Luận văn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích Đa dạng cà Định dạng của tập Đoàn cây dó bầu aquilaria sp tại hà tĩnh

Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật [16] trong đó có đó bầu ở Việt Nam [18| khi những quau sát hi thai, sinh trưởng và phát triền

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG ĐĂNG HIẾU

SỬ DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PITAN TÍCH DA DẠNG VÀ DỊNI DANIT LOAT CUA TAP

DOAN CAY DO BAU(AQUILARIA SP.) TAI HA TINH

LUẬN VĂN TIIẠC 8Ï KIIOA HỌC

Hà Nội - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG ĐĂNG HIẾU

SỬ ĐỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG VÀ ĐỊNH DANH LOÀI CỦA TẬP DOAN CAY D6 BAU(AQUILARIA SP.) TAI IIA TINII

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUAN VAN THAC 81 KHOA HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS CLIU TIOANG TIA

Trang

Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU, à i occc sec

1.1.1 Đặc điểm phân loại và vị trí phán bố bồ của cây đó bằn 2

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây đó bâu 3

1.1.3 Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dỏ bầu 5 1.1.4 Thực trạng trồng và khai thác cây dó bau trong nước và trên thể giới 7 1.1.5 Các nhân tế ánh hướng tới khả năng tạo trầm nhân tạo "—

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong việc định đanh loài và xáo định quan hệ di

1.3 DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại 12

1.3.1 Giới thiệu DNA bareode ìà cceseieerrrrirerererire.T7

1.3.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode 13 1.4 Một số locus được sử đụng trong phương php DNA barcode ở thực vật 14

1.4.3 Trình tự gen lục lạp cằerrararrrririrserrseso TỔ 1.4.4 Trình tự gen rBche cscs sensssesssusiestusensiatineuninteneenenaeintsineeieenenned 7

1.4.9 Trình tự hai gen irnl(UAA) - fn F(GAA) ssesesnsneeneeneneenatennesneenernei dD

1.6 Một số kết quả trong nghiên cứu vẻ cây dé bau tại Việt Nam và trên thẻ giới 21

Chương 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG THÁP

3.1.Vật liệu

2.1.1 Thực vậ

2.1.2 Chủng vi khuẩn - - - 23

2.1.5 Các cặp mỗi sử dụng rong nghiên củu "— Ô

Chương 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN ìeeece 33

3.1 Kết quá tách chiết và tĩnh sạch IDNA tổng sổ 33

3.2 Tìm nhiệt độ gắn mỗi đặc hiệu của phản ứng PCR - - 34

3.3 Kết quả nhân ban gen với các cặp mỗi nghiên cứu 36 3.3.1 Kết quả nhân bản gen zÖđ, ni 3ỔÔ 3.3.2 Kết quá nhân bản gen zpoÖ reo 3Ổ 3.3.3 Kết quá nhân bán gen psk1-fHH1 ào 3.3.4 Kết quả nhân bản gen Ƒ7S - 38

3.4.1 Kết quả tình sạch sản phẩm PCP (thôi sel) 38

3.4.2 Kết quá chuyển gen vào vector tách dòng, 39

3.4.3 Kết quả biển nap DNA plasmid vao tế bảo khả bại 39

3.4.4 Kết quả chọn lọc đông tế bảo mang gen tái tô hop 40

3.4.5 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp - - 4I

3.4.6 Kết quá cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp A

3.5 Xác dịnh và phân tích trình tự nueleotide của các doạn DNA chỉ thị, 43

3.5.1 Kết quá xác định và phân tích trình tự gen #n-psÐ/1 e 44

3.5.2 Kết quả xác định và phân tich trình tự gen rpaÐ 46

3.5.3 Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp re, 48

3.5.4 Kết quả xác dịnh và phâu tích trình tự gen Ï7Ẩ " SZ

KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ - n snneeraeaeoeoiooS TÀI LIỆU THAM KHẢO co oeHheeeeeereeeroereooeo.2Ð)

Bang 2.6 Chu ky phan ting POR ccceeccseesssesiestsessiseeeestessinssestisensiatensesns 26

Bang 2.7 Thanh phan phản ứng ligase

Bang 2.8 Thauh phan môi rường chọn lọc tế bào vị khuẩn mang DNA (ai tổ hợp 29

Bang 2.9 Thanh phan phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc sessees.3Ô)

Bang 2.10 Chu ky phan tng PCR- clony - - 30

Bang 2.11 Thanh phan hóa chất tách plasrnid 30 láng 2.12, Thành phần hóa chất đứng trong phản ứng cắt enzyme 31

Bang 3.1 Nhiệt độ bắt môi và kích thước gen của các cặp mỗi nghiên cứu 34

Bang 3.2 So siuh trinh ty ving trnH-psbA intergenic le lạp đố Tăng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp zpa « "— Bang 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp zöcƑ, - 30

Bảng 3.5 VỊ trí sai có thể khác dùng dễ phân loại của doạn gen vùng zbei 51

Đảng 3.7 Các vị trí sui khác đừng dễ phân loại của doạn gen vùng 7T§ $5

iv

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của một số màu dó bầu nghiên cứu 33

Tlinh 3.2 Két qua chay PCR - gradient cia chi thi rpo# ở các nguỡng nhiệt độ từ

Hình 3.3 Kết quá điện di san phim PCR gen zèo của các mẫu do bau

Hình 3.4 Kết quả diễn di sản phẩm PCR gen rpoÐ của các mẫu đó bầu

nghién cin essinsvtestientieeeesetesinsstueeinesiiaeisetesauaveeeetivet see 237

Hinh 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen psh4-traH cia cae miu dé bau nghiên

Tình 3.12 Cây phân loại giữa trên kết quả muỗi 7TS 56

Deoxyribomucleotide triphosphate Escherichia coli

Elhylenediarminctetraaceltic avid Isopropylthie-beta-D-galactoside Internal Transcribed Spacer-2DNA Kilobase

Luria Bertani Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid

Ribosome deoxyribonucleic acid

Random Amplyfied Polymorphism DNA

Restriction Fragment Length Polymorphism Ribonuclease

Sodium dodecyl sulphate Solution

Sequence-Tapged Site Tris - Acetic acid - EDTA Thermus aquaticus polymerase

‘Tris - Lithylenediaminetetraacetic acid

X-5-brom - 4 - phloro3 - indolyl - B - D - galactosidase

MỞ ĐẦU

Cây đỏ bầu (Aguilaria sp) là một trong những loài thực vật đặc hữu của nước

ta, phan bé rai rắc từ Bắc tới Nam, tập trung nhiễu ở các tính miễn Trung đặc biết là

Ha Tinh va Quang Nam Cay dé bau mang lại giá trị kinh tế rất lớn vải mục dich chỗ yếu là khai iác trầm hương, một mặt hàng có gid ui kink tế cao sử dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, trong được liệu, trong tốn giảo, chế tác đồ thủ công mỹ

nghệ

Ở nước ta hiện đã phát hiện ra 6 loài đó bàu phân bổ rải rác trong rừng ram nhiệt đới thường xanh, ẩm nguyên sinh: 4 crassna (Dé bau, Dé tia, Dé tring),

A baillonii (Dé Gach), A rugosa (Dó Quả Nhăn), 4 malaccensis (D6 MA Lai),

A sinensis (Do Trung Quéc), A banaensis (Do Bà Nà), Trong đô 4 crassna là loài

được trắng phổ biến nhất đo có khả năng tạo ra loại trảm Kỳ tốt nhất thể giới Tuy thiên, hiện nay các loài đá bầu ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiều, công tác lựa chọn giống dưa vào rồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi

ca nhân, đẫn đến năng suất và chất lượng trảm thu được không ến định Do vậy,

việc chon loc giống cây ban đầu dé đưa vào triển khai là hết sức quan trong và là nhiệm vụ cấp thiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý

Hiện nay phương pháp DNA bareede là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh chóng, bự động hỏa bằng nách sử dụng một vùng, DNA chuẩn hay còn gọi lá chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài bằng DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật [16] trong đó có đó bầu ở Việt Nam [18| khi những quau sát hi thai, sinh

trưởng và phát triền chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phản biệt loài

Xuất phát từ những yêu câu đặt ra như vậy chúng tôi quyết định thục hiện đề tài “Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích da đạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (4guiiariz sp.) tại Hà Tĩnh.”

