Luận văn nghiên cứu Định lượng Đồng thời một số chất nhóm methylxanthines trong chè bằng phổ uv vis ir và bước Đầu nhận dạng chè xanh

Một số công trình nghiên cứu xác định các methylxanthines và cáo chất khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC.... Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trinh nghiên et nao định lượng đồn

DAT HOC QUOC GIA HA NỘI TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRAN THI HUE

NGHIEN CUU DINH LUQNG BONG THOI MOT SO CHAT

NIIOM METITYLXANTIIINES TRONG CITE BANG PIIO

UvV-VIS, IR VA BUGC BAU NHAN DANG CHE XANH

LUẬN ÁN TIỀN SĨ HÒA HỌC

Ha Nai - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA IIÀ NỘI 'TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRAN TIT NUE

NGHIEN CUU BINH LUGNG DONG THOI MOT SO CHAT NHOM METHYLXANTHINES TRONG CHE BANG PHO

UV-VIS, IR VA BUGC BAU NHAN DANG CHE XANH

Chuyên ngành: Hỏa phân tích

Mã số: 9440112.05

LUẬN ẤN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học

1.PGS.TS Tạ Thị Thầo

2 PGS.TS Nguyén Van Ri

Hà Nội - 2020

LOICAM DOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cửu của riêng tôi dưới sự hướng

din của PGS.TS Tạ Thị Thảo và PGS TS Nguyễn Văn Rị Các số liên, kết quả nêu trong, luận án là trung thực và chưa từng được công bỗ trong bất kỳ công trinh

trào khác

Tác giả

'Trần Thị Huế

LOI CAM ON

Luận an nay được hoàn thành tại phỏng thí nghiệm Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Dai hoc Khoa học Tự nhiên - Dại học Quốc gia Hà Nội và phỏng thí trghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Với lỏng kinh trọng và sự biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm on PGS 'TS

Tạ Thị Thảo và PGS.TS Nguyễn Văn Bi bộ môn Ióa Phân tích, Khoa Iiéa học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc giá Hà Nội đã giúp đố, tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong qua trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thây giáo, cô giáo trong bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc giá Hà Nội đã

giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hợc tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành câm on Ban Giám hiệu, Ban chứ nhiệm Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho Lôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cửu

Tôi xin chân thành cảm cm sự hỗ trợ kinh plú của để tải mã số ĐH2018-TN04-03

để tôi có thể hoàn thành tết luận an nay

Cuỗi cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bẻ vá đồng nghiệp

đã luôu động viên, giúp đỡ về vật chất và tnh thần để tôi có thể hoàn thành tốt

luận ản này

Tác giá

Trần Thị Huế

Chương 1 TÔNG QUAN

1.1, Giới thiệu chưng về cây chè và sắn phẩm chè Việt Nam 14

1.1.1 Phân loại chè Việt Nam -14 1.1.2 Thành phần hóa học trong chè sl?

1.2 Giới thiệu về nhóm chất methylxanthines seseeeeereu.Ô'

1.4.1 Các phương pháp nhận dang và phân loại đối tượng phân tích

ác địa lụ chè dựa trên đữ liệu hàm lượng chất phân tích

138

1.4.2 Phân loại nguồn

1.4.3 Phân loại nguân gắc dia |ý chè dựa trên phân tích dữ liệu phố kết hạn thống kẽ đa biến

2.1.2 Dung cu va thiét bi

3.3 Phương pháp nghiên cứu - - - - 48

2.3.1 Phương pháp dịnh lượng dồng thời ba chất TH, 1P và CP trong các mẫu chế

AS

3.3.2 Phương pháp phân loại nguần gốc dịa lý của cúc mẫu chè dựa trên đữ liệu

phé UV-Vis, NIR

3.1 Phát triển phương pháp HPLC định lượng đông thời TB, TP, CF rong ché xanh

HH Hee HH urtederiararirriirrrrerrerariroo SỐ 3.1.1.Khảo sát lựa chọn điều kiện tách TB, TP, CF trên hệ HILC

3.1.2 Đường chuẩn xác Ãịnh TB, TP, CF và giới bạn phái hiện của thiết bị 62

3.1.3 Xhảo sát điều kiện chiết TB, TP, CF ra khỏi nên mẫt 64

3.1.4 Xác nhận giả trị sử dụng của phuong phap phan tich TB, TP, CF bang

thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với thuật toán hôi quy đa biển ee FA

3.2.1 Phương pháp hôi quy đa biển huyền tình 74 3.2.2 Phương pháp thêm chuẩn da bién sir ding mi hinh SANAS 8S 3.3 Nghiên cứu dịnh lwong déng thoi TB, TP, CF trong ché bang phé héng ngoai

3.4 Phân loại chẻ theo nguồn gốc địa lý dua trên dữ liệu phổ và các phương pháp

3.4.1 Phân loại và nhận dụng chè theo nguồn giv dia ly bang phd hap thy phân

08

2

3.4.2 Phân loại và nhận dang chè theo nguôn gốc địa lý bằng phd héng ngoại

DANH MỤC CAC CONG TRINH KHOA HOC CUA TAC GIA LIEN QUAN

DANH MUC CAC CHE VIET TAT

1 |ARN Artificial neural network ‘Mang noron nhan tac

6 [DA Discriminant analysis Thân tích phân biệt

8 | LCG Lpicatechin gallate lipicatechin gallate

10 | HGCG Lpigallocatechin gallate Hpigallocatechin gallate

12 | HPLC High performance liquid Sắc ký lóng hiệu năng cao

chromatography

13 |HPLC-DAD | High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography with diode-array | kết nối detector mang diod

detection

14 |HPLC-DAD/ | High performance liquid Sắc ký lòng hiệu năng cao

MS chromatography with diode array _| két ndi detector mang diod

delection coupled with mass vả khối phố

spectrometry

15 [APLC-UV | High-performance liquid Sắp ký lỏng hiệu năng cao

chromatography with ultraviolet kết nối detector quang phd

detection, tử ngoại

16 [IR Infrared spectroscopy Pho hong ngoai

17 |ICP-MS Inductively coupled plasma mass | Quang phé nguén plasma

22 [LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

3 [TAQ Tarmit of quantification Gidi hum định lượng

26 | MLR Multivariate linear regression Hỗi quy đa biến tuyển tính

29 |NIR Near infrared spectroscopy Phé héng ngoai gin

31 | PCA Principal componem analysis "Phân tịch thành phần chính

32 |PCR Principal component regression | Hồi quy thành phànchính

34 [PLS Partial least sqquares Binh phương tối thiểu từng,

phan

35 | ppm Parts per million "Phần triệu

36 |R Coeficient regression Tệ số tương quan

38 | RMSE Roel mean square error Cầm bậc hai sai số loàn

phương trung bình

40 |RSD, Relative standard deviation for Độ lạch chuẩn tương đối lặp

49 |UV-Vis Ultraviolet-visible Vũng tử ngoại - khả kiến

(Chu: thich: 18n hoa chit trong inan an được viết theo tên Tiéng Anh)

ĐANH MỤC CÁC BẰNG

Trang

Bang 1.2 Các tiêu chuẩn hóa lý của châu Âu về sản phẩm chè xanh 20 Bảng 1.3, Công thức cầu tạo, danh pháp IUPAC của các metlrylxanthines 2l Bảng 1.4 Tỉnh chất của một số hợp chát hữu cơ nhóm reihybeathines - 32

Bang 1.5 Một số công trình nghiên cứu xác định các methylxanthines và cáo chất

khác trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC 2225 Bằng 1.6 Một số công trình nghiên cứu xác định đông thời các ‘methyLeanthines va

Bảng 1.7 Một số công trình nghiên cứu phân loại chờ dụa lrên dữ bêu phổ NIR 42

Bang 3.1 Ảnh hưởng của đưng môi pha động đền thông số pic các chất định phân 58

Bang 3.2 Anh Inténg cia ti J than phan pha déng dén théng sé pic cac chit dinh

phân - 60 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ dong d dén thông sé pic cdc chat định phần 62 Bang 3.4, Digu kign tdi wu che phep tach TB, TP, CF bằng phương pháp HPLC 62 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc của điện tich pic vao néng 46 TB, TP, CF - 63 1iảng 3.6, LOD, LOQ của đường chuẩn 113, TP vá CE bằng phương pháp LIPLC 64 Bảng 3.7 Bằng phân tích dữ liệu phổ MS của mnethylxurdhires 68

