Luận văn tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin 1 Ở người việt nam

MO DAU Thụ thể neurokinin 1 thude nhém các thụ thẻ xuyên màng liên kết với G protem, Khi thu thé nay tương tác với câu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đơn từ vùng thân kinh

DẠI HỌC QUỐC GIA HẢ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Hỗng Thu

'TÁCH ĐỒNG VÀ Tỉ {KE VECTOR BLEU LIEN GEN MA CUO

THU THE NEUROKININ-1 6 NGUGI VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

1Hả Nội - 2012

DALUOC QUOC GLALA NOL TRUONG DAI HOC KHOA HOC TY NHIEN

Lê Hỗng Thu

'TÁCH ĐỒNG VÀ 'THIẾT KẾ VECTOR BIỂU LES GEN MA CHO

THU THE NEUROKTININ-1 6 NGUOF VIET NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUAN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PG5.TS Võ Thị Thuong Lan

Hả Nàải - 2012

MUC LUC

MỞ ĐẦU

Ch-agi TONG QUAN TAT LIEU

1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein il

1.3 THỤ THÊ HỌ TACHYKINLN VÀ THỤ THẺ NEUROKINIR-1 18 1.3.1 Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin ¬—

1.4ỨNG DỤNG CỦA THỤ THÊ NEUROKINIR-I TRONG BIEL TRI

0 .ố.ố ¬— -

1.5 VECTOR BIEU HIEN GEN MA HOA CHO THY THE

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.5 Hóa chất và thiết bị cnniseeroer ¬

2.3.1 Sơ đỗ nghiên CứA óc nh sen ước -

2.3.2 Các kỹ thuật dùng trong, nghiên cứu 31

2.3.2.3 Phản ứng phiền mã ngược áo nen snseesosoeu.32

2.3.2.3 Phản ủng PCR (Polymerase Chain Reactlon) c 221

2.2.2.4 Tinh sach DNA bing phương pháp théi get - - 33

Chương $3: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TACH DONG GEN MA HOA CHO TRU THE NEUROKININ-1

TU PHOI NGUOI

3.1.2 Khuếch đại đoạn 5'-NKI của đDNA mã hóa cho tụ thế neurelinin-L.37

3.1.3 Khuch đại đoạn 3”-NKI của cDKA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.39

3.1.4 Tach động đoạn 5'-NK1 và 3'-NK1 của cDNA mã hóa cho thụ thể

neurokir-L ¬ ¬" ,

3.1.5 Tách động đoạn cDNA hoàn chính mã cho thụ thể neurokirin-T 44 3.1.6 Giải trinh tu cDNA béan chinh ma héa cho thy thé newrokinin-t 49 3.2 THIRT KE VECTOR BIRU HIEN GEN MA CHO THU THE

KET LUAN

KIÊN NGHỊ

TAI LIEU THAM KHẢO

Hình 5: Sơ đỗ nghiên cứu tách đòng và thiết kế vsctor biểu hiện cDNA ma héa cho thu thd

Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạm 5° và 3'-NKI của gơn mã hóa cho ngurokirineÌ 9

Hình 7: Diện di sản phdm PCR khuéch đại đoạn 5'-NKI của eDNA mã hóa cho thụ thể

Hình f8: Điện đi sản phẩm PCR sing lọc các khuẩn 1se với cặp môi NKI F/ NKI RỊ 34

Hinh I1: Điện di san phim ĐC sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn chèn 3'-NKL 1 tắng cập

Hình 12 Sơ đỗ tách dong doan cDNA hoan chinh mi cho thy thé nevrokinin-2 36

di sin phim PCR khuếch đại đoạn 5'-NK1 bằng cặp mỗi pier RINKI

Hình 18: Điện ci san phim cit ve clor pCDNA3, pEGFP-NI va cNK | véi hai enzyme

MO DAU

Thụ thể neurokinin 1 thude nhém các thụ thẻ xuyên màng liên kết với G protem, Khi thu thé nay tương tác với câu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đơn từ vùng thân kinh ngoại vi vẻ trung ương thần kinh, gây ra trạng thải

lơ âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phần ứng miễn dich của cơ thể,

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chúc năng của thụ thể

netrokinin-1, các hãng được phẩm đã cô gắng tim ra các chất đối vận với thụ the

neurokinin-I nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu thuắc chồng trâm căm, thuốc chẳng nôn cho các bệnh nhan ung thu, Tuy

nhiên, các công trình nghiên cứu vẻ thụ thể này ở người Việt Nam còn rất ít hoặc

chưa được công bố Chính vì vậy, với mục đích phân lap duoc doan cDNA hoàn

chính mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế

‘bao động vật để có thê chủ động được nguồn gen và các hệ thống sảng lọc thuốc lừ

nguồn được liệu Việt Nam, chứng tôi đã tiến hành đề tài “Tach dang và thiết kế

vector biểu hiệu yen mit héa che thụ thể naưoiininl ỡ ngườiViệt Nai", Đề tải

dược thực hiệu tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sink hee; Phong Genomie thude Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghé Enzyme - Protein va Phong Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cửu Khoa học sự sóng,Trường Đại học Khoa học

Tự nhiền, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Chilơng 1 Chương 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU

11 THỤ THẺ LIÊN KÉT VỚIGPROTEIN

1.4.1 G protein

G protem lần dầu tiên dược phát hiện và mô tả bởi Alfred va Martin khi hai ông nghiên cứu tác động của adrenaline đối với tế bảo Với công trình nảy, hai ông

đã giảnh giai Nobel ly sinh — y hoo mim 1994 [4]