Chuong 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tổng quan về cây đó bầu

1.1.1 Đặc điểm phân loại và vị trí phân bô của cây dó bằu

Cây do bau (Aguilaria sp.) la mét trong những loài thực vật có giá trị kinh tế

rải rác từ Bắc tới Nam, cỏ nhiêu ở các tỉnh

cao Ở Việt Nam, cây do bau phan bo

miễn Trung Cay do bau cỏ rất nhiều tên gọi tủy theo mỗi địa phương như: cây

Tram Huong, D6 Tram, Do Bau Hương, cây Tóc [43]

Cay dé bau thuộc chi tram Aguilaria, ho Thymeleaceae, bộ Thymelaeales,

lớp cây gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Méc Lan Magnoliophyta [41], [42]

Hinh 1.1 La cay dé bau

Chi Tram Aquilaria gom 24 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ cỏ 15 loài cỏ khả

nang cho tram huong gom: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis hodc

A chinesis; A borneensis; A Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata;

A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa;

A grandiflora; A bancana; A Rugosa Trong đó loài 4 rugosa mới đây được

TS Lê Công Kiệt và TS Paul Kessler người Hà Lan phát hiện năm 2005 [18]

Trên thẻ giới, chỉ trảm phân bố chủ yêu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á vả miễn Nam Trung Quốc Ở nước ta, dỏ bẩu phân bỏ rải rác trong

rừng rậm nhiệt đới thường xanh rừng âm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang,

t2

Thanh Hoa, Nghé An, Ha Tĩnh, đặc biệt lá từ Quảng Hinh, Quảng Trị, Thừa Thiên

Tiuế, Quang Nam, Da Nẵng, Quãng Ngai, Binh Dinh, Ninh Thuận, Bình Thuận đến

Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đáo Phú Quả: [42]

“Trong số các loài có khá năng, tạo trầm thì ⁄1guilaria erassna là loài cày nỗi

tiếng có khả năng tạo ra loại trâm kỳ tốt nhất thế giới [5]

1.1.2 Dặc điễm sinh trưởng của cây đó bau

Đó bắn là một loại cây gỗ thường xanh, cao 20 - 30 m, đường kinh thôn đạt

60 - #0 ơm, thân thường thẳng, đôi khi có rãnh dạng lòng mảng, võ ngoài nhẫn, mau xiâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nút dọc lăn tin, dé bác và

tước ngược từ gốc lên, cảnh mãnh, cong queo, máu nâu nhạt, có lông hoặc nhẫn, tán

thưa La đơn, mọc cách (so }e), cuống lả dài 4 - 6 mm, phiên là hình trừng, bầu dục

Thuôn đến mác thuên, kích thước 8 - 15 x 2,5 - 9 em, xmặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt hơn và có lông nun, gốc lá thon nhọn dẫn bay tủ, chóp lá nhọn, thuôn

nhợn, tận cùng có mũi, gần bên 15 - 18 đồi, thay đổi thất thường, khả rồ ở mặt dưới

Cụm hoa hình tán hoặc chàm tán, mọc ở nách lá hoặc ở đầu cành, cung cụm hoa

tránh, đại 2 - 3 em Hoa nhỏ, mẫu 5, đải hợp ở phần đười, hình chuông, màu vàng,

lục, trắng nhạt hoặc vàng xám, phía ngoái có lông thưa; mặt trong gân như nhẫn, có

10 đường gân rõ, tồn tại ở quả, 5 thùy dải hinh trứng thuôn, đài 12 - 15 mm Phân

phụ dạng cảnh hoa, gốc bản có luyến mật, Quả nang gần hình trứng ngược hoặc

tình quả lê, đài 4 em, đường kính 2,

tại, khi khô nứt lãm 2 mânh, thường mỗi quả chỉ có một hạt Mùa hoa vào tháng 7 -

8, quả chín vào tháng 9 - 16 13], |43J

1ó bầu sinh trưởng rải rác trong rừng thường xanh âm nhiệt đới, nguyên sinh

- 3 em, cá lông mềm, ngắn, có mang đài tên

hoặc thứ sinh, trên sườn núi hoặc trên đất bằng ở độ cao 50 - 1.000 rn có khi lên lới 1.200 m so với mặt biên Ổ nước ta, dó bầu thường phân bố rãi rắc trên sườn nủi có

độ dốc nhỏ, thoát nước, Trong quản xã của dó bằu thường gặp các cây gỗ lớn: Táu,

Huỳnh , đụ một Đôi khi cũng gặp cây đó bầu mọc trong rừng thứ sinh cùng các loài Thành thất, Mỏ lưng bạc, Bưởi bung, Mit nai va Rang rang

Deo bau (4 crassna) ua dat feralit dién hinh, feralit trên mùi phong hóa tử đả kết, đá phiên hay đá granit Lớp đất mặt trung binh hay méng, hơi ẩm, chua hoặc gần trung tính (pH vàe khoảng từ 4 - 6)

‘Tai Malaysia vả vùng Đông Bắc Ấn Độ, dé bau (4 malaccensis) phân bố

kha rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thế trên mét hecta G Déng Bac An Dé, loai dé

‘bau này (hưởng mọc rải rác ở độ cao Lit 200 - 700 m, doi khi 1én toi 1.000 m Da

bầu sinh trưởng trong các khu vực có lượng mưa hàng nằm thay đổi từ 1.500 - 6.500 mm, nhiệt độ trung bình tối đa năm 22 - 28°C Khững kết quả quan sát ở vững Đông Bắc Ân Độ còn cho biết, loài này phân bộ chủ yếu trong rừng âm thường xanh hoặc rừng thường xanh, rất it gặp trong rừng nửa rụng lả Tuy nhiền, trong,

Thực tế, cây dé bau trade va sau khi tai tao tram vẫn sinh trưởng tốt ở những nơi có

độ cao trên đưới 40 ru số với Trực nước biển, ‹4, malaecensis thích ứng với các loại

đất phong hóa trên nham thạch, trên các loại đá biến tính, nhưng cũng sinh trưởng,

†ốt trên đật phong hóa từ sa thạch [42]

Tại Malaysia, từ lâu dã dưa cây đó bầu vào trồng trọt, những quản thể rừng, tram „4 malaccensis 67 năm tuổi đã có chiều cao trung bình 27 m, vả đường kinh thân trung binh 38 em Những cây đó bầu có độ trưởng thành 80 nằm tuổi tại miễn

Đông Bắc An Độ, có chiều cao cây 25 - 30 m, thần to nhất có dường kính 55 - 70

om G mién Tay Bac An Dé (Arunachal Pradesh), cdc quan thé tram § năm tuổi đã

có chiêu cao gân 5 m, và đường kính thân gân 30 em Cũng ê Tây Đắc Án Độ, chúng thường bắt đầu ra họa, kết quả ở thời kỳ dại 7 - 9 năm tuổi Những cá thể có

kich thước trung bình cho năng suất hạt tốt, mỗi cây có thế cho tới 1,5 kg hạt [42]

