster of differenciation Complement dependent

eyloloxieily

Complementary Deoxyribonucleic avid Complementarity determining, region

Chronic Lymphoeytic Leukemia

Chronic Myelogenous Leukemia

Khang thể mang thuốc

Hội chứng suy giảm miễn dich mắc phải

Ung thư tế bảo lympho cấp tỉnh Ung thư bạch cầu dòng tủy cấp

tinh

Cum biét hoa

Gây độc tế bảo phụ thuộc bổ

Kỹ thuật miễn địch liên kết

Nature killer cell

Overall response rate Programmed cell death

Phosphate buffered sale Partial remission

Polyvinylidene fluoride

Rheumatoid arthritis Ribonucleic acid

World Health Organization

tử chuột khi tiếm váo cơ thẻ do

không tương hợp với hệ miễn

dịch của người, khiến cơ thé sinh ra kháng thế chóng lại nó

Virul viêm gan B

U lympho Hodgkin

Chat cam img IPTG

Tổ chức Nghiên cứu ung th

Quốc tế

Khang thé Khang thé đơn dòng,

Ung thư Ìympho không Hodgkin

Tế bảo giết chết tự nhiên

Tỉ lệ phản ứng tổng thể 'Tế bảo chết theo chương trình

Tả chức Y tế THê giới

Mot s6 mAb khang CD20 đã duoc phé chuan và dùng trong diéu tri

‘Trinh tu các mỗi sử dụng để tạo thư viện kháng thể scl'v

tù gả gây miễn địch

‘Trinh ty các cặp môi sử dụng dễ tách dòng gen mã hỏa

scFv tir ga

Thanh phan phan img RT-PCR

‘Thanh phan phan tng gn (ligase)

Thanh phan phan mg cắt bởi enzyme giới hạn

Thành phần phản ứng gắn DNA

‘Thanh phan phan ing PCR

Mức đệ đáp ứng miễn địch của gà bằng ELISA sau khi

gay miễn dịch lân thứ 3

Kết quả sảng, lọc chọn dòng phage biểu lộ kháng thể sel*v

đặc hiệu kháng nguyén CD20 Kết quả ELISA xác định hoại tính của seFv-Cg2 và so

Danh muc cac hinh

Trường hep mắc mới cáo bệnh ung thư máu ở Mũ nấm 2011

va 2013

CD20 bidu hién trén mang té bao B Tiền trình biểu hiện của CD20

Sự chuyển vị tí của CD20 vào “sang” lipid sau khi gắn

So để cầu tạo cửa kháng thé

Sự biệt hỏa và sinh kháng thể của lympho B

Sq dé câu tạo của mảnh kháng thé đơn chuỗi (seFv)

Một số cầu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên Câu trúc của phage mang gen mã hớa seFv

Cơ chế hoạt động của rituximab đối với sự suy giảm của tế

bào B

Sơ đỗ bồ trí thi nghiệm xác định hoạt tính của se#v-Cr2

Ảnh điện đi tách RNA tổng số từ bệnh nhằm

Ảnh diện di nhản bản gen mã hoá cho CD20

Kết qua kiểm tra plasmid tải tổ hợp bằng enzyme giới hạn

vector pET-21a(1) mang

Tinh sach protein tai 16 bop (kháng nguyên CD20) bằng cột

sac ki ai luc Ni*

Kết quá Westem blot của khang nguyén CD20 với khang thể thương mại

él

62

So dé tao gen ma hoa scFv Anh dién di gen ma héa khang thé scFv Ảnh điện di sản phẩm PCR gen antiCD20

Anh dign di pET22b(+) va gon antiCD20

Ảnh diện di biểu hiện gen antiC'D20 6 X coli BL21 Ảnh điện đi mức độ biếu hiện seFv theo nống độ TPTG Anh dién di protein tai (6 hop (scFv) theo (hoi gian

Ảnh diện di mức độ biêu hiện seEv ở các nhiệt độ khác nhau

Anh điện di mức độ biểu hiện seFv theo mật độ tế bảo

Ảnh diện di mức độ biểu hiện seEv ở một số diễu kiện tối ưu

Ảnh điện di mức độ hỏa tan của kháng thể sel'v tải tổ hợp

Ảnh điện đi kháng thể seFv tái té hop tinh sach bién tinh (B)

vả không, biến tỉnh (A}

Nông độ imidazol thu kháng thể seFv khi tỉnh sạch

Hình ảnh Đot blot của kháng thể seEv đặc hiệu CD20

Hinh anh Western blol của kháng thể seFv đặc hiệu CD20 Biến để xác định hàm lượng kháng thể seTv bảo quản ở các thời gián và nhiệt độ khác nhau

Ảnh diện di sản phim PCR gon mi hóa Cụ2 và kháng thé scFv

(A) và nồi gen mã hỏa seEv vả Cụ2 (B)

Ảnh điện di sân phẩm PCR gen antiCD20Fa gin va cic

vector biểu hiện

Ảnh điện dị biểu hiện gen mã hóa seTv-Cn2 trong 3 vector

Fink anh Western blot của kháng, thé seFv-Cy2 6 3 vector

80

81

83

83 84

Ảnh hưởng của IPTG dén mức độ biểu hiện của seFv-Cw2

Ảnh điện đi mức độ biến hiện của seFv-C2 theo nhiệt độ

Ảnh điện di mức độ biểu hiện seEv-Cụ2 theo mật độ vi khuân

Ảnh điện đi mức độ biếu hiện seFv-Cp2 theo thời gian

Ảnh điện đi độ hòa lan của soFv-Ow2

Ảnh điện di seFv-Cq2 tinh sạch ở nẵng độ ñmidazol trên cột

NỈ

Ảnh điện di seFy-Cy2 tink sạch

Ham lượng seFv-Cụ2 báo quản ở nhiệt độ và thời gian khác Tihau

Hi ảnh các tê bảo Iyinpho B va két qua ELISA xác dịnh khả

năng liên kết của kháng thể seFv-Cr2 với CD20

Khang nguyén CD20 trong huyết thanh bệnh nhân NIH,

Kết qua Westen blot voi huyết thanh bệnh nhân NHI, Biểu để kết quả LLISA xác định độ pha loãng của huyết thanh

bệnh nhãn XHL

Bid qui ELISA so sảnh hoạt tỉnh liên kết của scFv-

Cư với kháng thể chuẩn ở các bệnh nhan NHL

xii

a1

94 95

MỞ ĐẦU

Ung thư máu là một trong 10 Toại ung thư phổ biển trên thê giới Ứng thư máu

được chia thánh 3 loại chính: lymphoma (a lympho), ledkenuia vả myeloma Theo thông kê của Tổ chức Nghiên cứu tng, tr quốc tế (TARC) ở Mĩ năm 2011, 2013

lymphoma chiếm lỉ lệ cao nhát (544-2011, 51%6-201 4), tiếp đến là leukemia (31%-

2011, 339-2013) và thấp nhất là myeloma (159-2011, 1594-2013) trong các loại ung ty mau Ung thu lympho khéng Hedgkin (NHL) 1a mét trong 2 loai cia Iymphoma và là loại ung thư đứng thứ 5 trên thế giới [51]

G Mi, hang nam có hơn 66.000 trường hợp mắc mới và gản 20.000 người chết

de bénh ung thy lympho không Hodgkin [49] Trong số các bệnh nhân ung thư

Iympho không Hodgkin, 85% người mắc bệnh có nguồn gốc Ws té bao lympho B va biểu hiện các chỉ thị kháng nguyên bê mặt tế bảo 8 CD20 là chỉ thị phân tử biểu

hiện chủ yếu trên tế bào T3 vả xuất hiện khoảng 85 — 90% ở bệnh nhân NHI, [52],

179|, |82| CD20 không biểu hiện trong các tế bảo gốc tạo máu, không để đàng bị đồng hóa và không bị tách rời khi gắn với kháng thể đánh dầu phòng xạ nên CD20

là một đích hấp dẫn cho liệu pháp điều trị hướng đích hay còn gọi là liệu pháp

kháng thể don dong (mAb) [37], [43]