G protein một nhóm protein én cé ban chat la enzyme GTPases [46] Dua

vào kich thước người ta chia chủng thành hai họ: GTPases dang monomer kich

thước nhở và G protein dang timer kich thước lớn Œ protein kich thước lớa được

tao thánh từ các tiêu đơn vj alpha (G,), beta (Gg) va gamma (G,) Iai tiéu don vi bela (Gs) va gamma (G,) hinh thanh phite dimer bén viing (Gp); phic này liên kết

với tiểu đơn vị alpha (G„) [29]

G protein dinh vi 6 mặt trong muảng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với Œ protein (GPCRs) phân bố trên bẻ mặt mảng té bảo

1.1.2 Thụ thể Hên kết với G protein

Họ thụ thể liên kết với Œ proleim là những phân tử prolem kích thước nhỏ

(350-500 acid amuine)} [45], được phân thành các phân hợ khác nhau dựa theo độ

tương đẳng về trình tự acid araine, chức năng và khả năng liên kết với các câu tử

Đến nay đã người ta dã phát hiện ra 367 thụ thể liên kết với Ở prơtem ở người,

trong đó có khoãng 150 GPCRs được tim thấy vẫn chưa biết chức năng [52]

Hình 1: Sự đa dạng của các họ thụ thẻ liên kết với G protein (GPCRs) [56]

Họ GPCR được phân chia thành ba lớp chỉnh: lớp A, B và C Lớp A hay con

gọi là lớp Rhodopsin đông đảo nhất vẻ số lượng thụ thẻ trong họ GPCR với 19 phân

lớp (Hình 1) Lớp A cho phép nhận tin hiệu từ các monoamine, purine, opioid,

chemokine, một số hormone có bản chất peptide hoặc glycoprotein, trong đó đặc

biệt là truyền dẫn các tin hiệu cỏ liên quan tới mùi hương Lớp B còn được gọi là

lớp Secretin với 34 phân lớp chủ yếu dẫn truyền tín hiệu liên quan tới các honmone

có ban chat peptide nhu parathyroid, calcitonin, Lớp C còn được gọi là lớp

Glutamate với 8 phân lớp có vai trỏ thu nhận tin hiệu trong quá trình trao đổi dinh

dưỡng của tế bảo [3, 60]

Ve câu trúc, tất cả các thụ thẻ liên kết với G protein đều có đâu amino ở

ngoài màng, 7 chuỗi xoắn xuyên mảng, 3 vòng ở phía ngoài (exoloop), 3 vòng ở

phía trong mảng (cytoloop) va dau carboxyl phan bó trong màng (Hình 2), Hau het

các thụ thẻ nảy đều được gắn thém carbonhydrate vao dau amino va palmityl héa 6

vi tri Cys 6 dau carboxyl Méi chuỗi xuyên mang chita 20-27 acid amine, dau

amino chtra 7-595 acid amine, các vòng xoắn chứa 5-230 acid amine, dau carboxyl

chửa 12-359 acid amine Điều này cho thây câu trúc của GPCR rất đa dạng Người

ta đã tìm ra môi liên hệ yêu giữa chiêu dài của đầu amino với kích thước của cầu tử

gắn tương ứng [S1]

Hình 2: Câu trúc chung của thụ thể xuyên màng 7 lần liên kết với G protein [60]

Vùng xuyên mảng với 7 chuối xoắn alpha tạo nên hình dạng đặc trưng cho

thụ thê GPCR Trong đỏ vùng xuyên mảng 1, 4, 7 chỉ chửa duy nhất một acid amine

ky nước lả asparagine hoặc serine Điều này khiển cho chúng có tính ky nước cao hơn các vùng xuyên màng còn lại Trên câu trúc của các vùng xuyên màng thường

chứa cysteine tham gia vào tạo câu disulft [51]

GPCR đều có chung một cơ chê hoạt động Khi một câu tử mang tín hiệu (hormone, photon, .) liên kết với vùng đặc hiệu trong thụ thẻ trên bẻ mặt tế bảo sẽ lam thay đổi cấu hình của GPCR Sự thay đổi đỏ kích hoạt G protein chuyên từ trang thai “tat” — dang lién ket voi GDP sang trang thai “bat” — liên kết với GTP ở

tiểu đơn vị Gụ Ở trang thái “bật”, phức G„-GTP tách khỏi phức dimer Gp, khi 46

chúng sẽ kích hoạt các enzyme hình thành lên chất truyền tin thứ hai là cAMP hoặc

inositol triphosphate/diacetyl glycerol (IP;/2AG) Diéu nảy phụ thuộc vào loại tiểu

don vi alpha trong, G protein, tir dé tao ra mét dong thac những tín hiệu được truyền

dân, kết quả cuối cùng là làm thay đổi hoạt đồng sinh lý, smh hỏa của tế bảo |29,

đang là đích tách động cho nhiều liệu pháp chữa bệnh Theo ước tính có khoảng,

hơn một nửa số thuốc hiện nay 6 dich tae déng la GPCRs |3, 4|

1⁄2 IQ TACLIYKININ O DONG VAF CO VU

‘Tachykinin 1A một trong những ho neuropeptide lớn nhất được tim thấy trong,

cơ thế của tất cả các loài động vật Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không xương và có xương sống [15, 45]

Trong ho tachykinin, chat P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi

