Luận văn tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm a h5n1 và a h3n2 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Kết quả từ một số nghiền cứu in vitro vé quả trình phiên mã và sao chép ARN dã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quả trinh tổng hợp ARN théng tin, gắn vào cấu trủc mũ của ARN thông tin của tế

PAT HOC QUOC GIA BA NOT

TRUGNG BAT HOC KHOA HOC TU NATEN

LE TH] THANH

TONG HOP VIRUT CUM MOI

TU VIRUT CÚM A/H5N1 VÀ A/H3N2 BẰNG KĨ THUẬT DI TRUYÊN NGƯỢC

Chuyên ngành : Vi sinh vat hoc

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC Si KHOA HOC

Người hướng dẫn khoa học: T8 LÊ THỊ QUỲNH MAI

Nội - 2012

1.7 Vẫn để đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu

CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGIHÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên củu

2.3.1 Plasmid pIIW2000 và hệ thống plasmid chủng đương 20

2.2.2 Sinh phẩm và hóa chất SH HH E111 1111 ca 21

2.3.2 Chuẩn bị vector nhàn dòng SH HH E111 1111 ca 28

2.3.4 Nhân đèng ADN đích vào plasmid pHW2000 30

2.3.5, Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) we Bl

2.3.6 Chuẩn bị plasruid cho quá trình chuyén nhiém 32

2.3.8 Khuéch dau virut ¬— " - 1 33

2.3.9 Xác định hiệu giả viưúL, chen rre 34 2.3.10 Xác định liễu gây chết 50% động vật thí nghiém (LDsq) 36

CHƯƠNG 3 - KẾT QUÁ VÀ BẢN LUẬN

3.1 TÔNG HỢP VIRUT CUM MOI TU VIRUT A/HSN1 VÀ A/H3N2

3.1.2.3 Chuẩn bị ADN dịch " - wel

3.1.3 Xây dung hệ thẳng chuyển nhiễm plasmid tạo virúL cúnt 45

3.2 Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/11SN1 (gia cầm — người) ớ1

3.2.1 Khả răng thích ứng của viútrg~A/H5NT với tế bao MDCK va trứng gà

DANH MUC BANG

Bang 1.1 Các phân đoạn ARN và protein của virÚt củm A sd Bang 2.1 Hệ thống méi đùng khuếch đại các phân doạn gen dích - 22 Bảng 3.2 Hệ thống rỗi dang cho quá trình giải trình tự nucleotide 23 Bảng 3.1 Kết quả giải trinh tự các doạn ADN dich trade nhân đòng we dd lảng 3.3, Kich thước cáo plasmid được kim tra cccccccccccesssssstisnseeeessssssneee .40 Bang 3.3 Tam plasmid Iva chon cho hệ thông chuyển nhiễm tao vinat clm rg-A/HSNI

Hãng 3.7 Mức dộ tĩnh sạch mâu ARN của virút rạ-A/HSN]., - 5É

lảng 3.8 Nguồn gốc các phân doạn sen của virút rg-A/H5N160

lảng 3.9 Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bao MDCK va trimg ga

Bang 3.10 Định lượng virút rg-3 và rg~4 bằng kĩ thuật plaque 65 Bảng 3.11 Kết quả thí nghiêm xác định LD50 của virút rg~4 trên chuột Swziss 66

DANH MỤC HÌNH

Linh 1.1 M6 hinh cau tric virion virut cum " - so

Hình 1.2 Cha trình nhân lên của virút eum — ~e.10

Hình 1.3 Nguồn gốc các chủng vinit cum gay đại địch 52255 wee lB

Hình 2.1 Mô hình cầu trủe vector pHWW2000 nen rreere 2

Hình 2.3 Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm pÏasmid có khả nẵng tạo virút cứm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ viưút cũm A/TI5SN1 và ATT3N? 27

Hình 3.1 Quy trình tống hợp viút cứm mới rg-A/HSNI từ virút cảm A/HSNI va

Hình 3.3 Sự lưu bành cóc phm (ip viral ci mia thea nim 40

Hinh 3.3, Kiém ta plasmid trén gel agarose S11 HH n1 xe wee Al

Hình 3.6 Xác định vi khudn chia plasmid trên môi trường chọn lọc 46 Hình 3.7 Kiểm tra kích thước pluamid trên gel agarose 48 Hình 3.8 Kiểm tre mức độ tính sạch mẫu ARN của vướt rg-A/H5N1 we 5D Hình 3.9 Khô năng nhân lên của viúL rgŸA/HSNI trong hệ thống cảm nhiễm 8

ii

Haemagglutination Assay (Phwong phap ngung kết hồng cầu) Llighly Pathogenic Avian Influenza (vinat cum gia cầm độc lực cao)

Madin-Darby Canine Kidney Cells (tế bào thận chó thường trực)

Polymerase Chain Reaction (Phan ứng chuỗi trùng hợp]

Phòng thí nghiệm Reverse genetic (đi truyện đão ngược}

Ribonueleoprotein (phức hệ ribonueleoproterr)

Tế chức Y tê thê giới

L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone ARN của virut

phức hệ ribonueleopratein của virúL

đi

MODAU

Trong lịch sử y hoe, cac dai dich củm xảy ra đều có căn nguyên là virút củm A

(nRuenza A vir) Virút cứm gây đại dịch ¿ địch là do có sự thay đối đặc tính kháng

tuyên Sự thay d6i nay 6 thé theo kidu bién thé khang nguyén (antigenic drill) do dot biến ngẫu nhiên xây ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin (IA) hodc hoán tị kháng

nguyên (amipenie shift) [3] do trao đối va tich hop di truyén (reassortment) giữa các

chủng viưút cứm khác nhau Từ dâu thể kỷ XÃ dến nay đã có 5 đại địch cúm được ghi

nhận, trong đó 3 đại địch (các năm 1957, 1968 và 2009) xảy ra do xuất hiện virut cảm

lich hop di truyén [2, 7 14, 17, 25

mới nhờ hiện lượng trao đối

Trao đối và tích hợp vật Hệu đi Iruyén (reassortmenl) la mdi trong những đặc

điểm của virùt cum A Nhé dé, khi có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt về mặt dị

truyên, cùng lúc xảm nhiễm vào một tế bào sẽ tạo ra chứng virút mới có câu trúc hệ

gen pha trộn giữa hệ gen virút “bố” và “mẹ” chúng, Virút mới (đặc tỉnh kháng nguyên

mới) sẽ kháng lại kháng thể đã được hinh thành trong đáp ủng miễn dịch lần trước và

có khả năng lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng “bổ - mẹ” chủng không có khả năng gây nhiềm Chúng virút mới có thể là nguyên nhân gây địch / dai địch cúm |3{

Ở Việt Nam, ngoài các phân típ virit com À lưu hành ở người theo mùa

(A/LUI3N2, A/LLINI) đã ghí nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virit cum gia cảm độc lục cao