THiện nay có khoảng 2§ mÁb được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Mì (TDA)

phê chuẩn đúng trong điểu trị ung thu [S0], [82] Trong đó, có 5 mAb đặc hiệu

kháng nguyên CD20 dược FDA phê chuẩn điêu Irị ung thư máu Tuy nhiên, 4 mÀb

dc higu khang nguyén CD20 (Rituximab, Y°* [britumomab, “"I-Tositumomab,

Ofalumumab) có nguồn gốc từ chuột nên khi điều trị có nguy cơ bị hiện tượng HAMA và Ì kháng thể Obinutuzamab có nguồn gốc tử người được FDA phẻ chuẩn

thing 11 năm 2013 [78] và ở Việt Nam cững mới đừng lại ở việc ứng đụng các

khang thé nay trong chan đoán và điển trị bệnh,

Xuất phát từ nhu câu thực tiển và gop phản váo việc nghiên cửu tạo kháng, thể mới hiệu quả trong chân đoán và điều trị ung thư máu dạng ung thu lympho khang Hodgkin, chúng tôi thục hiện đè tài “Biểu hiện gen mã hoá khẳng thế

kháng CD20 và thữ nghiệm để phát biện CD20 trong huyệt thanh cũa bệnh nhân ung thir lympha không 1lodghin”

Nục tiêu cña luận ám

1 Tạo được kháng thé dang đơn chuỗi (scFv-Cn2) có khả năng nhận biết, gắn

kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20

2 Thủ nghiệm kháng thể tạo ra (soFv-Op2) phát hiện CD20 trong huyết thanh

bénh nhan ung thu lympho khéng, Hodgkin

Nội dung để tài

1 Tạo kháng nguyên CD20 tái tổ hợp

2 Gay mién dich ga bang khang nguyén CD20 tao ra

3 Thu nhận gen mã hóa kháng thể seFv từ gà gây miễn địch

4 Tạo kháng thẻ seFv kháng CD20

5 ‘Tao kháng thể seFv-Cn2 khang CD20

6 Thủ nghiệm khảng thể scFv-Cg? phát hiện CD20 trang huyết thanh bệnh nhân ung thư lympho không Hodgkin

Ý nghĩa của luận dn

« Lí luận: Góp phần hoàn thiện qui trình tạo kháng thẻ tái tổ hợp, khang thé don chuỗi đặc hiểu kháng nguyên CD20 bằng công nghệ gen 6 Việt Nam

+ Thực tiễn: Sử dụng công nghệ DNA tải tổ hợp để tạo ra kháng thể sel'v, solv-

C2 đặc hiệu CD20 có thể sử dụng trong chân đoán bệnh NHL

Đồng gáp mới cũa luận én

1 Kháng thể đơn chuỗi dạng seFv, seFv-Cn2 va khang nguyên CD20 được tạo ra bằng công nghệ gen

2 Kháng thể seEv-Cu2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyén CD20

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TAT LIEU

11 UNG THU MAU

1.1.1 Đại cương ung thư mau

‘Ung thư máu là sự tầng sinh các tế bảo raấu một cách không bình thường, các

lế bào máu

tế bảo nảy thường là các lế bào bạch cầu và các lế bảo lạo thành c

‘Ung thu mau cé thé anh hưởng đến tủy xương, các tế bảo máu, hạch bạch huyết va các phân khác của hệ thống bạch huyết Nguyên nhân thực sự của ung thư máu hiện

vẫn chưa biết rõ nhưng các rà khoa học xác định được rằng khi cơ thể rửnễm các virus (HBV, HIV) hoặc rồi loạn trong quá trình phát triển của các tế bảo thuộc hệ lympho đều dẫn tới các bénh ung thư máu Các nhà khoa học đang có gắng xác định khi nào và tại sao cơ thể bắt đầu tạo ra các té bào bất thường, và khi nào các tễ bào nảy bắt dau xâm nhập vào hệ thống máu Ở một chừng mực nảo đỏ, những câu hói

xảy đã được trả lời Các thâng tin đã được sử dụng để cải thiện các úng dụng phòng,

và chữa trị bệnh ung thư máu

Phân loại ung thư máu

Dựa trên cơ sở nhóm bệnh và cơ chế sinh bệnh cáo nha khoa hoc chia ung thu

máu thánh 3 nhóm lớn: Leukenua, myelora vá lymphorna [68]

Leukemia, lymphoma va myeloma déu có một sẽ đặc điểm chung và những

điểm khác biệt, chúng đại diện cho một số lượng lớn các bệnh về máu Các bệnh

tung thứ máu khác nhau về nguyên nhận, về nức dé phan tii va su tiến triển tự nhiệm

của mỗi bệnh Trong thập kỷ vừa qua, cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân

tử cùng hàng loạt kinh ngÌiệm, phương pháp và thiết bị hiện đại giúp quá trình sàng lọc phân loại các bệnh ung thư máu thuận lợi và chính xác hơn Có sự khác biệt về

mặt phân tử giữa tế bào bình thường với tế bào ung thu va su khác biệt rõ rảng giữa các lế bảo của các loại ung thư khác rau

« Leukemia (bénh bach cit)

Teukemia la dang ung thư các Lễ bảo máu, thường là các tế bào bạch cầu

Các tế bảo leulkemia nhìn khác biệt so với các tế bảo thông thường và không có khả

năng thực hiện chức nãng cia minh Ung thư có thê xáy ra hoặc trong, các tế bảo

‘bach cầu trang hệ lympho boặc trong cáo tế bào tủy Khi ung thư phát triển ở các tế

bảo lympho thì người ta gọi là lymphocytic leukemia, khi ung thu phat triển ở các tê

Đảo hạt hoặc tế bảo đơn nhân thì người ta gọi là myelogenous leulkemia

Mỗi loại leukemia trên lại gồm có hai dang: cấp tính và mạn tỉnh [9] Dạng,

ung thư máu cấp tính là tình trạng bệnh: lí cp tính của lế bào sinh mau non - 1é bao

chưa chín, tủy xương có trên 30% tế bào non trong tổng số tế bảo có nhân, chúng,

được chia hai nhóm chính: Ung thư tế bảo lympho cấp và tng thư đồng tuỷ cấp

Còn đựng leukermia tran tính là mội nhóm bệnh lăng simh tủy đơn đồng hay nhiều tế

bảo sinh máu trong tủy hoặc tăng tạo máu các cơ quan ngoài tủy (lách và gan) Các

tế bảo này sinh trưởng chậm và sé long ting cíng chậm đo đó bệnh tiên triển từ

từ

'Theo theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung, thư quốc tổ năm 2011 ở Mĩ

có 274930 người mắc các bệnh Leukkemia [19], tỉ lệ mỗi loại lã:

- Ung thu té bao lympho cấp (Acutc lymphocytie leukemia-ALL): 13%

- Ung thu té bao lympho man tinh (Chronic lymphocytic leukemia-CLL): 33%

- Ung thu déng tuy cap (Acute myelogenous leukemia-AML): 29%

- Ung thu dong tuy man tinh (Chronic myelogenous leukemia-CML): 12%

- Cac dang ung thu leukemia khac: 14%

© Myeloma (u tiiy)

Là bệnh ung thư tương bảo (plasma cells - cơ quan chịu trách nhiệm sản xuất khang thé), thuộc Hãy xương với sự có mặt của lốn thương xương, lắng tương bào non, xuất hiện protein đơn dòng trong huyết tương và nước tiểu, đau xương, tăng

Ca`" máu và thiếu mau [9]

Nguyên nhân của bệnh hiện chưa được làm rõ, nhưng chúng thường có các

triệu chứng sau: đau xương, xuất hiện vết nứt trong xương, ốm yêu, mệt mới, giám cân, có vẫn đẻ trong hệ tiêu hóa, đau hoặc tê cóng chân Các triệu chứng nay ofa u tủy thường khá giống so với các triệu chứng bệnh khác về xương nên để xác định rõ ràng cản phải có các xét nghiệm lam sang cu thé

'Theo thẳng kẽ của tổ chức y tế thể giới năm 2001 tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ lả 1:1 [68] Theo Tổ chức Nghiên cứu ung ther quéc té nim 2011 & Mi cé 74.814

ngudi mac bénh myeloma, trong dé có 20.520 trường hợp mắc mới (11.400 nam

và 9.120 nữ) [49]

© Lymphoma (a lymphoiu bạch hupét)

