Luận văn thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ rnai

Hơn nữa, với khá năng dễ tái sinh va chấp nhận gơne ngoại lai tốt, thuốc lá còn được xem là cây mô hímh trong nhiều nghiên cứu sinh học cơ băn như: nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở

MỞ ĐÀU

s« LÝ DO CHỌN ĐỂ TÀI

Thuéc 14 (Nicohana tabacum L.) 1A cay công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh t@ cao va dem lai nguồn thu ngân sách đáng kế cho nhiều quốc giá trên thể giới Việc trồng vả sản xuất thuốc lá góp phần tạo công ăn việc làm

và thu nhập cho nhiều đổi tượng lao động Ngoài ra, cây thuốc lả còn được sử đụng làm nguyễn liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Hơn nữa, với khá năng dễ tái sinh va chấp

nhận gơne ngoại lai tốt, thuốc lá còn được xem là cây mô hímh trong nhiều nghiên cứu sinh học cơ băn như: nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở thực vật;

nghiên cứu vai trỏ, chức năng của gene vả protein cũng như làm đối tượng đề tiếp nhận gene ngoại lai

Thuếc lá là cây trồng mẫn cẩm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt là các

bệnh do virus gây nên Cho tới nay, hơn 2000 loại virus gây hại trên thực vật

đã được phát hiện vả nghiên cứu, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng

nghiềm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng như: bệnh khảm lá chủ yếu là do 7obaco mosaic virus (IMV) va Cucumber mosaic virus (CMY) gay

nên; bệnh xoăn dot ving 14, héo ngọn do virus héo đốm cd chua Tomato spotied will (TSWV) va Tamato yellow leaf curved virus (TYLCV) gay nén

Cáo virus này gây thiệt hại nghiêm long tới năng suất cây trồng có thể lồn tới

95% thậm chí là 100%, làm ảnh hướng lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia

và trong đó có Việt Nam [3]

Bệnh do virus gây ra không có biện pháp diệt rừ mà chỉ có thể phòng

bệnh Các biện pháp truyền thống đã được áp dụng để phòng ngừa, hạn chế sự lây

lan của virus như: loại bổ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, trồng luận anh

giữa các cây trồng, vệ sinh dng ruộng dều không mang lại hiệu quả cao mả còn đôi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hưởng xấu tới môi trường Việc tìm ra các

biện pháp dé ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn cấp bách

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng dung sinh học phân tử trong chon tạo giống cây trồng kháng virus, trong đỏ,

công nghé RNA interference (RNAi) la một giải pháp hữu hiệu nhất thông,

qua việu sử đụng cáo vật liệu đi truyền từ virus gây bệnh như gene mã hoa

protein ‘oat protein, CP), protein di chuyén (movement protein, MP) dé

chuyển vào cây trồng tạo cây trằng chuyén gene kháng lại chính virus đó Đã

có rất nhiều nghiền cửu thành công trong việc sử dụng công nghệ RNA¡ để tao ra giống cây trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh như kiểm soát virus

Y ở khoai tây [47], chuyển gene khang RYMV (Rice yellow motile virus) vào

cây lúa |34]; kháng virus khám dưa chuột (CMV) |11 JJ26|, virus khảm thuốc

lá (TMV) [12] Tuy nhiên, hầu hết các công trình dã công bế chỉ là chuyển

đơn pene hoặc gene kép để tạo cây trồng kháng một hoặc hai loái virus nhất

định, cây trồng vẫn có thể bị nhiễm các loài virus khác Trên cơ sở đó, chúng

tôi đã tiến hành nghiên cửa đề tài: “Thiết kế vector chuyén gene khang virus

phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAT”

® — MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU

- Thiết kế được cầu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây bệnh hại trên cây thuốc lá hiện nay