HSNI (HEAT H5N1) [10, 12| Sự xuất hiện virút cúm A/HSNI thường xuyên trong đâu

gia dầm củng với tập quan chân nuôi gia cảm tại hộ gia dinh của người Việt Nam có thể sẽ làm tăng nguy cơ trao đổi và tích hợp đi truyền giữa virút cứm gia cầm và virút cúm người Ngoài ra, lần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên của virit cừn A/H3N2 (4 lần) nhiều hon so với virút củm A/1I1N1 (2 lần) tại miễn lắc Việt nam (giai đoạn 2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả năng để trao đổi và tích hợp giữa virút com

A/H3N2 với virúl cứmn À khác khi có điểu kiện đun lợi

rên cơ sở tiến bộ khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tứ, rất nhiều các phương

pháp mới đã được áp dựng trong nghiền cửu virút cúm, một trong số đó là đi truyền

Tggược (reverse gonetic) Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động lổng hợp virút

cum co dic diém hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả nãng xuất hiện trong tự nhiên,

khả uăng gây bệnh cho người của vùul này, từ đó chủ động xây dụng các biên pháp

phòng chống hữu hiệu Trên thẻ giỏi, di truyền ngược dã được áp dụng nhiều trong việc

nghiên cửu độc lực virút cũng như phát triển vaccine cim [30, 38, 45, 48, 51]

Xuất phát từ những l do trên, chứng tôi đã tiến hành thực hiện để tài nghiên

cứu

“Tổng hợp virút củm mái tử virút cũm A/HSN1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật

di truyền ngược”

voi mye dich:

1 Xây dựng hệ thông chuyén nhiém plasmid cé kha nding tao viniit culm A

2 Tổng hợp virit cửn mời từ viritt ciim H5N1 (củm gia cằm) và /1/H3N2

(cứm người) bằng hệ thẳng chuyển nhidm plasmid

3 Tom liểu đặc tính cơ bản của virút cúm mái

tạ

Chuong 1 - TONG QUAN

1,1 Khái quát về virút cam

chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ

virút củm A được chia thành các phân típ (subtype) dua trên hai glycoprotein

bé mil 14 hacmagglutinin (HA) và neuramiridise (NA) HA được chia thành 16 phân

típ (từ II1 đến IT16) và NA được chia thành 9 phân típ (từ NI đến N9) Các loài chim

thủy sinh lá ô chứa tự nhiên của lât

chơ người chủ yêu là HÌ, H2, H3 và N1, N2 |5j

áo phân líp virút cúm A Các phần típ gây bệnh

Danh pháp quốc tẻ dược quy dinh cho virut cúm gồm những thông tin sau típ virút/viết tắt vật chủ (nếu là động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập Với virút củm À,, có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và

NA của chúng virút [53]

Vì dụ: A/swine/[aiwan/l/70 (3N2)

B/HneLADN/5/66

C/Earis/U67

Hinh thai va edu irae virion viral cam

Virion virut củm đa hình, có thể hình câu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi

kéo đài tới 2000 nm, đường kính tning bình từ §0-L20 nm.

'Virút cúm có hệ gen là ARN đơn, âm, phân đoạn Mỗi sợi ARN liên kết với các

protein NP, PA, PBI, PB2 đề tạo thành phức hệ ribonueleoprotein (vRNP) (mô hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và phiên mã Phức hệ này được bao bọc bởi

mang protein nên vả lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bảo chủ Trên vỏ

có 2 gai glycoprotein là haemagglutinnin và neuraminidase

1.2 Hệ gen của virút cũm A

Hệ gen viưút cim A gom tám phân đoạn ARN có chiêu đải không giống nhau, đoạn ngan nhat la 890 nucleotide (phan doan 8) va doan dai nhat 14 2341 nucleotide

(phân đoạn 1 va 2) Trên tám phân đoạn ARN của vưút cúm đều có những trình tự

nucleotide bảo tồn Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều cỏ chung một trình tự

g6m 13 nucleotide 6 đầu 5` và một trình tự gồm 12 nucleotide 6 dau 3° Hai ving bao

tồn nảy có trình tự ngược nhau và bỏ sung một phản cho nhau Đặc điểm nay có vai trỏ trong quá trình phiên mã va sao chép ARN: polymerase cé thể nhận biết trình tự bao

tồn ở đầu 3'của sợi ARN() vả ở đầu 3'của sợi ARN(+) đề khởi đầu quả trình tổng hợp Một trình tự phố biển thử ba cỏ ở cả tám phân đoạn ARN lả trình tự uridine cách dau

5° khoding 15-21 nucleotide, day 1a tin hiệu khởi đầu cho quả trình gắn chuối polyA

trong quá trình tổng hợp sợi ARN thông tín [27, 33, 52]

Phin đoạn 1, 2 và 3: protein PB2, PBI, PBI-F2 và PA

Phân doạn ARN 1, 2 và 3 mã hóa cho các protein PB2, PBI, PBI-F2 và PA

Thân đoạn ARN 1 va 2 c6 chiéu dai 2341 nucleotide Phan đoạn ¡ mã hóa cho protein tương ứng gồm 759 axiL amin, phản đoạn 2 mã hóa cho hai protem 14 PBI gdm 757

axit amin và PB1-F2 {7 hoặc 90 axit amin) ƒ8, 26] Phân đoạn 3 có chiều dài 2233

nucleotide va ma héa cho protein gồm 716 axit amin Kết quả từ một số nghiền cứu in

vitro vé quả trình phiên mã và sao chép ARN dã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quả trinh tổng hợp ARN théng tin, gắn vào cấu trủc mũ của ARN thông tin của tế bảo

chú; PA liên quan đến quá trình tẳng hợp sợi ABN virút (vENA), FB1 có vai trò khỏi

đầu quả trình sao chép; PBI-F2 lảm chết các tế bảo miễn dịch đáp ứng quá trình

nhiễm vinit [8]

Phân doqn 4: Lemagglutinin {IIA}

ILA 1a mét glycoprotein gắn trên màng virút, có vai trò trong quả trình hấp phụ

và xâm nhập vào lế bao cia vinil Tén goi cia protein nay bắt nguồn Lừ khá năng ngưng kết hồng cầu bằng cảch gắn vảo gÌycoprotein đặc hiệu chứa acid neuraminie

trên bẻ mặt tế bào hỏng cảu TIA là kháng nguyên virút quan trọng nhật chống lại các

kháng thể trung hỏa, sự thay dỏi vẻ tỉnh kháng nguyên của HA là nhân tổ tạo thành vụ dich ctm Chudi polypeptide TLA tién thân (HAO) có thể tạo thành hai chuối polypeptide HAI và HA2 nêu liên kết disdfide bị cắt Sự phân cắt này không ảnh tưởng dến hoạt tỉnh gắn vào thụ câm thể mà ảnh hưởng dến quá trình dung hop với

màng tế bảo để virút xâm nhập vào tế bảo vật chủ HAI chứa phần tận củng N của HA, HA2 chứa phần lận cùng C, là vùng kị nước, gắn vào màng vtúi và có tính bảo tổn cao

gitta cac ching virut, HA2 duye cho rang co vai tre giúp virút xâm nhập vào tế bảo,

Phan doan ARN 4 dai 1765 nucleotide, HA] gm 328 axit amin, HA? g6m 221

axit amin.