“Lymphoma” là thuật ngữ chung, cho nhiều loại ung, thư máu có nguồn gốc

ti hệ bạch huyết Lymphoma là kết quả khi một loại tế bảo bạch cầu trai qua sự

thay đổi ác tỉnh và phát triển không có sự kiểm soát Ư lympho ác tỉnh liên quan trực tiếp tới sw Ung sinh của dòng tế bảo lympho, khác với bệnh leukemia,

lymphoma xuất phát chủ yếu từ hạch bạch huyết, trong khi lekemia có nguồn gốc

chủ yếu từ tủy xương

Do đặc điểm của lymphoma là liên quan trực tiếp tới sự tăng sinh đàng tế

‘bao lympho B tại các co quan của hệ bạch huyết, nên lymphoma lién quan trực tiếp tới hệ miễn dịch của cơ thể, rong đó hệ bạch huyết đóng vai rò chủ dạo

Tiểu hiện rõ nét eva lymphoma 1a su ting sinh cac té bao lympho trong các

cơ quan bạch huyết và tạo nên các khối u nhật là lại các hạch bạch huyết ở vũng cổ, vùng nách, ngực và háng Tuy nhiên, vị các tế bào lympho còa phản bố ở khắp nơi trong cơ thế nên lymphoma có thể phát sinh ở ngoài hệ thông hạch vả ngoài tổ chức

thạch huyết như ở xương, đa dày, ruội, vú, Luyển giáp trạng, não

Lymphoma duge phan loại dựa trên lai cơ sở: hinh dạng tế bảo và mô hình: phát triển của các quản thể tế bảo ung thu Dụa trên hai đặc điểm này, người ta chia

lymphoma thinh hai nhém chinh: nhóm ung thut lympho khong Hedgkin (WHT) va

u lympho Hodgkin (HD) [68]

1.12 Tỉnh hình ung thư máu trên thể giới và ở Việt Nam

"Tình hình ung thu mau trên thế giới

Ung thu mau là một trong 10 loại ung thư phổ biển ở các nước trên thể giới

Theo thống kê của IARC năm 2011 ở Mĩ [49], khoảng 4 phút có một trường hợp được chân đoán an thư trâu và có 140310 trưởng hợp phát hiện mới, chiếm 9%

tổng số các loại ung thu Dễn năm 2013, số trường hợp mắc mới tăng lên là 156120,

chiếm 9,4% tổng số các loại ung thư Trong 3 loại ung thư thì tỉ lệ mắc mới ở

lymphoma cao nhat (54% - 2011; 51% - 2013), tiếp đền là leukemia (32% - 2011;

Ai Tổng TH mắc mới 2011: 140310 B Tong TH mac moi nam 2013: 156420

Hinh 1.1 Truong hop mắc mới các bệnh ung thu mau 6 Mi nam 2011(A) và

„ 2013 (B) [49], [50] _

(TH mac mới: Trường hợp mắc mới)

Tân suất mắc mới trên 100.000 dân năm 2011 xáp xỉ bằng năm 2013 ở 3 loại

ung thư máu (leukemia: 12,5 - 2011; 12,8 - 2013); (lymphoma: NHL 19,8 - 2011; 19,7 - 2013; HL 2,8 - 2011, bằng 2013); (Myeloma: 5,7 - 2011; 5,9 - 2013) [49],

[50] Trong đó, NHL và HL là loại ung thư phỏ biển nhất ở trẻ em từ Ø đến 19 tuổi

Số người chết vỉ ung thư máu mỗi ngảy cỏ gần 145 người, hơn 6 người chết trong 1 giờ Tuy nhiên, tỉ lê chết vì ung thư máu đã giảm từ năm 1999 đến 2008

Tình hình ung thư máu ở Việt Nam

Theo ghi nhận của Nguyên Trân Anh Thư và cộng sự trong 2 năm (2006-

2007) bệnh nhân điều trị u lympho Hodgkin/bénh lympho ac tinh chung tai Bénh

viện Ung bướu Thảnh pho Ho Chi Minh là 6,29%, tỉ lê mắc bệnh nan/nữ là 1,7/1, chiếm tỉ lệ cao là 15-35 tuổi (46,2%) và trên 55 tuổi (32,39%) [11]

Nam 2008, ung thư máu được thông ké 6 5 tinh (Hả Nội, Hải Phong, Hue,

Can Tho, Thai Nguyên) là chiếm vị trí hàng đầu trong các loại ung thư phổ biến ở trẻ em [1] Năm 2010, tỉ lệ mắc bệnh NHL chuẩn theo tuổi là 6,3 và 3,7/100.000

dân, đứng thứ 7 ở nam giới và đứng thứ 9 ở nữ trong các loại ung thư Bệnh có tỉ lê

mắc cao ở nhỏm tudi 35-40 va 50-55 [2] Năm 2013, theo nghiên cửu của Nguyễn

Kim Lưu và cộng sự cho thấy bénh NHL tuổi mắc trung bình là 50,9 = 15,3, ung thư tập trung lứa tuổi 40 — 60 và tí lê mắc theo giới nam/nữ là 2,3/1 [R]

1.1.3 Các phương phán chẩn đốn và điểu trị ung thư máu

Các phương pháp chin dộn

Chẩn đốn xác định ung thu máu là bước đầu tiên quan trọng nhất khi bệnh

nhân ung ta; đến khám bệnh Quả trình chan đốn ung thir tir đơn giần như hồi, khám bệnh bảng, nhìn, sờ, gõ, nghe đến phúc tạp hơn như làm các xét nghiệm cận lâm sang gém cĩ:

(1) Xĩt nghiệm máu, (2) Sinh thiết tế bào Trong một số trường họp, cần nhuộm

hĩa mỏ miễn dịch với một số chỉ thị phản tử: tế bào B (CD10, CD20, CD21, CD23,

CD20, CD55, CD19), tế bào T (CD3, CDS, CD43, CD45R0) dé chấn đốn phân

biệt hay chẩn đốn xác định, (3) Chụp Xquang dược chỉ định cho những bệnh nhân

cĩ triệu chứng ung thư phổi hay ung thư máu ở các vị trí khác cĩ thể di căn vào

phối Siêu âm, chụp cất lớp vi tính, chụp cộng hướng từ; (1) Chân đốn bằng xác

định biển đơi gen: Kazcnwadol J và cộng sự đã phát hiện biến đổi gen GATA2 cĩ thé gây bệnh u tủy và bệnh bach cdu cdp tinh (AML) [71] Day là một phát hiện khoa học đột phá và quan trọng đối với việc điều trị và phát hiện sớm căn bệnh nguy hiểm này

Phương pháp diễu trị

Nam 1960, chi cé 4% trễ em chấn đốn mắc bệnh leukernia được cứu sống,

Ngày nay, 79% hy vọng sống sĩt nếu họ nhận được sự diều trị tốt Bệnh nhân ung

thư máu được cứu sống với tỉ lệ rất cao, điêu này cho thay việc nghiên cứu chấn

đốn và chữa trị bệnh trong những năm qua rất thành cơng Hĩa trị liên và xạ trị là các liêu pháp đã được sử dụng trong điều trị ung thư máu từ rất lâu Tuy nhiên, các

liệu pháp này gây ra nhiều tác dựng phụ cho người bệnh và kết quả điểu trị khơng, thư mong muốn Những liệu pháp mới hơn như phép tây và các liệu pháp sinh học

(liệu pháp miễn dịch, liệu pháp gen và diễu trị dáp img nhân tổ gây bệnh (Risk-

Adapted Therapy) dang được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và cũng đã thu được

Trhững kết quả nhất định L49|

1.1.4 Bệnh ung thu lympho khong Hodgkin (Non-Hodgkin lymphoma)

U lympho 4c tinh 1a nhém bệnh của hệ lympho ngoại vi, chia 2 nhóm

Hodgkin lympho với đặc điểm có tế bào RS (Reed Sternberg) va non Hodgkin lympho (NHL) voi đặc điểm thâm nhiễm lympho nhiều nơi

Bénh NIIL là sự tăng sinh các tế bào lympho B trong các co quan bạch huyết

và tạo nên các khối u, nhất là tại các hạch bạch huyết ủ vùng cổ, vũng nách, ngực và

‘ben NHI là ung thu phổ biển thử 5 trên thể giới |51 | NHL tăng hơn 82,59% từ năm

