Luận văn Ứng dụng kỹ thuật lai Điểm Để phát hiện methyl hóa gen rassf1a gstp1 Ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

Cả ba enzyme nảy đều liên quan tới quá trình phát triển của phôi nhưng giảm biểu hiện vảo cuối giai đoạn biệt hóa [44] Su methyl hỏa DNA cỏ liên quan và đóng vai trò quan trọng trong bất

DẠI HỌC QUOC GIA HA NOT TRUONG BAL HOC KHOA HOC TỰ NHIÊN

Doan Thi Héng Van

UNG DUNG KY THUAT LAI DIEM DE PHAT HIEN METHYL HOA GEN RASSF1A, GSTPI1 G BENII NILAN UNG TIIU Vt VA UNG TOU’

TUYẾN TIỀN LIỆT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội-2017

DAI HOC QUOC GIA HA NOI

‘TRUONG BAL HGC KHOA HOC TY NHLEN

Doan Thi Hong Van

UNG DUNG KY THUAT LAI DIEM DE PHAT HIEN METHYL HOA

GEN RASSF1A, GSTP1 O BENH NHAN UNG TAU VU VA TING THU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

‘Ma sd: 60420114

LUẬN VAN THAC Si KHOA HOC

1G DAN KHOA HOC: PGS T§ Vũ Thị Thương Lan

Ha Nội-2017

LỜI CẮM ƠN Trong những năm tháng theo học vả làm việc tại Phòng Thí nghiệm Sinh Y, tôi

cd co héi hoc hỏi kiến thức mới, có điều kiện thực hành cũng như tiếp xúc với tác phong khoa học nễ nếp Tôi được thir ste minh voi những khỏ khăn, thử thách của thực nghiệm mang lại Vì thể, lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin được gửi tới PGS

Vũ

Thị Thương Lan — người đá bên cạnh tôi suốt những năm tháng đó Cỗ là người

thưởng, dẫn đặc biệt, tâm huyết và vô càng kiên nhẫn sửa dỗi khuyết diểm của tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Bich Thuận Mặc đủ, cô không, thưởng dẫn trực tiếp nhưng những lời động viên của cô làm cho tôi suy nghĩ tích cục hơn trong lúc gặp trắc trở Tôi cững xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Anh Thủy Dương và NCS Ngô Thị Hà hai người chị luôn chia sé kinh nghiệm vá lắng nghe

những khúc mắc của tôi Tôi gửi lòng yêu mến của minh tới các bạn đẳng khóa cùng,

toàn thể sinh viên và học viên nao học trong Phòng Thí nghiệm Sinh Y,

Để có được kết quả trong luậu vẫn này, tôi xi cảm ơn Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K, các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại bọc Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điêu kiện giúp đỡ trong, quá trình học tập và thực hành

Téi gửi lòng biết ơn cũng như lời cảm ơn này tới cáo thành viên trong gia đình

dã ủng hộ mọi quyết dụnh của tôi

Hà Nội, ngày 27 tháng 7 năm 2017

Học viên cao học

Đoàn Thị Lồng Vân

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1— TÔNG QUAN TÀI LIỆU

11.1 Methyl hea DNA HH HH HH ng reo "

1.1.2 Methyl hòa DNA vả tung thữ, ào sisennererrrreriereerouf 1.1.3 Methyl hóa gen GS7P1 HH HH HH HH iu re 7 1.1.4 Metyl hóa gen R.4SSE1 HHeHharersrrireierarrrouŸB

1.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT PHẦN TÍCH SỰ MEHTHYL HÓA DKA 10

1.2.1 Cảc kỳ thuật phân tích phổ biển net eervec 10

1.2.2 Kỹ thuật khuấch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specifie PCR) 12 1.3 KỶ THUẬTLAIĐIỂM HH HH HH HH iu re 15

1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật Jai axit nucleic

1.3.2 Phương pháp dánh dau dau do

CHƯƠNG 2~ NGUYÊN [TEU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 CÁC BƯỚC TIỀN HÀNH THÍNGHIỆM co TỔ 2.2 NGUYEN LIBU HOA CHẤT VẢ THIẾT B1

2.3.1 ‘Tach chiết 1DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thư vủ ộ.- 30

2.3.2 Xử lý DNA với sodiam bisuffite ào ienireeierrei 30 2.3.3 Phương pháp PƠR cu ceneeeireirersrreeerieuserooo.3Ó) 2.3.4 Tỉnh sạch sắn phẩm PCR coccccsteccretrtrrrirrrrrirerrrrriiec 3E

35

235

35 2.3.8 Phương pháp lai diQM i ccecccccceeeessssssseseseseeessseeessetee sansssnsssssaessseeeenieee dS 2.3.9 Phương pháp phân tich thống kê sinh HOC oe sessssssaessseeeeeen BO

3.1 ĐIỂU KIỆN LAI ĐIỂM TÔI ƯU CỬA BAL BO G200 VA R200 PHAN BIRT

TRINH TU BI METHYL HOA VA TRINH TU KHONG BI METHYL HOA .38 3.1.1 Kết quả tỉnh sach cac trinh tu nucleotide bi methyl héa va trinh ut

3.1.3 Điều kiện lại điểm phân biệt trình tự GS7Pƒ bị mettyl hóa (Me@) và trình

tự GS7P1 không bụ methy] hóa (LUnG) với đầu đỏ G200 40

3.1.4 Diễu kiện lai điểm phân biệt trình tự 7È455//144 bị methyl hóa ỆMeR) và

trình tự R4SSF144 không bị methyl hóa (UnR) với đâu đỏ R200 42 3.3 PHÂN TÍCH SỰMETHYL HÓA PROMOTER GEN GS7P1 VÀ R4SSF14 BẰNG KỸ THUẬT MSP Heeerrrirrrrirrrrreroseoooeo 7

3.22 Xứ lý DNA với sodiam bisulfite ào 49) 3.2.3 Xae dinh sy methyl hoa promoter của hai sen G67P7 và R.4SSF1⁄4 trên cáo

Bang 2.8 Thanh phan và điều kiện phân ứng MSP với cặp mỗi khuếch đại trình Lự

G871 không bị methyl hỏa TH Hee Sao

Bảng 2.6 Thành phan vả điều kiện phản ứng MSP với cặp môi khuếch đại trình tự

Bang 2.7 Thanh phan va điển kiện phản ứng MST với cặp mỗi khuếch đại trình tự

JR4SSE1⁄1 không bị methyl hỏa à ái snereereeeiereeroo.35

Bang 2.8 Thanh phan và điều kiện phan ứng PCR tổng hop dau do có và không có

Bảng 3.1 Điều kiện lai điểm phân biệt sắn phẩm tỉnh sạch mang trình tự G9777 bị

motlyl hóa (MGG) và trình bự GS57P7 không bị methyl hóa (UnG) sử dụng, dầu dỏ G200 ch nhện HH HH H0 HH HH hen nhu ri 40

Bang 3.2, Điều kiện lai diễm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự #458744 bị

methyl héa (MeR) va trinh tự 7t44SS/71⁄4 không bị methy1 hóa (UnR) sit dung

Bang 3.3 Nông đề và độ sạch của một số mẫu DNA tách chiết tù mẫu mô 48 Bang 3.4 Nong dé va độ sạch của một số mẫu DNA sau xử lý với aodium biaullite 49

lăng 3.5 1ý lệ methyl hóa hai gen G821 và /È49S/74 trong ung thư vú S5

Bang 3.6 Mối lign hé gitta sz methyl ha promoter hai gen GSTP2 va RASSFIA voi

6

các thông số sinh học của bệnh nhân tng thư vú

Hình 1.9 Mục độ tương đồng giữa trình tự bi methyl hoa và trình tự không bị methyl

Hình 3.1 (A) Kết quả tách plasmid mang các trình tự bị methyl hóa và không bị

xmethyl hóa (B) Kết qua dién di 4 ng tinh sach san phẩm PƠR các trình tự nucleotide GSYPI va RASSF14 bi methyl hoa (MeG, MeR) và trình tự

Hình 3.2 Kết quả tổng hợp đân đò G200, R200 có và không có biotin - 39

Tình 3.3 Kết quả lai điểm với đầu đò G200 tại các nông độ muối SSC khác nhau 4]

Hình 3.4 Kết quả lai điểm với đầu đẻ R200 trên các sẵn phẩm tỉnh sạch mang trinh tự