Phân đoạn 5: protein nucleocapsid (NP)

Protein NP tuong tac không chỉ với chính nó và ARN trong phức hệ nueleocapsid mà còn tương tác với các protein PB2, PBI va PA để hình thành đơn vị

sao chứp Phân doạn 5 có chiểu dai 1565 nucteotidetide, chudi polypeptide gầm 498

axit amin Nueleoprotein cỏ vai trò báo vệ v‡NA khối sự phân huỷ cúa các enzyme

phân huỷ ribonuclsotide (ribonuclease)

Phân đoạn 6: Neuraminidase (NA)

Phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase - protein gin mang Neuraminidase sé

phân cải liên kết glyeosidie gan voi nhém keto cia acid N-acelylncuraminic (acid sialic) thanh D-galactose hoặc D-galactosamine MA có đạng hình nấm, gồm 4 chuối

polypeptide giống nhau, gắn với nhau bằng lién két displfide

Trong quá nình nhân lên của virút, NÀ giúp giải phóng các hạt virút dang nay

chổi ra khỏi mang tế bảo vật chủ NA cỏ thẻ cũng, giúp bộc lộ vị trí phân cắt của phân

tử TA Hoạt tỉnh neuraminidase cũng cho phép virút tránh các sialoglycoprotein ức chế

có mặt trong dường hỗ hấp, cho phép vrút tìm dường dến các tế bảo biểu mô dích kháng thể kháng NA không trưng hỏa hoạt tính lây nhiễm của virút mà hạn chế chà

trinh nhân lên của virút và làm suy giảm triện chứng bệnh

Trình tự nmcleotide của đoạn ARN 6, với phân tp N1 và N2, có chiều đài [413

nucleotide, prolein gdm 453 axi arnim

Phân dogn 7: protein M1 vi M2

Phan doan 7 mi héa cho hai protein 1a M1, M2 va cé thé protein tht ba la M3 Trong đỏ một phân tứ được phiên rnã trực tiếp từ đoạn ARN, hai phân tứ còn lại là

+kết quả của quá trình chê biên nhờ bộ máy cắt ghép (splicing) ARN thông tin của tế

bảo chú

a

Protein M1 tao thanh mét lop v6 protein bao bọc bên ngoái để bảo vệ

ribonueleoprotein Lớp vẻ protein nảy có khả năng tương tác với lipid dé tao thành lớp

vỗ ngoài (envelope) Proteim MI có thể nhận biết các glycoprolcin vưút và hình (hành

nên một vùng ở bẻ mặt bên trong của mảng tế bảo chất, cung cấp vị trí gắn cho các ribomueleoproleim trong quả trình đóng gói vưút MỸ quyết định độ nhạy của viru voi

thuốc kháng virút amatidie M2 là kênh ion xuyên màng, có vai trỏ trong quả trình dung hop, edi v6 virit

Chiều dai cia doan 7 14 1027 nucleotide Protein M1 gdm 252 axit amin, M2

gồm 97 axit amin

Phân đoạn 8: protein không cẫu trúc NS1 và NÑ2

Phân đoạn ARN nhô nhất mã hỏa cho 2 protein là NÑ1 va NS2 Trong tế bảo chủ, N51 dược tạo thành với luợng lớn hơn, liên kết với polysome và hạch nhân Chức

tiăng cúa NSI vẫn chưa rð rảng, song người †a cho rằng có liên quan đến quả trình tổng, tiợp vRNA và đến việc ngừng tổng hợp prolcim cửa tế bảo chủ N82 dược tổng hợp trong giai đoạn nhiễm muộn, tham gia vào quả trinh vận chuyển các vRNP từ nhân ra

tế bao chat [43]

Doan ARN 8 dai 890 nucleotide, protein NS1 gdm 230 — 237 axit amin (phụ thade vio chimg vinii), NS2 gém 132 axit amin,

1.3 Quá trình nhân lên của virút com A

Quá trình nhân lên của viút củn A cé thé chia thanh các giai doạn sau: (1)

gắn màng và xâm nhập vào té bao chủ, (2) phiên mã và sao chép ARN, (3) giải

phóng vRNP ra khôi nhân và (4) đóng gói, nảy chỗi và giải phông virút thế hệ mới [20, 24, 44]

(1) Gắn màng và xâm nhập vào t bào chit

Gai LLA của virút sẽ phát hiện và Hên kết với thụ cảm thể của nó trên bê rnặt tế

bao chủ Phân tử HA tiên thân, HA0, được tạo thành từ hai đưới đơn vị: HAI, eó vùng,

gần thụ cảm thê và HA2 có peplide dung hợp, HAI và HA2 hên kết với nhau bằng liên két dispfide Thu cam thể của virút cúm là axit sialic liên kết với dudng galactose của glycoprotein / glycolipid bằng liêu kết alpha 2,6 (viút cn người) hoặc alpha 2,3 (vinut cm gia cam) Hai dang liên kết nảy rất quan trọng, đối với tính đặc hiệu của liêu kết LLA — thụ căm thé ó những loi khác nhau Sau quả trinh gắn mảng, virút sẽ xâm nhập vào lễ bảo bằng cách tạo bong (endosome} Trong cndosorne, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HAO sẽ bị thay đổi câu trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2

Peptide đưng hợp gắn vào mảng endosome khién cho màng virút vả màng endosome

hoà vào nhau Môi trường aoid trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp diễn ra mà côn tác động đến kênh ion M2 Ion TH+ sẽ đi vào virút qua kênh

M2, làm axit hoá lõi virút, giải phóng vRNP khỏi MI, các phân tứ vRKP tự do này đi

vào tế bảo clái của lế bào chủ [11]

Các protein cầu thành vRNP là NP, PA, PBI và PB2 dông thời là các tín hiệu

định vị nhân (NLS) [37] Các tín hiệu định vị nhân này liên kết với các thành phân của

