Luận văn tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm Đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân Điều trị Ở bệnh viên Đa khoa việt tiệp hải phòng 2010 2012

Bệnh viêm đường hồ hấp cấp do căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong cộng đồng tăng cao, ví dụ: địch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI TRUONG DAL HQC KHOA HQC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI TRUONG DAL HQC KHOA HQC TỰ NHIÊN

NGUYEN VT SON

TÌM HIỂU CAC CAN NGUYEN VI RUT GAY VIEM

DUONG HO HAP CAP CUA MOT SO BENH NHAN

DIEU TRIG BENH VIEN DA KHOA VIET TIEP

HAI PHONG 2010 - 2012

Chuyên ngành — : Visinh vậthọc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHÓA HỌC

PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai

Hà Nội - Năm 2012

MUC LUC

DAT VANBE

CHUONG 1 - TONG QUAN TAI LIEU

1.1 CAC VI RUT DUONG HO TAP

1.3 DAC DIEM LAM SANG

1.4 DỰ PHONG VA DIEU TRI

1.4.1 Dự phòng, ¬— ¬— ¬— —

1.5 CHAN BOAN TRONG PHONG THI NGHIEM

1.5.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên ¬— se-eoo 2

2.3.5 Phan ứng xác định trình tự chuối nucÏeolide (sequenee) 47

CHƯƠNG 3 - KẾT QUÁ VÀ BẢN LUẬN

3.1 CAC TAC NHÂN VLRUT GAY ¥

HAT PHONG

3.1.1 Sy phan

3.1.3 Phân bố theo độ tuổi

3,2 XÁC ĐỊNH CĂN NGUY:

3.3.1 Tỹ lê tác nhân vi rút gây VDITITC được xác định trong nghiên cứu 55 3.2.2 Vai trò của các họ vị rút gây VĐHHC ¬— —- 3.2.3 Kết quá xác định căn nguyên vị rút gây VIDLLIC 3.2.4 Phản tích sự lưu hành của các táo nhhằn ví rút theo tháng él 3.2.5 Sự liên quan giữa táo nhân lây nhiễm và các lửa tuổi ø

3.3 PHAN LAP

34 XAC DINHDAC DIEM VIRUT HOC CUA VIRUT CUM

3.5 HOAN THIEN QUY TRINH CHAN ĐOÁN VĐHHC

'ết luận TH HH0 0.2.0.0 XE E.TTE T.E T.rHn LH 8110110110011 1cm cre 73 Kiến nghị sexy sexy sexy seo TA

Vi rút củm A/HINI đại dịch 2009 Centers for Disease Control and Prevention (Trung tam

Phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ)

Deoxiribonuclcotide 5ˆ-triphosplates Enzyme linked-immusorbent assay (7Jử nghiệm hấp phụ

miễn dịch gắn enzyme) Hemagglutination test (2bẩn ứng ngưng kết hông cầu)

Hemagglutination Inhibition Test (Phan img ngdn ngung

Hội chứng viêm đường hỗ hắp cấp (VĐHHC) đo căn nguyên là vi rút

lioặc vì khuẩn chủ yêu hay gấp tại các nước có kiểu hình khí hậu nóng ẩm, rnưa nhiều Một số tác nhân có thể gây nên các vụ dịch lẽ tế hoặc thành dại dịch (dịch

cứm, vi rút hợp bào hô hập — Respiratory Svcytial Virus ) [6, 30, 51] Tác nhân

vi rút gây bệnh thường gặp lá: vi rút thuộc họ Pieornaviridue, Paramjyxoviridae (R§V, vĩ rút á cúm ), Orfhlomyxoviridae (vì rất cảm A, B ) [1, 13, SE] Trong,

dé, vi rút củm được xem là một trong những căn nguyên quan trọng nhất gầy bệnh VĐHHC |50, 59, 79] Hiện nay cẻ khoảng hơn 200 loại vị rút có cầu trúc kháng nguyên khác nhau gây bệnh VDILIIC

Trên thế giới, hội chủng VDLHIC xuất hiện quanh năm ở các vũng ôn

đới, nhật là vào thời gian thời tiết lạnh va ấm Bệnh viêm đường hồ hấp cấp do

căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong

cộng đồng tăng cao, ví dụ: địch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa

đông tại các nước ân đói thuộc khu vục Bắc bán câu, á cúm là nguyên nhân chỉnh gây VĐHHC vào mùa thụ và dẫu dông, trong khi cao điểm của nhiễm vì

rút entero lại vào cuối hè VDITTC đo vị rút có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe đặc

tiệt đối với trẻ em và người giá tại các nước dang phát triển Theo báo cáo cửa tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 4.5 triệu trễ em dưới 5 tuổi tử vong hang nim do VDLILIC va cin nguyên vị rút chiếm 40% trong tổng số đó [86]

‘Tai Việt Nam, bệnh VID11LIC xảy ra quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu

trong 10 bệnh truyền nhiễm cấp tinh [12] Tuy nhiên, các nghiên cứu vẻ VĐHHC

do căn nguyên vi rút cũng như các tác nhân nảo chủ yếu vả thưởng gặp còn hạn chế Dặc biệt các nghiên cứu sâu về vi rút học và các phương pháp chân đoán nhanh phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc điểm đi truyền,

đặc tính kháng nguyên của các tác nhân vị rút gây bệnh VĐHHC hiện chưa được

áp đụng rộng rãi, đỏ là lý đo chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Tim kiểu các căn nguyên vỉ rủi gây viêm dường hô hẳn cấp của một số bệnh

nhân điều trị bệnh viện a khoa Liệt Tiệp - Hải Phong 2010-2012"

3 Hoàn thiện q#ụ trình chân đoán sớm nhiễm vĩ rút đường hê hắp tên

bệnh phẩm lâm xăng bằng kỹ thuật RT- PCR thông dụng (comuentional RT-PCR).

đọ thông đụng được phân tích đó là

Hãng 1.1 Cáo vi rút gây bệnh VIDLHIC

- Virdt human Metapneumoviridae (XMPV)

~_— Vi rút ú cúm (vi rút Parainluerzz) phân líp 1,

2,3

3 Picornaviridae - Virut Entero

- Vint Rhino

4 Coronaviridae -_ Vi rút gây hội chủng viêm đường hỗ hắp cấp

tính nguy hiếm (Severe acute respiratory

syndrome coronavirus - SARS-CoV)

LLL Virat ho Orthomyxoviridae

ILL Hinh thai:

Orthomyxoviridae 1 ho vi rat đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là ARN đơn, ôm, phân đoạn Trước đầy, các vi rút Orthomyxo va Paramyxo đều được

xếp chưng vào mét ho 1A Myxeviridae do chúng có câu trúc vả khả năng lây bệnh giếng nhan, nhưng về sau được tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae va Paramyxoviridae do phat hién thấy chúng còn nhiều đặc điểm cơ bản không giống nhau [13, 51]

Vi rut Orthomyxoviridae gom 5 nhom vi rut: vi rut cam A, vi nit cum B, vi

rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa [51] Trong đỏ vỉ rút cúm A lưu hành phỏ

biến trên gia cảm, người và các động vật khác như lợn, ngựa là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toan cau Vi nit cúm B thường g

Hình 1.1 Mô hình cầu trúc virion của vị rút cúm [18]

Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình câu với cầu trúc xoắn, đường kinh

80-120nm nhưng đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đền vải Jun Genome của vi rút

cúm A và B được chia thành 8 phân đoạn, đơn âm với tổng khỏi lượng 5x10

Dalton

Trong virion có chứa enzyme ARN-polymerase phụ thuộc ARN, enzyme

nảy cẩn cho quá trình phiên mã vì genome là ARN chuỗi âm Protein capsid kết

hop voi ARN tao nucleocapsid déi xtmg xoắn Nucleocapsid được bao bọc bởi

mang protein nén M1 (M: Matrix) phía ngoài mang lại được bao bọc bởi vỏ

ngoài là lớp lipid kép cỏ nguồn gốc từ mảng sinh chất của tế bảo chủ Protein M2

dâm xuyên và nhô ra khối vỗ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong,

endosome thay dai [13]