Buler và đaddum khi hai ông nghiên cứu dịch cliết não và ruột ngựa long con

Dịch chiết này có tác dụng kích thích hiệu quả hoạt động của ruột và gảy giảm

tuyết áp ở thỏ [21] Tuy nhiên, rất nhiều thí nghiệm nhằm phân lập vả tỉnh sạch SP

có hoạt tính tir các mẫu ruột nga đã không thành công, Bốn mươi năm sau đó (năm

19701, Chang và Leernan mới tình sạch được SP từ vùng dudi déi của bò [14] và

đến năm 1973, Studer va céng sự đã phân lập, tỉnh sạch SP, đỏng thời giải trình tự

gơne mã hóa cho SP từ ruội ngựa [50] Năm 1983, Kangawa và Kimura di phan lap

được thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với 3P là newokmin A

(NKA) và neurokinin B (NET) từ vùng thân kinh trung ương và ngoại vỉ [31, 33]

Hién nay, tachykinin trong mé động vật có vú đã dược xác định gém cỏ chất P (hay SP), neuokinim A (hay neuromedm L hoặc chất K) vẻ neurokmin 3 (hay

neuromedin K) Riêng NKA được mở rộng thêm 2 dạng lả neuropeptide K và neuropeptide y (Bang 1).

Bảng 1: Trình lự amino avid đầu carboxy của các lachykinin ở động vật có vú [61]

PeptidefN guần Trình tự amino acid đầu C Tải liệu trích dẫn

ở His-Lys-Arg-Lys-Asp-Ser- Kage và công sự, 1988

Ruot tho Phe- Val-Giy-Leu-Met-NH; e cà,

- ‘Asp-Ala-Asp-Ser-Ser-le-Glu-

Neuropeptide Ke Lys-Cin-Val-Ala-Leu-LenLys- | -ratemoto và cộng sụ,

‘Ala- Lew-Tyr-Gly-His-Gly-Gln- toes Tle-Ser-His-Lys-Arg-His-Giy

Quá trình biển đổi sau dịch mã

| “Quả trình biển đổi sau địch mã

Hình 3: Sơ đồ cắt-nôi gen mã hóa cho tachykinin 6 dong vat cd vi [37]

Các gen mã cho tachykmm ở người gồm 7⁄4C7 (hay PPT-4) định vi trên

NST số 7 và 74C3 (hay PP7-B) định vị trên NST số 12 Các gen này tương ứng với

gen Tac! va Tac2 ở chuột Gen 74C7 mã hóa cho SP, NKA, neuropeptide K,

neuropeptide- y [3, 7] Sở dĩ gene nảy mã hóa được cho một loạt sản pham 1a do mRNA tổng hợp từ gen 7⁄4C7 đã trải qua quá trình cắt nổi luân phiên để tổng hợp

các dạng preprotachykinin khác nhau: alpha (a-PPT), beta (B-PPT) va gamma (y-

PPT) [34] Sau quá trình dịch mã, từ các tiên chất protein nảy sẽ tiếp tục được cắt

nổi đề tạo thành tachykinin SP, NKA, NKB Chỉ tiết sơ đỏ quá trình cắt nói được trình bảy trong Hình 3 Trong đó, dạng ơ-PPT-A mARN thiểu exon 6 được tìm thấy

chủ yêu ở trong não Dang y-PPT-A mARN thiêu exon 4 và dạng B-PPT-A mARN

đủ cả 7 exon được tim thấy chủ yếu ở các hạch thần kinh ngoại biên [36, 37] Các

doan peptide tién thân được nhận biết nhờ 6 nhỏm enzyme thúy phân gọi lả

convertase và cắt đặc hiệu tại các vị trí Lys-Arg, Arg-Arg hoặc Arg-Lys để tạo

thành các dang tachykinin tương ứng |34, 47| Trong đó cả ba đựng

preprotachykinin đều được sử đụng dé tao thành chất P còn dang preprotachykinin

beta và gamma mỏi được sử dụng để bình thành lên các dạng peptide khác (NKA,

neuropeplide y, ucurapeptide K) O mat sé mé tong co thé, neuropeptide K va y

thường 6 dau amino dai hon so véi NKA [12] Trong khi đó gen 74C3 /PT-B)

mã hóa cho neumokimin Ð biểu hiểu chủ yếu trong ving dưới đổi vá ruột [7]

‘Tu nim 2000, nhom ciia Yu Zhang va cộng sự tiền hành nghiên cửu ở tế bảo

lympho B 6 chuột đã phát hiện dạng tachykirin thứ tư là hemokinin Ở người, hơmokinin dược mã hóa bởi gen 74C /ĐP7-C) dịnh vị trên NST sé 17 139, 54]

Gen này có được cắt nối theo nhiêu cách khảo nhau để từ đó hình thành nên nhiều

dang hemokinin và cndokinin khác nhau trong ca thé

Tachykinin được tổng hợp trong các tế bào thân kinh (rung ương vả ngoại

vị và cả các tế bào không phải tế bào thân kinh Sự phân bổ này phụ thuộc vào từng loài và rất khó tìm ra quy luật phân bố của chát này, Có nhiễu vị trí biểu hiện tachykinin đến nay vẫn chưa biết chức năng Khi phân bổ ở tế bào than kinh, tachykimm hoại động như một chất truyền dẫn tín hiệu thân kinh, trong khi ð các tê bao không phải tế bảo thân kinh, chúng có vai trò như những chất nội tiết, cân nội tiết hoặc điều chính hoạt động hệ nội tiết [27] Ở động vat ¢6 vi, tachykinin chú yêu

được biểu hiện ở tế bảo không phải tế bào thâu kinh đưới động SP Sau khi được

giải phỏng vào máu, SP củng vdi serotonin hoạt động như một chất cận nội tiết hoặc một chất nội tiết tô thực sự Khi đó chúng đông vai trỏ như một tác nhân giản tiếp gây giải phóng chất gây giãn mạch máu hoặc trực tiếp gây co cơ trơn [8, 21]