Thể thông xâm nhập vào nhân lễ bào và do đó vENP ởi vào nhận Lê bảo chủ

(2)Phiên mã vào sao chép

Vinit cim có hệ gen là RNAC), quá trình sao chép để tạo các sợi vRNA(-) mới

sẽ được tổng hợp thông qua eRNA(+), c€RNA(£) là sợi ARN có trình tự bé sung với

vRNA(-), có chiêu dài bằng sợi vRNA(-) Quả trình sao chép hệ gen virút củm không,

cân đến môi mà thay vào đó, các ARN polymerase phụ thuộc ARN (RđRp) sẽ khởi dau

quả trình tổng hợp ARN ngay trên sơi vRNA Đầu 5` và 3` của môi sợi vRNA có trình

tự đão ngược và bỗ sung một phan với nhau do đó hình thành cau trac mở nút chai, cho

phép khởi đâu quá trinh sao chép mà không cân sử dụng môi

Khác với nhiêu virút khác có hệ gen la ARN(-), qua trinh phiên mã của virút

cúm diễn ra trong nhân Người ta nhận thây rằng trong quá trình phiên mã của virút

cửm có cơ chế được gọi là “dành giật mũ” (cap-snatching): P2 của viút có hoạt tỉnh

endomnclease sẽ cắt các sợi ARN đã được gắn mũ (7-methylguanosine) của tế bào chủ

ở một gốc purin cach dau tan cing 5° 10 — 13 nueleotide, đoạn ARN này sẽ được sử dụng dễ khởi dâu quả trình phiên mã Quá trình khởi dau, kéo đãi, kết thúc và gắn

polyA đến đuợc xúc tác bởi phúc hệ protem PB2, PB1, PA va NP Cac soi mRNA có

chiéu dai ngắn hơn các doạn vRNA(-) mRNA sau khi được tổng hợp trong nhân tế bảo

sẽ được vận chuyển ra tẻ bào chất đề tổng hợp các protein của virút Các protein mảng

HA, NA MI và M2 sẽ được vận chuyên đến mang sinh chất cửa tế bảo trong khi các

protein NP, PA, PB1 va PB2 duge chuyén vao trong nhàn dé củng với vŸNA(C) tao

thành vRKPC) mới [44]

TIệ gen của virit cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho E1 protein đã biết

Méi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hoá cho 2 prolcim; các phân đoạn còn lại mỗi phân đoạn

mi hoa cho 1 protein

(3)Gidi phéng vRNP() ra khdi nhân tỄ bào

Trong nhàn tế bảo, chí céc vRNP (-) được vận chuyển qua lỗ mảng, nhân ra tế

‘bao chat théng qua cơn đường vận chuyển phụ thuộc CRMIL Protein CRMII là một thụ

cảm thể cho các tin hiệu vận chuyển từ nhân ra tế bảo chất Đầu tận cùng C của protein

MI liên kết với vRKP, đầu tận cùng N của MI liên kết với NS2; MS2 liên kết với protein CRMI Phúc hệ pằm M1, vRKT (-) và NS2 sẽ được vận chuyển từ nhân ra tê

bào chất nhờ khả răng liên kết của NS2 với CRMI |13]

(4)Đông gói, nấy chỗi và giải phóng vừút thể hệ mới,

Vưút củm sử dụng mảng sinh chất của tế bào chủ dễ tạo thành các hạt virút hoàn chính rỗi rởi khỏi tế bảo và tiếp tục gầy nhiễm các tế bảo lần cận Quá trình đóng,

gói vinil dién ra tai vị trí màng sinh chất có cáo protein HA, NA vi M? eda vir

Người ta đua ra hai mô hình giá thuyết cho quả trinh déng g6i các doan ARN virút: mê hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu Theo mô hình đóng,

gói ngấu nhiên, các đoạn vRNA sẽ được đóng gói một cách ngẫu nhiên bên trong,

virion M6 hình dong gói dặc hiệu dựa trến cơ sở các tín hiệu dóng gói viút dược xác

định là các vùng mã hoá và không mã hoá ở đầu Š° và 3` trên đoạn vRNA Protem MT

dong vai trò quan trọng trong quả trình đóng gói và nảy chỗi hạt vướút

Hạt virút chỉ được giải phỏng ra ngoài màng sinh chất tế bảo chủ khi liên kết giữa acid sialic va glycaprotein / glycolipid được cắt đút, Quá trìmh này được thực hiện

nhờ neuraminiđasa (NA) trên bể mặt virút

1.4 Vai trò của hiện tượng trao đổi và tích hợp vật Hệu đi truyền trong các

vụ dai dich cum trên thể gi:

Thể ki XX và dầu thể kỉ XXI đã ghi nhận có 5 đại địch cứna xảy ra vào các năm

1918, 1957, 1968, 1977 va 2009, Tim hiểu căn nguyên gây đại dịch cho thấy dai dich

xây ra khi xuất hiện chủng virút có tính kháng nguyễn mới và cơ thể chưa có khang thé

trung hỏa virút đỏ Trong 5 đại dịch đã xảy ra, 3 đại dịch củm có cần nguyên lá những, chủng virút được hình thành đo hiện tượng trao đổi vả tích hợp di truyền, đó là oác đại dịch năm 1957, 1968 và 2009 |2, 15|.

- Dai dich cúm năm 1957: xuất hiện vào tháng 2/1957 ở miễn Nam Trung Quốc

réi lan sang Singapore, Hongkong Mj va Anh Trang vụ dịch này đã có hơn l triệu người lữ vong Căn nguyên được xác định là virút cúm A/H2N2, một chẳng mới xuất

hiện do hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortmen các doạn gen của chủng A/HINI

nam 1918 va ching virút cúm gia cam Chimg A/H2N2 mới lây các đoạn gen PR2, PA,

NP,M, NS của A/H1NI (1918) còn các doạn PBI, HA, NA từ virút củm gia câm

- Đại địch cúm năm 1968: có căn nguyên là viút cúm A/H3N; dịch xuất hiện

đầu tiên tại llongkong vảo tháng 6/1968 sau đó lan ra toàn thế giới vào mùa đồng

1968, 1969 và 1970 với tỉ lệ tấn công khoảng 40% đân số, tập trung chủ yêu ở độ tuổi 10-14 Chúng A/H3N2 gây đại dịch lả kết quả trao đổi vả tích hợp genome giữa chúng,

ATION? pay đại địch ở người năm 1957 và chúng virút gia cầm Sự thay thể các đoạn PRI, H2AA trong chủng A/H2N2 (1957) thành các đoạn PB1 và H3HA của gia cản

dã tạo nên chủng A/H3N2 mới gay dai dich

- Đại dịch cũm năm 2009: bệnh nhân nhiễm virút cúm mới dẫu tiên được phát

triện ở Mexico, sau đó phát triển thành dịch lan sang các nước châu Mỹ, rồi bùng phát trên toàn câu Căn nguyễn của địch là do một chủng viưứt À/HTN1 do trao dỗi gen giữa

chứng virút củm A/HIN1 va chúng A/LILN2 (chúng trao đổi và tích hợp bậc 3) gây bệnh trên lợn