Các khối

âm thường được tạo thành Irong thân cây hoặc trong những cành lớn, chủng là kết quả của cả một quả trình chuyển hoá các hoạt động bệnh lý ở những nơi bị bệnh, bị thương Nắm là một thành phân có tác đụng trong các hoạt động đó, ngoài ra các côn trừng đục thân cây cũng có thể có mới liên hệ nảo đỏ Có giả thuyết cho rằng, trước tiên cây bị nam gây bệnh tại những, chỗ bị thương làm

cho cây bị suy yếu, tiếp đó ndm thâm nhập vào cây và tạo thành các khéi tram

Nhựa ầm là sản phẩm từ cây hay do nằm lạo ra? Tý giải điển biến của quả trình

chuyển hóa đề tạo thành các hợp chất hóa học trong nhựa trằm thể nao van cỏn là vấn đề nan giải và vẫn chưa hiểu biết tường tân [1]

Đến nay đã xác định được nằm Cy/osphaera mangiferae có ở trầm của loài

A, Malaccensis va nam Melanotus ƒlavolwes chứa trong khối tram ti loai

A, sinensis [42]

Hinh 1.2 Hoa va qua cay dé bau

1.1.3 Gid tri kink té va sinh thai cua cay dé bau

Giả trị kinh tế quan trọng nhất của cây dỏ bâu là để khai thác trầm hương Từ

thời xa xưa trâm hương đã được coi là sản vật hết sức quí hiểm, ngảy nay tram

hương vần lả lâm sản ngoài gỗ cỏ giá trị thương mại quốc tế lớn Trên thể giới trâm hương được sử dụng dé chung cat tinh dau tram, một chất định hướng quan trọng,

trong ngành công nghiệp đề sản xuất các loại mỹ phẩm cao cap Tinh dau tram co

giá trị đặc biệt, được dủng trong công nghệ ché bien các loại chất thơm, các loại

nước hoa cao cáp, giá trị Tràm hương là sản phẩm văn hóa vật chất tin ngưỡng tâm linh của dân tộc Việt Nam da ton tại từ xa xưa đền thời nay [9]

Theo CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of

Wild Fauna and Flora - Công ước vẻ buôn ban quốc tế những loài động thực vật hoang đã nguy cấp) khói lượng mua ban tram hương trên thị trường thể giới thời kỳ

1995 - 1997 khoảng 1.350 tân Giá mua bán trầm hương được tỉnh theo kg tủy thuộc vào chất lượng Giả bản trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vao năm

1993 giao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt

nhấp [11] Theo ước tính của Liên hiệp Khoa học sản xuất tỉnh dâu - hương liệu - +nỹ phẩm Việt Nam thì trong những năm tir 1980 đến 1990, khói lượng trầm hương các loại đã bị khai thác và xuất khẩu từ nước ta khoảng 300 tấn Trơng đỏ có 2.000

kg trầm từ loại 1 - 4 trị giả khoảng 1,5 triệu USD va 300.000 kp Trầm loại 5 - Ø trị

giá khoảng 4,5 triệu UISD; đặc biết lả 200 g kỳ nam loại 1 - 3 trị giá 0,5 triệu USD

va (61 2.800 kg ky man loại 4 - B trị giá 2,52 triệu USD Với giả trị kinh tế cao, trầm

hương đã dem dén những hứa hẹn triển vọng cho ngành sân xuất lâm nghiệp khi |

ha trồng cây đó bẩu, tạo trầm hương có thể làm ra giá trị 1,5 - 1,8 ty déng/ 10 nam,

Đình quân giá tri tao ra 150 - 180 triệu? ha/năm, trong đó lợi thuận từ SỐ - 60 %

fll]

Ngoài ra trong y học, trâm hương còn được sử đụng dé chữa một số bệnh hiém nghéo Theo Đông y, trầm hương là vị thuốc quý hiểm, có vị cay, tính ôn, vào

3 kinh: tí, vị, thận, có tác dụng dáng khí, nạp thận, bình can, tráng nguyên dương,

chữa các bệnh đau bựng, đau ngục, nôn mửa, hen suyễn, lợi tiểu, giảm đau, trân

tĩnh, hạ sốt, câm khâu, thổ huyết, khó thở, kich dục Theo tây y, râm hương có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn A#ycobacteruzn tuberculosis va

Shigella flexneri, cò tỉnh khánh sinh, tạo kháng thế mạnh (điệt khuẩn, làm lành vết

thương), có tác dụng chữa một só bệnh như bệnh về tim mạch (suy tìm, đau ngực),

‘bénh vé hồ hắp (hen suyễn), bệnh về thân kinh (an thản, mắt ngủ, giảm đau, trần

tĩnh ), bệnh về tiêu hoá (đan bung, buẳn nồn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu

tiên) Đặc biệt, có thể đừng trằm hương để chữa ung thư tuyến giáp [42]

Cũng giồng như một số cây lâm nghiệp khảo, đó bầu là một trong những cây

lâm nghiệp cùng cấp nguyên liệu làm giấy có chất lượng cao Theo các kết quả

nghiên cứu thực nghiệm nhiều năm của Trung tim nghiên cửu lâm đặc sẵn thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, đó bảu là loài cây thích nghỉ tắt với khí hậu

Triệt đổi nông Âm mưa nhiêu và cho năng suất khai thác khá cao, được ngành công, nghiệp giây xác dịnh là một trong những nguồn nguyên liệu chỉnh trong, các dự án đầu tư phát triển sản xuất của ngành từ nay đến năm 201 0 [6]

Tên cạnh đó đổi với môi Irường sinh thái và phát triển bên vững Thì việc dưa

đó bầu vào cơ câu cây rững với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tình nói

riêng và trong cả nước nói chung đã gdp phản thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng, chồng xói mòn đất vả bão vệ môi trường Đẳng thời gớp phân bảo tổn và phát triển loài cây đặc hữu, qủy hiếm, có giả trị về khoa học và kinh tế của nước ta Đây con

là giải pháp phủ hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trường, kết hợp lợi Ích tước mắt với lọi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tải tạo lợi thế đặc

hữu, ưu việt của tài nguyên quốc gia Hơn nữa, cây dé bau còn có ý nghĩa tạo công,

ăn việc làm cho người lao động mở ra hướng phát triển kinh tế bẩn vững cho nông

thôn, vùng sâu vừng xa |5]

1.1.4 Thực trạng mồng và khai thắc cây đả bầu trong nước và trên thế giải

Với giá trị kinh tế cao và nhụ cầu ngày cảng tăng nên trên thế giới nói chung,

và Việt Nam nói riêng, trâm hương tự nhiên bị khai thác đến cạn kiệt [L3] Năm

1994, cây dó bầu dược ghi trong công ưỏc quốc tế CITES quy định về việc buôn bán các sinh vật có nguy cơ tuyệt chúng [31]

- Trong nước

Theo thống kê của ngành thương trại, nước ta Lừ năm 1986 - 1990 đã khai

thác và xuất khẩu khoáng 1.163,9 tân trằm hương Nhưng cũng giảng như các nước trên thế giới, số lượng này ngày cảng giảm sút, năm 1985 khai thác và xuất khâu