~ Thiết kế vector RNAi chuyén gene măng các cầu trúc gene da doan

- Tạo cây thuốc lá mang sấu trúc gone chuyển

® NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus

- Sử dựng các trình tự gene CP của các virus để thiết kế mỗi đặc hiệu

- Ghép nối các đoạn gene

- Xác định trình tự gene

2 Thiét ké vector RNAi

- Tạo vector pPDONOR mang cấu trúc gene CP của 4 loại virus

- Chuyển oẫu trúc gơne CP vào vector chuyển gonc pK7GWIWG(I)

bằng kỹ thuật Gatcway

- Chuyển vcetor chuyển gơne vào vì khuẩn 4 /nefaciens

3 Chuyển gơne vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn 4 tumefaciens

- Chuyển gene

- Phân tích cây chuyển gene

Chương 1 - TONG QUAN TAI LIEU

11 GIỚI THIẾU CHUNG VẺ CÂY THUỐC LÁ

1.1.1 Lịch sử phát triển của cây thuốc lá

Thuốc lá (Nicotiana tabacum va Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ

chau Mf, 1a cây nhiệt đới và á nhiệt đới, có hương vị đặc trưng và được người

bản địa sử dụng trong các nghỉ lễ Lồn giáo và dùng làm thuốc chữa bệnh [6]

Khi Christophcr Columbus dặt chân lên Tây Ấn Đô Dương, ông dã phái hiện

người bản xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lã cuộn trén gọi là Tabaccos Các

thông tin vỀ sự phân bề rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác nhau đã được một s6 tac pid dua ra [13]

Thuếc lá bắt đầu được trồng ở châu Au vào khoảng những năm 1496 -

1498 do nhà truyền đạo người Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ về Andre Teve mang hạt từ Hraxin về trồng ở Tây Ban Nha va Bd Hao Nha nim 1556 [9]

Thuốc lá được du nhập vào trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản từ giữa thê ky

thứ XVI, ở Ấn Đô vào khoảng năm 1605 Từ đó, các nước náy dã trở thành

các nhà sản xuất thuốc lá lớn, phục vụ cho tiêu đùng nội địa và thị trường

thuếc lá thế giới

Ở Việt Nam, thuốc lá đã được du nhập vảo từ năm 1660 thời vua lê

Thánh Tông, nhưng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá mới chính thức

được phát triển tại Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) và ở mội số tỉnh miễn bắc với giống ban đầu lả Virginia Bland Cash [10]

1.1.2 Phân loại và nguén géc

Thuốc lá có tên khoa học lả: Vicofiana sp thuộc ngành thực vật hạt kin

Angiosper, lop 2 14 mầm Đicotylndones, phân lớp Cúc 1sferidae, b6 hoa mim

s0i Scrophulariales, ho ca Solanaceae, chi Nicotiana |35| Chi Nicotiana cd

khoáng 50-70 loài, da số lả cây dại , căn cứ vào hình thái , màu sắc của hoa

người ta phân chia thành 4 loại chính:

Loai Nicotiana tabacum 1 Cé hoa mau hang , đỗ tươi hoặc đỏ thẫm là loai phé bién nhất chiếm _ 90% diện tích thuốc lá trên thể giới, hầu hết các

3

giống thuấc lá sợi vàng thuộc loại nảy

Loài NicaHana rustica L Có hoa màu vàng , chiếm 10% diện tích, hầu thết các giống thuốc lá sợi nâu và sợi đen thuộc loại nảy, trường dung để nhai,

ngửi, lâm thuốc xỉ gả

Loài Micofana pehurioide L Có hoa màu trắngphớt hỗng hay tỉathường có

trong vườn thực vật học phục vụ nguồn dự trữ gene cho lạitaó trong sẵn xuất

Loai Nicotiana polidieide 1 CO hoa mau trắng, trong thực tỄ cũng có íL

trong sản sản xuất, chỉ có trong vườn thực vật học của một số nước

Các giống thuốc lá sợi vàng có chất lượng cao là Virginia gold,

Virginia blond cash, Virginia bright duoc trong nhigug My, Italia, Bungari, Trung Quốc, Ba Lan, Đức và một số nước khác ở am Mỹ

G Việt Nam, các giống thuốc lá sợi vàng được trồng lầu năm ở Ba Vì và Cao Bang, giéng rung Hơa Bài trồng ở các tỉnh phía Bac, cdc giéng C-83, K