1.5 Ứng dung kĩ thuật di truyền ngược tổng hợp virút củm A

Di truyền ngược là cách thức phục hỗi chức năng của gen khi đã biết trình Lự nucleotide day di của gen (full leneth) Kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng dễ

nghiên cứu sự thay đổi chức năng gen khi thay đối trình tự nucleotide trên gen Trong

sứu vẻ virúL cúm, kĩ thuật đi tuyển ngược được áp dựng để ông hợp vưdt

Từ những năm 90 của thẻ kí wude, virut cum A di duoc tổng hợp bằng cách sử

dụng virút trợ giúp Trong công trình nghiền cứu công bố năm 1996 của Palese, P và

cs [40], viưút cúm À được lạo ra nhờ một hệ thống phụ thuộc viút trợ giúp: phú hệ

VRNP dược tạo ra bằng cach tang hop soi ARN vi vitro cing voi sự cỏ mặt của các protein polymerase và ND tình sach Phức hệ vRNP này được gây nhiễm cùng viút

cúm A trợ giúp đẻ tạo viút mdi [40] Đến năm 1994, Neumam và cộng sự dã phát

triển một phương pháp khác, trong đó, vRMA được tổng hợp ứr vivo trong tế bào chủ

nhờ ARN polymerase L Thực hiện chuyển nhiễm plasuid mang e€DNA thôn đông

củng với virut trợ giup sẽ tạo virut mdi co doan gen tuong ứng với cONA nhân dòng

Với cả hai phương pháp này, virút mang đoạn gen mong muền được tạo ra đẳng thời

với virút trợ giứp nên gây khó khăn trong việc sàng lọc virút đích,

Năm 1999, Neumarm, € vá cs đã có những thay đổi về hệ thẳng tạo virút púm

A [16] Hệ thống mới không sử dụng virút trợ giúp má gồm các pÏamid mang các doạn

cDNA nhan dong Hai loại plasmid được sử dựng là plasmid biểu hiện VRNA(-) và

plasmid biéu hiện protem vrúi Khi chuyến nhiễm dồng thời 8 plasmid biéu hiện 8

đoạn vRNA(-) va 4 plasmid biéu hién 4 protein PB2, PB1, PA va NP vào tế bào 2931,

sẽ tạo ra 8 phúc hệ vRXP, lừ đó tổng hợp nên virit etm A Nyoai hé théng gam 12 plasmid như trên, tác giả cũng đã thử nghiệm với hệ thông 17 plasmid gồm 8 plasmid tiền hiện vRNAC) và 9 plasmid biểu hiện protein (PBI, PB2, PA, HA, NP, NA, MI, M2 và NS2) để tạo viưút cứm A Kal qua ä hệ thông 12 plasmid và hệ thống,

cho thay

17 plasmid déu tao virat chm A có khá năng gây nhiềm Lệ thẳng chuyển nhiễm ADN

có ưu điểm hơn so với hệ thống cần virút trợ giúp, đó la tạo ra chính xác virút mong

muốn, không phải thục hiện sảng lọc virút đích

Để han ché tdi da số lượng plasmid, có nghĩa dơn giãn hóa quá trình xây dựng,

hệ thống chuyển nhiễm plasmid, năm 2000 Hoffimam, E và os đã phát triển hệ thông, chuyển nhiềm gồm 8 plasmid [19] Hệ thống way chỉ sử đụng một loại pÏasnngd là

pIIW2000 Plasmid plIW2000 duoc thiết kế để biểu hign déng thoi vRNAC) va

protein virit Khi mét đoạn gen của virút cảm được nhần đồng vào pHWW2000, vRNA() và polein ci viral sé được tổng hợp từ cùng mội planid nhờ ARMN

polymerase 1 và ARN polymerase 1I của tế bảo chủ Chính vi vậy, hệ thông mới chỉ gồm 8 plasmid pHW2000 mang 8 doan cDNA của virúL cúm Hệ thống nay cd 86

lượng plasmid ít hợn, đồng nghĩa với việc quá trình xây dựng đơn giản hơn so với hệ

thống chuyển nhiễm plasmid của Neumam, G vả cộng sự Với tu điểm này, hiện nay tiể thông chuyển nhiềm 8 plasmid được sử dụng trong nhiều nghiền cứu về đặc tỉnh

phân tử khá năng gây bénh cua vinit cum

1.6 Cơ sở khoa học để thiết kế và thực biện nghiên cứu

Theo kết quả giảm sắt cúm của PTK Củm Viện Vệ sinh Dịch tế Trang ương, từ năm 2000 đến nay (tháng 8 năm 2012), ở Việt Nam, virút cúm gây bệnh cho người lưu Tưmh quanh năm, gồm các líp và phân típ pứm A/HTNI, A/H3N2, dúm B, A/HINI-09 dại dịch (từ năm 2009)

Hên cạnh sự lưu hành các chúng viút cảm người, từ năm 1997 đến nay, dịch

cứm gia cảm độc lực cao A/TISNI (TIPAI TSNI) lây từ gia cảm sang người đã và đang,

gay mỗi lơ ngại cho các nước về nguy cơ bùng phát đại dịch Theo ghí nhận của TCYTTG, tử năm 2003 đến tháng 7/2012 đã có 608 người nhiễm virút cum gia cầm

độc lục cao ở 15 quốc gia khác nhau, trong đó 359 trường hợp tử veng (59,09) [12]

đồng Chúng virút này có thể được hình thành do những thay đổi nhỏ trên các đoạn gen

của virit hoặc do hiện tượng trao đổi gen giữa chủng virút cứm gia cẩm độc lực cao

voi ching viriil cam mùa đong lưu hành:

Theo kết quá giảm sắt cảm lạt Hà Nội giai doạn 2001-2005 và giám sắt cúm tại miễn Bắc Việt Nam giai đoạn 2006-2008, hai phân tịp virút cúm ruùa lá A/H3N3 và A/TIINI thường xuyên lưu hành và là căn nguyên của các địch cúm vào mùa hè [1]

Kết quả thu thập dược từ hai chương trình giám sát cúm trên cho thdy vinit com

A/LI3N2 được ghi nhận là căn nguyên chỉnh của các vụ địch năm 2002, 2004, 2005,

2007, tương tự virút cúm A/HINI1 là căn nguyên chính của các vụ dich năm 2003,

2005 và 2008 Viưút cum A/H3N2 gây dịch vào các năm khác nhau có đặc tình kháng, nguyền khác nhau đã được ghỉ nhận đó là A/Panama/2007/99 (2001-2002), A/Fujian4lU/202 (20042005, A/Wisconsin/67/2005 (20062007) din A/Brisbane/10/2007 (2007-2008) Trong khi đỏ, các virit cum A/HIN1 giiy dich trong, giai đoạn trên có đặc tính kháng nguyên được xác định là A/New Caledonia/20/1999 (2003, 2005) va A/ Solomon Islands/3/2006 (2008) [1, 31] Kết quả này dã khẳng dịnh

sụ tiến hỏa về mặt di truyền của virứt củm A/113N2 nhanh hơn viút cứm A/H1NI, ví

vậy viúl cứm À/H3N2 dự tuyển cho vắc-xin cứm mùa hàng năm được cập nhật và thay doi nhiều lần hơn so với viút cứ A/HIN] trong củng giai doạn