Bề mặt vi rút có đính các gai bán chất la glycoprotein, đỏ là kháng nguyên

hemagglutinin (ILA) va neuraminidase (NA) Protein IIA gây ngưng kết hồng cầu

và cô vai Irò gắn vì rút vào tế bảo vật chủ, protein NA có vai Irò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào dễ giải phóng vi rút,

1

2 Cầu trúc phân tứ

Vật liệu di truyền của vi rút cảm A, B là 8 phân doạn, có chiều đải khoăng,

10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho | protein cau trúc hoặc không cầu trúc:

7 protein cam trie: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP va MI và 3 prolcin không cầu

tric: NSI, NS2 va M2 d6i voi vi nit cum A va NP déi voi vi nit cum B

Phần đoạn gen HA gồm 1.742-1.778 nucleotid ma héa cho 562-566 axit

amin, protem LIA có kha nang gây ngưng kết hỏng câu, gắn với thụ thế chứa axit

sialic rên bê mặt tế bao và giủp vì rút xâm nhập vào tế bào Protein HA tổn lại

dưới 2 dạng: dạng tiên thân không phân tách lá LLA° hoặc dạng phản tách thành

HAI và HA2 liên kết với nhan bởi cau ndi disulfua (S-S) Sự phân tach này là

điều kiên quyết định để vị rúi có khả răng gây nhiễm và lây truyền của vì rút

[73] Ngoài ra, vị trí axit anin trên gen HA co vai tro gan với trụ thể tế bảo chú

cững đóng vai trò quian trọng trong việc lây

ao chủ lại công 2.6 (SAn- 2,6 Gal) [43]

truyền vi rút cúm Vì rút cúm người

gắn vào thụ câm thể tr

Phân doan gen NA cé 1413 nucleolid ma héa cha 453 axil amin, Protein

NA có bản chất lá một enzyme dong vai tro quan trong trong việc giải phòng vị

rút từ tế bao nhiễm và lan trải vi rút trong đường hô háp Các đột biến tại vị trí

axit amin: 275, 295 ở NA của típ N1 hay 2Ø2 ở NA của tip N2 liên quan sự

kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rit (Osertamivir va Zanamivir), Suv đột biên này được cho là kết quả của quá trình cạnh tranh sinh học [19, 34, 35,

42, 44]

1.3 Cơ chế nhân lên

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của vỉ rút củm[48]

- Đầu tiên, vi rút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ

gai glycoprotein HA Vị rút xâm nhập vào bên trong tế bảo theo cơ chế nhập bảo

Màng tế bảo bao lây vi rút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bảo chất Quá

trình dung hợp với mảng endosome làm giải phong nucleocapsid vao té bao chat

và được vận chuyên vào trong nhân tế bảo

~ Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn đề tổng hợp nên sợi ARN

(+) theo co ché bé sung cARN (+) nhờ enzyme ARN - polymerase phụ thuộc ARN

của vi rút Chính các cARN (+) nay lai duoc ding làm khuôn đề tông hợp các sợi

ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút Các sợi ARN (-) được tạo thành

nảy lả một sợi hoàn chỉnh vẻ độ đài và một phần được phiên mã tạo ra các mARN

(+) ngắn hơn Sau đỏ, quá trình dịch mã thảnh các protein chức năng xảy ra 6 te bao

chất

- Cae proten NS1, MI và NP được vận chuyên vào nhân kết hợp với sợi

ARN (-) méi téng hop dé hinh thanh nén nucleocapsid, sau dé được vận chuyền

ra té bao chat Tai day, nucleocapsid được bao bọc bởi các protein HA, NA, M2

thông qua sự tương tác với bộ mảy Golgi Hạt virion mới được tạo thánh bang

cach nay chéi tir mang sinh chat, axit sialic 6 mang sinh chất sẽ bị phân cắt bởi

bảo chị

enzyme NA và giải phóng vĩ rút ra khỏi dễ bắt đâu một chu trình lây

nhiễm mới Nhu vậy, quả trình sao chép của vi rút củm xây ra trong nhân tế bảo,

vả một số bệnh đường hỗ hập khác [12] Nhưng các vi rủt thường gặp gây

VBHHC Ia vi rat hop bao đường hỗ hấp (RSV), hMPV và parainlluerza (á cúm: phan tip 1, 2, 3)

1.1.2.1 Hinh thai

Virion thuộc loại đa hình thải, thường có hình cầu với đường kinh 50-

200nm, chứa 5-7 polypeptid và một phân tử ARN đơn (-), đài, khối lượng 5-

7x10° Bao quanh nucleocapsid đối xứng xoắn là mảng M có cấu lao từ groleim

M không dược glycosvl hoá Phía ngoài mảng M là vỏ ngoài với các gai slyeoprotein bê mặt đãi khoảng 8nm

Virion bi bat hoạt bởi các đúng mỗi hoà tan Hpid, chất tấy rửa,

formakichyde, cic chat oxy hoa

Đặc điểm đặc trưng là hạt vị rút được bao bọc bởi 2 lớp vô lipid với các gai

elyeoprotein mang tính kháng nguyên [13]

Phần võ bao của vi rút Paramyxo bao gồm hai cau truc glycoprotein: H-X

và T Chứng fạo nên các gai trên bê mặt của hạt vỉ rút Các gÌycopratein lớn II, N

có vai trò của hemaggiutinin và neuraminidase là men ngưng kết hông cầu động vật lông vũ và giúp sự hấp phụ (adsorbtion) của vị rút trên tế bảo cắm thụ Cấu

trúc protein khác, ký hiệu E, só vai trò kết dính các thành phần của hạt vi rút

trong tế bảo và giúp vị rúi xâm nhập qua mảng tế bảo cảm thụ Hoạt động xâm nhập của yêu tố F là nhờ sự hoạt hoá bởi phân giải protein (proteolytie) làm cho

men sớm của tế bào chủ tạo E thành Eo rồi cất thành Fl va E2 F1, E2 hoạt động,

“4

dễ có sự hoà nhập của vĩ rút vào mảng lế bảo đo dó ARN vị rút xâm nhập vào

được tế bào [13]

1.1.2.2 Cầu trúc phân tứ

Bé gen cua cae Paramyvoviridae 1a phan tit ssRNA với 15k mu chứa bộ gen

mã hóa 6 loại protein đặc trưng của vi rút [53] 6 gen đó có chức năng mã hóa protein N gắn ARN của nuoleocapsid, phosphoprotcin P của nuoleocapsid, các

enzyme polymerase chỉnh của tiểu phản L„ protein mảng M không gắn dường, glyeoprotein gắn mảng G, H hay HN và glycoprotein hỏa màng F Ngoài ra, các thành viên trong họ Paramyxoviridae còn có thêm từ ruột đến năm loại gen điển hình mã hoả các protein phi cầu trúc để tăng cường quá trình phát triển của vi rút,

Do ¥6 lipoprotei cửa vì rút dễ vỡ nền thông thường hinh ánh của hạt vi rút trên kính hiển vị điện tử méo mó, vỡ và thành phin nucleoprotein thudng chay ra

nigoai hal vi rt Cac polypeptid câu trúc của vỗ bao gồm HN (hemagglutinin - neuraminidase) va |’ (fusion) protein tir cac gai bé mit va M (matrix) protein 3

protein khac cing voi RNA cau thành nhân nueleoprotein của hạt vi rút và quá

Lớp vô bao ngoài (envclope) là mảng kép Hpid, lớp màng này thu nhậu

được từ mảng tế bảo chủ Lớp mảng bao ngoài bao gồm ba loại glycoprotein bẻ

mặt: Protein gắn mảng G, protein hòa màng F và protein ky nước SIL Ngoài ra còn có protein M (inatrix protein) 1a protein nim ở trong của lớp vỗ cnvelope