Đảng 38 Tính thích hợp của hệ thông HPLC đối với TB, TP, CF - 6

Bang 3.9, Kết quả phân tỉch độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với TH, TP, CE bằng

phương pháp HPT.C - - - - 60

Bang 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại trong ngày và khác ngày đổi với TD, TP, CT bằng

Bang 3.11 Gia ti MDL va MOL déi voi TB, TP va CF bằng phương phap IIPLC 71

Đảng 3.12, Hiệu suất thu hỏi của phương pháp phân tích trong các mẫu chẻ 71

Bảng 3.13 Hàm lượng TP, TP và CE trong các mẫu chè xác định bằng phương pháp

Bang 3.14, Harn huong CF, TB, TP trong cic mau ché sit dimg lam mu chudn .77 Bang 3.15, Ham hrong CF, TB TP trong các mẫu che str đụng làm mẫu kiểm tra tì Bảng 3.16 Độ chính xác của mô hình PCR xác định TB, TP, CE rong mẫu kiểm tra theo

Bang 3.17 Dé chinh xac ctia mé hinh PLS xáo định TB, TP, CF trong mẫu kiểm tra

theo phuong phap UV-Vis ccsccsseerssesseessesinenestaiee ¬ 83

Bang 3.18 So sanh d6 chính xác của mé hinh PCR va PLS xac dinh TB, TP, CF trong

mẫu kiếm tra trước và sau khi loại tannin - - 84

láng 3.19 Ma trận nông độ TH, TP, CE được thêm và mẫu chẻ 8Š

‘Bang 3.20 Ham luong TB, TP va OF trong các mẫu chủ xác định bằng phương php UV

Bảng 3.21 Độ chính xác cứa mỏ hình PCR xác dịnh TH trong mẫu chuẩn và mẫu kiếm

Tảng 3.22, Dộ chỉnh xác của mô hình PCE xác định TP trong xnẫu chuẩn và mẫu kiểm

tra theo phương, pháp NIR He nerer „uØ] Bang 3.23 Độ chỉnh xác của mô hình PCR xác định CE trong mnẫu chuẩn và mẫu kiếm

tra theo phương pháp NIR à se Hee re -.92 Bảng 3.24 Độ chính xác gủa mô hình PL8 xác định TR trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm

Bang 3.25 D6 chinh xée ciia mé hinh PLS xde định TP trong mẫu chuẩn và mẫu kiêm

Tảng 3.26 Dộ chính xác của mô hình FLS xác định CF trong mẫu chuân và mẫu kiểm

Bang 3.27, So sanh him luong TB, TP va CF trong cfc iu cha xe din bing pharong

Bang 3.28 Hăm lượng TB, TP và CF trong 75 mẫu chè xác định bằng phương pháp

ố thống kê đữ liệu TB, TP trong các mẫn chế 106

Tiảng 3.30 Kết quả các chỉ số thống kế đữ liệu CT va téng, ba methylxanthines trong các

Bảng 3.31 Số lượng mẫu thuộ vùng địa lý trong mô hình phân loại 107

Bang 3.32, Dé chinh xéc cla mé hinh phan loai nguén géo dia ly che theo phurong phip

Bang 3.33 Độ định xác của mô hình phân lại nguễn gốc địa lý chế theo phương pháp

Bảng 3.34 Độ chính xác của mô hình din loại nguồn gốc địa ly cht theo phưng phap

Bang, 3.35, 96 chinh xe ela mé hinh phan loai nguén gée dia yet chè theo phương pháp

DANH MỤC CÁC HÌXH

Trang Tình 1.1 Hình ảnh thân cây, lá và hoa chè - 14

Hình 1.3 Mõ hình xứ lý số liệu của phương, pháp ANN " Hinh 3.1 Phd UV-Vis cia TR, TP, CF - - 56

Tlinh 3.2, Anh huéng dung méi pha động trong phép định lượng đồng thời TB, TP,

Himh 3 11 Sac ky dé mẫu chẻ (a) - LD35, (b) - TN9, (e)- CTK10 - 73

Hình 3.12 Phố LIV-Vis của 125 mẫu trong vúng phé 190-700nm (a), va ving 240-

310 nn (b) - 74 Tinh 3.13 Phd LUV-Vis của đụng dịch chuẩn mẫu chè và mẫu chè thêm chuẩn 75

Tỉnh 3.14 So đồ tìm ma tran tr sda) và ma trận trọng, số b) 78

Tĩnh 3.15 Phương sai tích lũy của mô hình biểu diễn theo số PC trong phương pháp

DO ceeeeeeiroeu 7Ð Hình 3.16 Biển diễn cách tim ma trận trực giao trong PLS 81 linh 3.17: Phương sai tích lũy của mô hủnh biểu diễn theo số PC trong phương pháp

UV-Vis PLS - 82

Hinh 3.18 Đường thêm chuẩn xác định nông độ is CF, TB(b) TP(c) trong mau che

xanh Thái Nguyên

Hinh 3.19 Đường thêm chu

xanh IIà Giang

Hình 3.20 Phổ hồng ngoại hân xa ofa cdc mẫu ch Seseeeeeoeuu.8

Hinh 3.21 Phd héng ngoai phan xa eda cdc mu ché sau tién xử lý bằng MC (c) và SNV

xác định bằng IIPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiêm tra 24

Hình 3.25 Phương sai tích lũy của mô hình biểu điển theo số PC trong phương pháp

Linh 3.26 Độ chính xác cúa mô hình PLS xác định 113, TP, Cử trong mẫu kiêm tra bằng

Hình 3.27 Tương quan ham hong TB, TP va CE tim được từ mỏ hình FLS với hàm

lượng xác định bằng HPLC trong mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra LÚI

Hinh 3.28 Biểu đồ biểu điền độ lập trung và phân tán hàm lượng TP, TP, CF Hơng các

THmli 3.29 Phương sai tích lũy của mô tình biểu điển theo số PƠ trong ng phương ghioU-

Hình 3.30 Kế quá kim ba mô Lành POAD -DA/UV-V với 25 mẫu kiểm tra L1Ô Hình 3.31 Mê bình ANN trên cơ số dữ liệu phế UV-Vis - - 112

linh 3.32 Số mẫu nhận dang và độ chính của mỗ hình phân loại theo ANN trên cơ

THnh 3.33 Số mẫu nhận dang và độ chính xác của mô hình phân loại theo AKN trên

cơ sở dữ liệu phổ UV-Vis của mẫu kiểm tra « 114

Hinh 3.34 Phuong sai lich Kiy cia 1d hinh biéu điển theo số PC trong nướng pháp

Hinh 3.35 Két qua kiém tra mô bình PCA-D.A/NHR với 25 mẫu kiểm tra L16 Hình 3.36 Kết quá kiếm tra mỏ hình PLS-DA/NTR với 25 mẫu kiểm tra 118 inh 3.37 Dộ chính xác cửa mồ hình PLS-DA trên cơ sở dữ liệu ghép phổ LV-Vis

Hình 3.38 Độ chính xác của mô hình phân loại theo PCA-AKN trên cơ sở đữ liệu

hép phổ của mẫu chuẩn (a) vả mẫu thử (b) ca E20)

MGPAU

Ché (Camellia sinensis) từ lâu đã là một đỗ uống quen thuộc của con người và

được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thê giới, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Ban,

Việt Nam Nghiên cửu vẻ thành phân hĩa học cho thấy lá chẻ chứa khoảng 2000 hợp chat hoa hoe, Irong đĩ các polyphenols chiém khoảng 25-30%, cafTeine chiếm khoảng

2.5%, theobromine va theophylline chiém khộng 0,2-0,5% lượng chất khơ [4, 99] Trong 14 ché, caffeine, theobromine va theophyline thuộc nhĩm methybranthines