1975 đến 2008, trung bình hàng năm tăng khoảng 2.4% Tỷ lệ bệnh NHL cao hơn thiểu so với bệnh ung thư lympho Hodgkin (HỊ,) và có xu hướng lăng ð cã nam và

nữ Theo thông kẽ của LARC tý lệ bệnh NHI, năm 2011 và 2013 bằng nhau (chiếm 88,594) trong tổng số người mắc bệnh u lympho ở Mĩ và phu thuộc theo mối [49],

[50]

Phan loai NHL

Có nhiêu cách phân loại NIIL khác nhau nhưng có 2 cách phân loại được sử

dụng phổ biển trong chan đoán va điều trị hiện nay là phân loại theo WHO |42| ở

bang 1.1 va Working ormulation 6 bang 1.2 [106]

Bang 1.1 Phan loai NHL theo WHO - 2008

1 | Té bao lympho nho (Small Lymphocytic Lymphoma)

2 _ | Tế bàa nang (Follicular Lymphoma) 6 (100%)

3 _ | Tế bảo lympho lớn, lan téa (Diffuse Large Cell Lymphoma)

*_ Tế bào lymnpho B lớn, lan toa (Diffuse Large B Cell 11 (55%) Lymphoma)

= _ Tiển tế bào lympho T (Peripheral T Cell Lymphoma) 325%)

© Té bie lympho T lon (Anaplastic Largs T Cell 3 (15%)

Lymphoma)

* Té bao lympho T nguyên bảo miễn địch 1 59)

© _ tế bào lympho nhỏ, lan tỏa

« _ Tế bảo nang, nhó, nhân chễ

= _ Tế bảo nang hỗn hợp: to, nhỏ xen kẽ

Các triệu chứng của NHI,

Mỗi người có thể gặp các triệu chứng khác nhau như sưng các hạch bạch

thuyết ở cổ, nách và háng Sốt, đỗ mô hỏi đêm, một mỗi, giảm cin, ngita da, nhiém

trùng dịnh kỷ Các triệu chứng NHI có thẻ giống như rối loạn máu khác như bệnh cứm hoặc nhiễm trùng Tuy nhiên, một số người bị NIIL không nhận thay bat ky

triệu chứng não NHL của ho chỉ có thể phải! hiện klu xét nghiện ruảu |9J

Các yêu tố nguy cơ

Nguyên nhân chỉnh gay bénh NHL cho dén nay chưa dược biết rõ Có một số yếu tổ có thể gây bệnh NIH, như:

- Viur: lây nhiễm virut (EBV) va vi khuẩn Z7 pyiori Tuy nhiên, bệnh NHL không

lây nhiễm tử người này sang người khác

- IIệ miễn dịch: người suy giảm hệ thẳng miễn địch mắc phải (AIDS) hoặc những,

người đang uống thuốc chống miễn địch khi ghép tạng có thế tăng khả năng phát

triển bệnh NHL,

- Tuổi: nhóm người có nguy eơ mắc bệnh INHL cao là từ 20-34 tuổi và trên 60 tuổi

- Mỗi trường: nhiễm các chất hóa học (benzen, chất độc da cam} và lia phóng xạ

- Lịch sử bệnh của gia định: Các thành viên trong gia đình, đặc biệt là anh chị em

song sinh có người mắc bệnh NHI hay các bệnh liên quan dén lympho thi kha năng xuắc bệnh NHI, cảng cao |38]

Chan doin

Dé chin đoán bệnh NEIL ngoai cac phuong pháp cơ bản như xét nghiệm

máu, chụp Xquang, chụp cộng hưởng từ thì sinh thiết tế bảo và làm hóa mô miễn dịch xác định một số chỉ thị phân tử CD trên bễ mặt tế bảo Iympho là rất cần thiết Một số chỉ thị phân tử được sử đụng trong chân đoán NHL như: CD20, CK, CDI5,

CD3, CD79, CD30, CD45, CD79a, CD43 Tuy nhiên, CD20 la chi thi co tin sé xuat

hiện cao trên bê mặt tế bảo lympho T ác tỉnh

Ngoài ra, phương pháp chấn đoán chụp ảnh phóng xa qua khang thể đơn đồng cũng rất hiệu quả

Điều trị

Các liệu pháp hỏa trị và phông xạ được sử dụng phố biển trong điều trị NHỊ., nhưng các liệu pháp nảy thường gây ra nhiều tác dụng phụ và hiệu quả diễu trị

khéng nh meng muốn

Ngày nay, liệu pháp điều trị hướng đích hay liệu pháp kháng thể đơn dòng là

unột liệu pháp diều trị mới với các bệnh nhan ung thu mau dic biét a dang NHL Co hơn 350 chỉ thị phân tử CD (kháng nguyên) Tất cả cáo tế bảo có thể có một hay nhiều chỉ thị trên đó Hầu hết chứng có vai trò bảo vệ cơ thể khỏi sự lây nhiễm các

10

tác nhân có bại [B3] Trong số các kháng nguyên bể mat, CD20 có tắn số xuất hiện

cao (hơn 90% ở bệnh NITL), được lựa chọn làm mục tiêu phân tử điều trị bệnh NIL

và một số bệnh khác ninr bệnh ng thư tê bảo lympho mạn tính và viêm khớp dang

thấp (RA)

Tiện nay, ở nước ta nhiều bệnh nhân NIIL được điều trị bằng mAb (chủ yếu

là rituxinab) kết hợp với hoa chat (R-CHOP) đã thu được kết quả tối Theo nghiên

cứu của Trần Quốc Hùng tại bệnh viện 198 bệnh nhân NHL diéu trị bằng phác đỗ

R-CHCP và CHOP tỉ lệ đáp ứng hoàn toàn là 52%, đáp ứng bàn phân 20% và không đáp ứng là 28% |5] Lê Thị Khánh Tâm theo đối 23 bệnh nhân NHI, điều trị

bằng phác dỗ R-CHÓP cho thấy tí l§ dáp ứng hoàn toàn sau 6 dợt là 82,6%, kết quá

xảy thấp hơn nghiên cửu của Van Oers và công str (85,1%) [120], nhưng lại cao hơn xrghiên cứu của Lê Thanh Tú (71%) {12J

1.2 KHÁNG NGUYÊN CD20

1.2.1 Câu trúc gen va protein CD20

Một số kháng thé don dòng kháng CD20 đã thành công trong điều trị bệnh

ung thư máu dang ung thu lympho không 1lodgkim [25], [35], [43] Tuy nhiên,

chúng ta biết rất ít về mặt sinh học của CD20 vả sự hiểu biết về phân tử này chủ yêu

dua trén cau tric gen va protein

Câu trúc gen CD26

Gen ma héa CD20 gém 8 exon dai 16 kb va đã được tách dòng thành công Trầm 1988 [116] Gen này nằm ở nhiễm sắc thể số 11 trên nhánh đài vùng qJ12-g13.1 (11q13-g13.1), nằm gần sát các gen mã hóa chuỗi FceRIB và các protein HTm4

Dựa trên sự biểu hiện của tế bảo, cầu trúc geu D20 ở người, chuột và thổ khá

giống nhau Tuy nhiền, theo Luang va Tedder da xác định một số thành viên họ mới,

znô tả nhóm lớn hơn như họ gen M544Ab gỏm 21 protein khác biệt giữa người vả

chuột |81 |

Gen CD20 khéng cỏ hộp IA'LA cổ điển và thay vào đỏ lá sự xuất hiện một

số vị trí mở dau khác nhau Do vậy, quá trinh phiên ma bat dau ở một số điểm kháo nhau ở exon 1 và 2 dẫn đến sự khác nhau vẻ chiều dài phân tử mÄNA từ 2,6 dén 3,4

11

kb Mac dủ có sự khác nhau về chiêu dải của mRNA nhưng vùng dịch mã được bắt

đầu từ ở exon 3, do đó tạo nên protein có câu trúc đơn giản

Cấu trúc protein CD20

Khang nguyên CD20 co ban chat la phosphoprotein gồm 297 amino acid với

khỏi lượng phân tử 33-36 kDa Tiên đoán từ trình tự eDNA và dữ liệu thực nghiêm

[35] [48] cho thấy protein nảy đặc trưng bởi 4 vùng xuyên mảng, 2 đầu tận củng

NH; và COOH' đều nhúng trong tương bảo, cỏ 2 vỏng khong glycosyl hoa nằm ở

ngoại bảo: 1 vỏng nhỏ 13 amino acid (từ aa thứ 72 đến 80), vòng lớn 41 amino acid