Cáo glycoprotein được hình thành từ viion - spikes, nó có kích thước rất

ngắn khoáng 1] - 20nm, khoáng cách giữa các spikes là từ 6 - lOnm

Nueleocapsid có câu trúc đối xứng xoắn, đường kính xoắn ắc khoảng 18nm

Phân lớp pneumovirinae (hMPV va RSV) không có enzyme neuraminidase Protein G không có hemagglutinin mà nó đảm nhiệm chức năng

năng thay cho hemagglutinin để gắn vào thụ thẻ của tế bảo

Hemagglutinin neuramidase (4 cúm) Protein gin mang (RSV, hMPV) G

/ hán hòa màng ()

Protein ky nước (SH) (RSV và hMPV) Lớp lipid kép

Hình 1.3 Mé hinh cau trie virion ctia vi rit ho Paramyxoviridae [31]

1.1.2.2 Cơ chế nhân lên

Trong quá trình gây nhiễm trùng, vi rút Paramyxo xâm nhập vào tế bảo tạo

tế bảo không lồ Khả năng xâm nhập tế bào nảy được sử dụng như một đặc điểm

quan trong đề chân đoán bệnh

Có thé xâm nhiễm vào nhiều loại tế bào nuôi cây mô Xâm nhập nhờ dung hợp giữa vỏ ngoài vi rút với mảng sinh chất của tế bảo chủ Quá trình phiên mã

và nhân lên đều diễn ra trong tế bào chất Virion trưởng thành chui ra ngoài theo lỗi nảy chỏi Các tế bảo nhiễm thường bị tan ra, nhưng cũng xảy ra sự dụng hợp

tế bảo với nhau đề tạo ra thể hợp bảo, thẻ vủi

1.1.3 Vi rat ho Picornaviridae

Picorma bắt nguồn từ chữ gieo là nhô, rma TA axil ribonucleic Ho

Đieornavitdae cò chửa rất nhiều vì rút gây bệnh quan trọng cho người và động,

vật, bao gầm vi rút polio, viêm gan A, vi rút bệnh lở mềm long, móng (Foot and

mouth disease virus-FMDV), va vi rl rhino [13, 51] Thea dy ban phan Toai vi

rủt quốc tế, họ Picornaviridae gdm:

- Vi rút aphto bệnh lở mỗm long mỏng

- Vi rút avihepato gây bệnh viêm gan A ở vịt

- Vi rút cardio gây bệnh viêm não, viêm cơ tim ở loài gặm nhậm

- Vi nit Hntero gồm cô vĩ rút polio, coxsackie, Hcho

- Vi rút Hrbo gây viềm mũi ở ngựa

- Vi rút hepato gây bệnh viêm gan A

- Vi rút Kobu gồm Aichivirus va bovine kobuvirus

- Vi nil Parecho gdm human parecho va Ljungan

- Vi rút sapclo gồm Porcine sapelo, Simian sapclo, Avian sapelo

- Vi rút 8enecavirus

~ Vĩ rút Tescho

- Vì rút Treme

1.1.3.1 Hình thái và cấu trúc phân tử

Pieemm là ví rút nhỏ hình cầu, đường kính trung bình 22-30ran Cac thanh vién

của Pieornaviidae là vì rút không vô với một bộ gen sợi đơn (ssRNA), dương

Virien: Capsid hình khởi đa điện 20 mặt tam giác đều, gêm 60 dưới đơn vị, mỗi đơn

vị chứa một phân tử gồm 4 polypepiid chính ký hiệu VP1, VP3, VP3 và VP4 Ba

polypeptid đầu nằm trên bề mặt virion còn polypeplid sau nằm ở trong lỗi gắn với ARN Genome là một phân tử ARN đem, (+), đạng thẳng, đài 2,5x106, đâu 3' có

gắn đuôi poly A, còn đầu Š° liên kết công hoá trị với một pvotein do vỉ rất mã hơá, gọi là VPg.

Hình 1.4 Cầu trúc virion ctia Picornaviridae [40]

G vi nit cardio va aptho, gan dau 5° của ARN còn có vùng polyC Đó là câu

trúc thứ cấp mả chiêu dải có thể khác nhau tuỳ chủng Ở vi rút Rhino và Entero không co ving nay,

1.1.3.2 Quá trình nhân lên

Vi rút nhân lên trong tế bảo chất Đầu tiên vi rút gắn vảo thụ thê nằm trên mảng sinh chất của tế bảo chủ, sau đỏ vảo tế bảo theo cơ chế nhập bảo vả tiền

hành cởi vỏ trong endosome hoặc lysosome Sau khi được giải phỏng khỏi

capsid, ARN lap tức bắt đầu dich mã ở lai tri gan dau 5’ để tạo thảnh một

polyprotein Polyprotein nay hic dau phan cắt thành 3 protem tiên chất là VPI, VP2 va VP3 Mỗi protem lại tiên hành phân cắt tiếp:

~ VPI cắt ra thành VP1A, VPIB, VPIC và VPID Đó là protein capsid

- VP2 cắt thành VP2A, VP2B Đỏ là kháng nguyên của vật chủ và VP2C

tham gia vào tổng hợp ARN

- VP3 tiên hành tự cắt thành VP3A, VP3B (VPg), VP3C (protease ding

phan cat hau hét cac protein) va VP3D (ARN polymerase lam nhiém vụ kẻo dai

chuỗi ARN mới tổng hợp trên khuôn ARN) Sợi (-) được tổng hợp trên khuôn sợi

(+) Dau soi (+) duge uén lại thành hình kẹp tóc để làm mỗi cho tổng hợp sợi (-)

Ket quả là tạo ra một phân tử “đúp”, có chiều dải gấp đôi genome

VP9 ARN viral Poly A

Dich ma +

Tĩnh 1.5 Sơ đỗ sinh tổng hợp protein của vi rứt polio [12]

Dé lip ráp, rước hết cần phân cắt VPI tạo thành một protome (don phan

gốc) 58 chưa hoàn thiện chứa VD0, VDPI và VP3 Các protorne này sẽ liên kết với

mét genome ARN dé tao thanh tién virion Trong qué trinh hoàn thiện, phản lớn hoặc tắt cả các phan tit VPO déu bị phân cắt sẽ tạo thành VP2 và VP4 Sau lắp map, virion trudng thành ra khôi tế bảo nhờ tam bào

1.1.4 Vì rút họ Caronaviridze

Coronaviridae là một họ virus ARN soi dương có mảng bao bọc

Cormavius được truyền qua đường miệng, phân,hoặc bằng các giọt khí dung tiết ra từ đường hé hp Coronavirus gây bệnh cho một loạt các động vật có vú và các loài chim trên toản thế giới Mặc di hau hét các bệnh đêu nhẹ, có liên quan đến các bệnh thản kiih, gan, tiêu hóa và hồ hập trên động vật, tuy nhiên chứng có

gây ra bệnh nghiêm trọng hơn ỡ người, chẳng hạu như hội chứng viêm đường,

hô hấp cắp tinh nguy hiểm (SARS) Hệ gen của vi rút có chiều dải 26-32 kb [13]