được quan tâm đặc biệt vị cĩ nhiều hoạt tính sinh học cĩ giả trị nhu: caffeie 06 tac dụng kich thích hệ thần kinh trung ương, tim và hỗ hấp; theobromine và theoplyline

là các chất cĩ tác đụng lâm giãn cơ trơn Thành phân hĩa học đặc biệt là hàm hrong

của các methylxanthines, polyphenol sẽ quyết định đền chất lượng vã giá trị kinh tê

của chẻ thành phẩm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, bền cạnh yếu tế giống, chế độ canh tác, kĩ thuật chế biến .thì diễu kiện khí hậu, thỏ nhưỡng cĩ ảnh hướng rất lớn đến các thành phần hịa học cửa chè |15, 61, 97 Do vây, chè thành phẩm ở các vimg

dia ly khác nhau sẽ cĩ giá trị kinh tế khác nhau Trong những năm gần đây, một số

loại chè đã được đăng ký nhăn hiệu chúng nhận, chí dẫn địa ly như: chè Shan tuyết Mộc Châu, chẻ Tân Cương Thái Nguyễn, chè Lâm Đồng, chẻ Suối Giảng Yên Bái

Tuy nhiên, hiện may vẫn tổn tại nhiều diểm ban chè với thương hiệu nổi Hếng nhưng, khơng cĩ nhấn mắc đứng quy chuẩn Trước thách thức trêu, việc kiếm sối chất lượng,

và truy xuật nguễn gốc sản phẩm đàn trở thành nhu câu tất yên mang, lại những lợi

ích thiết thực cho nhà sán xuất vả người tiêu dừng,

Phương phảp diễn hình để dịnh lượng các methylxanthmes trong chè la phương pháp sắc ký lồng hiệu năng cao (HPI.C) sử đụng detecror UV, khải phổ [48,

65, 84] Tuy nhiên, phương pháp TIPLC cĩ nhược điểm quá trình xử lí mẫu phức tap,

chỉ phí dung mối lớn đo đỏ khơng phù hợp với thực tế sản xuất hưởng đến các phương pháp phân tích nhanh, dịng thời Gần đây, hưởng nghiên cửa nhĩm các phương, pliáp phố như quang phé hap thu phân tử (UV-V) và quang phỏ hỏng ngoại (TR) kết hợp

đái

với các thuật tốn thơng kê đa biển nhằm mục đích định lượng đồng thời c

đang phát triển mạnh mẽ [6, 75, 83, 104] So với các phương pháp phân tích hĩa

học, thi dịnh lượng các chất trong thực phàm bằng phổ UV-Vis vá phổ 1R co uu diém

nổi trội, khơng phải xử lý mẫu, phân tích nhanh, giá thành rẻ,

10

Ở Việt Nam dã có một số công trình nghiên cửu ứng dung phuoug phap IR vùng gần và trưng bình để đựh lượng đồng thời một số hoạt chất trong thuốc viên xién [2, 3] Trong các nghiên cứu trên, việc xây đụng mô hình hồi quy tuyến tính được thực hiện trên các mẫu chuẩn đã biết trước hảm lượng bằng cách trộn các chất chuẩn

và tá dược theo công thủ đã biết Tuy nhiên, không thể tự tạo chính xác mẫu chuẩn

theo cach nay với nền mẫu tự nhiên như mẫu chè Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trinh nghiên et nao định lượng đồng thời các chất nói chung và nhỏm

+nethylxanthines nói riêng trong nên mẫu phúc tạp như thục phẩm đựa trên đữ liệu

phd UV-Vis, IR

Để truy xuất nguồn gốc sân phẩm thì hầu hết các nghiền cửu dễu sứ dụng các

phương pháp thống kế đa biển đựa trên lập số Hiệu về kết quả phân tích các thành

phan héa hoc trang mẫu bằng phương pháp TIPLC, ICP- OES [13, 64, 71, 107] Tay nhiên, để phân loại sản phẩm theo cách mày đòi hỏi cần rất nhiều dữ liệu phân tích

dẫn dến chủ phí và thời gian phân tích lớn So với phương pháp trên, phương pháp

thông kê đa biển dựa trên đữ liệu quang phd ton phan cho lượng thông tin vẻ thành phân hóa học trang mau da dang hon nên kết quả phân loại và nhận dạng hiệu quả

hơn Mặt khác, trên cùng một tập sẻ liệu phé IR, UV-Vis cé thé dat doe cả mục đích

phân loại và dịnh lượng các hoạt chất

Xuất phát từ các lý do nêu trên, để lài luận án Tiến sĩ: “Nghiên cứu định tượng đồng thời một số chất nhém methylxanthines trong chè bang phd UV-Vis,

1 và bước đầu nhận dạng chè xanh” hướng đến mục tiêu

Xây dụng phương pháp định lượng nhanh một số chất nhỏ methylxanthines trong chè và nhận dạng nguồn gốc dịa lý các mẫu chè xanh Việt Nam dựa trên củng,

đữ liệu phổ UV-Vis và TR (sử dựng kĩ thuật do phổ TR phần xe khuếch tán) kết hợp với phân tích đa biến

Dé đạt được mục tiêu trên, luận án cần giải quyết các nội dụng sau:

1 Phát triển phương pháp HELC dễ định lượng dỏng thời các chất nhóm xnofhylxarthines trong các mẫu chè và sử dung ede mau nay lam mau chuẩn dễ xây đựng mô hình hỏi quy đa biến khi phân tích phố UV-Vi và NTR

3 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đổng thời các chất

Tnothybandhines trong chè bằng phổ UV-Vis và NIR kết hợp với hải quy đa biến

3 Nghiên cứu xây dụng phương pháp phân loại có chỉ din {supervised classification) mau che xanh Viét Nam dựa trên cùng dữ liệu phổ UV-Vis và NLR kết

hợp với phân Hch đã biển,

4 Ủng dụng phương pháp xây dụng dược dễ phân tích định lượng các amethylxanthines trong ché va nhận đạng nguồn gốc địa lý các mẫu chè xanh Việt Nam

dang lưu hành trên thị trường dựa dn dt Hida phd UV-Vis va NTR

* Điểm mới về mặt khoa học vả ý nghĩa thực tiễn của luận án

* Diễm mới của luận án

Xây dựng được quy trình xác định đồng thời ba chất nhóm mmethylxarnhines

gềm theobromine, theophylline, caffeine trong mAu ché bằng phé UV-Vis và NIR kết

hợp với hổi quy đa biển (mê hình bình phương tối thiếu từng phần (Partial Least

Square-PT,S), hỗi qui thành phản chính (Partial Component Regression - PCR) Cac xnô hình trên được xây dựng từ đữ liệu hàm lượng ba chất phân tích trong mẫu chè

đã được xác định bằng phương pháp HPLC Quy trình này cho phép phân tích nhanh,

đông thời các chất trong nền mẫu thực mà không cần xử lý mẫu (với phương phán

_NIR) và không cân tách chúng ra khỏi nhau (với phương pháp UV-Vis)

Xây dựng được mỏ tình phân loại nguồn góc địa lý các mẫu chè xanh đã biết

trước trên cơ sở dữ liệu đã dùng, định lượng các methylxarthines trong mẫu ché, bằng

các thuật toàn phân loại có chí dẫn (gồm phân tích thành phan chink phan biét (Principal Component Analysis - Discimimant Analysis —PCA —DA), bink phương tối thiểu Lừng

phân phân biệt (Partial Least Square - Discininant Analysis PLS - DA), mang uoron shin tao (Artificial Neural Networks - ANN)), Từ mô hình xây dựng được cho phép

nhận đạng được các mẫu chẻ xanh Việt Nam

* Ý nghĩa thực tiền của luận ản

Nghiên cứu đã xây đựng và phát triển một số phương pháp định lượng các

xuethybxathines trong mẫu chè xanh Việt Nam gém: HPLC, UV-Vis va NIR Các

phuong phap UV-Vis va NIR có ưu điểm phân tích nhanh, kỹ thuật đơn gián Để tải

ác định nhiên hợp chất

cũng mớ ra hướng nghiên cứu sử đụng một cơ sở dữ liệu phố

Tiểu có hộ số lện chuẩn từ phương pháp HPLLC thay vì phải phân tích rất nhiễu mẫu

và nhiều chỉ tiêu

Kết quả dịnh lượng hàm lượng caffcine, theobromine, theophylline trong 50

smu che cho thay hảm lượng của ba methylxanthines trong các mẫu chẻ trên là khác Trhan giữa lĩnh Thái Nguyên so với tỉnh Phú Thọ và Tâm Đồng