RASSFIA bi methy! héa (MeR) va trình tụ R4SSF14 khong bi methyl boa

Hình 3.5 Kết quả lai điểm với đầu dò R20 tại nhiệt độ 402C, 45"C và 49°C trong,

Linh 3.6, Kết quả lai điểm và điện di của sắn phẩm PCR tinh sạch mang trình tụ bị

methyl hoa (MeG, MeR) và trinh tự khéng bi methyl hoa (UnG, UnR) 46 Hình 3.7 Kết quả điên di minh họa một sé DNA tách chiết từ 49 cặp mẫu bénh phim

mô mg thư vú VŨ và mô liển kê-VI, (Á) và từ 10 mẫu đúc mô ứng thư

tuyến tiên liệt F1-F10 Œ) "¬ AT

Linh 3.8 Kết quá điện dị sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter GSTPI su

đụng các mẫu bệnh phẩm ung thư tuyên tiên liệt (T1-T10) 51

Hình 3.9 Két qua dién di minh hoa san pham MSP phat hién sur methyl héa promoter

gen GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thư vú - 32 Tình 3.16 Kết qui dign di minh hoa sin phim MSP phat hidn sz methyl hoa promoter

RASSF L4 sir dmg cdc mu bénh phim ung ther vii - 34

linh 3.11 Kết quá lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm tung thư vú

Deoxyuridine triphosphate Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay Lstrogen Receptor

Glutathione S-transferases

Glutathione S-transferases Pi 1

Human Epidermal growth factor Receptor 2

imprinting Control Region

e-hm N-terminalkinase

Kilobase=1000 bp

Luria-Bertani Messenger Acid Ribonucleic Methylation-Specific PCR

Prostate specific antigen (khang nguyên đặc hiệu tuyến Hiển liệt)

Ras association domain family 1A Ribonucleic Acid

Sodium Dodecyl Sulfate Single Nucleotide Polymorphism (da hinh don nucleotide) Saline Sodium Citrate

LỜI MỞ ĐẦU

Methyl hóa DNA lả một trong những cơ chẻ chính của di truyền ngoại gen, có vai trỏ quan trọng trong nhiều quả trình sinh học như: phát triển phôi, điều hỏa phiên

mã, câu trúc nhiễm sắc thẻ, bát hoạt nhiễm sắc thể X, in dâu gen và ôn định hệ gen Do

những vai trò quan trọng đó nên hiện tượng methyl hóa DNA có mỗi liên hệ với nhiều bệnh ở người Đối với bệnh ung thư, hiện tượng methyl hỏa DNA bất thường được

quan sát ở các tế bảo bắt đầu bị tôn thương cho tới các tế bảo ở các giai đoạn khác

nhau Bởi vậy, methyl hỏa DNA có thể trở thành dâu chuẩn tiêm năng hồ trợ chân đoán sớm, tiên lượng và điều trị đích ung thư

Các kỹ thuật phân tích methyl hỏa DNA ngày cảng phát triển và hoàn thiện

không chỉ để đáp ứng độ nhạy và độ đặc hiệu cao mả còn có khả năng ứng dụng thực

tiên Hiện nay, kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)

được sử dụng phô biên trong nhiều phỏng thí nghiệm, bởi cỏ độ nhạy cao và không yêu

cầu thiết bị đặc biệt Mặc di vậy, nhược điểm của MSP là không định lượng, cỏ hiện tượng dương tỉnh giả và cần thời gian chuẩn bị gel để phân tích kết quả Do vay, nhieu

nghiên cửu đã cải tiền kỹ thuật MSP cũng như kết hợp với các kỹ thuật khác nhằm mục đích tăng độ nhay, đô đặc hiệu, khả năng ứng dụng trong thực tế và giảm chỉ phí Tiếp

nói các nghiên cửu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khỏi u cũng như kết hợp kỹ

thuật MSP và kỹ thuật lai điểm dé phat hién methyl hoa DNA của Phòng Thí nghiệm

Sinh Y, chúng tôi thực hiện đẻ tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 6 bénh nhan ung thư vú và ung thư tuyén tien ligt”

Chuong 1— TONG QUAN TAI LIEU

11 METHYL HOA DNA VA UNG THU

1.1.1 Methyl hoa DNA

Di truyền ngoại gen là những thay đổi sự biéu hién hoặc kiểu hình có khả năng

đi truyền qua các thẻ hệ nhưng không do biển đổi về trình tự DNA [44] Methyl hóa DNA lả một trong những cơ chế chỉnh của di truyền ngoại gen liên quan trực tiếp tới

sự biến đổi hóa học DNA Đây là hiện tượng thêm một gốc methyl (-CH;) vảo vị trí

carbon số 5 của cytosine thành dạng 5-methylcytosine [44] Hién tuong nay xảy ra ở prokaryote va eukaryote [24] G vi khuan, methyl hoa DNA phan biét DNA genome vi khuẩn với DNA của thực khuẩn thể, nhờ đó DNA của thực khuẩn thẻ bị cắt bởi các enzyme vat chi Déi voi thue vat, su methyl hoa xảy ra ở các cảu trie CG, CHG va

CHH (trong đó H có thể là A, C hoặc T) Nhưng ở động vật có vú, sự methyl hỏa xây

ra ở cytosine trong dinucleotide CpG [24]

Ở động vật cỏ vú, sự methyl hoa DNA duge xtc tac béi ho enzyme DNA methyltransferases (DNMTs) chuyén mét géc methyl tir S-adenyl methionine (SAM)

của gốc cytosine thành dạng 5-methyleytosine [24, 44] DNMT3A va

DNMT3B có thể thiết lập sự methy] mới trên sợi DNA không được biển đổi Mặt khác,

vào carbon số

chức năng DNMTI trong quả trình tai ban DNA dé sao chép su methyl hỏa của sợi

DNA bồ mẹ tới sợi mới Cả ba enzyme nảy đều liên quan tới quá trình phát triển của

phôi nhưng giảm biểu hiện vảo cuối giai đoạn biệt hóa [44]

Su methyl hỏa DNA cỏ liên quan và đóng vai trò quan trọng trong bất hoạt

nhiém sac thé X, in dau gen, ôn định hệ gen và điều hỏa biểu hiện gen [12, 61]:

eBất hoạt nhiễm sắc thể X: Ö giới tính cải của động vật có vũ (kiểu gen XX),

một trong hai nhiễm sắc thẻ X bị bất hoạt để bủ lại sự mât cân bằng các gen liên kết với nhiễm sắc thẻ X so với giới tỉnh đực (kiêu gen XY), Quá trình này xảy ra trong giai

đoạn phát triển phôi sớm [12] Sự bất hoạt xây ra ngẫu nhiên với một trong hai nhiễm

sắc thê và được duy tri trên củng nhiễm sắc thẻ đỏ trong quá trình nguyên phân của tế

bảo cho tới khi phát triên thành mô trưởng thảnh Cơ chế duy trì nhiễm sắc thé X bi bat hoạt là sự methyl hỏa quả mức đảo CpG vùng promoter các gen phân bỏ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thẻ X bị bắt hoạt (Hình 1.1D) [12] Su methyl hoa DNA trong trường hợp nảy xảy ra khá muôn [61] Quá trình bắt hoạt được khởi đầu bởi sự hoạt hỏa các RNA không mang mã hoạt đồng kiểu cis (cis-acting noncoding RNA), tir dé làm kích hoạt sự thay thé các nhân tố phiên mã, thay đổi nhiễm sắc thể vả sau củng,

các CpG bị methyl hóa tại đảo CpG vũng promoter [43] Sự methyl hoa DNA rat can

thiết cho việc duy trì ôn định trạng thái không phiên mã của các gen nằm trên nhiềm

sắc thể X bị bất hoạt [12]

In đấu gen: Ö động vật có vủ, hệ gen có nguồn gốc từ bổ vả từ mẹ có chức

năng không cân bằng nhau nhưng đều cân cho sự phát triển bình thường Tinh trang của gen được biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền tir bo hay me Những gen

được in dâu thường định vị theo cụm và các allen được đánh dấu khác nhau nhờ sự

methyl hóa DNA, acetyl hóa/khử acetyl hóa histone, methy] hóa histone và thường liên

quan tới các sợi antisene RNA [61] Các gen trong cum thường chịu kiểm soát của

vùng điều khiển in dau ICR (Imprinting Control Region) (Hình 1.1E) Phôi sau khi thụ tỉnh, methyl hóa ICR ở dòng tế bảo mầm không chịu sự tải lập chương trình của

genome nhung trong qua trinh phat trién ctia té bao mam, su methy] hóa TCR bị xóa và

được thiết lập lại ICR hoạt động khi không bi methyl hoa và không hoạt động khi bị

methyl hỏa Ở trạng thái hoạt động, ICR sẽ điều khiển các gen bị m dâu biểu hiện [48]