1.1.4 1 Hinh thái và câu tric phan tử

Vi rút có cấu trúc da hình thái, dường kinh 75 — 160mm, có nuclcocapsit

xoản được bao bởi vẻ ngoài lipid kép Trên bẻ vẻ ngoài nhô Ta các gai

glyeoprotein cô dang đặc trưng hình đời củi gọi là peplome đài 12-24rmn

Genom của vi Til corona dai khoảng 26-32kb Đầu 3' gắn đuôi poly A Các

protein liên quan dén virion bao gồm

Protein § cầu tạo nên các gai peplome bề mặt võ ngoài Đây là kháng,

nguyên khích thích tạo kháng th trung hòa

Protein M tạo mảng trung gian nằm giữa capsit và võ ngoài Từ mảng này

mọc ra các peplome

Trotein N gắn với các genom tao nucleocapsit Protein N it thay déi, trong, khi protein S thường thay đổi, đẫn dến sự thay dỗi của kháng nguyên vì rút,

Ho coronavuridac gém 2 chỉ là Coronavirus và Torovirus Co rat it bang

chứng về khá năng gây bệnh cho người cúa chỉ Torovirus, do vậy chỉ này ít được quan lâm

Các thành viên cla Coronavirus bao gồm :

- Vinit corona gay bénh cho ngudi - HCV (human corona virus) va nim

2003 đá phát hiện thêm vi rit corona gay hội chứng viêm đường hô hấp cấp

- SARS

- Các vi rút corona khác gây bệnh cho gà (viêm phé quan), chudt (viém gan,

dạ đầy, viêm não), lợn (viêm ruột - đa dày, viêm não), chó, gà tây, gia cảm, ngưa (sưng tuyến nước bọt) và mèo (viêm phúc mạc)

1.1.4.2 Quá trình nhân lên

Vì rút corona bám vào thụ thẻ của tế bảo dich nhờ proteim 8 Sau khi xâm nhập vào tế bảo, chứng dịch mã tạo thánh ARN_ polyrneraza phụ thuộc ARN,

nzyme nấy tiến hành phiên mã

khuôn để tạo genom ARN đương và nLAKN mARN tiên hành dịch mã đề tạo

tao so ARN âm rồi sợi này lại được dùng làm:

Trotein câu trúc (capsit) Quá trình nhân lên xảy ra trong tế bảo chất Sau khi lắp

Tap vi nil way chối từ bộ máy Golgi chứ không phải từ ràng tế bảo chất Các protein M đã được gắn sẵn vào màng của bộ máy Golgi Khi vi rút chui ra được

bọc bởi protein M và nằm trong bào nang Bao nang van chuyển đến tế bào chat

tôi tiến hành dung hop sau đó được đẩy ra ngoài |13|

Các tổ bảo nhiễm vì rút có thể bị phân giải nhưng chúng có thể dụng hợp với nhau dưới dạng, hợp bảo Trong thể hợp bảo, vi rút có khá năng tên tại lâu Nhiệt

độ thích hợp cho quá trinh nhân lên của vi rút là 33C, tương đương với nhiệt độ

môi trường sống ở đường hỗ hấp trên

Hình 1.6 Quả trình nhân lên ở vi rút corona

1.2 SỰ LƯU HANH CUA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM DUONG HO HAP

CÁP

1.2.1 Trên thể giới

Các tác nhân gây bệnh VĐHHC trên thể giới vừa cỏ tính lưu hành địa

phương vừa có thể gây thành dịch, nhất là dịch vị rút cúm A đã lan rộng đến nhiều nước trên thê giới và trở thảnh đại địch Hội chứng nảy có thể xuất hiện quanh năm:

ở vùng ôn đởi nhưng tần số mắc cao vảo mùa thu, mùa đông và mủa xuân, nhất lả

vảo thời gian mã thời tiết lạnh và âm Bệnh VĐHHC phát triển mạnh ở nơi mật độ

15

dâm số cao Ở vùng ruột đới, bệnh VĐHHC xây ra nhiều hơn vào lúc thời tiết âm ướt và lạnh Trong cộng đồng dân cư rộng lớn, một số bệnh do vi rút đường hé hap

Thường xảy ra không có tính theo mùa và có thế gây ra các vụ địch lớn như vi rút

adeno, vị rút hợp bào Tỷ lệ mắc hàng nắm cao, đặc biệt ở trẻ em và lứa tuổi thiếu

miên [1, 11]

Trong thể kỷ XẦX đã ghi nhận nhiều dai dich cảm với số mắc và số tử vong,

cao Đại địch cúm Tây Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cú A phan tip HIN] gây nên uớc tính có khoảng 20 triện người tử vong |59, 68, 75J Dịch cúm Châu Á

nam 1957-1958 cd nguồn góc Singapore do vi rut cam A phan tip H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong, trong đó lứa mỗi từ 5-19 mỗi chiếm hơn

50% |59,62,74J Đặc biệt, ương những nằm gân đây, năm 1997 xuất hiện cứu À

phân tịp H5N1 tại Hồng Kông lây tr gia cim sang người vả gây tứ vong 6/18

trường hợp mắc Iỏng Kêng đã phải thiêu hủy hơn 2 triệu son gà, gây một tốn thất

kinh tế lớn Cuỗi tháng 12 năm 2003 và những tháng đâu năm 2004, dich cum gia cảm đã gây thiệt hại lớn về kimh tế cho các nước Châu Ả, trong đỏ Việt Nam và Thai Lan lả 2 nước có cứm gia cảm lây truyền sang người gây tử vong 26 trường

hợp [38]

Đại địch cảm năm 2009 do tác rhân là vì rút cúm A/H1NI là ví nit oii hoàn toàn mới được tích hợp gen từ vi rtus cúm lợn (ITN1; H3N2), vi rút cúm

gia cam (H5N1), vi rút cũm người (H3N3) lần đâu tiên được xác định vào thang

3 nằm 2009 tại Mexico Trong thời gian ngắn, vi nil cum A/H1N1pdin/2009 dã lây truyền trên phạm vi toàn câu Ngày 11 tháng 6 năm 2009, Tổ chúc Y tế Thể

giới (WHO) đã chính thức công bố đại dịch cảm toàn cầu, và tạt thời điểm đó ví

rút dã ghí nhận tại 74 quốc gia, 28.774 người và 144 trường hợp tử vong| 64]

Vĩ nút acum phan tip 1- 3 gay bệnh dường hồ hấp trên, gặp ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên trễ em có xu hướng cảm nhiễm nhiều hơn Vì rút này xuất hiện nhiều nơi khác trên toàn thê giới, lây truyện qua đường hê hấp và lan truyền ở tập thê

Vi rút ácũm là căn nguyên của 1⁄3 số nhiễm khuẩn đường hô hấp vả 1⁄2 số trường hợp nhiễm bệnh được xác định ở trẻ em trước tuổi đi học (<6 tuổi) [53]

Vi nil acim tip 1 va tip 2 thường liên quan dén viêm hãu họng -khi-phê quản

(bệnh bạch hậu thanh quần), bé trai số xu hướng cấm nhiễm nhiều hơn bé gái Vi rit 4 cum tip 3 thudng gay nhiễm bệnh đường hô hắp dưới như là viêm tiêu phê

quản và viêm phổi Vị rút á củm típ 4 thường lưu hành ở Châu Phi và gây bénh

nhẹ đường hô hâp trên [13]

Vì rút hợp bảo đường hô hấp (Respiratory Syncytial Virus-RSV) là một

trong những căn nguyễn gây bệnh viêm dường hô hắp chủ yếu ở trẻ nhỏ Dich thường xảy ra vào mùa đông và mùa xuân SV phân bá khắp nơi và có những yêu lố dịch tổ riêng, hàng năm có thể bùng phát thành địch và kéo dai khoảng 5

thàng, từ tháng 12 đến tháng 4, dinh địch thường vào tháng 1 hoặc thàng 2 [29,

30, 50] Ó Anh, nhiễm RSV thường xây ra từ tháng giêng đên tháng ba và nó có thể thay đổi từ năm nảy qua năm khác Ở Mỹ, RSV xuất hiện vào mùa đông và kéo dải tới mùa xuân [29] Ở Washington DC, số trẻ em nhập viện có triệu chứng,

giêng R3V, viêm đường hồ hấp dưới cao hơn 2,7 lần Dịch lớn có thế đao động,

và thay đổi từng năm Mặc dù mủa mắc RSV có thể tiên doán được hàng nắm nhưng tinh khắc nghiệt của vụ dịch lại thay đổi