Nam 2009, đại dịch cúm A/H1N1 xuất hiện và lan rộng trên toàn thể giới Phân

tích câu trúc hệ gen của virút cửa AJIIN-09 đại dịch cho thấy các gen M và NA có

côn các gơn PB2, PBI, PA, HA, NP,

Tuguồn gốc lừ viruL cúm lợn HÌN1 động Á — Âu

NB có nguồn gốc từ virut cum lợn 1IN2 dòng lắc Mỹ Virut cim lợn LILN2 Ja vinit

trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortant virus) giửa virút gia cắm (pen PB2, PA), virút củm lợn (HA, NE, M, N®) và virat cứn người H3N2 (gen PBI, NA) [46

Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược chủ dòng tổng hợp viút cứm mới trao đổi

và tích hợp di truyền giữa virút cứm gia cằm và virút củm người để tìm hiểu độc lực

virứt, khả năng gây bệnh cho người, chú động xảy dựng cáo biện pháp phỏng chống,

hữu hiệu là các xu hướng nghiên cứu về virút cứm trên thể giới Nghiên cứu của Li, C

và cs năm 2009 đã tạo ra các virúL mới trên va sé vind clan A/H3N2 ở người và virút

cum gia cằm A/H5N1 Kết quả cho thấy việc trao dỗi và tích hep gitta virdt cam

A/H5NI và virdl cúm cô độc lục thấp trên người hoặc chuột (A/H3Ñ2) có khả năng lạo

ra virút có độc lực cao và phân doan gen PB2 của virút cúm người có trong viưút cúnh

gia cảm A/HSNI có thể lâm tăng độc lực của virút củm này [29] Tương tự, nghiên cửu

của Jackson, § và ca năm 2009 cũng xác định khả năng Irao đổi và tích hợp vật liệu di

truyền của vưút củm A/H3X2 và HSN] trên mô hình động vật là có thể, Thêm vào đỏ, kết quả phát hiện tỷ lệ cao virút trao đổi và tích hợp trên biển mô đường hồ hấp trên của chồn sương cho phép kết luận rằng: nêu hiện tượng phơi nhiễm của người hoặc

động vật với virút A/LISN1 củng với virút cúm mủa trong củng thởi gian sẽ lâm tăng

nguy cơ tạo virút cứm trao đối và tích hợp, có thế đào thải qua đường hồ hấp trên như

virút củm mùa |23]|

Tủ các kết quả nghiên cứu trên, phối hợp với tình hình dịch tễ học bệnh cứ tại Việt Nam, chứng tô: đã tiên hành xây dựng hệ thống chuyển nhiềm plasmid có khả trăng tổng hợp vmúl cúm A Sau đó, Lừ hệ thẳng chuyển nhiễm mày chúng lôi tiễn hành tổng hợp virút củm A mới từ viưứt củm A/H5N1 và A/H3N2, Hệ thống chuyển nhiém plasmid néu thành công, sẽ tạo điểu kiện phát triển các nghiên cứu sân hơn về virút

cúm Đồ k]

ông chỉ là các nghiên cứu về độc lực viúi, khả năng lây truyén cia vinit

ma cén vé hiện tượng trao đổi vả tích hợp diễn ra trong quân thể virút cúm A lưu hành

tại Việt Nam cững như các nghiên cửa về phát triển vaocins cúm phòng bệnh trong

tương lai

1.7 Van dé dao ditc va An toàn sinh học trong nghiên cứu

Plasmid pHW2000 được cung cấp bởi PTN của TS Robort Wcbstor, Bệnh viện hiên cứu nhỉ đồng St Tude - Mĩ Việc trao đổi và sử dụng plasmid này chỉ với mục

dich nghiên cứu, tuần theo các quy định đã cam kết giữa người gũi và người nhận dược nêu trong MUA (Material Transfer Agreemet) (Phụ lụo 1)

Trước khi tiền hành thực hiện nghiên cứu, nhỏm thực hiện được đảo tạo, cấp

chứng chỉ về An toàn sinh họo cơ bản và sử dụng, PTN an toàn sinh học cập II, TH

Qua trình chuyến nhiễm plasmid vào tế bào cảm nhiễm để tảng hợp virút cúm

được thực hiện trong PTN An toàn sinh hạc cấp độ II Nghiên cửu viên thực hiện thí

gm trong PTN An toàn Sinh học cấp II được cg cấp trang bị bảo hộ cá nhân và

phải được sự đẳng ý của lãnh dao Khoa Virdl, Khoa An toan sinh hoc — Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương

Cáo chúng virut dược tạo ra trong nghiên cửu dược bảo quản ở diều kién -80°C,

trong PTN An toàn sinh học cấp độ II, đưới sự quản lí của lãnh đạo Khoa Virút — Viện

Vệ sinh Dịch tế Trung ương.

Chương 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Virút cúm gia cầm độc lực cao A/HSN1

Phan doan gen HA vả NA cửa chúng A/Vietam/1203/2004

- Virt cũm người A/H3K2:

Phân đoạn gen PB2, PBI, PA, NP, M và N8 của chủng, A/Hanoi/N062/2007

2.2 Vật liệu nghiên cứu

221 Plasmid pHW2000 va hé théng plasmid ching đường

Ne V1)

Hom BI (43) Kpn 1658)

pHW2000

2980 bp

Hình 2.1 Mô hình cầu trúc vector pHW2000

Nguénzhttp:/www.academicjournals.org/AJB [6]

Doan cDNA ctia virut cim duoe chén vào giữa hai vị trí nhận biết của enzyme

gidi han BsmBI

Hé thong plasmid ching dương

Hệ thông plasmid chứng dương gồm tam plasmid pHW2000 mang tam doan

cDNA tương ứng tám phân đoạn gen của virit củm A/PR/8/34 (HINI) Hệ thống plasmid chứng dương được sử dụng trong quả trình nhân dỏng đoạn gen virút cúm

(nhân định két qua PCR, kiém tra plasmid mang ADN địch) và quá trình chuyền nhiễm tạo viưút cúm từ hệ thông chuyên nhiềm plasmid

3.22 Sinh phẩm và hóa chất

Các bộ sinh phẩm, hoa chất sử dụng trong nghiền cửu cỏ quy trình hướng dẫn

thực hiện kèm theo, các bước thực hiện liên quan được tiền hành theo hướng, dẫn của

bộ sinh phẩm

* Các cặp mỗi sử dụng trong nghiên cứu

Hê thống môi dùng khuếch đại các phân đoan gen đích bing PCR Các cặp môi sử dụng cho PCR được thiết kế với mục địch tổng hợp các phan đoạn gen chiêu dài đủ của các chủng virút cúm A, đồng thời phủ hợp cho quá trình

nhân đỏng vào vector pHW2000 Hệ thống mỗi này được sử dụng chung cho các

chủng viút trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Hệ thống mỗi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích

PED TẠTTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGIC ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGICGIT Ô

TTATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA — ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT Ỳ

TATICGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC _ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT aaa

11ệ thông môi sử dụng cho qua trinh gidi tr

nh tự

Hệ thông mỗi dược sử dụng cho quả trình giải trình tự gồm:

- Cap méi dặc hiệu với vector pHW2000: pHW18OE và pHW 100,

- Các môi đặc hiệu với mỗi doạn gen dich

- Các cặp mỏi dùng để khuếh đại gen đích (Báng 2.1)

Bảng 2.3 Hệ thống mỗi dùng cho quá trình giải trình bự nueleotide

MÀ L496P: E'-CAAG6TC7GACTATAGCTTAGS-2

ND ASIF: £'-ATCTSGCATTCCAATTIGAAT 3 WD99IP ©-ATCAGACOTAACAAGAATOCAS

WA BME: 9" GISITACICTACTTACCGAGAS F NAAOTE, 5'-GICAICAK ‘OCCAT SATO N& T0LTE: '-TACGGCSATSGTGTCTGGATC-S'

Nữ 6908: $'-ATCGCUACAACAGCTAGUTCA3'

NE 318B: § GTTATCAGTACASTCAATACA ocd oTaGa

Cặp môi chẩn đoán phan tip LI5: U15-1 và 115-3 được cung cấp béi TCYTTG, sản phẩm khuêch đại có chiều đài 219bp

* Sinh phẩm và hoá chất cho quá trình nhân đồng các đoạn ADN đích

Tach chiét ARN QIAamp viral ARN Mini Kil (250) 52904 QIAGEN

Tong hap ADS bo perSeriptill Reverse ‘Lranscriptase 18080-044 _invilrogen

(cDNA)

Tinh sach sin phim Wizard SV Gel & PCR CkamUp „sao; Promega

Tach plasmid tideep) ‘Nucleobond Xtra Midi 4 74041050 ACHEREY — ACERT

* Phản ứng xác dịnh trình tự chuỗi nucleotide

- Bộ sinh phẩm BigDye Temniator v3] cycle sequeneing P/N, CatNo

4336017 hãng ABI (Applied Biosystems)

- B6 sinh phdm DyeLx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat No: 63206)

* Chuyén nhiém plasmid vao tế bào động vat có vú

- Sinh phim: Lipofectamine2000, INVITROGEN, Cat No 11668-027

- Mỗi trường phát triển tế bào: TIMEM chứa 10% FCS (Fetal Call serum)

- Mỗi trường phân lập lế bao: DMEM 2% BSA, Trypsin TPCK (0,001 my/ml)

* Phần ứng ngung kết hing cau

Héng cau ga.0,5%; Dung dich dém PBS

2.2.3 Hệ thẳng câm nhiém virit chm

- Trứng gà gó phối 10 ngày được cung cấp bởi Viện chân nuôi Việt Nau:

- Tế bào MDCK có nguồn gốc từ ATCC — Trang lâm nguồn sinh học toàn cầu

224 Trang thidt bi va dung cu

Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp II:

Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp 11

ly lâm tuýp EppendofT Beckman-Copher

Đầu côn vô trừng các loại, có phín lọc: tử 1 ul đến 1000n1

Phiển nhựa 6 giếng, phiến nhựa 96 giêng đáy chữ V, chai môi tế bào 75cm2

Tuýp vô trừng các loai: 0,2 ml; 1,7ul, 20ml

- Trang nhục bảo hộ cả nhân (rung PTN An toàn sinh học cấp 3

Khấu trang N95 (3M 1860), bộ quần áo (Tyvek)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình xây dung hệ thông chuyên nhiễm ADN có khả năng tổng hợp virút

cum A vả tổng hợp vưút cam mới từ virút củm A/HSNI vả A/H3N2 được tóm tắt

peri dai des een te @) ] Bosanh trnh tự @ va @

[khuếch đại virút trong trúng gà có phối

'Xc định hệ gen cia virat

Hình 2.2 Quy trình xây dựng hệ thông chuyên nhiễm plasmid có khả năng tạo virút

cúm A và quy trình tổng hợp virút củm mai tit vinit ci A/HSNI và A/H3N2

23.1 Lira chon chiing virat gắc

Chúng virut củm A/HSK1 và A/H3N2 dược lựa chọn từ các chủng hiện dang lưu giữ tại PTN Cúm, Viện Vệ sinh Dịch tẾ Trung tương Chứng virút củn được lựa

chọn phải cĩ hiệu giá ngưng kết hơng cầu (HA) tơi thiểu 8

232 Chuẩn bị xectar nhân địng

Khuếch đại phasmid:

- Biển nạp plasinid pHW2000 vào tế bảo cam biến E.cọi chẳng TH5-TT bằng

phương pháp sĩc nhiệt

- Sử dụng mỗi trường LB thach dé lựa chọn tế bảo mang plasmid

- Khuếch đại tế bảo mang plasmid rong mơi trang LB léng (100 200 mÙ)

‘Tach plasmid tử tế bảo vi khuẩn: Sứ dụng Nucleobond Xtra Midi Kit

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn:

Hàm lượng plasmid dược cắt: 5 nạ,

- Cat plasmid bing enzyme BsmBI

- Tinh sach plasmid bing Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

- Xac dinh néng độ plasmid sau xứ lí bằng máy nanodrop

lão quân plasmid ở nhiệt độ -70%C

233 Chuẩn bị ADN nhân dịng

Tiich chiét ARN

Si dung QlAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN ) dễ tách chiết ARN từ chúng

virtt phan lap, thực hiện theo quy trình hướng dẫn

Với mỗi mẫu tách chiết, thê tích ARN thu được 14 60 pL.