Khi liên kết với thụ thể tương ứng của minh, tachykinin có vai trở kích thích các tế bảo thân kinh, gợi những phản ứng thỏi quen, hành vi giới tính, dẫn truyền côn giác dau đớn và gây eo trực tiếp hoặc gián tiếp cơ trơn, từ đó gây hiện lượng co

thắt ruột, gây giản mạch máu và phản xạ nôn, gây viém [6, 8, 10] Dựa vào hiểu biết

về chúc răng cuã tachykinin, nhiều nghiên cứa tập trung tìm kiểm các chất đổi vận

với tachykinin để điều trị các điều kiện gây viêm như hen suyễn, triệu chủng kích

thích co thắt ruột [§, 16, 25] Tuy nhiên, mục đích chính để sử dụng, các loại thuốc

nay là chống buồn nôn cho người và động vật |18, 19]

13 THỤ THỂ HỢ TACHYKINIX VÀ THỤ THỂ NEUROKINLN-E 1.3.1 Giới thiện chung vé thu thé ho tachykinin

Thụ thể của ho tachykinin (TACR) thuộc lớp A trong họ thụ thể liên kết với

G protein (Ilinh 1) Tuong tự như thụ thể rhođopsin, TACR có cấu trúc gồm 7 ving xuyên mảng đặc trung được nối với nhau bối các vòng phía ngoải và phía trong, mang sinh chất (cxoloop và cyloloop) Những vòng ở phía ngoài mảng lế bảo của thụ thể liên kết với G protein có cho năng lựa chọn cấu tử gắn đặc hiện trong khi các vùng xuyên màng có chức năng quyết định hoại tỉnh của thụ thế Người la phân

loại TACR đựa vào sự sai khác trong các trình tự này [45]

Có ba dạng thụ thể của họ tachykinin ở động vậi có vủ đã được phải luện là neurokinin 1 (NK1), neurokinin 2 (NK2) và neurokinin 3 (NE3) tương ứng với cáo

tachykinin SP, NKA vả NKH Trên thực tế, giữa các thụ thể và tachykinin co thd

liên kết chéo, nhưng ái lực liên kết thay đối nhiều giữa thụ thể và câu tử (Bảng 1)

[3, 9, 10, 35] Rigng tachykinin endokinin vả hemokinin déu ưu tiên gẵn với thụ thể

NKB NK3 >> NK2 > XKI Neuropaptide-y NK2 > NKI >> NK3 Neuropeptide K NK2>NKI >> NK3

Đặc điểm 'Thụ thể NKL ThụthểNK2 || ThụthÊNK3

$6 Iuong acid amine (chiêu dài đữ) 398 40 7 465

Độ tương đồng 41% với XK3 47%vớiNKI | 5I⁄%vớiNKI

Các nghiên cửu đều chí ra rằng gen mã hóa cho 3 dạng thụ thể trên đều chia

5 exon xen kẽ với 4 inron Việc các gen mã hóa cho TACR chứa inưan đã gợi ý

tổng các gơn này cô thể có nhiều cách cắt nối khác nhau, từ đó tạo nên tính đa hình của thụ thể [22]

Khi nghiên cửu các thụ thể TACR người ta thấy có sự biến đông về số lượng,

acid amine giữa các loài dộng vật Trong đó NK1 ở tất cä các loàidộng vật có vũ chúa 407 aoiđ amine NK2 ở người chứa 398 acid amine, trong khi ở chuột chủa

390 và ô lợn là 402 acid amnine, Tương tụ như thế với NE3 ở người chứa 465 acid

amine trong khi ở chuột là 452 và lợn là 440 acid amine [3]

C4 ba thu thé cia ho tachykinim ở người mặc dù có cầu túc khác nhau nhưng déu có chung cơ chế hoạt động Sau khi tachykinin liên kết vào thụ thể tương ứng của chúng, phức hẹp thụ thế-câu tử sẽ kích hoạt phân tử Œ protein, từ đó làm tăng,

ham lượng Ca” nội bảo hoặc hoại hóa phospholipase C lam phân hủy

phosphoinositol thánh [P;/DAG Mé6t số nghiên cứu khác chỉ ra rằng phức hợp giữa thụ thể tachykinin và tachykinin tương ứng còn có khả năng kích hoạt G protein gay

hoạt hóa adenylate cyclase hinh thank cAMP (26, 42]

Vai trò của TACR được phát hiện thông qua các thí nghiệm gây đột biển làm

mat các gen Lng hợp tachykimin hoặc thụ thể của tachykmim ở động vật [16, 18, 55] Nhìn chung, các TACR khi phối hợp hoạt động với G protein cho phép truyền

din tín hiệu từ tachykinin vào trong tế bào, gây co thắt phế quản [23], tăng cường,

vận chuyển khi ở mạch máu và tặng tiết dịch nhảy, gây có thất cơ trơn, gây phân từng viêm, Chất đổi vận của thụ thể NKI có cơ chế hoạt động tương tự như chất

† đã được chứng mỉnh là eó kha nang chồng suy nhược [9, 10] trong khi chất đối

vận với thụ thể NK2 được chứng mình là có tác dụng chéng lo 4u.[11, 12], cén chit

đổi vận với thụ thẻ NK3 có chức năng chông lại sự rồi loạn thân kinh [46, 14]

1.3.2 Thy thé neurokinin — 1

Trong họ tachykinin, biểu hiện và dong vai trò quan trọng nhất phải kể đến

SP SP có khả năng liên kết với cả ba loại thụ thế NE1, NK2 và NK3 nhưng ải lực mạnh nhất với thụ thể KT Khi biểu hiện eDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-Ï