On dinh hé gen: Methyl hoa DNA dong vai trò ồn định hệ gen bằng cách bắt hoạt phiên mã các trình tự DNA lặp lại và các transposon nội sinh [61] Hoạt động

phiên mã ở các vùng nảy bị ức chế bởi sự methyl hoa quá mức Nêu các transposon

không bị ức chế bởi sự methyl hỏa thì cỏ thể làm đông hoạt hỏa các gen xung quanh hoặc phiên mã các yêu tổ có khả năng đi chuyên (Hình 1.1B) Nếu vùng lặp lại ở gân

tâm động được hoạt hóa phiên mã thì gây ra sắp xếp lại các vùng lân cận tâm động, cỏ khả năng là nguyên nhân dẫn đến các nhiễm sắc thé khong xếp hàng trong nguyên

phân (Hình 1.1C) [43]

(A) Sự methyl hòa vũng promoter (B) Bắt hoạt Iransposon (E)In dấu gen

“1P cú ung, = (€) Sự methyl héa tại ving tam dong

LEP: Ving promoter mat a CpG thap ICP: Ving promoter mat d6 CpG trung binh

HCP: Ving promoter mat do CpG cao

Hinh 1.1 Su methyl hoa DNA trong genome d6ng vat co vii [43] (A) Phân loại promoter tia

gen dua trén mat 46 CpG bi methyl hoa, (B) Cac transposon bi tte chế bởi sự methyl héa

DNA (C) Sự methyl hóa DNA ức chế phiên mã của các trình tự lặp lại vùng tâm đông (D) Sự

methyl hoa DNA duy trì bắt hoạt gen trên một nhiễm sắc thể X- (E) In dâu gen điều khiển biểu

hiện gen đặc hiệu allen Sự methyl hóa DNA tại vùng điều khiển in đẫu điều hòa các protein

bam hoặc biểu hiện của các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis

Điều hòa biểu hiện gen: Phan bo CpG được coi là vùng quan trọng cho sự điều

hòa của di truyền ngoại gen tới biểu hiện gen [41] CpG phân bố không ngẫu nhiên

trong genome mà tập trung thành vùng được gọi là dao CpG [11] Dao CpG chiém 1-

2% genome, đài 200 bp đến vải kb, thành phân G và C ít nhất chiêm 50% với tỉ lệ quan sáVmong đợi >0,6 [11, 41] Các nghiên cửu hiện tại bổ sung thêm vào xung quanh đảo CpG các vủng CpG lân cân Mặc đủ các vùng này có mật đô CpG thấp hơn nhưng lại

có chức năng quan trọng đối với điều hỏa biểu hiện gen Ví dụ, trong quả trình biệt hóa

tế bảo, sự methyl hỏa vùng CpG cach dio CpG 2 kb diễn ra manh hon su methyl hoa tại đảo CpG, chứng tỏ vai trò chỉnh của vùng lân cận này đối với hướng biệt hỏa của tế bảo [14] Đảo CpG thường gần với vùng promoter và/hoặc exon của gen [11] Mật độ CpG vimg promoter xac dinh su methyl héa sẽ ảnh hưởng tới biểu hiện gen (Hình 1.1A) Theo nghiên cứu của Lister và cs (2009), vùng promoter giàu CpG (High-

density CpG Promoter, HCP) không bị methyl hóa ở tất cả các mô ngay cả khi sự phiên

mã của gen liên quan bị bất hoạt Vùng promoter mật độ CpG thap (Low-density CpG Promoter, LCP) hầu như bị methyl hoa không kẻ tới sự hoạt hỏa hay ức chế của gen

Ngược lại, sự methyl hóa ở vùng promoter có mật độ CpG trung bình (Intermediate-

density CpG Promoter, ICP) có liên quan tới sự bắt hoạt gen [40] Bắt hoạt phiên mã

bởi sự methyl hỏa DNA chưa được hiểu biết đầy đủ mặc dù đã có nhiều cơ chế được đưa ra Cơ chế thứ nhát, sự methyl hóa tại trình tự DNA điều hòa đặc hiệu vả việc thêm nhóm methy] vào DNA có thể ngăn cần các protem điều hòa bám vào trình tự này [12]

Vi the, su methyl hoa DNA theo cơ chê này sẽ trực tiếp ngăn cản các gen hoạt động

Một cơ chẻ khác điều hỏa giản tiếp thông qua protein bám DNA Những protein nảy cỏ

vùng bám DNA bị methyl hỏa nên có thể nhận biết và bám vào một hoặc nhiều CpG bị methyl hoa Sau d6, ching tương tác hoặc tham gia vào phức bất hoạt quả trình phiên

mã như phức tái cầu trúc nhiễm sắc thể và/hoặc các enzyme biển đôi histone [12]

1.1.2 Methyl hoa DNA va ung thư

Methyl hóa DNA có nhiều ưu điểm đề trở thành chỉ thị sinh học trong ung thu

và ứng dụng trong lâm sảng Thứ nhất, các chỉ thị methyl hóa DNA đặc hiệu cho các tế bảo khối u vả xây ra với phân trăm cao hơn so với biển đổi di truyền [30] Thứ hai, DNA là phân tử hóa học ôn định, vì thẻ, có thể khuếch đại và phát hiện để đàng Thứ

ba, các khối u có nhiều vùng bị methyl hóa bất thường, một trong số đỏ đặc hiệu cho từng loại khỏi u trong khi một số khác có mặt ở hâu hết các loại khối u [30] Do đó, methyl hỏa bắt thường DNA có thể được tim thấy trong các tế bảo biểu mô cỏ vẻ bình

thường [30] Ưu điểm này của dấu chuân methy] hóa DNA đã đáp ứng yêu cầu phát hiện sớm vả sảng lọc quản thể người có nguy cơ mắc ung thư

Methyl hoa DNA bắt thường được quan sát ở ung thư tự phát vả ung thư do di

truyền [41] Có hai hiện tượng thay đổi sự methyl hóa DNA thường xảy ra trong tế bảo

ung thu so với tế bảo bình thường đã được nghiền cửu:

eTrong tế bảo binh thường, vùng dị nhiém sac bi methyl hoa cao Cac ving trinh tu

lặp lại như LINE, SINE, IAP va Alu bi bat hoat, nhờ đó đảm bảo genome được toàn

m định Tuy nhiên, trong nhiều loại khỏi u, cơ chế này bị gián đoạn và xảy ra

vẹn

hiện tượng mất đi sự methyl hóa ở các vùng mả bình thường bị methyl hóa Đây được

gọi la su methyl hỏa dưới mức, Hiện tượng nay tạo cơ hôi cho sự tái tổ hợp không

mong muốn trong nguyên phân Các yếu tô gen nhảy được tái hoạt hỏa và tích hợp vào

vị tri bat ki trong hệ gen dan tới hình thành đột biên và sự bất ôn hệ gen Điều này có liên quan tới sự phát triển khỏi u vả các giai đoạn của bệnh [36] Ví dụ, mất sự methyl hỏa DNA của Sz/2 (j

xtacentromeric satellite 2) va Sata (centromeric satellite) trong

ung thư vú có liên hệ với sự phát triển sớm của khỏi u trong khi ở ung thư buồng trứng

thì chủng góp phân vào sự tiền triển của khối u và được đề nghị trở thành chỉ thị cho

tiên lượng sớm [36]

sNgược lại với hiện tượng trên, ở các tế bảo ung thư, các gen chịu sự bắt hoạt do sự

methyl hoa qua mirc dao CpG ma trong tế bảo bình thường chủng không bi methyl hóa

[36] Cac gen liên quan tới chu trình tế bào, sửa chữa DNA, kháng thuốc và khử độc, biệt hỏa, tự chết theo chư trình, tăng sinh mạch, di căn vả xâm nhập đều bị bất hoạt bởi methyl hóa quá mức [11] Nghiên cứu của Drexlex và es (1998), hai gen liên quan tới

chu trình tế bào là p6?“ và p15”#“ chịu sự methyl hóa quả mức ở nhiều loại ung thư Nhiều gen sửa chữa DNA cũng b¡ methyl hỏa trong các khỏi u nhw MGMT,

AMLHI Điền hình, sự methyl hỏa gen 8RC41, gen liên quan tới sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA, được nghiên cứu nhiều ở ung thư vú và ung thư buồng trứng [36]

Dau chuan methyl hóa DNA được tiến hành phân tích thuận tiện và cỏ thẻ sử

dụng kết hợp với các phương pháp chan đoán khác Methyl hỏa DNA không chỉ có thẻ ứng dụng trong chân đoán mả còn lả công cụ hỗ trợ xác định và phân loại khỏi u, có

khả năng dự đoán đáp ứng điều trị và cải thiện tiên lượng bệnh [13]

1.143 Methyl hóa gen GS7PI

Glutathione S-transferases (GSTs) bao gồm các enzyme có nhiều chức năng Cac enzyme nảy có vai trò giải độc cho tế bảo, bảo vệ các đại phân tử khỏi các chất oxi hóa [27] GST Pi 1 (GSTP1) là một trong ba lớp phổ biên của GSTs [45]