(từ aa thứ 142 đến 182) (Hinh 1.2) Cả 2 vòng nằm ở ngoại bảo đêu chứa các câu

trúc quyết định các loại kháng thê đặc hiệu kháng nguyên CD20 hiện có, bao gồm

Rituximab (kháng thẻ đơn đỏng (mAb) kháng CD20 được FDA phê chuẩn dùng

trong điều trị bệnh u lympho không Hogdkin (NHL) đầu tiên Cầu trúc bậc hai vùng,

vỏng ngoại bảo phụ thuộc vào hai amino acid, alanine va proline tại vị trí 170 và

172 tương ứng Đột biên gen mã hỏa các amino acid này làm tất cả các kháng thé mat kha nang gan voi CD20 [41], [44]

Hinh 1.2 CD20 biéu hién trén mang té bao B [28]

1.2.2 Chức năng của CD20 trong cơ thể

Kháng nguyên CD20 biểu hiện ở lympho bao B tir giai doan sém (pre-B) toi

giai đoạn muộn (late B), sự biểu hiện được cho là ngừng lại khi tế bảo B biệt hóa

thành tương bào (plasma cell) (Hinh 1.3) [27]

12

lủy xương

Hệ thống bạch huyết

Tổ bào gc Tebdogde Tiền TảbàoB TỉbảoBdá Twong bio

đa nâng, bach huyer — tê bàoB hoạthỏa — (plasmacell)

1 Biểu hiện kháng nguyen CD20

Hình 1.3 Tiền trình biểu hiên của CD20 [53]

Hiện nay, chức năng của CD20 vần chưa được biết đây đủ nhưng nhiều nghiên

cứu đã chỉ ra rằng, với câu trúc đặc biệt gồm 4 vùng xoắn xuyên mảng và vùng

nhúng trong tương bảo có thể bị phosphoryl hóa, CD20 đóng vai trò như một kênh

vận chuyển xuyên mảng hay một kênh ion Sau khi gắn với các phân tử (kháng the)

có khả năng nhận biết và gắn đặc hiệu với nó sẽ gây ra

- Su dich chuyên vị trí của các CD20 vào “mảng” lipid giảu sphingolipid và

cholesterol trên mảng tế bảo (Hình 1.4)

~_ Hỏa các “mảng” lipid ở cạnh nhau nảy thành những mảng lớn hơn Chính sự

tập trung CD20 và tạo thành các mảng lipid lớn làm tăng nông độ tại chỗ của CD20, tạo điều kiện thuận lợi cho sự oligomerie hóa cũng như sự hoạt

động như một kênh vận chuyẻn ion CaŸ" của các kháng nguyên CD20

- Hoạt hóa các protein kimase, phosphoryl hóa CD20, làm ồn định “kênh”

CD20 ở trạng thái hoạt động

Hình 1.4 Sự chuyển vị trí của CD20 vao “mang” lipid sau khi gan khang thé [28]

Chính những thay đối này làm thay đổi các tín hiệu trong tế bảo, tăng

mông độ C”' nội bào, đẫn đến ức chế chư trình lé bảo, ức chế lăng sĩnh và biệt hóa

lympho B và cuối cùng là dẫn dẫn sự chết theo chương trình của tế bảo (apoptosis)

[28], [41]

CD20 cé vai trỏ như kénh calei

Câu trúc của CD20 dân đền giả thuyết CD20 có thể hình thành một kênh trên

nàng tế bảo và đóng vai trò điều chỉnh dong chay ion Giả thuyết này được đưa ra

bởi thực tế CD20 có cấu trúc rất tương, đẳng với FccRIB mà FccRIB liên quan đến

độ dẫn truyền calci [28] T3ubien và công sự [26] đã chủng minh sự vận chuyến của

CD20 vao cae dong (é bao CD20 4m tinh din đến tầng nông độ calci trong tương bảo Có lẽ hầu hết sự biểu hiện ở các tế bào B, nơi các kháng thé khang CD20 xuất

hiện và gây ra các dong vận chuyển caloi khác nhau phản ứng với kháng thé den

dòng đã sử dụng Tuy nhiêu, tác giả khác lại chứng mình: Gắn ŒD20 với kháng thể

đơn dòng, có các tác dộng khác nhau lên chu kì sinh trưởng tế bảo (có thể kim hãm

hoặc kích thích sự tăng trưởng của CD20) [116] Vi vậy, các tác động về chức năng,

khác nhau của kháng thể đơn đồng kháng CD20 liên quan một phẩn đến sự khác nhau trong vận chuyển calci mả chủng gây ra

1.2.3 Kháng nguyên CD20 — mục tiêu phân tử trong chẩn đoán và điểu trị ung

thu mau va ung thu lympho khéng Hodgkin

CD20 14 mét dich phân tứ có nhiều ưu điểm hon so với các đích phân tử

+khác được lựa chọn trong điều tri ung thu máu

14

-_ D20 biểu hiện với nông độ cao trên bé mặt lympho B khi so sảnh với các mục tiêu phân tử khác (hơn 250 000 phân tử CD20 trên một tế bảo R) Diễu này cho phép tập trung mật độ các phân tử gắn đặc hiện với nó trên bê mặt tế bảo, tăng hiệu quả tiêu ciệt tế bào đích và đặc biệt có ý nghĩa đối với hiệu quá gây độc

phụ thuộc bổ thẻ (CDC) [58]

~ Với cấu trúc có 4 chuỗi xuyên mảng cho phép CD20 bám chắc vào tảng tế

bảo, thậm chí sau khí liên kết với phân tử gắn đặc hiệu, CD20 có thể bám trên mang trong nhiều giờ thậm chí đến nhiều ngày Đây là ưu điểm nếi trội hơn se

với các mnụe tiêu phân tử khác trên Iymipho B (ví dụ so với CD22) |58]

- GD20 khỏ bị dỗng hỏa sau khi gắn với các cấu trúc gắn dặc hiệu, do dò giảm

sự tiêu thụ các cầu trúc nhận biết và gắn đặc hiệu với kháng nguyên CD20 của

cae U6 bau dich [58]

- Hai vong ngoai của C20 là nơi chứa hầu hết các epitope của nó không xa

màng tế bảo nên các phân tử gắn đặc hiệu với nó rất thuận lợi cho hiệu ting gây

độc phụ thuộc bé thé (CDC) [58]

Với những tu điểm nởi trên, CD20 đang là một mục tiêu phân tử quan trọng, trong điều trị ung thư liên quan tới sự tăng sinh các tế bảo lyrapho B ác tính Thực

tế trong diễu trị ung thư máu, thành công trong diễu trị dược ghí nhận cho đến nay

chủ yếu là các cầu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên CD20 Iiiện nay, số lượng các

nghiên cứu về CD20 và câu trúc pắn đặc hiệu kháng nguyên CD20 tăng lên nhanh chong và những “cầu trúc” này cưng được “thiết kế” mới nhằm tăng hiệu quả điển

tri [16]

Tiện may, nhiều bệnh viện trong nước và trên thế giới đã đựa vào sự xuất hiện các chỉ thị phân tử trên bé mat té bao lympho dé chân doán bệnh thông qua phương pháp xét nghiệm hóa mẻ miễn dich, dém tế bảo dòng chảy, CD20 biếu

hiện khoảng 85 — 90% ủ bệnh NHI và bi

biện thấp hơn ở các loại mg the mau khác [52] Theo các nghiên cứu CD20 có thể xuất hiện ở tủy sống, máu ngoại biển 1125], huyết tương [88], và huyết thanh [S7]

Vi vay, dé cé thé chan đoán sớm va don giản khi lẫy mẫu xét nghiệm, ngoài

7a có thể theo đõi sự tiên triển của bệnh trước và sau khi điều trị thì một số nhà khoa

hoc đã nghiên cứu xác định sự có mặt của CD20 trong máu, huyết tương và huyết thanh bệnh nhân Ổ bệnh nhân tung thư tế bảo lympho mạn tính, Manshouri và cộng,

sự đã xác định được CD20 có trang huyết tương với nẵng độ cao (từ 52,89 đến

15740 nM) [88], Alatrash va cộng sự cũng xác định CD20 trong ruán ngoại biên trung bình là 257 nmol/l |15| 6 bénh nhan ung the lympho khéng Hodgkin va ung, thư lympho Hodgkin, Giles và cộng sự đã xác định sự có mặt của CD20 trong huyết

thanh của một số bệnh nhân này [57] Kết quả nghiêu cửu cho thấy nổng độ CD20 ở

bénh NHL (341 nmol/]) cao hon 6 bénk HD (73 nmol)