Trẻ em thường mắc vi rút này trong vóỏng 3 năm đầu của cuộc đời Một nghiên cứu ở Houston, 69% trẻ sơ sinh bị nhiễm vi rút RSV trong nắm đầu tiên, 83% nhiễm Irong năm thứ hai Các năm liếp theo (3-4 tuổi) các trường hợp

nhiễm bệnh vẫn tiếp tục được ghỉ nhân do đỏ khả năng tái nhiễm của trẻ nhỏ là

có thế

1.1.2 Tại Việt Nam

Việt Nam lä nước đang phát triển, với dân số trên 80 triệu người, có khí hậu nhiệt đới (miền Nam) và bản nhiệt đới (miễn Bắc), duy trì kiểu hình nóng, âm, mưa nhiều nên bệnh VIDIIIIC có thể phát hiện quanh năm, nhưng có xu hưởng,

tăng ở những tháng giao mùa Bệnh VĐHHC thường gọi là bệnh cảm cứm xây ra

trên khắp dất nước với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cudi nam của thập ký 90 dược ghi nhận là 1.627,2/100.000 đân, xếp thứ nhất trong số 10 bệnh truyền nhiễm có

tỷ lê mắc cao nhật ở Việt Nam [11] Tuy nhiên, tỷ lễ mắc khác nhau thea phân

vùng địa lý và khí hậu Miễn Bắc và Tây Nguyễn có nhiều vùng núi can, khí hậu

41 mùa nên hội chứng VDITIC phát triển nhiều trong các mủa thu, mùa đông và

mùa xuân với tỷ lệ mắc Irung bình 5 năm cuối nũa thập kỹ 90 là 2.298,6/100.000

dân ỡ miễn Bắc và 3.160/100.000 dân ở Tây Nguyên Tỷ lệ nảy thấp hơn ở miễn

Trung và miễn Nam nơi duy trì khí hận nhiệt đới với hai moa khé va mia mua

trong rằm Tại hai khu vực này bệnh VĐHHC thường phái triển vào mùa mưa với thời tiết lạnh và ảm Tại Việt Nam, một số vụ dịch do căn nguyên vi nit cum,

vỉ rút á cúm, vị rút ađeno đã được ghi nhận ở nhiều địa phương [10] Dịch cúm

A/H2N2 lan rộng ra hấu hết các tĩnh thuộc miễn Bắc Việt Nam trong những răm

1957-1958 tuong ty nam 1968-1969 dich cum A/IIZN2 tiếp tục được ghi nhận

Ngoài ra, năm 2004 vi rút cú A/HSN1 da lay ti gia cAm sang người với

trường hợp mắc, trong đỏ 15 trường hợp tử vong được xác định, vĩ rúi cúm

A/HSN1 tiếp tục lưu hảnh trong quân thể gia cảm nuôi và tuyén bệnh sang, một

số người trong rữmg nữm tiếp theo[38]

Sự lầy truyền của vi rút cúm A/IIINIpđm/09 đã ảnh hưởng tới Việt nam, trường hợp nhiễm vị rút đầu tiên được xác dịnh vào ngảy 31/5/2009 tại thành

phế Lễ chỉ Minh, vả nhanh chóng vị rút cửm A/1I1NIpdm/09 đã lây truyền trong công đẳng ( 10/7/2009 Theo báo cáo của Bộ Y tẻ Việt Nam, tính đến ngày

30 tháng 9 năm 2009, Việt Nam có 9.68 trường hợp mắc cúm A/HIN1-pdm/09, trong đó có 22 ca tử vong,

Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu về căn

nguyên gây VĐHHC ở các vùng miễn khác nhau trong cả nước Nghiên cứu của

G8 TS Huỳnh Phương Liên và công sự về

gay VDIIIC 6 Ia Ni nam 2001 cha yéu 1a vi rat com B (74%), sau dé 1a vi rat

củm A/HTNI (20,789), các vì rúi gây VĐHHC khác rửu vi ral ho Picoma

(51,28%) và RSV phân tip B là 10,36%{9] Một nghiên cửu khác ở Tây Nguyên

năm 2003 đã cho thấy 13,9% là chúng ví rút cum A/113M2, xuất hiện gần như

thủng vi rủi củ va cae vi sul

quanh năm và cao nhất vào tháng 9 Ngoài ra, các vị rút gây VĐHHC khác như

vi rút hợp bảo dường hỗ hấp (RSV), hMPV và các vì rút đường ruột (họ

Picorma) cũng là căn nguyên gây viêm đường hô hấp ở Tây Nguyên (18,2%) [S] Nhóm nghiên cứu gần dây nhất về vị rút gây bệnh VĐHHC ở trẻ cúi miễn Trung

“Việt Nam năm 2067 dã cho thay cần nguyên chính là vi rot rhino (28%), RSV

(23%), vi rút cảm (15%), hMPV (4,5%), vị rút a cium (5% 184],

Tại Viện Vệ sinh dịch tế Trung trơng, tác giả Ngô Hương Giang và cộng sự cũng đã xác định có 9 tác nhân vi rút gây VIDITIIC của các bệnh nhàn tại miên

bắc Việt Nam trong giai đoạn 2007-2009 Kết quả nghiên cứu cho thấy vì rút

thuộc họ Picorna là tác nhân gây bệnh có tỷ lệ cao nhật (36.1894), vi rút cúm A/H3N2 cũng là tác nhân của 30.929 các trường hợp nhiễm bệnh, sau đó là vi rút cứm A/HSNI chiếm 11.1894, RSV 8,55%, A/HIN (7,249), vi rif cam B (1,97%), HMPV (1,97%), vị rút a cum tip 3 (1,32%), vi mat chino (0,66%)

Việt Nam lả nước dang phat trién, ngan sach chi cho cham séc sue khoe ban

đâu còn rất hạn hẹp Vì vậy, cùng với tiêu chảy và suy đỉnh đưỡng, viêm đường

hé hap cấp hiện dang có tỷ lê mắc và bử vong cao, đứng đầu trong các bệnh nhiềm trùng cắp tỉnh [66, 71]

1.3 DAC DIEM LAM SANG

‘Thy theo vi trí của hô hấp bị tồn thương mả có các hội chứng lâm sảng khác

nhau

- Hội chứng viêm đường hồ hập trên có các biếu hiện sốt, he, số mũi và

dau hong

- Hội ching viêm đường hô hếp giữa Viêm thanh quản, viém thanh khi-phé

quản: sót, ho khan, giọng khản, phổi có thể cỏ ra ngày nhẹ khi thăm khám lâm sảng,

- Hội chứng viêm nhiễm đường hỗ hấp dưới: viêm phổi, viêm các tiểu phế quản Diểu hiện lâm sảng: sốt, ho, khó thở Cận lâm sàng: XÓ có biểu hiện

1.4.1 Dự phòng

1.4.1.1 rút của

a,_ VẤc xin củm mùa (A/H3N2, A/HINIpám/09 đại địch và B)

- Gây miễn địch được coi là biện pháp hữu hiệu dé phòng cả vi rút cúm A

và B Tuy nhiên do vị rút cảm thay đối liên tục và hiệu lực của vắc xin phụ thuộc

vào sự tương đồng giữa chứng sản xuất vic xin và ching vi rit cum dang liu

thành

- Việc tiêm vắc xin được 1u tiên cho ba nhóm đổi tượng:

I Nhém đổi tượng có nguy ed cao: người giả, người tàn tật, người mắc bệnh man tỉnh về từn, phổi, thận