Gen GS7P! nằm trên vùng 1113, dải 2.8 kb va bao g6m 7 exon Khung đọc

mở bắt đầu tại vị trí 3` của exon đầu tiên vả đài 630 bp, mã cho protein gồm 290 axit amin với khôi lượng phân tử khoảng 23224 Da (Hình 1.2) [45] Vùng mã hóa bị điều khiển bởi đảo CpG thuộc vùng promoter nằm ở phía trước vị trí khởi đầu phiên mã Cả khu vực nảy bị phân cách bởi trình tự dài lặp lại ATAAA Trình tự lặp lại ATAAA

hoạt động gần như là một nhân tô đề phân chia các trạng thải khác nhau của di truyền ngoại gen [53] Ngoài ra, nhiều nhân tỏ phiên mã khác như SP1 (Stimulator protein 1), API (Aetivator protein 1), yêu tổ nhân tăng cường hoạt hỏa tế bảo B (NF-KB) và

GATAI cũng đỏng vai trỏ quan trọng trong điều hỏa biểu hiện GS7P7 (Hình 1.2) [53]

GRIM NF-KB (p50/p65 ) 3

(32)

(1208)

TRE (APa.NEea)".®-®5=s-

Protem GSTP1 liên quan tới điều hỏa chết theo chương trình của tế bảo GSTP1 tương tác với tin hiệu gây chét c-Jun NH2-terminal kinase (INK1) hode thụ thể liên quan với nhân tổ hoại tử khỏi u (TRAF2) GSTP1 có chức năng chuyền hóa và giải độc nên gen GS7P! biểu hiện ở hâu hết các tế bảo, đặc biệt các tế bảo tiếp xúc với môi

trường bên ngoài như tế bảo của hệ thống tiết niệu, tiêu hỏa, hô hấp [53] Mức độ biêu

hiện GS7P1 tăng chứng tỏ hoạt động giải độc tăng cường đề đáp ứng với các chất oxi hỏa Thực nghiệm cho thây, chuột khéng biéu hién protein GSTP1 sẽ nhạy cảm với các độc tô môi trường, thúc đây hình thành đột biến và phát triển ung thu [53] Su methyl hoa qua mire ving promoter dan téi bat hoat biéu hiện gen GS7P7 được nghiên cứu như một chỉ thị tiêm năng cho chân đoán ung thư tuyên tiền liệt [53] Ngoài tuyển tiên liệt, protein GSTPI biểu hiện ở nhiêu mô trong đỏ có mô vú [45] Do đó, sự methyl hỏa bắt thường vùng promoter GS7P1 cũng được phát hiện ở các bệnh nhân ung thư vú [53] Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng mình sự methyl hóa bắt thường GS7P! là một sự kiện xây ra sớm trong quá trình phát sinh ung thư vú [37], có thẻ trở thành chỉ thị sinh học cho sảng lọc sớm và nguy cơ mắc ung thư vủ [18, 37]

1.1.4 Methyl hoa gen RASSF1A

Gen RASSF/ nam trên vùng 3p21.3, có kích thước xáp xỉ 11 kb, bao gồm 8 exon [15] Sự cắt nổi luân phiên củng với việc phiên mã từ 2 promoter khác nhau tạo thanh 8 déng phan khac nhau R4SSF/4-RASSF1H trong dé RASSFIA va RASSFIC 1a hai dang phé bién [3] Gen RASSF/ c6 2 ving promoter tuong img với 2 đảo CpG khac nhau Dao CpG nhỏ có kích thước 737 bp chứa 85 CpG va li promoter cia RASSF1A, RASSFID, RASSFIE, RASSFIF và RASSF1G Đảo CpG lớn hơn cỏ kich thước 1365

bp chứa 139 CpG va la promoter ctia RASSF1B va RASSFIC [3] RASSFIA bao gồm các exon 1a, 2c, 3, 4, 5, 6 ma hóa cho chuỗi polypeptide gòm 340 axit amin cỏ khỏi

lượng phân tử 39 kDa (Hình 1.3) [3, 15]

Protein RASSFIA tham gia điều hòa nhiều quả trình sinh học của tế bảo

Protein RASSFIA có vai trỏ trong việc tổng hợp thoi vô sắc vả thúc đây sự ồn định của

chúng [15] Bên canh đó, RASSF1A có thể gây kìm hãm chủ kì tế bảo bằng cách tác déng dén protein RB (Restinoblastoma protein) RASSFIA tte ché qua trinh tích lũy cyclin D1 diéu khién su phosphoryl hoa Rb va kiểm soát chết theo chương trình của tế bao tir pha G1 [15] Nhé vay, RASSFIA cé the tre ché chu trinh te bao 6 điểm chuyền đổi G1/S Do đó, RASSFIA biểu hiện quả mức sẽ thúc đây quá trình chết theo chương trình, pha nghỉ chu trình tế bảo và giảm tình trạng khỏi u ở các dòng tế bảo ung thư [15] Ngược lại, thực nghiệm chứng mình rằng nêu protein RASSF1A giảm thi lam chu trình tế bảo mất kiểm soát, tăng sự bất ôn hệ gen, kháng lại nhân tổ cảm ứng quá trình

tự chết TNEø và K-Ras [15] Sự methyl hóa quá mức promoter J+4SSƑ1⁄4 có mỏi liên

hệ với việc giảm biểu hiện của protein RASSF1A Hiện tượng nảy được quan sát ở

nhiều loại ung thư phỏ biển Tỷ lệ methyl hỏa qua muc ving promoter RASSF/A xay

ra từ 999% ở các khối u cho tới 0% ở các mô bình thường ở xung quanh [23] Tỷ lệ cao

nhất được bảo cáo là 88%, 95% và 99% lân lượt ở ung thư phỏi, ung thư vủ vả ung thư

tuyển tiên liệt [15]

12 MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HOA DNA

1.2.1 Các kỹ thuật phân tích phê biển

Cac ky thuat phan tich methyl hoa DNA có thể được phân chia theo số lượng và phân bồ vị trí CpG thảnh các nhóm chỉnh sau [41]

«Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá toàn bộ số lượng C bị methyl hóa (Global SmC quantification approaches) Ban đâu, số lượng C bị methyl hóa được đánh gia dựa trên kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao và kết hợp với khả năng phỏng xạ của gốc methyl Sau đó, hưởng tiếp cận nay được cải tiền thành hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể của C bị methyl hóa, phân tích ELISA (methDNA-ELISA) Hướng tiếp cận nay cho phép danh giá toàn bộ những thay đổi chính vẻ mức độ methyl hóa nhưng không cung cấp được thông tin vị trí bị methyl hóa [55] và không phản tích được sự methyl hoa DNA đặc hiệu vùng [41]

Cac kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá su methyl hóa DNA của toàn bộ genome (Genome-wide DNA methylation approaches) cỏ thể sử dụng hoặc không sử dụng

microaray Kỹ thuật quét hé gen ving gidi han (restriction landmark genome

scanning, RLGS) khéng can microarray Ky thuat quét vủng hệ gen xác định các gen bị methyl hỏa đặc hiệu mô trong tế bảo bình thường và các gen bị methyl hóa bắt thường

trong tế bảo ung thư [55] Các kỹ thuật dựa trên microarray sử dụng kháng thẻ nhận

biét C bi methyl hoa hoae str dung protein bam trinh tu bi methyl hoa; hoac kỹ thuật

giai trinh ty thé hé mdi [41, 55]

Cac kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá sự methyl hóa DNA đặc hiệu từng vùng (Locus-specific DNA methylation approaches) sẽ xác định tình trạng methyl hóa DNA từng vùng được chọn Ving gen được chọn cỏ số vị trí CpG biển đổi Các kỹ thuật thuộc nhỏm này có chỉ phi tương đói thấp, đặc biệt hiệu quả khi vùng đích phân tích chứa các chỉ thị sinh học có giá trị Hướng tiếp cân này dựa trên phương pháp biến

10

đổi DNA nhờ sodium bisulũte hoặc phương pháp sử dụng các enzyme giới hạn nhạy cảm nhém methyl (Methylation-sensitive restriction enzymes, MSREB§)

Phuong phap sir dung enzyme giéi han nhạy cảm nhỏm methyl dựa trên cơ sỡ nhận biết vả cất trình tự tại CpG không bị methyl hóa [41] Phương pháp str dung enzyme nay có thê kết hợp cùng PCR đề làm giàu đoạn trình tự bị methyl hóa hoặc không bi methyl hóa Phương pháp này tương đối đơn giản và yêu câu it lượng DNA Tuy nhién, chi cac CpG trong vị trí enzyme được phân tích và nêu cắt không hoàn toan

có thể dẫn tới kết quả dương tính giả [55]