Từ dữ liệu phổ UV-Vis, IR của 125 mẫu chè thuộc các tỉnh Thải Nguyên, Phú

Tho, Lam Déng (trong đó có 50 mẫu đã đùng định lượng các methylxanthines) xây

dựng mô hình nhận đang nguồn gốc dịa lý các mẫu chờ xanh

Churmg 1 TONG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây chè vả sản phẩm chè Việt Nam

1.1.1 Phan logi ché Vidt Nam

Chè bay tà có lên khoa hoc Camellia sinensis, la loai cay tit Pong A, Nam

Ả và Đông Nam Á, nhưng ngày nay chè được trồng phổ biến ở các khu vực nhiệt

doi và cận nhiệt dới trên thể giới Chế là loại cây xanh lưu niễn mọc thành bụi hoặc các

cây nhỏ, thông thường được cắt tía để thấp hơn 2 mé¿ khi được trồng để lấy la Do dic

điểm sinh trưởng, chiều cao, thân cây chẻ có ba đạng chính là thân gã (1), thân bán gỗ (2) và thân bụi (3) (hình 1.1)

Hình 1.1, Hình ảnh thân cây, lẻ và hoa chè [4]

Cây chè thường được trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có lượng

rnưa tối thiểu là l2? em mỗi năm Cây chè sinh trưởng va phát triển tắt trong điển

kiện nhiệt độ 15-23°C, độ cao so với mực nước biến trên 1000 mét Tùy theo giống, chẻ, điều kiện khi hậu, thể nhưỡng, kĩ thuật chăm bón, canh tác, chế biển thì thành phan hoa học và giá trị kinh tế của chờ sẽ khác nhau do đỏ có thể có các cách thức

phân loại chè khác nhau [4]

1.1.1.1 Phân loại theo nguôn gốc thực vật

Theo phân loại của nhà phân loại thực vật Hà Lan Cohen Stuart (1918) và nhà xông học Pháp Du Pasquier (1923), giống chè có ở Việt Kam chia thành 4 loại:

a Ché Trung Quac la to (Camellia sinensis var Macrophyila)

b Chè Trung Quốo lá nhỏ (Camellia sinensis var Bohea)

c Ché Shan (Camellia sinensis var Shan)

d Che An D6 (Camellia sinensis var Assamica)

liến loại chè trên được trồng ở Việt Nam nhưng phỏ biển nhật là 2 loại chẻ:

Camellia sinesis var Maorophylla và Camellia sinesis var Shan

- Camellia sinensis var Macrophylla được trồng nhiều nhật ở các tĩnh trung,

du với các lên gọi của địa phương (theo mâu sắc lá) nhục trung du lé xanh, trung đu

là vàng, v.v

- Camellisa sinensis var Shan duge tréng ở miễn núi các tính miễn bắc và ở xriển nam Tây Nguyên (Lâm Dẻng) Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như:

Shan Mộc Châu, Shan Tham Vẻ [4]

Ngoài các giống chè lrên, ở Việt Nam hiện may có các giống chè cho năng suấL

cao như A, LDP, Kim Tuyén, TRI777

1.1.1.2 Phân loại theo cách thức chế biển

TDụa vào mức độ lên men, chè được ckua thánh ba loại chính lá chè xanh, chẻ Oolong

và chè đen “Mỗi loại chè có những tính chất cảm quan đạo trưng riêng về màu sắc, mùi

vị Quy trình sẵn xuất chè đượu mô tâ theo sơ đỗ bình 1.2 [14]

Chè tươi nguyên liệu

Hinh 1.2 Quy trinh sén xudt ché

Qua trinh ché bién ché xanh khéng có quá trình lên men vả các enzyme bị tiểu điệt ngay Lử giai đoạn đầu liên bằng cách sây niên hàm lượng trmim trong chè xanh biến đổi không đáng ké so với chè tươi

Trong quá trình chê biển chè đen có sử đụng hoạt tính của enzyme để oxi hóa các hợp chất catechine, Vì thể rong chè den thành phẩm hàm lượng của các hợp chải catechine rất thấp, khoảng 2 - 3 %4 hẻm lượng khỏ Màu đỏ đặc trưng của nước chè đen là đo các sân phẩm oxy hóa như theafTavim và thearubigin gây ra

Chè Oolong là một sân phẩm trung gian giữa chè xanh và chè den, hàm lượng,

catechine chiếm khoảng 10 - 20 % chất khổ, be khoáng 50 % so với chẻ nguyên liệu trấn đầu Trong quá trình chế biển chè Oolong, quả trình lên men được kiểm soát theo sue dịch tạo săn phẩm của người sản xuất, khi quá trình chuyên hỏa catechine trong,

chẻ nguyên liệu dat mite 46 mong muén, enzyme sé bi lan Chẻ den thành phẩm oxy hóa đừng lại [14]

1.1.1.3 Phân loại chè theo ngục Chề Oolong thành phẩm.

Cây chở thường dược trồng ở các vùng có khí hậu ở nễn nhiệt trang bình (20-

23°C) Viét Nam cỏ trồng chẻ chiếm sản lượng lớn nhất là ving ‘frung du mién

xui phía bấ (bao gồm các tĩnh như Thái Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Giang, )

chiếm 73% sản lượng chẻ của cá nước vả vung Lam Déng chiếm hơn 20 % tổng sắn kượng, phân còn lại thuộc các tỉnh khác nim 6 Tây Bắc Bộ và Nam Trung Tộ (như Son

Tra, Tai Châu, Nghệ An, ) Do ảnh hướng của điều kiện khí hậu, kĩ thuật canh tác niên

chẻ ở hai vùng trung, đụ miễn núi phía bắc vả Lâm Đẳng có những lương vị khác biệt rõ

Chất lượng chè thành phẩm được quyết định bởi những thành phẩn hóa học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biên Thành phần hóa học của chẽ biển đổi phức tạp phụ thuộc vào giống, tuổi chẻ, diều kiện thê nhưỡng, kỹ thuật canh tác, kĩ thuật chế biển [7.15] Trong thành phan la chè xành chứa khoảng 25% tannin (hỗn hợp các

ual của chủng), 3-4% caffeine, và bàm lượng các cÍ

Hảng 1.1 Thành phần háa học của lá chè xenh

Thành phần % khối lượng

(tính theo chất khô)

Nhóm các hop chal polyphenols 14 thanh phan được quan tâm nhiều nhật trong

lá chè Các hop chất polyphenols chiếm đa số là các catechine (C, EC, EGCG, BGC, LCG ) trong đó HGCG và HGC chiếm hơn 70% tổng lượng catechine Ngoài ra, trong, thành phần polyphenols của chẻ còn cỏ một số chất khác tỉ l$ thấp như các flavonol

(queroetin, kecmpferol, rulin ), câu dẫn xuất glucoside như myrioetin - 3 - glucoside, kaempferol-3 rhamnodiglucoside các leucoamthocvanin, các hợp chất poliflavonoid sưu theaflavin, thearubigin Các đạng hợp chất rhhư theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ

rất thấp trong búp chẻ và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chẻ giả hơn |99|

ñ Aeliylxandhines

'Methylxanthines là nhóm hợp chất vòng hữm cơ có chứa nirogen trong phân

tử Phân lớn các methylxanthines là những chất không màn, có vị đẳng Trong lá chẻ,

người ta tìm thấy các methylxanthimes chủ yếu là caffeine, theabromine va theophylline Trơng do, caffeine chiếm khoảng 3 - 4% lượng chất khổ; theobromine

18

và theophylline voi ham hong nhé hon rất nhiều sơ véi bam long của caffeme,

cliém khoang 0,2-

5% khéi lueng chal khd Tuy vậy, vai trò của theobroruine và

theophylline trong cay ché quan trong hon so vai caffeine [99, 63]

c Acid hitu ca va vitamin Trong lá chẻ chủa các cxalic acid va malic acid, citric acid, isocitric acid va

succinic acid Ngoai ra, ché cing chia shikimic 14 mdt trong những chất có vai trò quan trọng đối với quá trinh sinh ting hap cac polyphenols Vitamin C (ascorbic acid)

cũng đã được phát hiện trong chè xanh và đen [93]

d Duong va chất xơ

Trong lá chẻ các polysaccharides (saccarose, glucose, fructose, raffinose, stachyose)

chiếm 14- 2 94 lượng chất khô, chal xo (cellulose, hemicellulose, ligrim) chiếm 4-7 9á lượng:

chất khô Chất xơ trong chè xanh giúp chồng táo bón, kích thích nhm động ruột, thúc đây hệ

tiêu hỏa lam việc hiệu quá và khóe mạnh hon

Các chỉ tiêu dánh giá chất lượng chè xanh dựa trên tổng hảm lượng các

xnethylxanlhines, catechine, chất xơ trong chờ được trình bảy trong bang 1.2

[H3]