ở đồng tế bào COS-7, Ai hục liên kết giữa thụ thể KKI với SP có giá trị K„ là

0.35:10.07, cao gấp 100 lắn so với NKA và S00 lần so với NKP [24]

Như đã nởi ở trên, NK] là một thành viên rong họ thụ thể liên kết voi G

protein, ching chita 7 vimg xuyén mang ky nước, trong đó

53 loop xuyén ngoai

mang va ba loop xuyén trong mang, dau carboxyl nim trong tế bảo chất trong khi đầu amino nim ngoai mang tế bảo Thu thé nay chứa 407 aoid arnine Những câu trúc liên quan trực tiếp tới chức năng của thụ thể gồm cầu đisulfit tạo thánh giữa

Cys] 05-Cys180 thude ITM 3 va TM4, đầu amino cia NK1 bi glycosyl hoa tại vị trí AspL4 và AspI8, đầu oarhoxyl bị palmity1 hóa ở vị trí Cys322 [S8]; trinh tự Asp- Arg-Tyr của TM3 và I.ys/Arg-Lys/Arg-XX-Lyg/Arg nằm ở đầu carboxyl của thụ

thể phía là nơi tương tác với G protein (11inh 4A)

6 II Glycosyl hoa lycosyl hoa

A NKI dải hoàn chỉnh B NKI bị xén cụt dau carboxyl

Hình 4: Câu trúc thụ thể NK1 mang chiều đải hòan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl

bi xén cut

Gen ma héa cho neurokinin-1 6 hai cach cat néi trong ty nhién hinh thanh

nén dang NK1 mang chiéu dai hoan chinh va dang NK1 bi xén cut dau carboxyl tan

cùng ở người và ở lợn [5, 11, 22] Ca hai dang NK1 nay phát hiện ra thây ở tất cả

các vùng trong não, thậm chỉ mở rộng ra toi hé than kinh vùng ngoại vi trong ngũ

ién dang NK1 cé dau carboxy] bi xén cut 1a do bi

lỗi trong quá trình cắt bỏ exon số 5 đã tạo ra sớm mã kết thúc [5] Khi dịch ma sang

protein, dang NK] dai hoàn chỉnh chửa 407 acid amine, trong khi dạng NKI bị xén

cụt chửa 311 acid amine Hai dang nay khac nhau 6 chieu dai dau carboxyl tan cing

tạng Nguyên nhân của sự xuất

— vị trí gay ra su phosphoryl héa trong quả trình truyền tin hiệu của thụ thẻ NK1

Do sự khác biệt về đầu carboxyhiên khi biểu hiện ở dòng tế bảo thận phôi người

HEK 293, hai dạng thụ thể NK1 này có nhiều điểm khác biệt vẻ chức năng (Bảng 4)

[30] Theo nghiên cửu của Fong và công sư cho thấy ai lực của NKI bị xén cụt đầu

carboxyl giảm 10 lần so với NKI cỏ trình tự dải hoan chỉnh khi tương tác với chất

đồng vận SP [22] Điều nảy gợi ý rằng can phải có một lớp thuốc mới phù hợp với dang thu thé nay

Bảng 4- Sự khác biệt trong chiến dài của đầu carboxyl liên quan tới chủ măng của thụ thể NK1 {36}

Sô lượng acid amine 407 311

Biển đổi hàm lượng Ca nội bảo có không

Gan đây, có nghiên cứu còn chí ra mới liên hệ giữa chiểu dai thy thé

neurokinin-} với việc bị nhiễm virus IIIV Cũ thể là ở những người âm tính với

HTV biểu hiện dang NK1 hoan chỉnh nhiều hơn đăng kế so với nhưng người dương,

tính với virus LIIV [48]

Cơ chế hoại động của thụ thể NKI có thể tớm tắt như sau: SP được giải phóng ra từ các bóng synapse gắn vào thụ thẻ NK1 6 mang sau synapse tao ra dién thé hoạt động ở mảng sau theo cơ chế phụ thuộc Ca”, Khi thụ thể NK1 bị kích thích, bản thân chúng tương Lác với G Jrotein, từ đó có thể tạo riên chất truyền Lin thử hai theo ba phương thức: một là phụ thuộc hệ thống truyền tin thứ hai thông qua

phospholipase C phân hủy phosphatidy] inositol bên trong mảng tế bảo thành TP; và

DAG IP; hoa tan yao Lé bay chat va liên với thụ thẻ trên ruạng lưới nội chất hại dẫn

đến sự lruy động Ca?” vào trong tế bảo chất, từ đỏ DAG trên cón năm lại trên màng,

kích hoạt kinase C phu thuộc Ca?” gây hiện tượng phosphory1 hóa nhiều protein

đích Đầy là phương thúc hoạt hóa chính của thụ thể TACR cũng như là TACRI Lai la sy huy động aeid arachidoric thông qua phospholipase A2 va ba là gây ra sự tích lũy cAMP thông qua kích hoạt enzyme adenylate cyclase [35]

Nhiéu nghiên cửu dã chỉ ra rằng thụ thể NKI ở người dược mã hóa bởi một gen đơn bân nằm trên NST số 2, kích thước của gen mỏ rộng lên tới L51 kb [13]

Trình tự cDNA rã hóa cho thụ thể KT ở người và chuột lương dồng tới 8994 |28]

‘Theo ngân hang dữ liện, gen A1 khi tiến hành phiên mã có thể cho it nhất 4 dang

mmRNA khác nhau Mỗi cách thức biểu hiện sẽ cho một dạng thự thể NK] có ái lực

với các chất đồng vận khác nhau Quá trình nảy xảy ra ¡ những mô chuyển biệt

[13| Tuy nhiên, cho đến nay, người la mới chỉ phái hiện được 2 dạng biểu biện của sen này [30, 22]