+ Nhóm

nghiệm

lẾp xúc với các tác nhâu gây hiểm: nhân viên phòng thí

+ Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: cảnh sét

- Vắc xim củm hiện tại có nhiều loại khảe nhau bao gồm vắc xin bất hoạt

(inactivated vaccine), vic xin séng gidm dic luc (live attenuated influenza virus-

LAIV) va vắc xin sống bắt hoạt bằng công nghẻ di truyền nguge (reassortment

vaccine)

- Ve xin cim mua dang dừng phổ biến là vắc xin sống bật hoạt, đa giá

Hiện nay đe vi rút cúm A/HINI ít lưu hành, tố chức Y tế Thẻ giới khuyến cáo sử

dụng vắc xin gồm 3 chủng vị rút cú đối với khu vực Bắc bán cầu (Việt Nam)

mnủa cúm 2012 bao gồm:

Vi rút cúm đại dịch A/H1N1/09: A/Caifornia/7/2009 (HIN1)pdm09

Vi nit cum A/H3N2: A/Perth/16/2009 (H3M2)

Vi nit cum B: B/Brisbane/60/2008 [69]

b, Vắc xin cảm A/H5NI

Hiện nay, vắc xin phỏng bệnh củm A/HSN1 cho người vẫn đang được một

số nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu, sản xuất ở quy mô phòng thí

nghiêm và dược thữ nghiệm lâm sảng trên người|14| Đây là vỉ

xin sống bắt hoạt bằng công nghệ di truyền ngược

1.4.1.2 VÌ rất ú cửm:

Dự phòng vi rút á cứm là vắc xin vi rút chết có khả năng hình thành khang

thé trung hòa nhưng không bảo vệ được chẳng nhiễm bệnh điêu nảy đễ giải

thích vì vắc xin á cúm đổi hỏi phối lạo được kháng thể lớp TgA, hiện nay chưa thực hiện được Do vậy, việc cách ly bệnh nhân và xử lý chất thải của bệnh nhân

cân được quan tâm hon

1.4.1.3 nit hop bào âường bô hấp (RSV)

Dự phòng bệnh do RSV bằng vic xin là rất cần thiết và có hiệu quả tốt hơn Tuy nhiên cho đến nay một số loại vắc xin đang được nghiên cứu và thử nghiệm

Vắc xi đầu tiên được sử dụng lá vắc xin bất hoạt bằng formalin, tuy nhiên vắc

xin nảy đã không tạo ra được đáp ứng miễn địch Sau đé một loại vắc xin khác

được sân xuấi bằng lách thành phân F/G glycoprotein của vì rúi Vắc xin tai 16 hop adeno - RSV được sẵn xuất tạo ra được kháng thể kháng |'/G glycoprotein va

kháng thé trung hòa trên động vật thử nghiệm là chẻ, có khả năng bảo vệ chồng,

Tại nhiềm RSV ở đường hô hập dưới Một loại vắc xin tái tổ hợp khác là Vacein -

RSV cũng dã thánh công trong việc báo vệ khỏi mắc bệnh Các loại vắc xin trên cho đến nay chưa được thử nghiệm lâm sảng trên người

Do việc lây lan bệnh bởi RSV theo đường dịch tiết hô háp nên tỷ lệ nhiễm ở

trở nhỏ trong thời gian có dịch là rất cao Để giầm thiểu việc lày nhiễm thì nông,

tác vệ sinh trong, quần thẻ dân cư, đặc biệt lả tại những nơi tập trang đông trẻ nhỏ

như bệnh viện, nhà trẻ là hết sức quan trọng Với những người làm công tác

chăm sóc sức khỏc như các y tả, bác sỹ, hộ lý thí vẫn dễ tự bảo vệ cũng như tránh làm lây lan dịch bệnh là hết sức cần thiết

1.4.2 Điều trị

Các thuốc kháng vị rút được coi là phương pháp đặc hiệu cho diễu trị nhiễm

vi rút tuy nhiên hiện tại các sản phẩm này rất hạn ché, chỉ tập trung vào một số tác nhân nhát định

œ_ Các thuốc khang vi rut com

Ngày nay dã có Huốc trị bệnh cúm do vi rút gây ra, dược chia am 2 nhom

chính: ức chế sự xâm nhập vi rút Amantadine và Iimantadine (Fhmadine) và úc

chế sự gidi phéng vi rit Oscllamivir (Tanniflu) và Zanamivir (Relenza)

- Amantadine và Rimantadinc ngăn cản sự xâm nhập của vị rút bằng cách

ức chế hoạt động của kênh ion M2, đo đó ngăn căn su “edi 40” của vị rut [38]

- Oseltamivir và Zanamivir: ngăn cán sự giái phóng vị rút khỏi tế bảo nhiễm

nhờ ức chế hoạt động của enzyme neuraminidase (NA), 1A co ché hiéu quả nhất tác

động vào vi rút |74| Quá trình giái phóng của vì rút cửn phải có su Tham gia trực

tiếp của enzyme neurarninidase có tác đụng tách asit sialic từ màng glyooprotein của

vị rút đo đó vị rút được giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm Nếu không có enzyme nay

vi rút sẽ bị giữ lại bên trong lế bảo và không có cơ hội tấn công sang các tế bào

khác,

Các thuốc kháng vi rút hợp bảo đường hỗ hấp (RSV):

- Ribavirin là một chế phẩm tổng hợp tương tự guanosin được cấp phép sử

dụng năm 1972 tại Mỹ Cơ chế tác dụng của Ribaviin phức tạp và cd thé tae dộng vào nhiều yếu tổ: ức chế enzyme polymerase trong quả trình sao chép mRNA, tte ché inosine-S’ monophosphate dehydrogenase lam suy yên các quá trình tổng hợp các nueleotid trong tế bào [47]

© Vinita cm:

- Chua cé thude chita dic ti va chwa c6 vie xin hitu hiéu De vay, bién pháp tốt nhất là nghĩ ngơi và điển trị triên chứng nhĩ đúng thuốc giảm sốt hay giảm dau (vi du: actaminophen) Néu bi ho co thé dung thuốc họ

(dextromethophan)

1.5 CHAN DOAN TRONG PLIONG TH NGHLEM

1.5.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyễn

kè 8

1.3.1.1 Phân lap vi rit

~ Phân lập vi rút trên tế bào: vi rút dược gây nhiễm trên các dong té bao cảm

thụ: MDCK (vi rút cúm), Hep-2 (RSV, 4 cum), Llela (RSV), Vero H6 (RSV, a

cứm, hMPV), L1, - MK? (vi nit ho picora, hMPV, Rhino) [61, 81] Cac mau

cỏ sự hủy hoại tế bảo dược giữ lại dể dịnh loại vị rút

~ Phân lập vi rút cum dược coi là ''tiếu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [71 ]

Vi rut sau khi phân lập được định tip (xc định đặc tính kháng nguyên) bằng phân ứng ức chế ngưng kết hổng cầu (HD Chúng phân lập trong vụ địch được nghiên cứu về các đặc diễm sinh học, sự biến dỗi vật liệu di truyền và tỉnh chat

kháng nguyên đẻ có thể du báo được sự lan truyền của một chủng vi rút mới có

độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và che su lua chon thank phan vắc xin cúm

hàng năm

1.5.2 Phương phap phát hiệu vật liệu di truyền

1.3.2.1 Phân ứng chuỗi polpmerase phiên mã ngược (RT-PCRJ

Phin ung chudi polymerase phién ma ngược RI-PCR (Reverse transcriptase Polymerase chain reaction) 44 dugc ap dung va phat trién cho phần

lén các vi rút có vật liệu đi truyền là ARN Phương pháp này có khả năng xác dịnh nhanh sư thiềm vị rút thông qua xác định vật liệu di truyền cửa vĩ rút bằng

khã năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rat cim trong man bệnh phẩm lâm

sảng, Đây là phương phán nhanh, nhạy, có độ đặc hiện cao và chính xác khủ được

1.5.2.2 Phan tng real time RT-PCR

Phản ứng real trne RT-PCR sử dựng cặp mỏi và chất hóa học phát huỳnh

quang hoặc probe có đánh đâu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon,

hybridivation probe và Taqman probe) cho phép phái hiện chính xác số bản sao

ADN của vị rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [28] Phản ứng Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chân