Bảng 1.2 Các tiêu chuân bóa lý của châu Âu về sẵn phẩm chè xanh

2 | Hàm lượng tro có thể bị hỏa tan trong nước BAS TSO1576

Độ kiềm khi tro tan vào trong nước, (được quy

9 | Tỷ lệhàm lượng CatechinePolyphenals 95

Đổi với chè xanh Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng cũng áp đụng theo tiêu

chuẩn châu Âu và công bố & TCVN 9740:2013

12

Giới thiệu về nhém chat methylxanthines

1.21 Đặc điễm cầu tạo và tính chất

1.2.1.1 Dặc điểm cầu tạo

Xanthine la mét purine co sé duoc tim thay trong hau hét các mô và chất của cơn người và các sinh vật khác Methrylxantlunes là dẫn xuất methyl hỏa của xanthine, chúng là các hợp chất him cơ đị vòng được xây dựng từ các vòng pyrimidinedione và

imidazole Melhylxanthines bao gốm caffeine, theobromine, theophylline, aminophylline, paraxanthine, pentoxifylline, IBMX Các methylxanthinos thường,

duoc ding la chit kich thich nhe, giăn phê quân và điều trị các triệu chứng hen suyén

Trong chỗ, cà phê, ca cao thường chỉ tìm thấy ba methybemhines là cafTeine (1,3,7- trimethylxanthine), theophylline (1,3-dimethylxanthine) va theobromine (3,7-

dimethylxanthine) Công thức câu tạo của các methylxanthines được thế hiện trong

bang 1.3 [63]

Bảng 1.8 Công thức cấu tao, danh phdp IUPAC ciia cde methylxanthines

Hop chat Cong thac | Céng thie cautao Danh phap Tim thay

nhiên Caffeine CsIheNaO; [ =s L37Trmethyl- | Cả phê, chè,

“yến i> 1 II -purine-2,6 | cacao,

tư G11, 71T) -điene

bu Theobromime |CzHgNaO; 43, 7-Dihydro-3,7-_ | Caphé, che,

% purine-2,6-dione;

ctlume-],2- diamine

(5-oxohexyl)-3,7- dihydro-LII-

purine-2,6-dione

(-): không tìm thay trong tự nhiền

1.2.1.3.Tinh chất lý hóa của các metlybxanthines

Các methylxanthines là những chất ở trạng thái rắn dang tinh thể không màu,

không mùi và có vị đống, Chúng có nhiệt độ nông chảy lù 200-350 °C, tam trong made,

đặc biệt là nước nóng, Ở nhiệt dộ thường một lit nước hơà tan 20g caffeine, trong khi

21

xmột lit nước sôi hoà tan 700g caffeme Một số tỉnh chất lý hóa cda caffeine, theobromine, theophylline được thể hiện ở băng 1.4 [63]

Rang 1.4 Tinh chất của mội số hợp chal hitu co nktm methylxanthines

Hop chat | Công thức Khai Khối | Nhiệt độ | Giá | Giá trị

phântử lượng mol | lượng nông | trị | logP

phântử | riêngở | chấy | pKa (g/mol) 25C ec)

(g/em’)

'Theobromine | CzHsN¿O; 180,164 094 | 345350 | 99 | -208 Theophylline [CrlsNiQ: 186164 105 | 270274 | 88 | -017 Caffeine CIIhoNO: 19119 L2I | 235-240 [140 | -913

Cac methylxanthines 1a cdc bazo yéu, trong dé caffeine chi thể hiện tinh bazo,

theobromine va theophylline la cac hop chit lxdng tinh

1.2.2 Tác dụng được lý

Các nghiên cửu trên thẻ giới đã xác định methylxanthines có mặt trong khoảng

160 loài thục vật và phổ biến nhất là cả phô, chè, ca cao [27, 28, 29] Trong thực vật,

anethylxanthines tén tai chu yéu 14 caffeine, theobromine va theophylline Liiện tại,

paraxantine được xác định là không có mặt trong bal ki loa thực vật nào [32] Trong,

ba methyEsanthines (caffeine, theobromine và theophylline), caffeine chiếm khỏi lượng, lớn nhất, theobromine và theophylline chiếm lượng nhô hơn Ví đụ: caffeine ước tính

chiếm 0,1-2,4% trọng lượng khỏ trong cà phê vả 2-5% trong chè, theobromine và thuophylline chỉ chiếm khoảng 0,33 trọng lượng khô trong chế

Methylxanthines có tác dụng kích thích hệ thân kinh trưng ương, làm cho tính

thần mình mẫn Một số nghiên cứu chi ra ring methylxanthines ở hàm lượng trung bình sẽ phản ứng lên hệ thân kinh dẫn đến tăng khả năng tiếp nhận các adenosine cho

tế bào thân kinh Bên cạnh đó, methylxanthines kích thích quá trình tiết ra serotonine

ở vỏ não, góp phần làm tăng sự minh mẫn của bộ óc, làm giảm các cơn đau đầu

Metiylxanthines được sử dụng là chất kích thích cơ năng và tăng cường hoại

động của tìm do đó cơ thể không côn cắm giác mệt mói, tăng cường hiệu suất lâm

2

việc và sự déo dai Tuy nhiên, di với những người có bệnh về tìm mach thi viée tang

hoạt động của cơ tim và tốc độ dẫn truyền máu sẽ lam tăng huyết áp và nguy cơ vũ

động mạch

Ngoài ra, methylxarthines có tác đụng kích thích hoạt động của thận giúp cơ

thể nhanh chỏng dào thải ra ngoài những sản phẩm thừa của quả trình trao đôi chất

Methybranthines làm tăng cường tốc độ máu đên thận, tăng tốc độ lọc của thận và

tang cường sự tiết renin ở thận

Cac methylxanthines làm tăng hiệu quả diệt tế bào tmg thư của các thuốc

chéng ung thu Methylxantines có khả năng ức chế sự tạo liên kết các chất chuyển thóa của các chất gây ung thư đối với chuỗi AND, ức chế sự tăng doxorubicin tir cac

tế bảo u [53]

1.3 Các phương pháp định lượng methylxanthines trong chè

Trơng vòng bốn thập kỉ trở lại dây đã có nhiều phương pháp kỹ thuật khác

nhau được sử dụng để xác định đồng thời cáo methylxanthines trong thực phẩm, đô

trồng và các mẫu sinh học Dề phân tích đẳng thời hảm lượng các chất theobromine, theophylline va caffeine trong mau phân tích chủ yếu phải đừng các kĩ đhiật tách,

định lượng như phương pháp sắc ký lóng hiệu năng cao (HPLC) [16, 19, 25, 72, 84]

Đối với các phương pháp phế như phổ hỏng ngoai (IR), phé hap thu phan of (UV- Vis), muén dinh lượng, các chất theobromine, theophylline và caffeine buộc phái sử

đụng các thuật toán hỏi quy đa biên do sự tương đồng về phố hấp thụ[59, 60, 80,

104]

TNgoài các phương pháp trên, phương pháp pho Raman và phương pháp điện hóa cũng được dùng, để xác định các hợp chất methylxanthines nhưng chí đừng lại ở việc phẩn:

tích định tính hoặc định lượng một trong ba methylxanthines [69, 78, 105, 106]

1.31 Phương pháp sắc kí lắng hiệu năng cao

Phuong pháp HPLC là phương pháp có đô chính xác, độ nhạy cao, giới hạn

phát hiện thập được áp dụng rộng rãi để xác định cáo methylxanthines trong thục

phẩm, đỏ uống

'Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu sử đụng phương pháp HPLC nhằm định lượng các methylxanthines và các hợp chat khác trong thực phẩm, đỗ uống