Phân lớn phân tích methyl hóa DNA được phát triển dựa trên phương pháp biên

đổi DNA nhé sodium bisulfite [55] Sodium bisulfite duoc str dung dé chuyên gốc C

khéng bi methyl hoa thanh U, trong khi C bi methyl hoa được giữ nguyên Phản ứng

nay xảy ra trong điều kiện pH thập và nhiệt độ cao với DNA ở dang soi don và không

thể xảy ra khi DNA ở dạng sợi đôi [9, 34] Quả trình biến đổi nhờ sodium bisulũte gồm 3 bước cơ bản: phản ửng sodium bisulfite với liên kết đôi ở carbon số 5 vả 6 của

eytosine thành đẫn xuất cytosine sulphonate (bước 1); thủy phân loại góc amine tao

thành uracil sulphonate (bước 2); loại bỏ gốc sulphonate bang xử lý kiểm tạo thành gốc uracil (bude 3) (Hinh 1.4A) [9] Khi xi ly DNA véi sodium bisulfite trong diéu kién thích hợp, tỷ lệ biển đổi C không bị methyl hỏa thành U mong doi khoang 99% [45] Tuy nhiên, một số vủng nhỏ DNA nhiều bản copy có tỷ lệ C không bị methyl hỏa được biến đổi tháp [34] Tỷ lệ biên đổi này cũng phụ thuộc vào chat lượng DNA [34] DNA lần protein có tỷ lệ biển đổi béi sodium bisulfite thap hon DNA sach Protein lan trong mau sé lam cho quá trình xử lý với sodium bisullite xảy ra không hoản toàn Các vị trí

không được biến đổi sẽ xuất hiện một cách ngầu nhiên trên từng ving hoặc từng vị trí

đơn lẻ [63]

11

Uracil Uracil sulphonate 9 Géc methy|

Hình 1.4 Phương pháp biển đổi DNA nhờ sodium bisulñte (A) Quá trình biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite Bước 1: sự sulphonate hỏa Bước 2: sự thủy phân loại gốc amine Bước 3:

loại gốc sulphonate (B) Kết quả PCR với khuôn là DNA đã xử lý sodium bisulñte [66]

Việc biển đổi DNA nhờ sodium bisulũte chuyên gốc C khéng bi methyl héa

thành U nhưng gốc C bị methyl hóa được giữ nguyên, do đó tạo các sợi không bỗ sung [9] Điều nảy cho phép phân biệt được DNA bị methyl hỏa vả không bi methyl hóa

thông qua phan tmg PCR [55] Trong phan tmg PCR, uracil được khuếch đại như

thymine va cae C bi methyl héa van khuéch dai nlu cytosine (Hinh 1.4B) [9]

1.2.2 Ky thuat khuéch dai dic higu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)

Kỹ thuật MSP được Herman và cs mô tả năm 1996, cho tới nay, nó trở thành

một trong những kỹ thuật phô biên Kỹ thuật phân tích này được phát triển dựa trên phương pháp biên đổi DNA nhờ sodium bisulũte [28] Môi MSP được thiết kế dé

khuếch dai DNA bi methyl héa Sự đặc hiệu này được quyết định bởi nhiều vị trí CpG trong trình tự môi, thường ở gân hoặc tại vị trí đầu 3' Trong điều kiện của phản ứng PCR, chỉ có sự khuếch dai DNA bi methyl hóa xảy ra Kỹ thuật MSP thường thiết kế

12

thêm cặp môi thứ 2 để khuếch đại DNA không bị methyl hỏa, vì thế khẳng định được

sự cỏ mặt của khuôn đã được xử lý với sodium bisulũte (Hình 1.5) [34, 35] Cặp môi

đặc hiệu thiết kế cho DNA bị methy] hóa và cặp mỗi đặc hiệu thiết kế cho DNA không

bi methyl hoa nén cé cing vi trí CpG trong trình tự [5] Cả hai bộ mỗi nảy thường có

giả trị Tm tương tự nhau, sai khác không quá 5°C (Hinh 1.5) Kích thước sản phẩm

MSP được khuêch đại không quá 500 bp vì sự thoái hóa DNA xảy ra sau quả trình xử

lý với sodium bisulfite [5] Kỹ thuật điên di được sử dụng để phát hiện sản phẩm MSP,

so sánh độ sáng của băng điện di cho phép đánh giá tương đối mức độ methyl hỏa [34]

ˆ' Đảo CpG Nỗi thiết kế cho ADN bị methyl hóa

| cps =— Mỗi thiết kế cho ADN không bj methyl héa

Hình 1.5 Các cặp môi của kỹ thuật MSP [35]

Kỹ thuật MSP rất nhạy đề sảng lọc các gen bị methyl hỏa với khả năng phát

hién 1 allen bi methyl héa trong 1000 allen không bị methyl hỏa [28] Kỹ thuật nảy áp

dụng được trên các mâu DNA bị giới hạn về số lượng và chất lượng vi dụ như DNA tir

mẫu đúc [28, 55] Ngoài ra, kỹ thuật MSP không yêu câu thiết bị đặc biệt, đề sử dụng,

có thể áp dụng ở bắt kỳ phòng thí nghiệm nảo và được dùng rộng rãi cho việc phân tích

su methyl hóa DNA tại nhiêu vùng đặc hiệu [34] Hiện nay, một số hãng cung cấp các

dung dịch cho phản ứng MSP như EpiTect MSP kit (Qiagen), CpG® Wizard BRCA1 Methylation (Millipore)

13

Nhược điểm của kỹ thuật MSP là có thẻ cho kết quả dương tính giả đặc biệt khi

số chu ki PCR lớn Nguyên nhân có thể là do hiện tượng môi bắt cặp sai và xử lý

sodium bisulfite khong hoan toan [34] Hiện tượng môi bắt cặp sai có thê được ngăn chan bang cách giới hạn số chư kì và/hoặc sử dụng nhiệt độ gắn môi cao Vì trong trình

tự môi MSP cỏ chứa nhiều CpG nên nêu quả trình xử lý sodium bisulfite xảy ra không

hoàn toàn thì các phân tử DNA thu được có thê giồng các trình tự bị methyl hoa Mic

đủ mỗi MSP chửa nhiều CpG trong trình tư mỗi sẽ làm cho mỏi cỏ tính đặc hiệu cao với khuôn bị methyl hóa nhưng chỉnh nỏ cũng tạo thuận lợi cho sự khuếch đại các trình

tự bị biển đổi không hoàn toàn trong khuôn DNA bị xử lý [34] Bên cạnh đó, MSP không phải là kỹ thuật định lượng [55] Nhiều cải biển MSP str dung real-time PCR dé phát hiện các gen bị methyl hóa và định lượng được phát triển như MethyLight (Hình 1.6), MSP định lượng dựa trên SYBR Green [13, 55]

se _© _°

Kí hiệu:

© nen ARMM Aon stg phat rn

© cvencher @ ADN polymerase

— Môi |ADN dich bi methy hea

Hình 1.6 Kỹ thuật MethyLight Kỹ thuật này thiết kế probe gồm một đầu gắn với phân tử

fluorophore va một đầu gắn với phân tử queneher, có khả năng lai với trinh tự đích nằm giữa

hai mỗi MSP Nêu môi MSP bắt cặp được với trình tự đích, hoạt tính exonuclease của DNA polymerase sé phan cat probe Sau khi cat, fluorophore duc giai phong khoi quencher va anh sáng phát ra tao tin hiệu huỳnh quang Ảnh sáng phát ra tỷ lệ với số lượng đoạn được khuéch

đại trong ông [34]

14

13 KỸ THUẬT LAIĐIỂM

1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic

Lai axit nucleic bao gồm hỗn hợp sợi đơn từ hai nguồn khác nhau: phần tử đầu

đỏ (DNA tách dòng hoặc oligonucleotide) và phân tử đích Nêu ban đâu, hai phân tử này ở dạng sợi đôi thì chúng phải được tách thành sợi đơn dưới tác dụng của các yêu tố gây biến tính như kiêm, ure hoặc nhiệt độ cao Khi đó, các liên kết hydro giữa hai mach don bị bẻ gay nhưng không ảnh hưởng tới các liên kết phosphodieste Néu các tác nhân biển tỉnh bị loại bỏ và duy trì điều kiên môi trưởng thích hợp, hai sợi đơn trình

tự base tương đồng cỏ thẻ liên kết tạo cặp trở lại (hỏi tỉnh DNA) Trong trường hợp hai

mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tương đồng, chủng bắt cặp tạo nên

phân tử lai Hiện tượng tái bắt cặp như trên được gọi là quả trình lai phân tử [58]