đoán œ¡

vi rút gây bệnh như vị ri cúm, RSV [24, 25]

Phan ứng real time RT-PCR khong cân điệu đí sân phẩm như phương pháp

RT-PCR thông thường nên phương pháp Real trne RT-PCR được mô tả như một

hệ thông “đéng” Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, 06 độ chính xác

và đặc liệu cao, giảm thiểu nguy co lap nhiềm |37Í Tuy nhiên, phân ứng real

time RT-PCR yếu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giả thành tương dối cao

1.5.3.3 Kỹ thuật LiuninexA121G RVP

'TTác nhân vị rút gây VĐHHC được xác định rất lớn ( trên 200 loại), để đáp

ứng yêu câu phát hiện sớm, chính xác nhiều loại tác nhân vì rứt gây VDIIIG

trong cùng một phân ứng, nhiều phương pháp đã được Hết kế: RT-PCR đa môi, real time RT-PCR da mỗi và Luminex/xUAG đã được phát triển Luminex2TAG

có khả năng phát hiện nhanh nhiều loại vi rút và phân típ (18 tác nhân vi rút khác nhau) Cứm A, củm A/HTNI, cúm A/H3N3, cúm B, RSV, HMPV, Para 1,2,3,4, Enterovirus - Rhinovirus, coronavirus va Adenovirus Day 14 mét trong nhimg ứng đụng công nghệ đấy vi lượng ( microarray) trên cơ sẽ sử dụng bộ hạt vỉ lượng nã hoá mâu Tuminex ( Laminex 100 sols colour- codod beada) Các hại

vi lượng này có thể được bọc bởi các phân tử probe hoặc Tas, cho phép tóm bắt,

phát hiện các ADN đích đặc hiệu thông qua hệ thống lase [49] Tuy whién

phương pháp nảy còn mới, yêu câu trang thiết bị và sinh phẩm dấc chúng, giá

thành cao nên chưa được từng, dụng rộng rãi trong các phỏng thí nghiệm nghiên

cứu vì rúi

1.5.3 Phương pháp phát hiện kháng thể

Đây là phương pháp phát hiện khang the khang vi nit huyết thanh bệnh

hân Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứựg ức chế ngưng kết thẳng cầu (TT), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (BLISA) và phản ứng trung hoa vi hrong (MN) Kết quả được xác định đựa vào việc phát hiện kháng thé

kháng đặc hiệu vì rút edm (ELISA, MN) hode su biên động kháng thị

ng gấp

4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HH) Chẩn đoán huyết thanh học chí co ý nghĩa

hổi cứu và có tác dụng rât hạn chế đổi với các trường hợp lâm sảng, Tuy nhiên,

tô cũng là cơ sở cho việc chân đoàn nêu như việc phát biện kháng nguyên hoặc vật liệu dị trưyền cửa vi rút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một

lý do nào khác

1.3.3.1 Phân ứng úc chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition

test-Hi)

Phân ứng ức chế ngung kết hổng cầu (11) được Ilrst GK phát hiện năm

1942 [39] Nguyên lý của phương pháp là phát hiện kháng thế kháng HA đặc

hiệu vì rút cúm (anthemagglutinn) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn

(AIINI, A1N2, AHNL/09 đại dịch, A/IISNI, B ) có khả năng ức chế

ngưng kết hỏng cau Hang cầu chuột lang O,75%⁄ hoặc hàng cau gà 0,5% được sử dung (rong phẩm ứng HT dễ phát hiện kháng thé khang vi rit com mia, héng cau

ngựa 1% được sử đụng đề phát hiện kháng thế kháng vi rút cúm A/ISNI [21]

- Phản mạ HI tương đối đơn gián, kinh tê, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu

trành của kháng: thể kháng đặc hiệu vi rút cứm với một số lượng rnấn lớn Phần lớn kháng thể kháng HA dễu dược phát hiện bằng phương pháp HỊ, vì vậy dây là phân img đặc hiệu phân tip đổi với chân đoán huyết thanh học cứm Tuy nhiên, phản img

TH chỉ có giá trị rong chân đoán cứm khi có mầu huyết thanh kép để xác định được

sự biển dộng kháng thẻ (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh đơn không có giả trị rong chân đoán Mặt khác, theo những nghiên cứu gân đây cho thấy phản mg HT có độ nhạy thấp hơn so với phản tng trưng hòa vỉ lượng [77],

1.5.3.2 Phan tng trung héa vi heong (Microneutralization test — MN)

Phân tng trung hòa vỉ lượng-RI.ISA được Hormon và øs phát triển năm

1988 |33, 77 Nguyên lý của phân ứng là sử dụng kháng thể dơn dòng đặc hiệu nueloprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào

vỉ rút cũn Sử dụng phương pháp Recd va Muench để tính giá trị Hiểu gây

nghiễm 50% trên tế bào (TCID50)

Phần ứng trung hỏa vì lượng là một phân ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng

phát hiện kháng thể kháng đặc higu vi rit clam A/HSN1 va khang thé khang cac

phan tip vi nit clm gia cam khác mà phản ứng TII không có khả năng phát hiện

được [77} Phân ứng nảy để tiến hành vì không can kháng nguyên tính khiết Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiên

hành thí nghiệm kéo đải (2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với vi rút sống, đặc

biệt là vị rút cúm A/HSNI, nên thí nghiệm phối tiến hành trong phòng thì nghiệm

an toàn sinh học cắp độ 3

Tuy nhiên, chẩn đoán huyết thanh học ít sử dụng trong chấn doán bệnh VPHHC, thường được sử đụng đề nghiên cứu hổi cứu hoặc giảm sát huyết thanh

học

1.6 Cư sử lý luận để thiết kế và tiền hành nghiên cứu

Bệnh VĐHHC do căn nguyên vi rút là một trong 10 bệnh truyền nhiễm thường xuyên gây dịch tại Việt nam với tý lệ mắc vá tử vong cao [4,5,9] Trong, giai đoạn 2003-2012, một số dịch VĐHHC đã được ghỉ nhận : SARS, cum gia cầm A/H5NI, cửnn đại địch A/HINIpdm/09 các vụ địch này không những gây

ảnh hưởng cho sức khoẻ cộng đồng mà còn ảnh hưởng lớn đến kinh tế và xã hội

Cac nghiên cửu dã được triển khai trong những, năm qua taj Việt Kam đã cho phép có những thông tin cơ bản nhật về sự lưu hành, mức độ nguy hiếm, tính tiổi trội của một số tác nhân viún gây bệnh |4] Sự nguy hiểm, khả răng lây truyền dễ và nguy cơ tiêm tảng của bùng phát dịch của các vị rút gây VĐHHC trong cộng đồng yêu cầu phải có sự chủ động giám sát vi rúi học lại các bệnh viện cũng như trong cộng dông Chương trình giám sát cún Quốc gia dã dược triển khai từ năm 2006, một số nghiên cửu khác cũng tập trung tại các cộng đẳng,

cụ thế (Hà nam, Khanh hoa)