Thụ thể NET được tìm thấy gả Irong vững thân kinh trung ương và ngoại vĩ tương tự như SP, cự thê là ở tế bảo thản kinh, mảng trong mạch máu, các tế bảo cơ, ruội-đạ dây, phối, tế bào thuộc hệ miễn dịch, đảo giáp, Sự liên kết giữa SP với thụ thể NK1 cho phép wuyéu di các lín hiệu stress, dau don, phan img viém va co

rút sơ trơn, [55]

1.4 UNG DUNG CUA THU THE NEUROKININ-1 TRONG DIEU

TRI BENE

Từ những hiểu biết về chức năng của thụ thế neurokinin 1 hứa hẹn đây sẽ là

đích tác động hiệu quả cho các phương pháp điều Irị môi số căn bệnh có liên quan

Do đó cũng không có gì ngạc nhiên khi nhiều hãng được phẩm lớn tập trung nghiên cứu về thụ thể tachykinin nhằm tìm ra các chât đối vận của chúng để ứng đụng

trong diểu trị bệnh: lầm thuốc giảm đau, chống lo âu, trằm cấm, chữa các bệnh

đường hỏ hấp, Sự phát hiện ra các chất đối vận với thụ thể NK1 cũng là một mat xich quan trong trong việc thay đối hướng điều trị trong việc ngăn ngừa chứng buôn

nén và sự nôn mữa do tác dụng của hỏa tri liệu ung thư Tuy dến nay các nghiên

cửu về chất đối vận với thụ thể taehykinin vẫn chưa đạt được kết quá như mong đợi

và gặp rất nhiều khó khăn, nhưng việc sử dụng thụ thể NKI làm dich lác động của

thuốc văn là một bài tóan hay và khỏ cho nhiều nhà nghiên cửu Trong do các nghiên cứu chủ yêu tập trưng váo những phân tử không có ban chit peptide có kha năng thâm xuyên qua mảng tê bào thân kinh Trong tương lai, chật này hứa hẹn

sẽ cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13],

Kế từ khi tachykinin được phát hiện ra lần đâu tiên, người ta đã biết khá rõ hoạt lính sinh hoe eda ching trong các trường hợp bệnh lý và sinh lý học Tuy

nhiên, hiệu qua điều trị của các chất đối vận với tachykinin đến nay vẫn chưa được

trểu biết một cách đây đô

Chất đối vận của thụ thể lá những chất có khá năng liên kết thuận nghịch với

thy thể Thông thường cã chất chủ vận và chất đổi vận đêu có thể liên kết với một

ân thường không Hiên kết tạt những vị trị chính xác để kích hoạt cơ chế hoạt động của thụ thể Do vậy, chất đỏi vận không

có hoạt tỉnh sinh học nhưng có khả năng ức chế cạnh tranh làm giảm hoặc khỏa

vùng nhất định trong thụ thể, rihưng chất đổi

hoal tinh eda chat dang van [41 |

Từ những kết quả nghiên cứu vẻ vai trò của các chất đối vận thụ thế NKI,

người La đã dưa một số hợp chất vào sâu xuất thành thuốc trên thì ưường Các chất này đều có bán chất phi peptide, có vai trỏ chủ yếu trong việc điều trị chứng trầm cảm, cáo biếu hiện stress, chúng đau nửa đầu, giãm đau, giảm triệu chứng tâm thân, rốt loan than kinh, giảm tình trạng nồn mữa dói với những bệnh nhân ung thư

Theo công hỗ của viện ung thir quée gia Hoa kỳ, khi tiên hành hóa trị liệu

cho gác bệnh riiên ng thự, có tới hơn 7594 các ca hóa trị hệu có phân ứng nôn mữa

chỉ sau 2h điều trị, 90% bệnh nhân bị nôn sau 2-5 ngảy sau hóa trị Diễu này gây anh huéng lớn tới sức khỏe va tinh thân của bệnh nhân vả làm giảm đáng kế số bệnh nhân kiên trì điểu trị theo phương pháp này Theo bảo cáo của Hội Điều Dưỡng Xã Hội Về Lng, Thư, cò đến 50% số bệnh nhân ở giai đoạn CINV bỏ cuộc

villi do gặp phải các triệu chứng sau khi hóa trị Năm 2003, Cục Quân Lý Dược Va Thực Phẩm của Mỹ dã phê duyệt việc áp dạng cáo phương pháp liên quan đẻn thu

thể NK], dẫn đến việc sử dụng một lớp thuốc mới có tác dụng đổi vận thụ thể NK]

trong phương pháp hóa trị liệu [41, 43] Hiện quả khả quan được chứng mình rõ khi

sử dụng các loại thuốc này trong phác đỗ điều trị, chúng làm giảm và chậm đáng kế

quả trinh xảy ra các triệu chứng CUNV,

Một ứng dựng rộng, rãi ra của thuốc đối kháng thụ thể NK1 là tham gia vào việc điều trị chứng tâm thần phân liệt Theo các nghiên cứu về não bộ thì con đường, Mesolimtie liên quan trực tiếp đến các triệu chứng của nghiện, tâm thân phân liệt, tram cam do chúng tham gia vào việc tăng lượng dapamine trong não bộ bằng các

cơ chế khác nhau [41] Trong cơ thé, néu chất chủ vận SP được truyền đi sẽ kích

hoại con đường này dẫn đến lăng hoại tính của đopamine ở các tế bào thần kinh Vì

vậy, một trong những phương pháp điều trị là ngăn chặn sự tương tác của chất P với

thy thé NK1 bai các thuốc đổi kháng liên kết với thụ thể này Các hợp chất này tác