Trong đó, có những nghiên cứu định lượng ba methyb:anthines trong chè, có nghiên

cứu thực hiện phản tích nhiều thành phản khác nhau Với mục tiêu khác nhau niên

điều kiện xử lý mẫu, điêu kiện phân tích sắc ký áp đụng trong các nghiên cứu cũng,

khảo nhau, Thông thường, đối với các nghiền cửu sử dụng phương pháp HPLC nhằm

định lượng các methylzanthines hấu hết các tác giả sử đụng nước ở các nhiệt độ 80°C,

90°C, 100°C dé chiét methylxanthines ra khỏi nên mẫu [16, 24, 48, 84] Đổi với

nghiên cứu định lượng đồng thời methylxanthines và các hợp chất hữu cơ khác như catechine, amin các tác giả thường đủng các dung méi héu co nhu: acetonitrile, methanol va ethanol [40, 66, 72]

Sau quả trình xứ lý, mẫu phân tích được tiêm vào hệ thống LIPLC với nhiều

chế độ pha động và deleolor khác nhau Theo các nghiên cứu, pha tĩnh được số dựng,

phổ biển nhất là C18 với kích thước cột khác nhau Pha động thưởng lá các dung môi phân cực như HạO, MeOH, ACN hay hẫn hợp của 2 hay 3 đưng môi này theo những

t lệ nhất dịnh Một số loại detector đã dược sử dụng như: detector quang phé hap

thy phan ti (UV-Vis), đetsetor khải phố (MS) Trong đó đetector UIV-Vis được sử

dụng phô biển nhất trong phép xác định cac methylxanthines Cac nghiên cứu xác

định hợp chất methylxanthines và các chất khác Irong thực phẩm bằng phương phap

HPLC duge tổng hop trong bang 1.5

Bảng 1.5 Một số công trình nghiền cửa xác định các methybeanthines và các chất khác trang thực phẩm bằng phương pháp HPLC

La ché - nude

5 | Calleine, theobromine, Chè, 90°C, C18 200 mm * 4,6 | MeOH: acelic acid lô 273 l2

acclic acid Caffeine, theobromine, Dé uéng, | Nude 100°C Zorbax Eclipse

chocola Caffeine, theobromine, - C18 (250mm «4,6 | ACN! IsPOs 0,1%

C18 (250 mm + MeOII- acetic acid

4mm * § pm) %4 pradient theophyllme

(60:1:139, viv)

gradient Caffeine, theobromine, MeOIl, acetic | C1850 mm » 4,6 | MeCII, acetic aoid 0,1%

26

Ở Việt Nam, theo TCVN chưa có quy định về định lượng đồng thời các

methybxanthines trong ché, chỉ có quy định về định lượng caffeine trong chè bằng

phương pháp HPI.C Theo TƠVN 9744:2013 qui định phương pháp HPLLC

định hảm lượng caffeine của chè xanh như sau: caffeine trong mẫu chè xanh được chiết

bang cách cho hải lm với nước có magie oxit Sau khi lọc, hàm lượng caffeine được

định lượng bằng HELC với diễu kiện: detector UV-273rm, cột lách CT8 Partsphore +ích thước L1O mm x 4,6 mm với hệ thẳng IIPLC của hãng Whatman, đung môi pha động methminol:nước (36:70, v/v), tốc độ đồng 1,0 ml/phút

Tác giả Đoàn Thị Bích Ngọc vá công sự đã nghiên cứu sử dụng phương pháp

HPLC detector UV-Vis để định lượng đổng thời hảm lượng theobromine, theophylline va caffeine trong san pham ché 6 4 tinh gém có Phú Thọ, Thái Nguyên,

Lào Cai và Nghệ An Quá trình tách dược thực hiện với cột LiChrosphor 100 RP - 18

(250 mm x 4,6 mơn * 5 Lưn) sử dang pha động (15/85) = (ACN/ nước cất) với tốc độ

0.8ml/phút và bước sóng phát hiện 27Lnm Nghiên cứu đã khảo sát bản loại dung,

méi chiét mau la nude deion, acetonitrile, methanol va ethanol, két qua cho thay nude deion cho hiệu quả chiết là tốt nhất làm hong ba methylxanthines trong các mẫu

chế được xác định cu thé như sau: theobromine nằm trong khoảng 0,14-0,68 %,

theophylline 0,09-0,25% va caffeine 2,54-4,24% Tuy nhiên số lượng mẫu phân tích

còn bạn chế và chỉ tập trưng ở một số vùng miễn bắc Việt Nam [9]

1.32 Phương pháp sắc kỷ lông khỗi phd

1LC-MS/MS là một trong những phương pháp phân tích được sử dụng trong

dinh lượng các chất do có độ chính xác cao Ngoài ra, LU-MS/MS còn cung cấp các thêng tin vẻ đứ liệu phổ khối của các tin hiệu chất phân tích, từ tin hiệu này có thế đánh giá về độ tỉnh khiết píc, có thể dự doán được câu trúc hóa học của tín hiệu chất

phan tích Đã có một số nghiên cửu áp dựng LC-MS/M8 hoặc LC-MB phân tích các

Telhylxatlies trong các mẫu chè, cả phê, huyết Lương [74, 91]

Với dối tượng là đồ uống, nhom táo giả Fouad F Al-Qaim và công sự [74| đã

nghiên cửu xác định nông độ theobromine và caffeine trong cáo mẫu chẻ, cả phê, milo, pepsi bằng phương pháp sắc ký lỏng khỏi phố phân giải cao ((LC-TOF-MS), Quả trình xứ lý mẫu chè dược thực hiện dơn giản: cho 1 gam chè vào 50 ml nude ở

2 Q

95°C-100°C va duy tri nhiệt độ trong 5 phút Quá trình sắc kỷ được tiển hành ở 25%

trên cột Thermo Soientifie C18 với chương trình građient sử đụng đứng mỗi A (đụng, dich ACN-McOH (3:1, v/v) va dung mdi B ( dung dich acid formic 0,194 trong nước)

với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, Phương pháp xây đụng được xác nhận giá trị sử dụng théng qua các đánh giá về độ nhạy, độ tuyến tính, độ chính xác vả độ đúng Các phương trình hồi quy luyễn tỉnh thu được với kết quả R>0,979, Độ chính xác lặp lại

3/2296; độ thu hỏi nằm trong phạm vị từ 94-

trong ngày và giữa cáo ngày với RSD «

110% Phương pháp xây dựng đã được áp dụng để định lượng 09 mẫu chè và 13

mẫu dỗ uống, Kết quả cho thấy, nỏng đệ caffeine trong các mẫu phân tích nằm trong, khoáng 30,4-159,1 mg/l, nông độ theobromine nằm trong khoảng 16,2-255,8 mg/1

Với mục tiêu định lượng, nhôm lác giá |91 | đã xây dựng đuợc phương pháp UHPLC-M8 dễ định lượng nhanh theobromine, theophylline, caffeine trong, chẻ Qua

trình sắc ký được tiến hành với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi pha động ACN-nước (90:10, v/v), tốc độ đồng 0,5 ml/phúi Các phương trình hồi quy tuyến

tính thu được với kết quá R>0,995 Giới hạn phát hiện trong khoảng 0,010-

0,025g/ml Phương pháp xây đựng đã được áp dung để định lượng 30 mẫu chè Kết

qu cho thay, han luong caffeine trong các mẫu phân tich nhé bon 32,6mg/g va ham

luong theobromine nhé hon

72mg/g

1.3 Phương pháp phô hồng ngoại kết hẹp vớt thuật toàn hỗi quy đa biển

1.3.3.1 Nguyên tắc của phương pháp do phố bồng ngoại

* Sự xuất hiển của phố hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phả của cáo phân tử và nhóm phân tử xuất hiện đưới tác

dụng của chùm sáng kích thích có năng lượng phủ hợp (tương tác không đản bồi)

nam trong vùng hỏng ngoại (IR), lam cho các diện tử hóa trị trong các liên kết n và

ø của các nguyên tử trong phân tử bị kích thích, chuyển lên mức năng lượng cao l1 Đẳng thời, khi đó phân tử, các nhóm phân lử, nguyên tử quay và dao động Ba quá trình đó sinh ra phé hap thu hồng ngoại của chất dưới tác dụng của chủm sảng kích

thích.