Kỹ thuật lai được sử dụng nhiêu nhất là các kỹ thuật lai pha rắn Thông thường, pha rắn là mảng nitrocellulose hoặc mảng nylon [59] Quả trình lai pha rắn sử dụng mảng có thê chia thành 3 giai đoạn chính [4]

sGiai đoạn đầu tiên: DNA dich cé dinh trén mang nitrocellulose hoặc màng nylon

được ủ tiên lai với dung dịch có chứa hỏa chất khóa các vị trí của phân tử DNA không

đặc hiệu bám trên bề mặt, nhờ đỏ giảm tín hiệu nên Hóa chất khỏa mảng cỏ thể lả

dung dich Denhardt hoặc DNA của tình trùng cá hỏi đã biến tỉnh [4]

eGiai đoạn thứ hai: dung dịch tiên lai được thay thế bởi dung dịch lai có chứa đầu

đỏ được đánh dâu, ủ trong điều kiện thích hợp cho phép đâu dò bảm vào trình tự đích Trong suốt quả trình lai, đầu dỏ không chỉ lai với trình tự đích bỏ sung 100% với nỏ

mà còn bám vảo các trình tự tương đồng [4] Thông số được quan tâm trong một phản

ủng lai là nhiệt độ nóng chảy Tm Tm là nhiệt độ mà tại đó 50% phân tử DNA tổn tại ở

dang soi don, cho phép danh gia su 6n dinh soi déi axit nucleic

Chuỗi axit nueleic càng đài, thành phản GC trong chuỗi cảng cao thì đầu do sé

có số lượng liên kết hidro càng lớn và Tm càng cao [S8] Đầu dỏ sử dụng cho các kỹ

15

thuật lai pha rắn sử dụng mảng thường ngắn hon 500 bp, thanh phan GC nam trong khoảng 40%-60% để hạn chế các yêu tổ ảnh hưởng trên [4, 16, 17] Trong môi trường hoa học của phản ứng lai, các cation hóa trị một (vi dụ như Na+) sẽ làm ôn định câu trúc sợi đôi trong khi phân tử phân cực như formamide vả urea là các hóa chất gây biên tỉnh DNA [58]

eGiai đoạn cuối cùng: Màng được rửa với một loạt các dung dịch đề chỉ giữ lại câu

trúc phân tử lai có mức độ tương đồng cao nhất [4] Phản ứng rửa được tiền hành đẻ

loại bỏ các đầu đỏ không lai với phân tử đích và phá vỡ các câu trúc lai có nhiêu vị trí bắt cặp sai Không giồng với phản ứng lai, phản ứng rửa phụ thuộc vào mức độ ôn định

của cầu trúc lai Câu trúc lai đầu dỏ-phân tử đích ôn định nhất khi có sự kết cặp bổ

sung hoản toàn Các dung dịch rửa có thẻ tiên hành ở điều kiện khắt khe đề phá vỡ sợi đôi có sự tương đồng thấp Điều kiện cho kỹ thuật lai liên quan tới nhiệt độ và nông độ muôi trong dung dịch Điều kiện chỉ cho phép giữ lại câu trúc lai bắt cặp hoàn hảo được gọi là điêu kiện khát khe Điều kiên cho phép cấu trúc lai có nhiều vị trí không bắt cặp được gọi là điều kiện ít khắt khe Như vậy, nông độ muối thấp và nhiệt độ cao

là điều kiện khắt khe, ngược lại, nông độ muối cao và nhiệt độ thấp là điều kiên ít khắt khe [S9]

Một số kỹ thuật lai trên pha rắn có nhiều ứng dụng như kỹ thuật lai Southern blot, Northern blot, lai diém dot blot K¥ thuat lai Southem blot phân biệt một đoạn DNA cụ thể có mặt trong hồn hợp DNA Trong kỹ thuật nảy, trình tư DNA đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn được phân tách trên gel agarose

nhờ điện di Sau đó, các đoạn DNA được biến tính trong dung dịch kiểm dé thanh sợi

đơn rồi chuyển lén mang nitrocellulose ho’c mang nylon dé lai [58] Ky thuat Northem blot la mét cai biển của Southern blot trong đỏ phân tử axit nucleic dich la RNA thay

vi DNA RNA hoae DNAc da duge nhan dong co thé str dung lam dau đỏ trong lai

Northern blot [58] Dua trén nguyén tic lai axit nucleic, ky thuat lai điểm dot blot được

16

Kafatos và cs mô tả năm 1979 nhằm phát hiện phân tử đích quan tâm Thao tác thực hiện kỹ thuật này đơn giản Khác với Southern blot, DNA đích trong kỹ thuật lai điểm

dot blot khéng can phải cắt với enzyme giới hạn và phân tách trên gel trước khi chuyền

lên mang lai DNA dich đã biến tính được cham lên mảng mitrocellulose hoặc mảng

nylon và để khô Sau đỏ, tiến hành có định DNA trên mảng bằng cách chiều tia UV

trong vải phút hoặc ủ 80°C trong 30 phút [4] DNA cổ định trên màng sẽ được tiếp xúc với dung dịch chứa đầu dỏ đánh dâu Sau khoảng thời gian đủ để hình thành câu trúc

lai đâu dò-phân tử đích, dung, dịch chứa đầu dò được loại bỏ Màng được rửa đề loại

đầu dò còn sót, để khô vả thu tín hiệu lai điểm [4]

1.3.2 Phương pháp danh dau dau do

Đầu dò có thể được sản xuất số lượng lớn bằng cách nhân dòng trong tế bảo vật

chủ gọi là đâu dò nhân dong hoặc có thể được tổng hợp hóa học Các phương pháp đánh

dầu đầu đỏ bao gồm đánh dau DNA soi don, DNA sợi kép và RNA soi don Trong quá

trình đánh dâu, các nucleotide đã gắn với các chất đánh dau nhu biotin, digoxigenin hay fluorescence duoc str dung thay thể hoặc kết hợp với các nucleotide bình thường khác Có hai phương pháp đánh dâu đâu dò DNA [58]

eĐánh dầu ở đầu tận cùng: Phương pháp này cỏ thể sử dụng enzyme polynucleotide

kinase dé thém mét nhóm đã được đánh đâu vào một hoặc một vải nucleotide tận cùng,

Chất đánh dâu thường ở dạng P tại vị trí y-phosphate của ATP và hoạt tính của polynucleotide kinase sé thuc hién phan ứng chuyên nhóm phosphate sang đầu 5” của các

phan tir axit nucleic Phuong phap nay co the str dung dé danh dau oligonucleotide dang

sợi đơn và phân tử DNA dạng sợi đôi

eĐánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA ứz viø thường được thực hiện theo

một trong ba phương pháp (Hình 1.7):

17

Phuong pháp đánh dẫu bằng môi ngẫu nhiên: Đầu dò được biên tỉnh nhiệt đề làm

khuôn cho DNA polymerase sử dụng đNTP đánh dâu và các môi là các oligonueleotide

(thường là hexa hoặc octanucleotide)

Phương pháp dịch chuyên điểm đứt: DNase 1 sẽ cắt phân tử DNA ở nhiều vị trí tạo những điểm đứt phân bổ một cách ngẫu nhiên trên hai mạch Từ những điểm đứt

nay, DNA polymerase I sé sit dung dNTPs danh dâu để sửa chữa Kết quả cuối cùng

'DNA được đánh dâu trên khắp chiêu dài phân tử

Phương pháp đánh đấu nhờ PCR có hai cách thực hiện: (L) bỗ sung một loại

nucleotide danh dâu trong quả trình tông hop dau dò; (2) sử dụng môi có gắn nhóm đánh đâu ở đầu 5' Cách thứ nhất cho tin hiệu tốt hơn vỉ chất đảnh dau cỏ mặt đọc theo

đầu đò Phương pháp đảnh dấu PCR cỏ lợi thế đặc biệt so với các phương pháp khác,

Dau đỏ được tạo ra một cách nhanh chóng với kích thước nằm trong phạm vi rộng: cỏ thể thiết kế đầu đỏ từ bắt cứ vùng gen nao quan tâm; chỉ cản lượng nhỏ khuôn DNA

cho phản ứng tổng hợp Phương pháp nảy có thể áp dụng cho cả dau do sợi đơn (sử

dụng một môi) vả sợi kép (sử dụng một cặp môi)

Phương pháp sử dụng mỏi ngắu nhiên Phương pháp dịch chuyển điểm đứt

(khien AON 20) don, 3°

Ménadunnien ØŒ=3”

(nearer

“am

‡

hicancoenat SE Ga

s.7—_

Hình 1.7 Phương pháp đánh dâu thông qua phản ửng tổng hợp DNA in vitro [16, 17]

Chất đánh dau dau do c6 thé ding chất đánh dâu phóng xạ sử dụng các đồng vị

phóng xa ( 2P, **P, 15s, 3H, !*C, '2*J), Hiện nay chúng ít được sử dụng bởi một só hạn chế