CD20 có trong máu, huyết tương hay huyết thanh có thể là kết quả của sự

đứt gãy hay vỡ các LẾ bào Iympho thành các ruảnh mà các ruảnh có CD20 bám trên

đó, các mảnh vỡ nảy có thể di chuyển tự do trong máu [38]

Từ những nghiên cứu trên, trong đê tài này chúng tôi thử nghiệm khang thé

tạo ra đẻ phát hiện CD20 trong huyết thanh bệnh nhàn ung thư lympho không,

Lodgkin

1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng nguyên CD20 tai t hop

Khang nguyén CD là những protein màng biểu hiện chủ yếu trên càc tế bảo

miễn dịch (tế bảo lympho) Một số lượng nhỏ CD được biểu hiện trên các tế bảo nội

mé, hang câu và tế bào gốc Kobler và Milstein đá chứng mính mô hình của kháng nguyên CD hỏa tan xuất hiện ương máu tương quan với sự biểu hiện của các bệnh

cụ thể [75] Điều này cho thây các protem CD có thể sử đụng cho việc chân đoán

nhiều loại bệnh khác nhau Số lượng chỉ thì phân tử CD được phát hiện đá tầng,

dáng kể, năm 2002 có hơn 250 CD [83] dén nim 2010 có hơn 350 CD [30] Hiện

nay có hơn 300 kháng nguyên CD đã được sản xuất và thương mại hóa (một số công ty cung cấp như Sino Biologycal, ACRO Bịos

stems, NovaicinBio)

CD20 la một trong số chỉ thị phân tử dich tiêm năng trong chân đoán, diều trị

‘bénh ung thư máu và một số bệnh tự miễn địch Từ năm 1988, có một vài nghiên sứu biểu liên kháng nguyên CD20 tải tổ hợp với gác truc dịch khác nhau |46]

16

Phan tit CD20 có chiêu đái dây đú dã dược tách dong và biểu hiện, tuy nhién khang nguyên này tôn tại ở đạng thể vùi và bị lỗi khi cuồn xoắn thành phân tử protein có

hoạt tính [48] Các nghiên cứu khác như, phân tử CD20 có chiều dài đây đủ gắn vào

vector biểu hiện sau đó biến nạp vào tế bảo động vật và biểu hiện trên bề mặt tế bảo

nay đề nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của CD20 [26] Vũng ngoại bảo cửa

phân Lữ CD20 được biểu biên trên hé mal phage M13K07 va phage (ai 65 hop được

sử dụng để gây miễn địch ở động vật |130| Ngoài ra, gen mã hóa cho vùng ngoại

bao cla CD20 gan van vector biểu hiện pET32a(:) và biểu biện ở E.coli Khang

mị, có thể sử dụng trong phân ứng

HLISA, Western blot, sang, loc, tinh sach và gây miễn địch [17]

nguyên thu được có hoại tính, ở dang héa tan v

Hầu như các kháng thé đặc hiệu kháng nguyên CD20 được ứng dung trong chan đoán và điều trị bệnh hiện may đều kháng lại vùng ngoại bảo của CD20 |117|

Vi vậy, trong nghiên cửu này chúng tôi tách dòng vả biểu hiện đoạn gen mã hóa cho vũng ngoại bào của CD20

1.3 KHANG THE BON DONG (mAb), KHANG THE SCFV VA KHANG THE

PHAGUL-SCPV

1.3.1 Kháng thể

Khang thể là các protem được hệ rniễn dịch sản sinh dể nhận biết và liên kết

đặc hiệu với các kháng nguyên, qua đỏ thủe đây hệ miễn địch phân giải các kháng,

nguyên [7]

Cc:

duing thé ¢6 cau tạo hình chữ Y, có hai bộ “cảnh” gắn vào một “thân”

Các đâu của Y (Fab) được gọi là các vừng biến đổi còn thân (To) là một vng cổ

định Kháng thể gồm 4 chuỗi polypeplide, 2 chuỗi năng và 2 chuỗi nhẹ Mỗi chuối

có 2 vùng, vùng V (variable) bién déi va ving C (constant) cd dinh

Ở chuỗi nhẹ, vũng biển đối và cô định lần lượt là Vị, C¡ Chuẫi năng có 2

vũng Vụ, Cụ (Cgl, Cự2, Cg3) Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nếi với nhau bởi 1

cầu disulfide, 2 chuối nặng dược nổi với nhau bởi 2 cầu disulfide Kiểu của clruỗi

xăng quyết định kiểu lớp của Ig (IgA, IgD, IpG, IgM va IạE) [3], [107].

Sự kết hợp giữa Vị và Vụ tạo nên vị trí nhận biết và gắn đặc hiệu với khang

nguyên (paratope) Các vủng siêu biển đổi hoặc vủng quyết định bổ trợ (CDR: CDRI, CDR2, CDR3) được xác định trong vùng biến đổi, cỏ vai trỏ quan trọng

nhất đến việc gắn kháng nguyên của kháng thẻ Ngược lại, các vủng cô định không,

cỏ vai trỏ nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ câu nói với tế bảo miễn

dịch cũng như các bỏ thể

Trong chuỗi nặng, giáp ranh giữa Cụl và Cy2 goi la ving bản lẻ (hinge) Vùng bản lẻ cỏ đặc tỉnh linh động giúp 2 cánh tay của kháng thẻ di động được, nhờ

đó mà nó có thể đồng thời kết hợp dé dàng với các epitope ở xa nhau Vùng bản lẻ

còn là nơi dễ bị tác động bởi các enzyme như papain, pepsin Khi xử lí IgG với

papam thu được 3 mảnh: 2 mảnh Fab (Frangment antigen - binding) va 1 manh Fe

(Frangment crystalizable) [107] Câu trúc phân tử của một kháng thể hoàn chỉnh

được mình họa trong Hình 1.5

Khiinl yoann née hông nhyên

Hình 1.5 Sơ đỏ câu tao của kháng thể [93]

Kháng thể cỏ các chức năng như liên kết với kháng nguyên; hoạt hỏa bỏ thẻ

tiêu điệt các vi khuân xâm hại (bằng cách: đục các lỗ thủng trên vi khuẩn, tạo điều

kiên cho hiện tượng thực bảo, thanh lọc các phức hợp miễn dịch và phỏng thích các phân tử hóa hướng động; hoạt hóa các tế bảo miễn dịch và các chức năng phụ khác

(Vùng CHI có thể cổ định cấu phần C4 của bỏ thẻ và có thẻ được nhận biết bởi một

số yêu tổ: Liên kết với protein 4 của tụ cầu trùng, phân hy và di chuyển qua nhau thai ) [3]

1.3.2 Khang thể don déng (mAb)

Lympho B là tế bảo chịu trách nhiệm sinh kháng thể Quá trình biệt hỏa

lympho B bat đầu khi các gen mã hóa cho các globulin miễn dịch sắp xếp thành các

chuỗi và mã hóa cho tính đặc hiệu với các kháng nguyên nhất định Khi gặp các

kháng nguyên đặc hiệu, củng với sự kích thích của lympho T hỗ trợ, các dòng lympho B nay tăng sinh và biệt hỏa thành tương bao san xuất ra kháng thẻ đặc hiệu

với kháng nguyên ấy (Hình 1.6) [40] Mỗi té bao lympho B chỉ có thể sản xuất một

loại kháng thẻ đặc hiệu với một epitope khang nguyên nhật định Thông thường một

tế bảo B sản xuất đông thởi nhiều lớp kháng thẻ, chúng khác nhau ở vủng cỏ định của các chuối nặng nhưng gióng nhau ở tỉnh đặc hiệu với một kháng nguyên Đây là

cơ sở cho kháng thể đơn dòng (mAb) ra đời vả có tên gọi như vậy [3]

ng (Gial đoạn Trong mé bach huyét ngoal vi Không phụ Hiuật Năng ng.êM) (Giai đoạn phụ thuộc kháng nguyên)

Tường hào sảng hjẫN cpzorcos7"

gic ba BB tưởng hưởng hoạt a the uwng bao Se

ois 'C020

BAFE-R

Hình 1.6 Sự biệt hóa và sinh kháng thể của lympho B [40]