động làm dicu chink si tel ra dopamine & cae hé thorys Mesolimbic

Theo một nghiên cứu mới vào năm 2012 đã chứng mình được vai trò của

NET cùng phổi từ của chúng là chất P Irong sự phải triển khôi nung thư Chất P và các hợp chất khác khi kich hoạt thạ thể NKI dẫn dến sự thủy phân các

phosphoinositide, hny động Ca'“ và hoạt động của protein kinase kích hoạt quá trình phân bảo Hoạt động của NK1 dược tim tha

liên quan dến các quá trình phát

sinh ung thư như phân chia nguyên bảo, sự di chuyển cúa các tế bào và di căn Do

đỏ thụ thể KKI cũng như chất P ảnh hưởng mạnh mẽ đến ví môi trường của khỏi w

trong ung thư |6]

Kế từ đó tới nay, các chất đổi vận có bản chất phi pzptide được nghiên cứu

rộng rất và nhiều cầu trúc cũng như cơ chế lác dụng của chủng đá được làm sáng lồ Nam 1998, Kramer và cộng sự đã công bố những nghiên cứu bệnh học về tác dang

và tính an toàn của MK-869 ở bệnh nhân trong phản lớn các trường hợp rồi loạn trầm cẩm Năm 2003, lần dầu tiên chất dối vận NEI là aprepitent (Emend) dược hiệp hội quán lý thuốc vả thực phẩm (FAI)) Hoa Kỷ phế chuẩn cho phép sản xuất

và lưu thông trên thị trường Gần đây người Ia phát hiện ra hợp chất T-2328 là một chat doi van thu thẻ NKI không có ban chat peptide Chat này dược dưa trực tiếp vào tình mạch đề điều trị nôn cấp tính vả nên kẻo dài trong điều trị ung thư Người

tạ để xuất đưa chất này vào sân xuất thuốc chống buốn nôn qua hoạt động thụ thê NEI [3] T-2328 có hiệu lực quan trọng, ham lượng ức chế của chất này là dưới nanomol vả thấp hon 16 lần so với aprepitant hưu hành trên thị trường Sự c chế này có tính chẹn lọc cao đối với thụ thế NKI nên cũng được đưa vào lâm thuốc trên

thị trường [45]

Tuy cỏ ứng đụng rông rãi trong lĩnh vực y, được nhưng những nghiên cứu về

thu thé neurokinin — 1 ở Việt Nam vẫn còn rất ít hoặc chưa công bố Theo một lải

liệu mới đây người ta đã thành công trong việc tách đảng cDNA mã hóa cho thụ thể

Tieurokimi-Ì từ mẫu nao của người Việt Nam Tuy nhiên, khi đối chiếu với trình tự

clDNA được công bố trên ngân hàng đữ liệu NGHỊ (Mã số ME1797.1) [59] phát

tiện thấy 5 điểm sai khác tại các vị trí 184, 333, 370, 611, 996 trong dé tat ca A

trong Trình tự gốc đêu bị thay thế bằng G tại các vị trí 184, 333, 641 và 996, còn ö

vị trí 370, C bị thay bởi T Kết qua 14 cé avid amine da bj thay déi nhu trong Bang

s

Bằng 5: Sai khác về trình tự protein giữa cDWA mã hóa cho thụ thể neukdnin-1 ở người

'Việt Nam so với trình tự protein cDNA NK] trén NCBI

(CDNA NK1 mã số M41797.1) | (CDNA từ não người Việt Nam)

Tử đó đặt ra câu hỏi rằng su sai khéc gitta trinh tw acid amine trong cDNA

tach dòng tử não người Việt Nam với trình tự acid amine trong trinh tự cDNA gdc

có phải là do tính đa hình của gen? Dễ trả lời câu hỏi đó chứng tôi quyết định tách déng Jai cDNA hoan chính mã hóa cho thụ thế neurokinin-1 từ mau phối ở một cá thể người Việt Nam khác Từ nguồn gen này, chúng tôi thiết kế veetor biểu hiện cho

cDNA mã cho thụ thé neurokinin-1 để biển hiện chúng trên hệ thông tế bào động vậi, từ đỏ có thể chủ động được nguồn gen va cac hé thong sàng lọc (huốc có tính

đổi vận với thụ thên neurokinin-E từ nguồn được liệu ở Việt Nam Đây là lí do dé chúng tôi tiên hành dé tai “Tach dong va thiée ké vector bidu kiện gen mã hóa cha

thu thé neurokinin —1 8 người Việt Nam”

tế bảo nhân thực Tuy nhiên, do thọ thể Hên kết với G protein

thường được biến đổi sau dich ma bang cách gắn thêm carbonhydrate hoặc lpid

hỏa nên việc biểu hiện trên hệ thống tế bảo nhàn sơ thường không cho kết qua

như mong muốn

Trên hệ thông tế bảo nhân thực, các nghiên cứu chỉ ra rắng mỗi gen mã hỏa cho thụ thẻ liên kết với G protein phủ hợp với một hệ thông biểu hiện khác nhau

[Kemaeth Lunstrom] và hiệu quả cao nhất ở cac vector Semiki forest virus va

Baculovirus,

‘Theo các nghiên cửu dã công bổ, NKI được biểu hiện trong, vector pCDNA

[24], PMAM-neo [2, 28], pVLI393 [32], pAIIygCMVI [49] ở các chủng tế bảo HEK293, COS-7, CHO, đến cho kết quã khả quan Một nghiên cửu gần đây năm