18

như chu kỳ bản rã ngắn (chu kỳ bản rã của 3P là 14,3 ngảy) do đỏ phải lặp lại bước danh đầu đầu do khi tiên hành thí nghiệm lai trong thời gian dài; nguy hiểm cho người

sử dụng; yêu cầu nghiêm ngặt cho phỏng thí nghiệm vả cá nhân sử dụng cũng như việc

xử lý chất thải Chất đảnh dâu không phỏng xa hiện nay được dùng chủ yếu do có độ

an toàn, độ bền cao, đánh dấu tốt, cỏ thẻ phát hiện tại chỗ vả phát hiện nhanh chỏng,

Chất đánh dâu không phóng xa có hai loại [58]:

Hệ thông đánh dấu trực tiếp: chất đảnh dâu được phát hiện trực tiếp Phỏ biển nhật

là các enzyme như alkaline phosphatase hay horseradish perosidase, các chất huỳnh

quang nhu fluorescence hay rhodamin

Hệ thống đánh dấu gián tiếp: chất đảnh đâu đầu dò (gọi là nhóm bảo cáo) không

được phát hiện trực tiếp mà phải thông qua liên kết với một nhóm phát tín hiệu (gọi là

nhóm chỉ thị) Nhỏm chỉ thị có ái lực liên kết cao với nhóm báo cáo (nhở phân ái lực)

Sự phát hiện axit nucleie trong hệ thống giản tiếp bao gồm ba phan tng: (i) dau do da được đảnh dầu (mang nhóm bảo cáo) lai với phân tử đích; (i¡) nhóm bảo cáo gắn vào đầu

dò liên kết với nhóm chỉ thị: (ii) nhóm chỉ thị phát tin hiệu (nhờ liên kết với nhóm báo

cáo) (Hình 1.8)

19

Hình 1.8 Hệ thông đánh dâu gián tiếp [S8]

Phổ biến nhất trong hệ thống nảy là hệ thống biotin (vitamm H) Trong đó, biotin dong vai trỏ là nhỏm bảo cáo liên kết với nhỏm chi thi streptavidin alkaline

phosphatase (phan ái lực là streptavidm-một protem có nguồn góc từ vi khuân

Streptomyces avidinii) Tương tác giữa biotin và streptavidin là tương tác sinh học không công hỏa trị mạnh nhất được biết đến trong tự nhiên (hằng số phân ly K„=1019) Đầu dò gắn biotin có thể được chuẩn bi dé dang véi nucleotide dinh dau biotin nhu biotin-11-đUTP hoặc biotin-16-dUTP

1.3.3 Một số ứng dụng của kỹ thuật lai điểm

Trong phan tich axit nucleic, img dụng phô biển của lai điểm là phân biệt sự sai khác 1 nueleotide giữa các allen nhờ đầu dò đặc hiệu [58] Dau do được thiết kể trong

vùng có vị trí nucleotide biến đổi và đặc hiệu với phân tử địch [58] Đối với nghiên cứu

xác định và nhân giống cây trồng, lai điểm là một trong những kỹ thuật phủ hợp với

phân tích các đa hình đơn nueleotide (Single Nueleotide Polymorphism, SNP) [56]

Shirasawa vả cs (2006) sử dụng các đầu dò đặc hiệu đề tiến hành lại điểm kiểm tra 100 gen trên các cây lúa có SNP [57] Kiểu gen của 43 cây lủa được nhận biết và phân biệt với nhau dựa vào sự khác biệt ở 8 vị trí SNP Kết quả của nghiên cứu cho thay những

ưu thể của lai điểm: tỉnh chính xác cao, đơn giản vả hiệu quả khi phân tích SNP trên số

lượng mâu lớn [57]

Sự kết hợp giữa kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai đã được nhiễu nghiên cứu sử dụng

nhằm phân tích sự methy] hỏa DNA [10, 21] Trong nghiên cửu của Raad vả cs (2001), nhóm tác giả đánh dau sản phẩm MSP với fluorescence tại đầu 3` và lai với

một loạt đầu dò Mười hai đầu dỏ được thiết kể đề khảo sát tỉnh trạng methyl hóa 15 vị

trí CpG trong exon đâu tiên của gen ERa và chia thành các cặp Môi cặp đầu đỏ có khả năng phân biệt allen bi methyl héa va allen khéng bi methyl héa tai 2 dén 4 vi tri CpG của trinh tự đích Nhờ đỏ, nhóm tác giả tạo ra một bản đỗ bao gém các vị trí CpG bị methyl héa trong déng té bao ung thư vú, mẫu ung thư vủ và mẫu mô bình thường [21] Nhóm tác giả Pearlly va cs (2003) cũng áp dụng phương pháp thiết kế đâu đỏ trên đề tiên hành khao sat tinh trang methyl hoa dio CpG gen RASSF1A Tu cac dit liéu thu được, nghiên cửu chỉ ra sự phân bỏ vị trí CpG bi methyl héa xay ra tir exon dau tiên tới vùng promoter trong mau ung thư vú Tuy nhién, trong cac mé vu binh thudng, cac vi tri methyl héa nay chỉ quan sát được ở exon đầu tiên và không quan sát được ở vùng promoter [47] Trong khi đỏ, Cle ment và Benhattar (2005) sử dụng các đầu dò đánh dâu digoxigenin bỏ sung với trình ta DNA duoc khuếch đại nhờ cặp môi không

có CpG của phản ứng PCR Mỗi đầu dỏ sẽ xác định trình tự DNA bị methyl hóa hoặc

không bi methyl hoa Dé xây dựng đối chứng cho thí nghiệm lai điểm, hai tác giả đã

trôn khuôn DNA bi methyl héa va khéng bi methyl hoa theo ty 1é (0%, 20%, 50%, 100%), tién hanh xt ly bisulfite r6i khuech dai bang PCR San phẩm của phản ứng PCR được sử dụng cho kỹ thuật lai điểm với hai loại đầu dò, Cường độ tin hiệu của các chấm trên trở thành đổi chứng đề định lượng ty 1é bi methyl héa cho các mâu phân tích

khi lai với hai loại đâu dò Áp dụng đối chứng nảy, hai tác giả định lượng tỷ lệ methyl

21

hoa trén 3 gen ATERT, APC, va p16 déi với 2 mẫu mô bình thường và 10 mẫu ung thư thực quản [10]

Dựa trên phương pháp sử dụng đầu đỏ đánh dâu trong nghiên cửu của Cle ment

và Benhattar (2005), Phỏng Thi nghiệm Sinh Y đã kết hợp kỹ thuật MSP và kỹ thuật lai điểm dot blot nhằm phân tich su methyl hóa DNA Phỏng Thí nghiệm Sinh Y đã thiết kế hai plasmid pMeG200 và pMeR200 lần lượt mang trinh tự đầu dỏ (G200 va R200) đặc hiệu với trình tự GS7P1 và R⁄4SSF1L4 bị methyl hỏa sử dụng cho kỹ thuật lai diem Trình tự hai đầu dò nảy nằm trong vủng giảu CpG, giữa hai môi MSP khuếch đại trình tự bị methyl hóa Nhờ đỏ, đầu đỏ chỉ phát hiện trinh tự bị methyl hóa và không cho tin hiệu với các sản phâm phụ khác (sản phẩm không đặc hiệu hoặc dimer) Do trình tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa cỏ sự tương đồng với nhau, sai

khác nhau ở 5-6 vị tri CpG nên chủng tôi cần phải xác định điều kiện lai điểm đề đầu

do chi lai với trình tự bị methyl hỏa (Hình 1.9) Nghiên cứu trước mới dừng lại ở kết

quả tối ưu được điều kiên lai điểm của đâu đỏ G200 cho phép phát hiện đặc hiệu trình

tự GS7P1 bị methyl hỏa, phân biệt với trình tự GS7P7 không bị methyl hỏa có sử dụng, formamide trong dung dich dém lai Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi sẽ tôi ưu điều

kiện lai điểm của đầu đò G200 không sử dụng formamide và tiếp tục hoàn thiện điều kiện lai diém cho dau do R200