Bệnh viện đa khoa Việt-Tiệp, Hải phòng lá bệnh viên loại 4 tuyển y tế

cuối cùng chẩm sóe sức khoẻ cho nhân đân thành phố Hân phòng và các lỉnh lân cận thuộc khu vực Dông Bắc bộ: Quảng Hinh, Tải Dương, Thái Dinh đây là

một điểm giảm sát phủ hợp cho các nghiên cứu liên quan đền kiếu hình khi hậu

Để liếp nối các nghiên cứu đã tiến hành tương giải đoạn trước, dẳng thời phát triển các giảm sát chú động trong bệnh viện ede vi nit gay VOHHC, ching

tôi tiên hành xây đựng nghiên cứu “Từm ñiểm các căn nguyên vi rút gây viêm

đường hô hắp cắp của mội số bệnh nhân điều trị ở bệnh viện da khoa Liệt Tiệp -

lái Phòng 2010-2012”

bộ 3

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Định nghĩa ca bệnh

Các bệnh nhân viêm đường hô hắp cắp nghỉ do vi rút có triệu chứng như sau:

~ _ Bệnh khởi phát trong vòng 7 ngày

~_ Sốt cao đột ngột trên 38°C (xác định bằng cách đo nhiệt độ hoặc qua khai thác bệnh sử)

~_ Cỏ ho và/hoặc khó thở

~_ Và có ít nhất 1 trong những triệu chứng sau: Thở nhanh; tốn thương trên X

quang phôi; phải hồ trợ hô hấp

2.1.2 Cỡ mẫu

170 mẫu bệnh phảm đường hô hấp của bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghĩ

đo ví rút thu thập tại điểm giảm sát bệnh viên đa khoa Việt - Tiệp trong giai đoạn

Mẫu bệnh phẩm được lấy ở những bênh nhân nghi nhiễm virút từ 1-5 ngảy kề

tử ngày khởi bệnh

2.2.1.2 Loại bệnh phẩm

Bệnh phẩm đề xác định vi rút: Dịch ngoáy họng Trong trường hợp không lay

được dịch họng có thể lấy địch mũi, dịch nội khí quản được bảo quản trong môi

trường vân chuyên vi rút

2.2.1.3 Môi trường vận chuyển

Môi trường vận chuyên được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm củm — viện VSDT

TƯ, sau đó chuyên đền trung tâm y tế dự phỏng Hải Phòng,

Bảo quản môi trường vận chuyên ở 4°C Thời hạn sử dụng môi trường: 03 tháng

3.2.1.4 Kỹ thuật lẫy mẫu bệnh phẩm

Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào ving hau hong, dé cho thâm ướt toản bộ

đầu tăm bông, sau đỏ miệt mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan vả

thành sau họng 3 đến 4 lần (đẻ lẫy được dịch, tế bào vùng họng) Dua ngay tăm bông vào tube nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút

Hình 2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch họng

Dịch mũi: Dùng 1 tăm bông thu thập bệnh phẩm trong cả 2 mũi Đầu tăm bông, sau khi thu thập bệnh phẩm chuyên vảo tube chứa 2-3 mÌ môi trường vận chuyên,

bổ bớt đầu thừa của tăm bông

Hình 2.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi

Dịch nội khí quản: Bệnh nhân khi đang thở máy, đã được đặt nội khi quản Ding 1 ông hút dịch, đặt theo đường nội khi quản vả dùng bơm tiêm hút dịch nội

khí quản theo đường ống ta đã đặt Cho dịch nội khi quản vảo tube chứa môi trường

bao quản virút

2.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

3.2.2.1 Trang thiết bị

30

Bang 2.2 Bang mé ta trang thiết bị

cây an toàn sinh học (Biosafety Bioquell - Anh

Cabinet) — Class 2

2.2.4.2 Dung cụ

* Dung cu lay mẫu:

~ Que ngoay hong va ty hau

- Ong chia méi truong vận chuyên vi rút

* Trang bị phỏng hộ cá nhân: quân áo chồng dịch mặc một lẫn, khẩu trang

* Dụng cụ thí nghiệm:

~ Pipet tự động vi lượng các loại: 0,5ul ~ 1000 jul

~ Đầu côn vô trùng các loại,cõ phản lọc: 0,51 — 1000 gÌ

- Tiplytâm:1,ãnl 2mL

-_ Khay chạy điện đi 100-250 ml và răng lược, 15-30 rồng, dày Tnmu

-_ óc dong 100-300 ml

-_ Đa microtirc hoặc giấy parslïim

-_ Pipel da kênh, pipeL có lọc

M261R3/08 TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGCAG 22 “uD

TH HLA F AGG CAA ATG GAA ATC TAA TAG COC la oe,

ä | 1 Hệ HA ¥ AAG CAT ICC VAA TGA CAA ACC 12 coc,

šŠ | M5 TE-1 GGG ATT CCA CAA GAT ACA GCC WHO,

S | imam | mái Con ‘TGC ATT'1GG GLA AAT GIÁ ACA TIG ao we

swill Conv-R1 AAT GTA GGA TIT RCT GAK CIT TGG

FInBR CGGTGCTCT TGA CCA AAT TGG ve Mỹ RSV | RSV-ABEIEAM | AAC AGITIA ACA TTA OCA AGE GA ce,

jÿ | hMPV | hMPVFTIFAM | GAG CAA ATTGAA AAT CCC AGA CA “tT cục,

š | HPYI | PIVI-foward CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G am 2

Ệ IVI-revase CCT TGG AGC GGA GIT GTE AAG ‘ II

X | EIPV? | PIV2- forward CCA TIT ACC TAA GTG ATG GAAT 23 II

PIV2-reverse GCC CIGTTG TATTTG GAA GAGT HIPV3 | PIVS- forward ACT CCC AAA GIT GAT GAA AGAT 102 I2]

FIVS- reverse TTA AICTTG ITG TIG AGA TIGA Tle TIEO-TA-TRAM GGC CCC TGA ATG (CT)G GCT AA

4 Rhine 0124 CTA CITTGG GIG TCC G

& | Tateo TWP CLA CIT 1GG GIG ICC GTGTT sp

0L68 GGG AAC TTC CAGTAC Ca¥ CC

- Bộ sinh phẩm tách chiết vật liệu di truyền của vị rút - ARN sử dụng bộ kít QIAamp viral RNA Mini, 250 preps, Cat No 52904, Quiagen

33

- Bộ sinh phẩm dùng cho phan tng RI-PCR: QLAGEN Onestep RI-PCR kit Cat No 210212

- RNase inhibitor (40U/u) Invitrogen

- Ethanol (96-100%) (1.00983 1000 hiing Merck)

2.2.3.2 Sink phim cho phan imy Luminex/xTAG

Exonuclease 1 USB Cat No, 700732

Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate Molecular Probes Cat, No S-866

136 sinh phim ding cho ky thait Luminex/x AG: xT AG RVP kit, 96 preps Cat, No 1019C0290, Luminex

Chứng dương

E coli phage MS 2 ATCC Cat No 15997-Bl

Racleriophage Lambda DNA New England Biokabs Cal No N30118

3.2.3.3 Nguyên vật liệu hóa chất cho phân lập

Tế bào thường trực thận chó MDCK (Mardin— Daibv CDC, NHD

Kidney cells), Hep2, LLC-MK2

Phién 96 giéng day chix U Coming — Cato #3898

Dulbeceo’s Modified Eagle Medium (D-MEM)* GEBCO Cat.No # 11965-092

Pemcillin-Streplomycin, stock solution (10,000 UAnl = GIBCO Cat.No #15140-023

penicillin G; 10,000 pg/ml streptomycin sulfate)

Bovine serum albumin fraction V 7.5% sobation GIBCO Cat.No # 15260-011

Fetal bovine serum, 40 nm filtered IlyClone Laboratories, Inc

CatLNo., # A-1111-L

TrypsurEDTA GIĐCO Cat.No #25300-054 (0.05% Irypsm, 0.53 AI RDTA.4Na)

Gentamicin reagent solution GIBCO Cat.No # 15750-011

(50mg gentamicin sulfate/ml)

Dury địch đệm PBS

3.2.3.3 Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trành tự gen

- Uni 12 primer (CDC — My)

- cADN Superscriptlll Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen

35