216,1 tân đến năm 1990 chỉ còn 73,4 tân

Do có giá trị kinh tế cao và những thành công ban đầu trong các nghiên cứu

†ạo trâm trên cây đó bầu mà hiện nay, các đựự án trống cây đó bâu đã và đang thu hút

sự quan tâm của các dịa phương trêu cả nước Việc nhữn giống cây dó bảu vả sân

xuất trằm bên vững, là một vẫn để cân thiết về mặt kinh tế vá xã hội nhằm đem lại nguồn lợi lớn từ tram hương đồng thời gớp phần bão vệ môi Irường và ngăn ngừa tỉnh trạng khai thác cây đó bầu trong tự nhiên Quyết định 16/2005/QĐ-BNN ngày

15/03/2005 của Hộ NN-PTNT đã cho phép 6 trên 9 vùng sinh thải cá nước được

trang rừng sẵn xuất hằng cây dò bầu Kết quả rong vòng 3 - 4 năm gân đây diện tích cây do bau tăng nhanh góp phần da dạng hỏa loại cây trồng rừng và cây đặc sản, hứa hẹn nhiều triển vọng lớn cho nền lâm nghiệp nói riêng và nên kinh tế nói

chang [44]

Theo thông kê của IIiệp hội trằm hương, năm 2002, điện tích trồng cây đó

bầu ở các tỉnh phía Nam là 2.340 ha đên năm 2004 đã lên đến 5.527 ha, số liệu này

chủ yếu do tư nhân trồng cung cấp [7] Sẽ liệu thống kẽ của hiệp hội trâm hương,

cho thay chỉ qua 2 năm điện tích trồng cây đó bầu ở các tính phía Nam đã tăng thêm

?0%, đến năm 2007 đã có trên 22 tĩnh, thành trồng cây đỏ bầu với điện tích khoảng 15.000 - 18.000 ha, phân bố trên cã 3 miễn Bac, Trung, Nam | 4|

Tuy nhiên, đo diện tích trắng cây dó bầu ngày cảng tăng, trong khi đó nguồn cụng cấp hạt giống chủ yêu là những cây đỏ bồ mẹ côn lại trong rừng tự nhiền và từ

một số cây trồng vào thập niên 80, 90 cua thé ley XX để dẫn dén thoải hóa giống, Tgoài ra, phần lớn các cơ sở sẵn xuất giêng cây là của nr nhân, hạt giống thu hải từ những cây chưa tuyển chọn dầu dòng hoặc cây chưa thành thục sinh dục, kỹ thuật gieo ươm bạn chế, làm cho chất lượng giống cây còn những, điều đáng lo ngại Hơn

nila, hién nay, các loài đó bản ở Việt Nam bị lai tạp rất nhiên, công tác lựa chọn

giống dưa vào trồng, dựa chủ yêu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm của mỗi

cả nhân đẫn đến năng suất và chất lượng trằm thu được không én định

- Trên thê giới

Tại Malaysia va vùng Đông Bắc Ân Độ, dỏ bằu (Aguilaria crassna) phan bé

khả rải rác, độ gặp khoảng 2,5 cá thể trên một hecta Thái Lan được biết đến là quốc

gia trỗng và khai thác trầm hương nổi tiếng, Ở miễn dang Thai Lan phat hién thay Toài A subintegra, theo sé liệu cho biết loài này rỗi phố biển ở tỉnh Trad Trước dây,

đo người nông đân không biết khai thác trầm từ loài này nên đã đem một số loài từ

Có thể thấy, nhu cầu trâm hương trên thế giới ngày cảng cao và trầm hương

Tnua bán lrên thị trường hau hết là khái thác từ thiên nhiên Những một thực lễ chủ

thấy việc khác thác trầm hương vào những thập niên cuối thế kỷ XX có tỉnh chất thuỷ điệt cây dó bầu, làm cho nguẫn cung cấp trâm hương trên thị trường ngày càng

cạn kiệt Năm 1993, Indonesia khai thác và xuất khẩu hơn 661 tấn đến năm 1997

con sé dy chỉ còn 302 tấn, tương tự nhờ Indonesia, Malaysia từ 43,6 tắn còn 21,6

tắn, Campuchia năm 1995 khai thác và xuất khâu L33,8 tân sau 3 năm chỉ cỏn 13,2

Ân Độ năm 1995 xuất kị

tấn ú 15,1 tân đến năm 1997 cờn 1,4 tấn Những số liện

này cho thấy một thực tế khối lượng trầm bương mua bán trên thị trường đang giảm sút nghiêm trong do cây đó bầu tử thiên nhiên bị khai thác nặng nể Yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các quốc gia phải có biên pháp cũng như kế hoạch trồng và nghiên cứu tạo tràm trên cay dé bau đảm bão nàn cầu lớn của thị trường thể giới ƒS]

1.1.5 Các nhân tỗ ảnh kưởng tới khả năng tạo trầm nhân tao

Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây đó bu là sự biến đổi của các phân tử gỗ

đo tác động bệnh lý bởi vết nứt gấy, sự xâm nhập của các loài nắm xảy ra một

cach tự nhiên năm này sang năm khác Khi bị nhiễm bệnh ở một vùng nảo đó, cây

sẽ tích tụ ninra đên đây đề tự băng bỏ vết thương, xem như một khả năng tự để

kháng để chống lại bệnh nên tạo ra rằm kỳ Căn cứ vào sự hóa nhụa nhiêu hay ỉL

rà có những săn phẩm như: Tóc, Trầm hương vả Kỳ nam Dễ săn xuất trầm hương, nhân tạo thách thức lớn nhất là công nghệ tạo trầm, chất lượng cây giống, các chỉ tiêu về lâm sinh déi voi cây đó trồng, sự Lương thích giữa các cây trồng xơn, bệnh

của cây [43]

Trong đó, đựa trên cơ chế hình thành trầm trong từ nhiên, hiện nay về cơ bản

có 3 kỹ thuật cây tạo trầm nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu: Phương, pháp vật lý (gây vết thương cơ giới); Phương pháp hóa học (xúc tác hóa

bảo của do bau da bước dâu có kết quả [23], [20]

Tiên cạnh các nghiên cứu về các kỹ thuật cây tạo trằm nhân tạo, một hướng

nghiên cứu cũng rất quan trọng nhưng còn bí bỏ ngõ đỏ là các nghiên cứu ở mức độ

sinh hoe phan ti quan thé do bau để xác định nhỏm các cá thể hay giống dỏ bầu có

khã năng tạo trâm hiệu quả, vì ngay trang tự nhiên không phải bắt kỳ thân cây đó

e loài khác nhan

tấu nào cũng có trầm va khả năng lao tam, chal luong trầm ở

cũng là rất khác nhau Hơn nữa, việc dầu tư trồng cây đỏ bảu dến khi thu hoạch là

khả lầu, đòi hỏi thời gian khoảng 7-10 năm (sau 5-7 năm mới có thế cây tạo trầm

nhân lạo, và sau 2-3 năm mới có thế hạ cây để thu trằm) Trong hội nghị về cây

/2004 tại thành phố Hẻ Chỉ Minh, các chủ trại trâm cũng dưa

tram hương ngày 2

Ta những bắn khoản về công tác lựa chơn giỏng để có được trầm chất lương cao, do

chất lượng trầm tạo được thật sự chỉ tạo trầm loại 4 loại 5 ảnh hưởng rất lớn dén

"hiệu quả kinh tế [5]

1.2 Một số phương pháp sử dựng frong việc dịnh danh loài và xác định quan

hệ di truyền

Có niều phương pháp nghiên cứu kháo nhau trong phân loại và xác định

loài ở động, thực vật và hấu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chưng nguồn gốc, có những tính chất giếng nhau, cảng gần nhau thỉ

tỉnh chất giống nhau cảng nhiều Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoa, phôi sinh học Dối với thực vật, đặc điểm hình thái học của

các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cảnh có tu

điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thông kê phân tích một hoặc nhiều tỉnh trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp Điều nảy thật sự

gặp nhiều khó khăm khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mắt hình

thải bên ngoài Do vậy, việc dịnh danh dựa trên quan sét hình thái và kinh nghiệm

dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nêu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tứ