Phổ hổng ngoại này được chia lam 3 mién nhé: héng ngoai gin (12000- 4000

cm (800-3000nm)), héng ngoai trung, binh (1000 - 200 em (3000- 28000 nm)) va héug ngoai xa (200-10 en! (28000- 40000 m))

* Cio kit thuat do phd cin héng ngoai

Có ba kỹ thuật đo phế cận hồng ngoại: truyền qua, phân xạ toàn phân suy giảm

và phân xạ khuếch tán

Kỹ thuật đo truyền qua đựa trên việc xác định tỷ lệ cường độ của chùm bức xạ trước (Tạ) và sau khi truyền qua mẫu phân tích (D Khi bức xã đi qua mẫu, tỷ lệ này phụ thuộc vào độ hấp thụ riêng của phân tử, nồng dò chất phân tích, quang trình và tuần theo định luật Lambert-l3eer Kỹ thuật đo trưyền qua có ưu điểm là cổ định được

quang rùnh của mẫu đo, do đó cường độ phố sẽ ôn định Tuy nhiên, kỹ thuật đo phân

xạ truyền qua cỏ các nhược diễm như: phải lựa chọn được quang trình và tý lệ chất phân tích thích hợp cho các mẫu đo, phải khảo sát điểt

quy trình phân lích riêng cho từng chất phần tích Ngoài ra, khi do phố hồng ngoại

kiện đo và xây dựng được

bằng kỹ thuật truyền qua công tác chuẩn bị mẫu vả căn chính thiết bị rất phức tạp dẫn đến tên thời gian

Kỹ thuật đo phản xạ suy giãm toàn phần là kỹ tuậi mẫu đo được đặt lên bê

mặt một dụng cụ có cầu tạo từ các tính thể phần xạ toàn phần suy giảm, Khi bức xạ

cận hồng ngoại đi vào lỏng các tỉnh thể sẽ phản xạ nhiều lần qua mẫu đo Sau mỗi

lan phan xạ qua mẫn đo, các búc xa thích hợp sẽ bị hấp thu din và làm suy giâm cường độ bức xạ sau khi ra khói mẫu phân tích So sánh cường độ đầu vào với cường

độ đầu ra sẽ thu được phố hỗng ngoại của mẫu phản tích Kỹ thuật này có ưu điểm

hơn so với kỹ thuật đo tuyển qua là phân tích trực tiếp rrấu đo, ít bị ảnh hướng bồi

các diều kiện trang thiết bị, quang trình Tuy nhiễn, các tình thể phản xạ toàn phin suy giảm thường rất đất đẫn đến giá thành của thiết bi cao

Eÿ thuật do phân xạ khuếch tản là kỹ thuật đo phế trực tiếp và dơn giản nhất trong các kỹ thuật đo phổ IXIR Iức xạ cận hồng ngoại được chiều trục tiếp vào mầu

đo, đeleolor sẽ được bố trí hợp lý để thu được tín liệu khuếch tám Trong kỹ thuật đo phan xa khuéch tin, phé dé được xây dung dựa trên tỷ lệ của cường độ ánh sáng sau khi phân xạ qua mẫu do với cường độ ánh sáng phản xạ qua bê mat nén chuẩn So với

các kỹ thuật đo truyền qua thì kỹ thuật đo phản xạ khuếch tán có nhiều ưu điểm nồi

trội là phép đo không phụ thuộc vào đỏ dày, quang trình của chất phân tích mà chỉ phụ

thuậc vào bản chất và tỷ chất phân tích Irong mẫu |1, 10]

1.3.3.2 Dịnh lượng các chất bằng phô hông ngoại

Thế hẻng ngoại là phố đao động của các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân từ hợp chát hóa học nên việc định lượng các chất phân tỉch dựa trên phổ hẳng ngoại gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt là đối với mẫu thực

Vào cuối thế kỹ 20, sự phát triển của phân tích thống kế đã góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quả trình dinh ượng chất phân tích trong mẫu 5o với phương pháp phân tích truyền thống LIPLC thị định lượng các chất

nỗi trội về đơn giãn Irong quá trình liền xử lý mẫu,

bằng phổ hồng ngoại có tu điểi

lượng mẫu phân tích ít, chỉ phi thấp do dó có thẻ hạn chế dược các sai số trong quả trình chuẩn bị mẫu Phương pháp phổ hông ngoại nhanh chóng được áp đọng để định lượng chất phân lích trong các mẫu thực phẩm, được phẩm, hóa dẫu, đệt may và đặc

tiệt là việc sứ dụng trong phân tích chất lượng của nông sẵn [18, 21, 52, 57, 75, 80, 83]

Trong ngành công nghiệp được phẩm, NIR được ứng dụng rộng rãi để kiếm tra chất lượng dược phẩm Irong vòng hai thập ký trở lại đây đã có rất nhiều nghiên

iệc đỉnh lượng nhanh các hoạt chất kháng sinh như

cứu thành công trong

ccphazoline, aminoglyeosidcs, ccflizoxime, mong thuốc bằng phép đo hồng ngoại

[52, 57, 74, B1, 88] Mẫu thuốc thương mại eỏ chứa hoạt chất và tá dược được đo phổ

hỗng ngoại với chế độ đo phan xa str dung biển đổi Fotrier So sánh kết qua ham lượng các hoại chất được xác định bằng phương pháp đo phổ hông ngoại kết hợp với thuật toán hỏi quy da biển với hàm lượng thực có sai số thấp [2, 86, 89]

Trơng ngành công nghiệp thực phẩm, các tác giả đã nghiên cứu phát triển phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hổi quy da biển nhằm mục đích dnnh lượng, caffeine và một số chất nhỏm catecbine trong hạt đậu tương [18], bảnh mỉ [21] và cả phê [46] Các mẫu phân tích được da phd NIR trong vùng số sống 10.000 - 4000 em”

1, Kết quả sự tương quan giữa hàm lượng chất phản tích xác dịnh bằng phương pháp NIR so với phương pháp đổi chứng 11PLC đạt R 70,85

30

Chẻ được coi như một loại thảo dược sở hữu rất nhiều hoạt tỉnh sinh học cỏ

giá trị Vì vậy, trong vòng hai thập kỉ trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên

cứu định lượng các hợp chất trong chè Các mẫu chẻ thường được đo bằng phổ hỗng ngoại phản xạ trong vừng số sóng 10.000 - 4000 c1, Các thuật toán tiên xử lý số liệu như SNV, MSC, MC cũng đã được ứng dụng để thu được kết quả tết hem Dữ liệu phá hông ngoại kết hợp thuật toán hổi quy đa biến PI.8 dã định lượng thành công các caffeine vả một số chất nhóm polyphenols trong các mẫu chè Tuy nhiên chưa cỏ công

trình nào nghiên cứu định lượng đẳng thời theobromine, theophylline va caffeine trong

chẻ dựa trên dữ liệu phd NIR Mét số công trinh nghiên cứu xác dụnh các hợp chất hữu ich trong chè sử dụng phương pháp phổ NIR kết hợp thuật toàn hỏi quy đa biển được

chỉ ra trong bông 1.6

31

Băng 1.6 Một số công trình nghiên cửa xác dịnh dông thời các methykvanthines và các chất khác trong chè bang phương pháp NIR

x lượng | pháp phân Vùng sốsóng | Phương pháptiển pháp xử

Mẫu mẫu A tích P (em) 1 xử lý số liệu lẻ số lệ lý số ea | TT,

3 | Polyphenol ting, caffeine, | Ché xanh, 145 FT-NIR 4000~1 0000 MSC TTS | 32

amino acids den, oolong

4 | Theaflavin, thearubigin | Chè đến 78 NIR 4000~ 10000 MSC, SNV PLS | 37

acid, GC, EGC, C,

EGCG, EC, GCG, ECG)

polyphenol, amino acids

matc

10 |Aminoactds, caffkine, — | Chè đen theaflavins 95 FT-NIR 4000~10000 SNV, MSC PLS [104