Kháng thể đơn dòng là thuật ngữ chỉ các kháng thẻ đồng nhất nhận được từ

một đỏng tế bảo B vả có một vị trí kết hợp kháng nguyên (epitope) y hệt nhau,

nghĩa la khang the don dong là tập hợp các kháng thẻ giéng nhau củng nhận biết và

19

gắn kết với một loại epitope Ngược lại, các kháng thẻ đa dòng là tập hop Hnhieu

loại kháng thể không giồng nhau và nhận biết các epitope khác nhau [3], [111]

Các kháng thẻ đơn dòng có thể được tổng hợp theo các phương pháp sau:

(1) Phương pháp tạo te bao hybridoma ctia Kohler va Milstein khi dung hợp các tế

bảo myeloma với các tế bảo sản xuất kháng thẻ tách từ chuột đã gây miễn dịch [75] (2) Phương pháp DNA tái tỏ hợp [98]

(3) Phuong pháp tạo các kháng thẻ phage của Clackson, 1991 [34], nghĩa lả tạo thư

viện các vùng biển đổi của kháng thẻ vả bộc lô chúng trên bẻ mặt phage

1.3.3 Khang thé don chudi (khang thé scFv)

Khang thể đơn chudi hay kháng thé scFv 1a kháng thể có kích thước nhỏ

nhất, là protein dung hợp các vùng biến đổi của chuối nặng (Vạ) và chuối nhẹ (Vị)

của các globulin miễn địch, được nối với nhau bằng một đoạn nói (linker peptit) ngắn khoảng 15 amino aeid có trình tự (Gly4Ser)3 Doan nối nảy thường giảu

Glyeime đề tạo tính linh hoạt, cũng như giau serine can cho khả năng hòa tan và có

thể kết nổi vùng dau N của Vụ với vùng đầu C của Vụ hay ngược lại, [124], [63]

Đoạn nồi cho phép vùng biến đổi của chuỗi nặng (Vụ) kết hop với vùng biến đổi

của chuối nhẹ (V¡) tạo thành phân tử đơn chudi (scFv) ScFv được biểu hiện như

một chuỗi polypeptide đơn và được mã hỏa bởi một gen [23] Và scFv van bao tén hoạt tỉnh nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

Ứng dụng trong chân đoán, seFv cỏ thẻ được sử dụng đề xác định các loại tế bảo khác nhau trong huyết thanh hay đêm các tế bào đó [131]

Dé ting hiệu quả trong điều trị, từ seFv các nhà khoa học có thẻ tạo ra các

loại “mảnh” kháng thể khác như: Fab, diabody, minibody (2 scFv-Cụ3 của người),

seFv-Fc, (Hình 1.8) [99] Trong đó, seEv-Fc là dạng cỏ cầu trúc gân với cầu trúc

của phân tử mAb hoản chỉnh nhất, nỏ giữ được phần Fe cỏ nguồn góc từ người Vì

vậy, khi sử dụng trong điều trị, seFv hiệu quả trong việc gây phản ứng miễn dich

khi cần tới sự có mặt của Fe (như gây độc tế bảo phụ thuộc khang the - ADCC,

Hình 1.8 Một số câu trúc gắn đặc hiệu kháng nguyên [99]

Để thay thể sử dụng các phân tử mAb truyền thống, các mảnh kháng thẻ cần

đảm bảo 4 đặc điểm sau:

(1) Có ái lực cao vả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích

(2) Đảm bảo độ bên với thời gian cân thiết ở nhiệt độ cơ thể cũng như trong,

quá trình bảo quản

(3) Phủ hợp sản xuất ở quy mô lớn đề đâm bảo số lượng cần thiết cho điều trị

(4) Không kích thích sinh miễn dịch ở người sử dụng

Hiện nay, seFv là kháng thể phổ biển nhất của kháng thể tái tổ hợp, so với kháng, thể mAb thi các seFv đã có nhiều ưu điểm như

(1) Được tao ra kha dé dang với một lượng lớn và chỉ phi thấp

(2) seFv có thé được tạo ra tử thư viên gen người [61]

21

(3) Tôi ưu câu trủc soFv mà không mất khá năng liên kết với kháng nguyên

và các bề thể, hạn chế tối đa hiện tượng TAMA

(4) Kích thước nhô của scFv thuận lợi khi thâm nhập vào các mê đích và tiên diệt các mồ này [74]

(5) Kháng thể seFv có thé dé dang dung hop với protein đanh đấu khác như

euzyrn hoặc protein gan huỳnh quang tao thành các chất sẩn sảng cho các phân lích xuiển dịch |91], [104] Tuy nhiên, các phân tử seFv thể hiện ải lực thấp hơn các phan tử kháng thé don déng gốc [86], diéu nay đã làm hạn chê tới việc ứng dung

cae soFv trong các phớp thử miễn địch

1.3.4 Khang thé phage-scl'y

Khang thế phage-seFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh khang thể ở một dầu của nó, hiện nay thục khuẩn thể được dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13 Kháng thể phage-sck'v được tạo ra nhờ công nghé phage display

-_ Câu trúc của thực khudn thé ME3:

Hig gen cia phage có hình sợi, nhỏ, chứa khoảng hơn 10 gen phân bộ sát nlxeu

và một vùng không mã hóa, chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bán vả đóng gói của

phage Kháo với cáo virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phago hình sợi được tổng hợp và

bai tiết khỏi tế bào vị khuẩn chu ma khéng Jam tan té bio cli Cac phage fl, M13, fd

đã được sử dụng để biêu hiện các chuỗi polypeptide Hệ gen của các phage hinh sợi

có sự tương đẳng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chủng có thê thay thê

cho nhau vỉ vậy mà các phagc này được gọi chung là phagc Fd M13 kiểu đại có đường kính khoảng 65A”, dài 9300A° Trong cấu trúc virien của M13 chứa bộ gen TDNA mạch đơn có độ lớn 6407 bp [72] bao gói trong 2700 bản sao protein võ chính

pVIH Mỗi dâu của phage được bao phủ bồi hai protein vỏ phụ: một dầu gồm 5 ban

sao của pVI và p[X, đầu kia chứa 5 bản sao của pHI và PVI Ngoài các protein vỏ, 'MI3 còn tạo ra 6 protein khúc là pH, pX, pV, pl, pIV, gÄI Chiến đãi của viion phụ

thuộc vào chiều đài của bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại Tiểu đặc biệt là bộ gen có thể gắn thêm đoạn DNA lớn, kích thước bộ gen có thể lên dén gần 12.000 bp ma van không phá vỡ quá trình bao gói của thế hoang đại |127]

-_ Câu trúc của kháng thể phage-soFY:

Cáo gen mã hoá cho các mảnh kháng thể liên kết seFv có thể được đung hợp

với hệ gen của M13 hoặc vái gen mã hỏa pIII kiểu đại Tuy nhiên, việc gắn các gen

khang thể vào hệ gen của phage gặp một số bất lợi như:

Thứ nhất là hiệu quả biển nạp của hệ gen phage thấp hơn nhiều so với phagemid, do dé lam can rô việc xây dựng các thư viện kháng thể phức tap

Thứ hai, việc nhân bản và biểu hiện kháng thể gắn với việc nhân bản và biểu hiện của hệ gen, điều này dẫn tới việc chọn lọc rất khó khăn Khi sử đụng hệ gen phage dé chèn đoạn gen kháng thể thì tất cả các bản sao của pIIT đều dung hợp với các mảnh kháng thể, Điều này là một lợi thể cho việc chọn lọc kháng thể có khả năng, liên kết với kháng nguyên Kết quả, các phagemid duoc sit dung rong rai trong việc bộc lộ các khang thé phage

Khang thể phage-scFv về cơ bán là giống với M13 kiểu dại, nhưng chúng có mét sé đáo điểm kháo biết như

-_ Vẻ câu trúc protein, kháng, thể phage-scFy mang day di cae protein cau tric giống như M13, riêng protein pUI được dung hợp với phân tử kháng thể (Hình 1.9) [112], nh vậy một đầu của kháng thế phage-scEv sẽ đảm nhiệm chức năng liên kết với kháng nguyên

-_ Về hệ gen, kháng thể phage-scFv chỉ mang trong mình một phagemid chứa

gen HI dung hợp với gen mã hóa cho khang thé

Dai voi thu vign Griffin 1, cde scFv duge dita vie phagemid pHEN2, phagemid xây chúa tín hiệu nhân bản, promoter, gen kháng kháng sinh và tín hiệu tạo hình thái

phage rigng Điều này cho phép phagemid cé thé boe goi lap rap thanh hat phage hoan chinh [60| Bang cach sir dung các phagemid, việc nhân bản vả tao ra kháng thể độc lập với hệ gen phage Tuy nhiên, để tạo ra các kháng thế phage-seEv hoàn chỉnh phải

cân tới sự có mặt của helper phagc, thường dũng là MỸ3K0?