Tuên đại

Cáo phương pháp phân loại học phân tử và xác dịnh loài là hướng nghiên

cửu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dụng dựa trên việc nhận

biết thành phần va cau trúc của các gen đặc hữu của cac taxon sinh vat Hién nay,

các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài

Phan loại học phan ti co thé dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen

nhân, hệ gen của cáo bảo quan như tỉ thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như

gen lại phù hợp với từng đối tượng và

roleir, enzyane Mỗi loại gen, sẵn phẩm cũ

xuục dịch nghiên cửu khác nhau Do đó, việc lựa chọn gen nảo, loại protein nảo có ý

nghĩa lớn đổi với sự thành công của mối hướng nghiên cứu Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gầm: kỹ thuật isozym (đồng enzwine), các kỹ thuật phân tích so

sánh trình tự mueleotide các đoạn DA như phương pháp đa hình chuẻu dải các

đoạn cất giới han (Restrichen Fragment T.eneth Palymorphism - RFLT), các kỹ

thuật trên co sở phân ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repcals), da hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amphified Polymorphie DNA) [17], [24], đa hình chiều đài các đoạn DNA nhân bản - ATLP (Amplified Fragment

|8[ dã giúp giải quyết các

ty đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiên hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật Thêm vào đó cáo

Length Polymorphism), phan tich trinh ty DNA

xồi nghĩ ngờ về vị trị phân loại, đánh giá

*kỹ thuật này cũng dược sử dụng như những chí thị phản tứ dễ xác định những gen

+kiêm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đỏ của các cá thể, loài hay các nhỏm

loài

đeng được các nhà khoa học trên thể giới tập trung nghiên cửu và có những đồng,

Gan day, vié

góp đăng kế trong việc phân loại loài Đề nhận dạng gen bay đánh giá mức độ tiễn

Hoá loài thì các nhỏm gen chính thường dược sử dụng là gen ribosore rRNA, gen

ty thế, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rIENA 185, 55 và 165 hay được dùng

để đánh giá môi quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật So với chỉ t hình thái và chỉ

thị hoá học, chí thị DNA cho dộ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc váo bất cứ

yếu tổ khách quan nao

1.3 DNA barcode - quan diém mới trong phân loại

1.3.1 Gidi thigu DNA barcode

Kỹ thuật DNA barcode (DMA mã vạch) là một tên mới cho một khái niệm

cũ Thuậi ngữ “ DNA rã vạch ” lân đầu tiên được sử dụng vào năm 1993 (Amon,

1993), trong một bài bảo mà khỏng nhận được sự chủ ý nhiều từ cộng đồng khoa

hoe, va pan đây thuật ngữ này được sử đụng lại trong nhiều nghiên cứu Về cơ bản,

kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực DNA (400-800 bp) như là một Hiệu

chuẩn đễ nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật DNA mã

vạch giứp các nhà phân loại học trong công tác phân loại và xác định loài, Nêng cao

tăng lực kiểm soái, hiểu biết và tận dụng sự đa dang sinh học Ngoài ra, kỹ thuật nảy cỏ triển vọng nghiền cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa

hhọo pháp y, y tế, nghiên cứu y được, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm

Phương pháp nảy vô củng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học

cân giảm định loại đã được qua xủ lý, chế biển như các dạng chế phẩm thuốc hay

thực phẩm đã qua chế biển

Tiên thực tế, DNA barcode bat đầu có lẫm ảnh hưởng từ nghiên cứa của

iebert và es (2002), kết quả của nhóm nghiên cửu chỉ ra rằng các cả thể từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gi với nhau thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với

độ chính xác 100% bang cach sit dung gen ty thé cylechrome ¢ oxidase du don vi

I (COD [36] Sau đó nhiều nghiên cứu về định đanh loài bằng chỉ thị DNA đã thành

công trên động vật như chỉm, cá, Ốc tiể

Cảnh cứng, Gần dây, hệ thống chỉ thị DNA đang dược thiết lập cho các nhóm sinh

„ nhện và một số loài côn trùng thuộc bộ

vật khác như thực vật, tảo, nắm, sinh vật nguyên sinh vả vị khuân đã thu được hiệu quã đáng kế

Dé thic diy viéc siz dung DNA barcode cho tat ca sinh vật nhân chuẩn sóng,

trên hành tính này, CHOL (Consortium for the Barcode of Life ) d& duge thanh lap

vào tháng 5 năm 2004, gồm hơn 120 lỗ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu

là xây dựng một thư viện trực tuyển trinh tự barcode cho tất cả các loài cưa dược biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại che bắt kỳ mẫu DNA nào Với sự hễ trợ

của CBOL, DNA barcode ngày cảng phát triển và trở thành một phương pháp phân

loại và định danh loài mới

Trong bi cânh của nên kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác đông đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng phương,

pháp nhanh là cân thiết đề đánh giá đa dạng sinh học của cáo khu vục này nhằm bảo

vệ các loài đặc hữu quý hiểm và rguy cấp Tuy nhiên cần lưu ý rằng DNA barcode không thể thay thể phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích dễ tạo ra thông tin về dơn

vị phản loại chưa biết Hiện nay, trên thê giới, kỹ thuật này đang được sử đựng chủ yếu bồi cáu nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ö các lĩnh vực khác như khảo

cổ học, công nghiệp sinh học và chế biển thực phẩm

1.3.2 Cúc đặc diễm cơ bân của trình tự barcole

Tặc điểm quan trọng nhất của DNA barcode là phải phố biến và đặc hiệu trong các biển dị và đễ dàng sử dụng, Điều này có nghĩa là các doan gen được sử dụng như một barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phần loại, có sự biến đổi giữa

cáo loài nhưng ốn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biên đổi không đáng kể

Do dé, DNA barcode lý lưỡng là mội đoạn DNA có trình lự macleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mỗi được thiết kế đặc hiệu để dễ đảng khuếch đại bang PCR

Với động vật, hệ gen ty thế với các đặc tính đi truyền theo đỏng mẹ, tốc độ đột biển cao chủ yếu là các đội biển thay thể trong vùng mã hoá, vùng điều khiển và không tái tổ hợp được coi là một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu tim ra nguồn gốc các loài Thêm vào đỏ, DNA ty thé có số hượng bân sao lớn trong tế bảo và bên

vững trong thời gian rất đải, hàng nghìn nấu trong khi đó DNA nhân chỉ cỏ một

bản sao và nhanh chóng bị phân huý ra ngoài môi trường Do vậy phân lớn các nghiên cứu sử dụng một vùng DNA ngắu của gen ty thể mã hóa cyloclome œ

oxidase subunit I (COI) lim chi thi DNA Mic dit c6 vai truong hop ngoại lệ, COI được coi là một chỉ thị DMA điển bình vá chưng cho các loài động vật [35], [36],

145]

Qua trink tim kiém mét ehi thi DNA chung cho cae loai thyc vat gap nhiều khá khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiên đặc điểm thịch hạp đối với chỉ thị

DNA va hé gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi 77% (Internal

Transcribed Spacer) thường được sử đựng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên

cứu [12], [26], [33] Trong vòng 5 năm qua, nhiều vừng gen đá được nghiên cím và

để xuất là chí thị DNA che thực vật [14], [19], [29] Tuy nhiên chưa có chí thị DA,

nào được đa phan các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [14], [22],