Ở Việt Nam, trước đây phổ NIR thường chỉ được sử dụng để định tỉnh các

chát Trong những nầm gân đây, đã có một số công trinh nghiên cứu sử dung phd IR

kết hợp hỏi quy đa biến với mô hình đường chuẩn đa biến được xây dựng từ bộ mẫu chuẩn rắn tự tạo để định lượng các hoạt chất kháng sinh trong thuốc Tuy nhiên, đổi với các đổi tượng phúc tạp như chẻ, cả phê, ca cao thi việc xây dựng bộ mẫu chấn

tụ tạo là rất khó khăn

Tác giả Doan Thị Huyền đã phát triển thành công phương pháp định lượng đẳng thời một số hoạt chất rong thuốc kháng sinh bằng nhường pháp phd hẳng ngoại kết hep voi phương pháp hỗi quy đa biển Kết quả cho thấy hai thuật toán hỗi quy da biển PCR va PLS đã được sử dụng thành công để xác định đồng thời một sỏ chất kháng sinh trơng cùng nhỏm chất với hệ số lương quan R biểu ti hàm lượng tm được và hàn lượng biết trước trong mẫu chuẩn kiêm tra dạt từ 0,83 đến 0,99 [2, 3]

1.34 Phương pháp quang phố hâp thụ phân từ (UE-ETs) kết hợp với thuật toắn hồi quy đa biển

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử LIV-V¡s dựa trên phép đo độ hap thu

ánh sảng Sau khi chiêu chủm sáng đi qua dung dịch chúa chất phân tích, các phân tử

chát phân tích hập thụ một phân ảnh sáng Độ hấp thụ này phụ thuộc vào bước sống chum sang téi vá tí lệ thuận với nông độ chất trong dung dịch Dựa vào đỏ có thé

định tính và định lượng chất phân tích

Phương pháp quang phố hấp thụ phân tử UV-Vis cd ưu điểm rõ nét so với các phương pháp phân tich sông cụ khác lả thiết bị nhỏ gọn, kinh tẻ dễ trang bị cho các phong thí nghiệm và có thế phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau Tuy nhiền, han

chế của phương pháp là giới hạn phát hiện đạt khoảng 1Ơ#M đối với các chất có hệ

số hập tạ mol phân tử cỡ 10 Phương pháp cũng gặp khỏ khăn khi xác dịnh déng thời nhiêu chất, đặc biệt là trong trường hợp các mẫu thực có nên mẫu phức tạp thì

việc định lượng các chất cảng trở nên khỏ khăn UV-Vis déi héi dung dich dem do

phải cò độ bên cao, it phân Ìy, có thành phần xác định, én định theo thời gian [1, 8, 10] Mặt kháo, cũng giống như phương pháp TR, do sự tương đẳng về ph hip tha của ba chất CF, TB, TP trong chè nên dễ định lượng ba hợp chất này cản phải kết hợp với thuật to¿n hồi quy đa biến

33

Trên thể giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển phương pháp UV- Vis với mục dịch dịnh lượng các methylxanthines trong các nền mẫu phức tạp nÏĩư

chè, cả phẻ |49, 60, 76, 94 Để loại bồ tamim ong nên mầu, các mẫu chè sau khi ñ

trong nước nóng ở 90%C sẽ được loại bỏ tannin bằng cách thêm dung dịch lead aoetafe, lượng lead aeetate dư được loại bó bằng dung dich sodium carbonate Dung dich sau

khi loại tannin sẽ do phd hap thu UV-Vis trong khoang bude sóng 200-400 nm Ma trận dữ liệu phỗ được xử lý bang mo hinh hai quy tuyến tính PLS [59] hoặc mô hình

hếi quy phủ tuyển lính ANN [49] trong dé néng d6 caffeine, theolrornine đã được xác định bằng phương phap HPLC Tuy nhiên, với phương pháp trên các nghiên cửu xới chỉ dùng lại trong việc xác dịnh nông độ caffeine trong các mẫu chè, theobronine

và theophyline với hàm lượng rất nhỏ niên không thể định lượng,

Để khắc phục ânh hưởng của nên mẫn phức tạp, H Bahram và cộng sự đã

nghiên cứu sử đụng phương pháp thêm chuẩn đa biên trên nên mẫu thực để xác định

lượng chất phân tích bằng dữ liệu phổ LV-Vis Các tác giả đã thiết lập một day dung dịch thêm chuẩn trên nên mẫu thực chứa dông thời n chất với ma trận nông dộ của chát phân tích ở các mức khác nhau, đữ liệu dé hap thu quang gìn lại dưới dang ma

trận Trong phương pháp thêm chuẩn đa biển, nẳng độ cửa chất phân tích trong mẫu

chua biết được thay đổi lặp đi lặp lại cho đến khi sự đóng góp của chất phân tích trong ma trận dữ liệu dân tiền tới 0 [76]

Nhìn chúng, phương pháp VPV-Vis có độ chọn lọc và độ nhạy thấp, giới hạn

phát hiện cao Quy trình xử lý mầu khá phức tạp, rước khi đưa vào phân tích đều cần

có quá trình tiên xử lý mẫu như chiết, tách, làm giàu sử đựng đung môi độc hại

1.4 Ứng dụng thống kế da biển trong phân loại nguồn gốc dịa lý ché

1.41 Các phương phúp nhận dạng và phân loại dối trợng phân tích

Thương pháp phân tích thống kê đa biến là tìm mỗi quan hệ giữa các biên

trong tập số liệu Trên cø sở bộ số liệu xây đựng mỏ hình chứa các đữ liệu về

thành phân hóa học của mẫu phân tích, các phương pháp thông kế đa bién sé tim

ra điểm giống nhau và khác nhau giữa các mẫu, từ đó phân loại chủng vào các nhóm khác nhan Với raột mẫu bất kỹ khí sử dụng thông kê đa biến hoàn toàn có

thế nhận đạng xem chứng thuộc nhóm nào trong các nhóm đã được phân loại [11, 12]

34

Thếng kẽ đa biến được chia thành hai nhỏm chính là phương pháp phân loại

không chỉ dẫn (phan tich nhém (cum) (cluster analysis - CA), phan tich thành phân

chinh (principal component analysis - PCA)) va phin loai cé chi din (phan tich bidt thức (4seremimant analysis - DA), phân tích biệt thức sử dung bình phương tối thiểu từng phân (Partial Least Square - Discriminant Analysis-PLS-DA), phân tích biệt thức sử dụng phân tích thành phân chinh (PCA-DA), mang naron nan tao (4rtificial

neuron network - ANN)

1.4.1.1 Phung phap phan loai khong chi din (unsupervised clas

* Phân tích nhóm (cluster analysis - CA)

Phân tích nhóm (CA) là kỹ thuật phân tích đa biến nhằm phân loại số liệu

ification)

thành các nhóm nhố hơn có tính chất giống nhau (còn gọi là ede cum) (cluster)

Hai loại phân tích nhỏm thường được sử dụng là nhóm theo bic (hierarchical clustering) va nhom k- trungbinh (k-mean clustering)

~ Nhóm theo bậc nhằm tìm ra các nhóm trong tập số hiệu bằng cách tạo ra cây

phân nhóm (elusfer ree) Theo phương pháp này, tập số liệu lớn được chia thánh các

tap số liệu nhỏ hơn cho đẻn khi mỗi tập sẻ liệu nhỏ chỉ còn một phân tử Cây phân nhóm gồm nhiều bậc trong đó nhóm ở một mức được nội với với nhóm bên cạch ở mức cao hơn Điều đó cho phép quyết định mức hoặc thang chia nào của nhóm là

phủ hợp hơn Việc chia nhóm là vân đẻ quan trọng thường được đùng trong phân tích nihan dang, phan tích hình ảnh và các đối lượng khác trong Tĩnh vực khoa học và công, nghệ

-Nhóm theo k-trung bình: các phản tử trong tập số liệu được tách vào k nhóm,

cúc phân tử cùng nhôm được kết hợp với nhau và cáo nhôm khác nhụu được lách ra

khỏi nhan

Thương pháp phân tích nhóm có nhược điểm là không giả thiết có phân phối chuẩn giữa các biển Phân tich nhóm giả thiết phép do khoảng cách thích hợp giữa các cặp được lựa chọn Kết quả của phân tích nhóm tuỷ thuộc vào khoảng cách nay được tỉnh thể

nào Vi vậy có thể có những mô hình khác nhau tuỷ (heo cách tình khác

nhau về khoảng cách giữa các cặp biến |11, 12|

35