2006 của Farahdiba và công sự khi nghiên cứu truyền tin của thụ thể -arestin 1 dã

tiến hành dung hop gen mã hóa cho thụ thể này với gen mã hóa cho NKI và biểu

triện chứng rong hai hệ veclor pCDNA3.1 và pRGET-NI cũng cho kết quả tốt Đây

là tiên dễ cho chúng tôi lựa chọn và thiết kế vector biểu hiện pCDNA3 va pEGFP-

NI trong 46 tai

pCDNA3 va pEGFP-N1 la vector biéu hiện ở tế bảo động vật với các đặc diém dược trình bảy trong phụ lục

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PIIÁP NGIHÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.L.1 Mẫu vật

Mẫu phối tươi của người bị ung thư phối được cung cấp bởi Viện Quân Y

103 (ki bigu H211 lay ngay 25/1/2011)

2.1.2 Các cặp mỗi sử dụng

Hai cặp mỗi NE1 E/ NET Rị và NKI F/ NET R dược thiết kế dựa theo trinh

tu cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thé neurokinin — 1 được công bê trên ngân

hàng đữ hiệu |57|

Cặp mỗi NKI F¿/ NKI R; được thiết kế đựa vào trình tự eDNA hoàn chỉnh

tách đòng từ phối người Việt Nam Các cặp mỗi này được cung cấp bởi hãng TDT

(Mỹ) Trình tự các môi được trình bảy trong Bang 6

Bang 6: Trinh te cae méi sit dung trong nghiên cửu

NRIE; - | ATTTAAGCTTACCATGGATAACGTCGTOC | Chuyên gen mã hóa cho

nieurukinin-1 lử vecter tái

2.1.3 Cac hé théng vector

~ Hệ thẳng veclor biểu hiện ở tế bào động vat: pCDNA3, pEGFP-N1,

- Hệ thống veetor tách động pJHT 1.2 (Gene JLI”M PCR Cloning Kit

AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit (Bionccr) Tach RNA tong số

QIAguick Gel Extraction Kit (QIAGEN) Tinh sạch sản pham cat

- Pfu polymerase (Fermentas);

- Enzyme T4 DNA ligase (Invitrogen),

~_ Các enzyme giới han (I'ermentas, New England Diolabs);

~_ Môi rường nudi cay vi khudn Luberlani Broth (LB) gam 1 % trypton, 0,5%

cao nam men, 0,5% NaCl;

- Cav hoa chất thông dụng khác đều đại đỗ tính khiết dùng trong nghiên cứu

sinh học phân tử

e Thiết bi

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thị nghiệm Sinh

Y - Khoa Sinh hoc; Phong Genomic - Phỏng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Envym - Protem và Phong Sinh học Phân lử - Tnmg tâm nghiên cứn Khoa học sự

sống, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hả Nội

2.2, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cửu

Khuéch đại đoạn S°-NK1 Khuêch đại đoạn 3°-NK1

Tach dong đoạn 3`-NKI

Tach dong đoạn 5'-NK1

€Cắt-nối tạo €DNA- NKI hoàn chính

th dong cDNA- trình tự cD) 'NKI hoàn chỉnh hoàn chỉnh trong vector

Sử dụng mẫu phổi người bị ung thư phôi (mẫu tươi) để tách RNA tổng số

theo quy trình của kít 4eeuPrep® Viral RNA Extraction Kít (Bioneer) Quy trình

tách chiết gồm các bước chỉnh như sau:

- Can 20 mg mau phổi người cho vào ong eppendorf 1.5 ml

- Bề sung 400 ul Binding Buffer (VL), trén nhẹ 5 giây rồi ủ mẫu ở nhiệt độ

phòng 10 phút để ly giải tế báo

- Bé sung 100 pl isopropanol, tron đều trong, 5 giây, ly tâm nhanh trong ]0

giây Chuyến phần địch lên cột, ly tâm loại bỏ địch

- Rita cột với 500 nÏ W1 Buffer, ly tâm nhanh trong 1 phút dẻ loại bỏ dịch

- Rita lai cét với 500 „l W2 Buffer, ly tâm nhanh trong 1 phút loại bỏ địch, ly

tâm lại 1 phút dễ loại bỏ côn trong W2 Buffer

- Bésung 50 ju Elution Buffer, ly tam thu RNA

2.2.2.2 Phan img phién ma nguge voi enzym AMV Transcriptase

RNA tổng số được tách chiết từ mẫu phối người, sau đó được đảng làm khuôn trong phản ứng phiên mã ngược đề tổng hợp clNA nhờ enzvme phiển mã

AMF Transcriptase (Promega) Phan tmg nay được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của Promega với ac bude chink sau

- Buéc 1: Trén RNA và mỗi, ủ hẫn hợp ở 70°C, 5 phút để biên tình RNA rồi ñ

nigay vào trong đã

Trong bước nảy, chúng tôi sử dụng lần lượt 2 mỗi lá 1lexamer vá mỗi oligøT'

a8 tang hợp riêng rẽ cDNA tir mét miu RNA đã tách chiết

~_ đước 2; lỗ sung đệm và dNTE, ú ở 25°C trong 10 phúc

-_ Bước 3: Bỗ sung envyme AMV Transcriptase 300u/pl, Unze hién phin img

tổng hợp theo chu trình nhiệt: 25'C 10 phút, 372C 90 phut, 85°C 10 phút

Sân phẩm eDNA được bão quân ở 4°Ơ

2.2.2.3 Phan img PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phân ứng PCR là ky thuat khuéch dai dean trinh iz DNA nhờ sự thay đổi của