{25] Mặc đà vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất

sẽ

cân không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật

[14], [29], [19]

Theo Tabertol P va cs (2007), hệ thống nã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng

các yêu câu sau dây:

- Thứ nhất, đoạn DNA chỉ thị phải đủ đô biến thiên để phân biệt giữa các loài

xhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài

- Thử hai, hệ thống định danh bằng IDNA phải được chuẩn hóa, với củng một

vũng DNA có thể được sử đựng cho các nhóm phân loại khác nhau

~ Thứ ba, doạn DNA chỉ thị cần chứa đỏ thông tin phát sinh loài để có thể dễ

dảng định danh loài vào các nhóm phân loạt (chi, ho,

- Thứ tư, có khả năng áp dung với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mỗi nhân

sen có dộ bảo thủ cao, dể dàng thục hiện phản ứng khuéch dại và dọc trinh tự DA

- Doạn DNA nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản DNA

không bị sai lệch Thông thường, doan DNA nghiên cứu có kích thước 150 bp trỗ

lại, nếu đài hơn sẽ để bị sai lẫm trong quá trình nhân ban DNA

1.4 Mật số locus được sử dụng trong phương pháp DNA hbarcade ở thực vật

1.4.1 Trình tự gen nhân

Cáo trình tự bareode được nhân ban từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cụng cấp nhiều hơn thông tín về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PUR từ gen nhân vi gen nhân chủ yêu là đơn gen hoặc có bắn sao gen thắp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt đưới loài đo bảo toàn gen chức năng có thê chính là lý do tại sao hạn chế số hương

các gen nhân được thử nghiệm trong, xác dịnh loài bằng phuong phap DNA barcode

[36], [391

142 Ving gen mi héa ribosome

Gen rDNA 1a hé thống đa gen mã hóa phần RNA của ribesome Các gen

DNA ribosome (DNA) mang trinh tu vita co tính bảo thủ vừa có tính da dạng thích

hợp đề phân biệt các loài gần gũi Trong tê bảo, (DNA được sắn xếp như các don vi

được lắp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mi da ribosome 185, 5,88, 28§ và xen giữa

các trình tự không mã hóa 77%7, 27W2 (intemal transcribed spacers) nằm ở hai bên

sườn của vũng 5,85 Vùng mã hóa của ba genrDNA được bảo tồn cao hơn hai vững,

ITS Nhin chumg các đơn vị rINA dược lắp lại hàng nghìn lần và dược sắp xếp lập trung tại vùng, lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tình nắng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiền hoá độc lập, thay vào đó tắt cả các dơn vị tiền hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA dạt mức én dinh cao

hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Hiện tại, »zƑ7S vùng TTẾ của gen nhân được xem là một trong những công cụ

Tiữu ích nhất để đánh giá phát sinh loái ở cả thục vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa tử bẻ mẹ vả biến đổi cao do ít hạn chế chức năng, Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thây một số xuức độ biển đối ban sao của trình tự 7787 va JTS2 do nhiều nguyên nhân nhat lai gan, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biển cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dan đến những thay đối đó Trên cơ sở này nrDNA có thế được sử đụng

để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong củng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lầu năm, trên cạn, dưới nước) va nguồn gốc tiến hóa

khác nhau [36], [39] [46]

1.4.3 Trình tự gen luc lap

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phản tt DNA mạch vóng cỏ kích thước 120

- 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single-copy regicn) và

an sao don nhé (smal! single-copy repion) Hai bản sao được phân cách bởi hai

chúa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các

gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoang 100 gen) cần thiết cho sự tên tại của chúng,

Bang 1.1 Thêng tin của một sô mỗi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp

>: mỗi xuôi; ‹ : mỗi ngược

TIệ gen lục lạp có tinh bảo thủ cao và meng tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hé gen luc lap vào nghiên cứu phát sinh loài và

phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin cd

sẵn tù các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gân đây, một số locus là

đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu lam chi thi barcode tiềm năng cho

các lồi thực vật trên trải đất, Cĩ khoảng 20 gen lục lạp cĩ dé dai phủ hợp (khống,

1 kh) được sử đụng trong nghiên cứu phát sinh lồi Các gen này chứa đựng nhiêu

mức độ tiến hố và vì vậy phủ hợp cho nhiều rrức độ phân loại [36], [8] [35]

Cáo locus khác nhau đã được để xuất về điều tra nhĩm, mỗi thích hợp cho

cáo gen này được trình bảy trong bang 1.1

1.44 Trình tự gen rbc”,

Trong các gen lap thể, rừF, là trình tự gen đắc trưng nhật, mã hĩa các tiễn

dơn vị lớn của rabilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO)

rbeL là gen đầu tiên được giải trình từ thục vật zbeE, đã được sử dựng rộng rãi trong

nginên cứu phát sinh lồi và phân bơại thực vật với hơn 10000 trình tự rấcŸ, cĩ san

trong GenBank Do su dé dang trong khuéch dai PCR & mét

CBOL gân đây đã cơng nhận rbcl 14 mét trong nhimg trinh ty gen tiém năng nhất

mhĩm thực vật,

cho các nghiên cứu DNA barcode & thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân biệt lồi

nên hấu hết các nhỏm đều cho rằng nên sứ đạng kết hợp rưaL, với các với các

chỉ thị bareode kháo, ví đụ như mafK 1a hai locus bareode chuan cho thue vat [36], [371,5

LAS Trink te gen mai”

Trong sé cac gen luc lap, matK là một trong những gen tiền hố nhanh nhất,

cĩ kích thước không 1550 bp và mã hĩa cho enzyme maturase lién quan đến quá

trình loại bỗ 6 miron loại 2 lrong quả trình phiên mã RNA Do maiK tiên hoa

nhanh vả cĩ mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong,

nghiên cứu rỗi quan hệ giữa các lồi và phát sinh lồi ở thực vài CBOI, đã thử

nghiệm øafK trên gần 550 lồi thực vật và thấy rằng 90% màu thực vat hat kin dé dàng khuếch đại trinh tụ bằng cach st dụng một cặp mdi đơn và để nghị sử dang zmalE là một trong những loeus barcode chuẩn cho thực vật 136], [40]

1.46 Trình tự geH rpeB và rpaC1

Gen rpoB, rpoC'l, rpoC2 mã hĩa ba trong 4 tiéu dou vi cia RNA polymerase lục lạp Khi nghiên cửu ho Dipterocarpaceae, Tsumura va dig (1996) đã nhận thây

gen rpoB là thích hợp dễ nghiên cứu phát sinh loài Hiện nay rpo8 là gen dược sử dung nhiều trong nghiên củu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là

khi nghiên cửu các chứng có quan hệ gắn gũi Cùng với gen 165 rRNA, rpoB duoc

sử dụng trong nhiều nghiền củu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này

được đề xuất là chỉ thị baroode đôo lập hoặc kết hợp với một số gen khác Trong các

nghiên cứu gần đây, CBOIL, đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cua doan gen rpoC là thắp nhất (43%) Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Lĩu và

đtg (2010) đã chỉ ra rpoC7 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt

các loài bryophytes Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng mninh sự phù

hợp khi sử dụng rpo# và rpoC1 lám chủ thị bareode trong các nghiên cửu giám dịnh loài [36], [38]

1.47 Trình tự gen yofS

ợfŠ mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này được bão tổn

trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA

barcode ciia một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử đựng

nhiều lrong vai trò của một DNA barcode [36], [35]