Khang thé phage-scFv sử dụng lông giới tỉnh F (pilus) dễ nhiễm vào # coli

hờ tương tác giữa pIH với lông giới tính [1 L2] Lệ gen của kháng thể phage-seFv

sau đó dược chuyên vào tẻ bảo chải của lễ bảo vĩ khuẩn, tại đó chứng nhân lên, dưới

23

sự hỗ trợ của helperphage, các protem càn thiết cho quả trình đóng gói được tổng,

hợp, sắp xép lại hình thảnh các kháng thẻ phage-seFv mới, sau đó giải phỏng ra

ngoài môi trường

Các kháng thể phage-seFv có một số ưu điểm so với các kháng the tao ra

bằng kỹ thuật lai tế bảo (hybridoma), cụ thể lả tạo kháng thẻ bằng kỹ thuật lai dung

hợp cân thời gian và các thiết bị chuyên dụng, trong khi đó kỹ thuật bộc lộ trên thực khuẩn thể (phage display) thì các gen kháng thẻ được tách dong trực tiếp từ các tế

bảo lách với các kỹ thuật DNA tái tỏ hợp Việc tạo ra thư viện kháng thể phage-

seFv tử các nguồn gen cỏ thê loại bỏ việc gây miễn dịch động vật thí nghiệm va

nuôi cây một lượng lớn các tế bảo dung hợp vả cho phép tách kháng thể có ái lực

cao khang lai bat ky khang nguyên nào Biểu hiên trên phage co hiệu ích lớn trong

Gon

vv

Hình 1.9 Cấu trúc của phage mang gen mi héa scFv [112]

trường hợp mà các kháng thê đơn đóng không thẻ thu nhận được bằng kỹ thuật lai

dung hợp, chẳng hạn các kháng thê kháng kháng nguyên lả các độc tổ và các chất

không gây đáp ứng miễn dịch

Kỹ thuật kháng thê phage-scFv cũng cỏ thể sử dụng de tach dong vả thu nhận các kháng thẻ đơn dòng từ các thẻ lai không ôn định về mặt di truyền Các gen khang thẻ phage-seFv cỏn là nguyên liệu đề thu cac khang thé tai to hop, tir do

kháng thể tải tổ hợp có thé dược sắn xuất nhanh chong vả kinh tế, dồng thời cũng cỏ thê sử đụng trang y học dé chan đoán và điều trị bệnh

Từ nhímg ưu và nhược điểm của các loại kháng thể khác nhan, trong để tài này chúng tôi sử dụng kì thuật phape-seFv đẻ sảng lọc, thu kháng thể có khả năng,

liên kết với GD20 tốt nhật sau đó sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp đề tạo ra

kháng thế scFv vã scFv-Op2

1.3.5 Ứng dang mAb trong chân doán bệnh ung thu mau

Tử cuối năm 1970, các tế bảo tao máu đã được sử dụng như nguồn kháng nguyên để phát triển các kháng thể đơn đông và nhiều thuốc thử kháng lại các chỉ thị trên bề mặt tế bảo dã dược sử dụng trong chan doan bénh ung thu mau [113]

Hién nay, mAb được sử dụng đề chẵn đoán bệnh ung thư máu theo 3 phương,

pháp chính: (1) chụp ảnh phóng xạ qua kháng thể đơn dòng, (2) xét nghiệm hóa mô

xuiển dịch, (3) xét nghiệm đềm tế bảo dòng chảy

(1) Chụp ảnh phóng xạ qua kháng thể đơn đồng

Tháng thể đơn dòng chỉ phần ứng dặc hiệu với riêng một loại kháng nguyên

nhất định Khi được tiêm vào cơ thể, kháng thể sẽ tim đúng đổi tượng là các kháng, nguyên đặc hiệu nằm trẻn bẻ mặt các t8 bao ung thụ, lượng đẳng vị phóng xạ gắn trên kháng thể dơn đóng sẽ dược do bang may Gamma va nhu vay sé lam hiện hình

khối u với vị trí và kích thước rõ ràng Ngoài ra, kháng thể scTfv có thê gắn thêm

phan cảm biển nano vàng để định hướng trục tiếp và tìm đúng các khối tì có xuất

thiện kháng nguyên đặc hiệu |20}

() Xét nghiệm hóa mô miễn dịch

Hóa mô ruiển địch là phương pháp mã kháng thể được sử dụng để thắm đò các kháng nguyên ở các mẫu bệnh như máu, tủy sóng Đa số phương pháp xét nghiệm này là chân đoán và phân loại ung thư máu, ngoải ra còn được sử đụng để xác định giai đoạn phát triển bệnh, tiên lượng và thăm: đò khả năng điều Irị bệnh

theo liệu pháp miễn địch [47]

Tiện nay có hơn 350 chỉ thị phân tử CD vả nhiều kháng thể đặc hiệu CD được sử dụng trong phân tích chan đoán ung thư máu Ở tế bảo B, giai đoạn tiển

phát triển B chú yếu xuất hiện các CD (CD10, CD19, CD22, CD34, CD79a, b), t8 Đảo T3 trưởng thành (CDL9, CD20, CD22, CD79a, b), tế bào B đã hoạt hóa (CD10, BCT.-6, CD5, CD20, CD23) và trơng bảo (CD19, 38, CD138) Ở tế bảo T, giai đoạn tiên T' chủ yêu xuất hiện (CD1la, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD34, CD99), giai đoạn T trưởng thành (CD2, CD3, CD4, CDS, CD7, CD8, CD43, CD54RO)

Dựa vào sự xuất hiện các chỉ thị CD ở các giai doạn phát triển của tế bảo mmắu mả các nhà sản xuất đã đưa ra các panel chuẩn đế chân đoán bệnh ung thư râu Các panel nảy có thê xác định được đồng lế bản, giai đoạn phát triển của bệnh

và phân loại ung thư máu [47]

(3) Xét nghiệm đêm tế bào dòng chay

Xét nghiêm điểm tế bào dòng chây sử dụng raÁb dễ chân đoán (sàng lọc tế bảo mứu ác tính, phân loại kiểu hình miễn dịch của tế bào máu ác tỉnh), theo dõi

tỉnh hình bệnh đang điều trị và sau khi điều trị ung thu mau Phương pháp này ngày

cảng dược sử dụng rộng dãi và có ưu diễm hơn hẳn phương pháp xót nghiệm hóa

znô miễn địch như đơn giản, tính nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả xét nghiệm

nhanh [95] Ngoài ra, đêm tẻ bảo déng chảy còn được ứng dụng trong nhiều xét nghiệm khác như chân doán trước sinh, di truyền vả phân loại tình trùng cho thy

tỉnh ổng nghiệm Tiện nay, mét s6 hang nhu BD, Exbio da ban kit ding cho xét

nghiém dém té bao déng chay

Nhìn chung, việc chân đoán các lế bảo mg thư mấu dang lympho phổ biển

va dé ding hon ung tht dang leukemia va myeloma [1 13], [115]

Đêm tế bào dòng chây có thể chân đoán được các bệnh u lympho (có nguồn gốc lympho B va T) với số lượng rất nhỏ tế bảo ác tính trong máu, hủy sống và hệ

thân kinh trung ương Bệnh ung thư lympho không Hiedpkin được phát hiện với

lượng rất nhớ tổ bảo lympho l3 ác tính trong dịch tủy sóng (1 tế bảo/3 tủ) hay đụa trên sự khảo sát màu sắc khác nhau cúa các mAb trong xét nghiệm

(Bel3/CD10/CD20/CD38) [95] Banh ung thir té bao lympho man tinh (CLL) 06 thé chan doan dya trên su khdo sat mot sé chi thi CD20, CD22, CD81 va CD5/CD23

26