Tỗng hợp ADN bỗ trợ (cDNA)

Sử dụng bộ sinh phẩm SupcrScriptllI Reverse Transcriptasc - INVITROGEN

‘Theo quy trình của bộ sinh phẩm, thể tích cDNA thu duge từ mỗi phan ứng là 2⁄4 HÌ Trong nghiên cửu này, thực hiện O2 phản ứng để có tổng thể tich 18 48 yl

Thực hién PCR

Sử dựng bộ sinh sinh phẩm IlotStar IliPidelity Polymerase (QIAGEN), may PCR Biorad

Với mỗi đoạn gen đích, thục hiện 3 phản ứng, lổng thể tích sản pham PCR 14 100 ut

(ehi tiết xem phúụ lục 2)

Dién đi sân phẩm PCR

Điện đi để kiểm tra kết quả PƠR và quá trình tinh sạch sản phẩm PCR Sử

dung gel agarose 0.8% cé ethidium bromide (10ul / 100 ml dung dich agarose), higu

dién thé 100 vol trong 30 phút, thang AKD chuan 1kb (Promega), quan sat và chụp

ảnh dưới tia UV

Nhận dink kết quả

Dựa vào kích thước đẩy đủ của sản phẩm PCR khi thiết kế môi và thang ADN chuẩn để lựa chon ADN dich (san phẩm mong muốn),

Tình sạch ADN đích:

Sử dụng bộ sinh phim Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

Nit ADN dich véi enzyme gidi han:

- Cat ADN dich bing enzyme BsmBY/ hoặc Bsal tong ime với môi loại cặp môi

- Tỉnh sạch bằng bô sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System

2.3.4, Nhan dong ADN dich véo plasmid pHW2000

Bua ADN dich yao plasmid:

Sit dung 14 DNA ligase dé gan ADN dich vao plasmid pHW2000 da xf li tao plasmid tải tổ hợp, thực hiện theo quy trình của bộ sinh phim

Biển nạp vào tế bảo khả biến

Sử dụng phương pháp sốc nhiệt đề biến nạp 5 pl plasmid tai té hop vào tê bào ví khuẩn E.coli (DH5u — T1)

Cấy trái tế bào đã biến nạp trên môi trường I.B thạch

- Chuẩn bị môi budmg 1B thach od khing sinh Ampicilline (0,05mg/m?)

ty trải 150 ul vi khuẩn trên đĩa T.B thạch

~ Ú đĩa thạch chứa vĩ khuẩn ở 372, từ 18 — 20 giờ

Xác định khuẩu lạc chứa plasmid mang ADN đích

- Chuẩn bị môi ưường T.B lắng có Ampicillin (0,05mg/m])

- Chia 3— 5 ml mdi trudng LB léng vio tuýp lì tâm 15 mì

- Nhất khuẩn lae từ đĩa thạch L,B vào tuýp môi trường T.B lồng,

- Nuôi vi kh

m trong điều kiện 37C, 170 vòng/phúi, từ 18 — 20 giờ

- Tach ADN plasmid, sử dụng QIAprep Spim Miniprep Kit (QIAGEN)

- Điện đi plaxmid irén gel agarose 0,8%

- Tua chon plasmid mang ADN dich, baa quan 6 -20°C

Vị khuẩn chứa plasmiđ mang ADN địch: thêm 200 — 500 tt] Glycerol tiét trùng,

vào 500 4Í vị khuẩn, trộn đều, bão quần ở -70%C,

30

23.5 Phan ing xéc dink trink te chudi nucleotide (sequence)

Mục dích:

- Xée dịnh trình tự ueleotide các doạn AI2N dích tổng hợp từ gen dich (rước nhân dòng)

- Xác định trình tự nueleotide cáo doạn AION dịch trong plasmid (sau nhân dòng)

- Xác dịnh trình tự nueleotide các phân đoạn gen của virút cúm tổng hợp bằng hệ thông

chuyên nhiém ADN plasmid

Chu kì nhiệt tạo các đoạn ADN gắn dideoxynucleotide (Cycle sequencing)

Sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N

Tỉnh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn đideoxynucleotide

- Mục dich: loại bô các dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, trảnh nhiều trong quá trình giải trinh tự

- Sử đụng bộ sinh phẩm Dyelx 2.0 Spin kít Qiagen (Cat.No: 63206) theo hướng

din kém theo bộ sinh phẩm

Điện di qua mau quản và đọc trình tu nucleotide bing dau đọc laser

- Cho 10 ul HiDi Formamide (HiDi Formamids ABT 25 ml P/N: 4311320) vao tuyp 1.5 ml chtfa ADN sau khi lam khé (2.3.4.2)

- Chuyên toản bộ săn phảm sang phiến 96 giéng (phién chuyên đúng cho ABI

PRISM 3100 — Avant)

- U phiên 4 96°C trong 5 phút

- Chuyén phién vào giá giữ lạnh

- Đại phiên 96 giếng vào máy ABI PRISM 3100 ~ Avant

- Cài đặt chương trình chạy, thu kết quả từ tệp đữ Hệu khi phan ứng kết thúc

Phân tích các trình tự chuỗi thu đuợc

Sử dung phan mém phan tich DNAstar va SeqMan dé phan tích các trình tự

chuỗi thu dược: nói các đoạn muelcotide thành một đoạn gen hoàn có chiều dai day đủ, kiểm tra cầu trủc gen (chiều đải gen, chiều dải ORI, ving không mã hóa)

2.36 Chuẩn bj plasmid cho quả trình chuyền nhiễm

- Lay 100 il vi khuan được bảo quản trong glycerol cho vào 100 200 mì môi

trutmg LB long,

- Nuéi vi khudn trong điều kiện 372C, 170 vàng/phúi, tir 18 — 20 pid

- Tach ADN plasmid, sir dung Nucleobond Xtra Midi Kit (ACHEREY-NAGEL)

- Xác định néng 46 ADN plasmid bing may nanodrop ở bước séng 260nm

- Bao quan plasmid 6 -70°C

23.7 Chayén nhiễm plasmid vào tễ bào

Sử dụng sản phẩm plasmid tách bing Nucleobond Extra Midi Kit cho qua trinh chuyển nhiễm

Các bước tiền hành:

- Chuẩn bị tê bào: I ngày trước khi tiến hành chuyên nhiễm, tách tê bảo 293T

với số lượng là 1 x 10 lế bảo / giống Irong 3 m] môi trường TTMEM High glucose (sir dụng phiến nhựa 6 giêng)

- Với mỗi mẫu chuyền nhiềm, chuẩn bị hỗn hợp sau:

Hn hop (1} cho lug méi pÌasmid x # ADN plasmid vào 250 hÌ môi trưởng,

Opti-MEM, trộn nhẹ bằng pi-pét

Hén hop (2): Pha loãng Lipofeclamine2000 trong 250 jl méi trường Opti-

MEM, ñ 5 phút ở nhiệt độ phòng

Trên hỗn bop (1) và (2) (tổng thể tính là 500 HÐ, ä 20 phút ở nhiệt độ phòng,

- Loại bổ môi trường DMEM trong phiến tế bảo, thay bằng ]ml môi trường Opti-MLM Sau dé, nhé 500 pl hén hợp (1} và (2) vào giếng tế bảo và lắc nhẹ phiên

- Sau 4 giờ chuyển nhiễm, thêm môi trưởng Opii-MUM vào mỗi giếng để đạt thể tích là 3 ml Ủ phiến tế bảo đá chuyển nhiễm ở 37C, 5% CO; trong tối đa 72 giờ

23.8 Khuéch doi virdt

Trứng gà có phôi:

Sử địng trừng gà có phôi 1Ô ngày thổi, kiếm tra tình trạng phôi trước khủ phân lập

- Tạo một lõ nhỏ trên vẻ ở phía đầu tù của trứng,

33