148 Trình tự hai gen trnH-pshA

Gen #niT-psb4 có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ

296 dén 1120 bp, mmi-psb4 được chứng minh là có khả nắng xác đỉnh loài cao T,ocus #nf-psb4 đã dược khuếch đại thành công ỡ nhiều thực vật hại kín và bại trên uy nhiên, trong nhiéu thye vat hat kin fraH-psdd lại có kích thước rất ngắn (~-

300 Ðọ), kích thước cũa gen này thay đối lớn đo sự có mặt của gen zpŠ7 9 hoặc các

gơn giả nằm giữa cùng gen của hai gen nf và psb4 Trong nhiều nghiền cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng #z//-psb/1 như chí thị bareode độc lập cho thực vật hay

kết hợp với maC CRƠI, thấy rằng khả năng, phân biệt loài của trnH-psbA td cao

nhất (69%) trong số 7 locus dược thử nghiệm và do đỏ dễ nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung øz/7-psbxi có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus khi hé thống barcode hai locus khéng cung cấp day dit kha nang phan tích [361, [28]

1.49 Trình tự hai gen err(UAA-trnF(GAA)

1.oons ®ữ, (LAA) - f7 (FA A) chúa gen nữ, (ÚA A), vùng inrơn và vùng

nam gitta hai gen gral (UAA) va ouF (GAA) Taberlet va đhg là nhóm nghiên cứu

đầu tiên sử dựng #zư, trong các nghiên cửu hệ thống học thực vật Vùng không mã hoá œmH(UAA) và #ømF" (GAA) không phải là vùng có sự biển đổi lớn nhất của DNA lục lap nhưng có ưu thế nẵừ cầu trúc bậc 2 với vùng biến đổi và vững bảo thủ xen kẽ nhau Điều này tạo thuận lợi cho các nghiền cứu tìm kiểm trinh ty nucleotide

ð các vùng bảo thủ đề thiết kế mỗi vả sử đụng kỹ thuật PCR dé khuếch đại các đoạn gen @ ving biển đổi Trong nghiên củu để xác dink tral (UAA) intron cd nén được

stt dung lam ving DNA barcode, Taberlet (2007) dã sử dụng 100 loài thực vật và

kết luận rằng tử, intron có thể sử đụng như là một bareode của thực vật, anl.-irn

là một barcode tiểu răng cho phân tích, xác định các loài thực vật |29|, 136], [40] 1.5 Tình hình nghiên củu DNA barcode ở thực vật

“Trọng tâm nghiên cửu barcode ở thục vật chú yếu là về đánh giá hiệu quá

tương đối của của các đoạn gen chi thi đã được sử đụng trong nghiên cứu phát sinh

loài Đối với thực vậL, quả trình tìm kiếm một chỉ tị DNA chung cho ede Joai thc vật gặp nhiều khỏ khăn Liệ gen ty thể ở thực vật thường quả bảo thủ nên không

được đủng cho chỉ thị DNA, trong khi đỏ hệ gen lục lạp lại mang nhiễu đặc điểm

rong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ly thé ở động vậi Ở hệ gen nhân, vũng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) cing

được sử dụng làm DNA chi thị trong một số nghiên cứu [12], [26], [35]

Mie di một vải locus trong hệ gen lục lạp và gen nhân đã được nghiên cứu

làm chí thị trong nghién ctu DNA barcode song kết quả thu dược vẫn cỏ những hạn

chế Điểu này cho thấy việc cần thiết sử dụng kết hợp các loeus để bỗ sung cho nhau đem lại biệu quả cao hơn trong đánh giá, phân loại các loài thực vật Trên thực

tế từ lâu r©c?, đã được sử dụng trong nghiên cửu phát sinh loài, bên cạnh đó trình tự

gen maiK có tỹ lệ tiến hóa cao nhỏi rong cde gon lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao, Trên cơ sở đó CBOL dã kết hợp hai locus của rbeL, và maiÄ rang lại

hiệu quả cao (70% sự phân biệt loài) và giảm nhiều chỉ phí cho các điều tra về xây

dựng mối quan hệ cũng, như phân loại đành giả các loái thực vật Hiệu quả kết hợp giữa hai gen này thích hợp cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật -

động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy

„nô lớn vả phân biệt cảy giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biét va cho

mục đích xáo định loài và phân loại [36]

Spooner sau khi xem xél higu qua cia psbd - traH, malK, nrITS trên 63 loài

khoai tây dại dã chỉ ra rằng trink ty oa psbet - frnH, matK va mrITS khong cung cập đây đủ các thông tin về loài cụ thể Gen lạp thể không cho thấy đây đủ sự khác biết,

trong khi các trình tự ø7TẾ cho thấy sự khác biệt trong loài cao Những khó khăn

dó cũng gặp phải wong chí Magnolioideae, họ Magnoliaceae vả trong họ Lauraceae

khi giải thích những mối quan hệ rong loài Từ những nghiên cứu cụ thế trên ba

hom thực vật khác nhau, thực vật bạt kín, hạt trần và rêu các nhà phân loại kết luận

ring việc kết hợp các locus hệ gen lạp thể hu récé + rpøC1 + matK + trnH1-psb1

xnang lại hiệu quả cao như mệt hệ thêng barcode duy nhật cho xáo định các nhóm loài rộng Vì vậy, trong các dự án như giảm dịnh loài sử dụng các chỉ thị barcode,

việc để xuất barcode hai locus tiêu chuẩn lá không đủ do sự phân ly trong loái và quan thế ở nhiều thực vật hạt kín là rất lớn Đặc biệt trang cùng khu vực phân bổ trải qua giao phối và giao phổi cận huyết, sự thay dỗi của một hoặc hài trình tự gen

lạp thể không đủ để đánh đấu ranh giới loài Các vẫn đề sinh học như đa bôi thể, di

bội, sinh sân vô tỉnh, chuyển gen, chọn đêng, phân ly và tiền héa nhanh hình thái

hoe din dến sự khó khău trong xác định loài Do vậy không thể sử đụng cùng một ving DNA để xác định cho các loài khác nhau mả cẩn lựa chọn các vùng DNA khác nhau cho xác định ở các loài khác nhau [37], [38]

Tiện nay hệ thông DNA barcode cho thực vật chưa hoàn chỉnh Tuy nhiên với cáo trình tự DNA baroode này, cáo nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng

dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mỡ ra một triển vợng mới cho cho công tác dành giả, phân loại và bảo tổn da dạng sinh hoc

1.6 Một số kết quả trong nghiên cứu vỀ cây dó hầu tại Việt Nam vả trên thể

giới

Xuật phát từ nhữmg giả trị mà cây dó bảu mang lại đã thúc đây các nhà khoa học trên thể giới trong đỏ có Việt Nam đã tiến hành những thi nghiệm để nghiên

cứu vẻ loài cây này Một trang những nghiên cúu có đóng gớp lớn nhất cho tới nay

là T8 Tê Công Kiél va TS Paul Kessler ngudi Ha Tan da phat hiện loài 4guifaria rugosa nim 2005 déng thoi phan bigt duge Aquilaria rugosa voi A sinnesiss, A crassna, A yunasensis [18]

Đằng chỉ thị AFLP nhóm nghiên cứu của Nurila va đống tác giả (2009) đã phat hiện được sự tương dồng ch truyền giữa các ⁄1guilaria sọ là 44 malaccensis, A

beccatianavà A crasena khoảng 63,9 đến 72% so với các loài Aguilaria khác [21]

Các nhà khoa học người Malaysia cũng đã tiên bình phân tích trên 5 quần thể cây

do bau 6 Malaysia bing chi thi RAPD với 23 cặp mỗi RADE từ đó đã tìm ra 5 chỉ

thị SCAR đề phân biệt 44 Arta vdi cdc Aquilaria khac [27]