22

Như đã trình bảy, sự methyl hoa GS7P1 và RASSF1A déu co thé quan sat duge

6 ung thư tuyển tiên liệt và ung thư vú Cụ thể, methyl hóa GSTP1 có môi liên hệ với

các giai đoạn khác nhau của ung thư tuyển tiên liệt, co thẻ phân biệt mg thư tuyển tiên

liệt với các bệnh liên quan tới tuyên tiên liệt Sự methyl hỏa GS7P7 được xác định

thông qua các dịch cơ thể (huyết thanh, huyết tương, nước tiểu) và cỏ độ đặc hiệu cao

hon so với xét nghiệm PSA trong huyết thanh [64] Trong khi do, RASSFIA co méi liên hệ với các đặc điểm xâm nhập của khỏi u nên các khối u xảy ra su methyl hỏa RASSF14 cỏ mỗi tương quan với độ Gleason vả PSA [23] Déi với ung thư vủ, các

nghiên cứu những năm 1990 cho thấy, đảo CpG ctia promoter GSTP/ khéng bi methyl

hỏa ở mô vủ bình thường nhưng bị methyl hóa quá mức ở các mô ung thư vú đồng thời

có môi liên hệ với mức giảm biểu hiền của protein GSTP1 [45] Su methyl hóa qua mức promoter của /+4SSƑ1⁄4 là một sự kiện xảy ra sớm trong quả trình phát triển ung

thư vú, được duy trì ôn định ở tất cả các giai đoạn trong quá trình tiên triển ung thư vú

[20] Hơn nữa, methyl hóa ##4SSƑ1⁄4 xuất hiện có môi tương quan với tiên lượng xấu

và có thể trở thành một chỉ thị sinh học có giả trị cho ung thư vú [20] Do đó, su methyl

hóa của hai gen nảy được chúng tôi lựa chọn đẻ nghiên cửu trong luận văn

Các nghiên cứu không chỉ sử dụng mẫu mô ung thư mả còn lựa chọn các mẫu đổi chứng để phân tích sự methyl hóa Nghiên cửu của Phuong vả cs (2015) sử dụng

20 mẫu mô vủ bình thường phân tích củng 95 mẫu mô của bệnh nhân ung thư vủ người Việt Nam [49] Hoque và cs (2006) sử dụng mâu đối chứng là 76 mẫu máu [29] Theo Massie và cs (2017), mẫu đổi chứng phủ hop nhat dé phan tich su methyl hoa đặc hiệu

khối u là mẫu mô bình thường nằm cùng cơ quan với khối u Ở nhiêu loại ung thư, sự thay đổi methy] hỏa có thể quan sát được ở mô liên kê Vì thê, mỏ liên kể sẽ là một lựa

chọn thích hợp dé so sánh những biến đổi di truyền ngoại gen với mô ung thư [42]

Cho và es (2010) da phan tich su methyl hóa các gen trên cặp mẫu mô ung thư vả mô

liền kể từ 40 bênh nhân ung thư vú [8] Trong luận văn nảy, ngoài việc phân tích sư

methyl hỏa promoter GS7P! trên 10 mâu mô đúc ung thư tuyến tiên liệt, chủng tôi

24

cũng phân tích sự methyl hóa promoter GSTP! và /&4SSF1⁄4 trên 49 cặp mau mé ung thư và mô liên kể từ bệnh nhân ung thư vú bằng kỹ thuật MSP Tử đó, chúng tôi khảo sát được tình trạng methyl hóa của hai gen trên hai loại mâu này

Tir ket qua MSP thu được, chúng tôi sẽ phát hiện một số sản pham MSP dương tính với cặp mỗi đặc hiệu khuếch đại trình tự GS7P1 bị methyl hóa bằng lai điểm, sử dụng điêu kiện tôi ưu của đầu dò G200 Vì vậy, luận văn “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen /+4SSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt" được thực hiện với các mục tiêu bao gồm: (1) Tối ưu điều kiện lai điểm của đầu dò G200 và R200; (2) Khảo sát tỉnh trạng methy] hóa promoter GSTP1 và RASSFLA trên 49 cặp mâu mô ung thư vú va mau mé lien ke; tinh trang

methyl hỏa promoter GS7P! trên 10 mẫu đúc ung thư tuyển tiền liệt bằng kỹ thuật

MSP; (3) Phat hién mot s6 san phẩm MSP tir mau bệnh phẩm dương tính với cặp môi đặc hiệu khuếch đại trình tự GS7P1 bị methyl hỏa nhờ kỹ thuật lai điểm

25

Chương 2~ NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

21 CÁC BƯỚC TIÊN HÀNH THỈ NGHIÊM

Các bước tiền hành thí nghiệm gồm có

— Bước 1: Tôi ưu hỏa điều kiện lai điểm của các đầu đỏ G200 và R200 đẻ phát hiện trình tự bị methyl hóa, phân biệt với trình tự không bị methyl hỏa

—_ Bước 2: Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm tng thư vú, ung thư tuyển tiên liệt

và xử lỷ DNA với sodium bisulfite

— Bước 3: Tiên hành phản ứng MSP với cặp môi đặc hiệu khuếch đại trình tự bị

methyl hóa và cặp môi đặc hiệu khuếch đại trình tự không bị methy] hóa cho hai gen GSTP1 và RASSFLA sử dụng các mẫu DNA đã được xử lý sodium bisulfite

— Bước 4: Áp dụng điều kiện lai điểm trên mẫu bệnh phẩm sử dụng đầu do G200

NGUYEN LIEU, HOA CHAT VA THIET BI

Nguyên liệu

Các cặp mẫu mô tươi (mẫu mô ung thư vú và mẫu mô liên kẻ) từ 49 bệnh nhân ung ther va; mâu mô đúc từ 10 bệnh nhân ung thư tuyên tiền liệt được cung cập bởi Khoa Giải phâu, Bệnh viên K từ tháng 2 năm 2012 đền thang 12 năm 2013 Các mẫu

mô liên kẻ được lay cách khối u ung thư vủ khoảng 3-5 cm Mẫu bệnh phẩm được tách

chiết DNA sau đó tiền hành xử ly voi sodium bisulfite DNA sau xử lý được dùng lam

khuôn cho kỹ thuật MSP với cặp mỏi đặc hiệu trình tự bị methy] hóa và trình tự không

bi methyl héa

Dong vi khuan E coli TM109 (Promega) mang cac plasmid tai té hop str dung

cho kỹ thuật lai điểm được trinh bảy cụ thể trong Bang 2.1 Các dòng vi khuẩn này

được cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

26

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm

pRassi7o | Dom chén RASSHZ4 bi methyl hóa methyl héa va khong bi

Doan chén RASSF 1A khéng bj methyl

PRASSIS5’ | tiga kính thirée 135 bp

Đoạn 45 bp chứa 6 CpG trong ving | Ộ a =

BMRSGEUO trinh tw GSTP/ bj methyl hoa fi a asa

Dém Tag polymerase 10x (chira 15 mM MgCl) (Sigma-Aldrich)

JumpStart Tag DNA polymerase 2,5 w/t (Sigma-Aldrich)

Đêm DreamTaq polymerase 10x (20 mM MgCl) (Fermentas)

DreamTaq DNA polymerase 5 w/iI (Fermentas)

Kit tach chiét: Wizard®SV Genomic DNA Purification System (Promega,

42360) va QIAamp® FFPE tissue (Qiagen, 56404)

Kit xr ly bisulfite’ MethylEdge™ Bisulfite Conversion System (Promega,

N1301) va EpiTect® Bisulfite (Qiagen, 59104)

Kit tỉnh sạch sản phẩm PCR: High pure PCR production purification (Roche)

Kit tach plasmid: High pure isolation plasmid (Roche)

Biotin-11-dUTP 1 mM (Fermentas)

Streptavidin Alkaline Phosphatase (Promega)

27

— Co chat cho phản ứng tạo màu: Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline

Phosphatase (Promega)

— Mang nylon tich dién duong (Nylon membrane, positively charged-Roche)

— Tween 20 100% (Sigma-Aldrich)

— Cac dung dich ding cho qua trinh lai điểm được trình bảy trong Bang 2.2

— Cac hoa chất thông dung khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cửu sinh

Đậm rửa UI Tris-HCI 0,1M pH 7,5; NaCl 1,5M

Đệm rửa U2 Tris-HCl 0,1 M pH 9.5; NaCl 0,1 M; MgCl, 0,05 M

SSC 1x NaCl 0,015 M; Natti citrate 0,15 M pH 7,0

—_ Các cặp môi

Cap moi M13 E/M13 R thiết kế dưa vào trình tự có trong vector pTZ57R/T

(được gọi là cặp mỗi của vector) Plasmid pMeG200 và pMeR200 được sử dụng làm

khuôn trong phản ứng PCR với cặp môi của vector sẽ tạo các đầu dò G200 va R200 lan

lượt có kich thước 200 bp và 212 bp Đề thực hiện kỹ thuật MSP, phản ứng sử dụng các cặp môi đặc hiệu cho trình tự bị methyl hỏa và cặp môi đặc hiệu cho trình tự không

bị methyl hóa đã được tôi ưu trong nghiên cứu trước đó [62] Các cặp môi được cung

cấp bởi hãng IDT Trình tự các mỗi sử dụng và kích thước sản phầm PCR tương ứng được trình bảy trong Bảng 2.3

28