2.1.Vật liệu

Chương 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

21.1 Thực vật

Gồm 18 mẫu lá cây do bau được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào

được thông kê qua bảng sau

Tăng 2.1 Thông tin về các mẫu đó bầu đừng trong nghiên cứu

SIT Tênmẫu | Loài Xuất xứt

21.2 Chũng vì khuẩn

Chủng vi khuẩn Zscherichia coli (DI1So) sử đụng cho mục đích tách động,

đo Phỏng Công nghệ tế bảo thực vật - Viên Công nghệ sinh học cung cập

21.3 Hóa chất

Kit tinh sach DNA (AccuPrep* Gel Purification Kit) eta hang Bioneer (Han

Quốc)

Enzyme han chế BamHI, T4 DNA Iigase của Fennenlas (Hàn Quốc), Taq

DNA polymerase, RNase duge mua tử hãng Fermentas, vector tách đóng pBT do

Công nghệ sinh học cung cấp, Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Vì

Hoa chat ding cho tach chiél DNA tổng số: Nile Iéng, CTAB, NaCl, Tris

HCL HDTA, Sorbitol, NaH,PO,, H,O deion, Isopropano!, Ethanol, Chloroform, Isoamyl alcohol, RNase

Hoa chat ding cho tach dong gon: X-gal, IPTG, Vector tach déng pBT do

phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cdp, Bacto tryptone, Yeast extract, NaCl,

khang sinh carbecillin

Hoa chit dé tach plasmid: Sol T (Tris HCl, EDTA), Sol TT (NaOH, SDS), Sof 1H (Kali axetat), isopropanol, ethanol, phenol, chloroform [16a chat ding cho phan ting PCR: MgCl, Buffer , Tag-polymerase, dNTP

Hỏa chất dùng trong điện dì DNA: agarose, TAR 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide

21.4 Máy móc thiết bị

May PCR System 9700 (Appied Biosystem, My), may điện đi Powerpav300 (Bio-Rad, My), may soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad,

Mg), may chup anh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuy Dién), may vortex

(Mimishaker, TKA, Đúc), máy ly lâm, cùng với các lrang thiết bị khác của phòng

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

21.5 Cúc cặp mài xữ dụng trong nghiên cửu

Cặp mỗi sử dụng trong nghiên cứn này bao gảm 41 cặp mỗi baroode và 1 cặp méi pUC18 Trình tự nncleotide của các cặp mỗi được trính bầy trong bang 2.2

Bang 2.2.Trình tự các cặp môi nhân bản gen barcode

2.2 Phương pháp nghiên cứu

22.1 Các buậc nghiên cứu

- Thu thập mâu lá ở các cây dé bau

- Tách chiết tỉnh sạch DNA tổng số từ 18 mẫu đó bầu

- Sử dụng phương pháp PƠR để nhân bản đoạn gen quan tâm với mỗi đặc hiệu

- Tach dong doan gen quan tim

- Xác định trình tự gen và phân tích kết quả

222 Các phương phúp nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu cây đó ban

DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cái tiên bao gém các

thước sau

- Cân 200 mạ mẫu là cây dỏ bầu vả nghiền can thin trong niờ lồng thành dang bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2 ml

~- Bế sưng 1 ml đệm rửa (thành phân bảng 23) vào ống eppendorf 2 ml, voltex tạo thành dịch đồng nhất Ly tảm 13000 vòng/phút (v/p) trong, 5 phút

- Bễ sưng 0,6 m1 đệm tách chiết (thành phân bang 2.4), đão nhẹ thành hỗn hợp

đồng nhất trong 1 giờ 30 phút ( tỉnh thoảng đáo đều }

- Bổ sung 0,8 mì chloroform: ¡soamylaleohol (24:1), dao déu Ly tam 13000

víp ở 4°C Hút địch néi cho vao éng eppendorf 1,5 ml mdi

~ Bồ sung 0,8 inl isopropanol, dao uhe, dé 6 10 -20°C trong 1 git (it nal 20 phút) Ly tâm 13000 víp trong 15 phút ở 4°C, loại bỏ dịch nỗi flma búa

- Bồ sung 0,8 ml cén 70% Ly tâm 13000 v¿p trong 10 phút ở 4°C, loại cên thu

- Lam khd DNA ở nhiệt độ phỏng,

- Ilda tan DNA trong 200 pif made khit ion, Bé sung 0.5 ud RNase (100 mg/ml)

2.2.2.2 Phuong pháp PCR (Polmerase Chain Reaction)

Phan tmg PCR được thực hiện trén may PCR PTC - 100 (MU Research., Mỹ) với

tống thé tich 14 25 yl/mau trong đó chửa các thành phân và néng độ của các chất

than gia phần ứng như sau:

Bang 2.5 Thành phần phân img PCR

Thanh phan phan ứng Thé tich (ul)

Bang 2.6 Chu ky phan img PCR

Bước | Phân ứng Nhiệt độ Thừigian | Chu kỳ

5 Hoàn lái kéo đải chuối 72 10 phút

~ Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thẻ tích đoạn gel nảy theo quy ước

1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 il the tích

~ Bồ sung dịch kết gắn DNA vảo cột tính sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ

„gu: Vạg = 1:1

~ Ủ hỗn hợp ở 60°C trong 10 phút vả cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi

gel tan hoản toàn

- Chuyển hỗn hợp dung dich lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000

vỏng/phút (v/p) trong 1 phút Loại bỏ dịch chảy qua cột

~ Tiếp tục bổ sung đệm rửa 0,7 ml WB (Washing Buffer), ly tâm 13.000v/p

Loại bỏ dịch chảy qua cột Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút đẻ loại đệm

WB

~ Chuyển cột sang ông Eppendorf moi 1,5 ml Bồ sung 30 tl nước khử ion

khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút đề thu mẫu

DNA

2.2.2.4 Phản ứng ghép nổi gen ngoại lai vào vector

Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tái tổ hợp

thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase Vector sử dụng là

Bang 2.7 Thanh phan phn tng ligase

Phucng phap bién nap DNA plasmid vdeo té bao vi khuan F Coli

Tiến nạp là quá trình chuyén DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có kha ning tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến

Quy trình

- Tế bào khả biến lấy từ tủ -83 °C ra vả cho vào đã khoảng 10 phút trước khi

biển nạp

- Bé sung 10 pl DNA plasmid vao dng té bao kha bién (50 - 100 pl),

- Dễ én din trong da trong vòng 5 phút

- Sốc nhiệt ở 42°C long vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phúL

- Hỗ sung 200 pl méi trường LB long, nuỏi lắc với tốc do 200 vòng/phút,

37°C trong vòng giờ

- Cây trải 100 ¡Ú -150 HÍ trên môi trường thạch LP chứa Carbenieillin

- Nuôi cây trong tú âm 37°C qua đềm

- San phẩm sau biển nạp được cấy trải trên môi tường có chứa kháng sinh carbenicilin, X-gal va TPTG kết quả sẽ xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh

và khuẩn lạc trắng, Tất cả các khuẩn lạc nảy là những khuẩn lạc đều đã được biển

xiạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenioillin nên có thể phát triển được trên môi

trường chợn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc Những khuẩn lạc xanh xuất

hiện là do vector không, có nhận dược gen ngoại lai Do vector co mang operon lac nén khi operon nay hoạt động bình thường và khi có mặt chất cảm ứng IPTG sẽ

tổng hợp enzyme B-galactosidasc, enzyme nay sẽ chuyển hóa sơ chal X-gal think