511, Coker 176, K326, C9-1, Burley và Ilue-Cured virginia rỗng phổ biến ở

Nam va ‘rung bộ Hiện nay, giống thuốc lá A fabacwm I K326 và C9-1 dược tréng phổ biến nhất [3]

1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị khoa hye

la cây thuốc lá

'Thuốc lá là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm

quan trọng bậc nhất đối với nền kinh tế thế giới Việc tring thuốc lá không chỉ trực tiếp tạo công ăn việc làm cho trôn 33 triệu nõng dân của hơn 120 quốc gia trên thế giới mả còn đóng vai trò quan trọng cho toàn bộ nền công nghiệp thuốc 1á [13] Các hãng sẵn xuất thuốc lá trên thể giới đều phải thừa nhận rằng thuốc

14 dem dén cho họ nguễn lợi nhuận không lỀ Ở một số nước như Brazil

Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari thuốc lá lả một mặt hảng chiên lược cho thu

nhập lớn hơn các các loại cây trồng khác Các số liệu thống kê đã ước tính khoảng 1⁄4 sản lượng thuốc lá trên thể giới dã dưa vào kim ngạch xuất khẩu

goài ra, cây thuốc con giải quyết nhiêu vân để khác như luân canh, tăng vụ,

tận dụng đất dai lao động vả thu nhập cao hơn một số cây trồng khác

Ở Việt Nam, cây thuốc lá được trồng phổ biển ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ

và Nam Bộ Đây lả cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao

cho nông dân và thu nhập cho quốc gia Theo thống kế của Tổng công ty

thuốc lá Việt Nam (Vinatzba) |3| trong 3 năm (2006-2008) tổng đoanh thu

của thuốc lá đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9,653 tỷ đồng,

kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của người lao động

được báo đấm, dời sống từng bước được nâng cao

Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị về mặt khoa học,

thuốc lá là một trong những cây mỗ hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối

tượng thực vật như: nuôi cấy mô tế bảo thực vật, chuyển gene thực vật vì nó để

tai sinh va chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trưởng và chống chịu tốt [40]

Trong y dược hợc, thuốc lá là được liệu tốt dễ trị giun đũa, ký sinh trùng như chấy, ran, ghé, lá khô giã đắp vào vết thương để cầm máu [50]

1.2 MỌT SỐ BẸNII VIRUS THƯỜNG GẶP Ở CẦY THUỐC LÁ

1.2.1 Bệnh virus trên cây thuốc lá

Tiiện nay, năng suất và chất lượng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do bệnh virus hoành hành Trong đó, phố biến và nghiêm trọng nhất là gác bệnh

kham 14 do TMV (fomata mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây

ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm ngọn do cae loai virus TYLCV (Tomato yellow

leaf curl virus) va TSWV (Tomato spotted wilt virus) géy hai (Bang 1.1)

Năm 2008, theo thông kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích thuộc Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMTV và CMV là hai loài virus gây

hại chủ yếu trên cây thuốc lá ở Việt Nam Bệnh khám xuất hiện khá sớm với

tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng, từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% như ớ xã Lâu Thượng, tĩnh Thái Nguyên, trong đó giống thuốc lá rất mẫn cắm với TMV chú yếu la K326

Thiệt hại đo virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng [3]

Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khẩm nói riêng hiện vẫn chưa

có loại thuốc hoá hoc nao có thể phỏng trị được một cách hữu hiệu, do đó các

$

biện pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dung các hạt giống sạch bệnh để trồng,

không sử dụng các hạt giống từ các ruông trước đó đã bị các bệnh nói trên để

làm giống cho vụ sau Thường xuyên vệ sinh, kiểm tra đồng ruộng để phát

Bang 1.1 Bénh virus thường gap trén ciy thude la [49]

Khâm linh lng Alfalfa mosaie virus (Virus kham linh lng)

Quần ngọn cức tân ‘Beet curly top virus (Virus gay bénh quan ngọn cây cúc tần)

TNgọn cây bụi Tai ligp Tabacco vein distorting virus (Virus gay bién dang

gan thade 14) va Tobacco bushy top virus (Vins nggn cay bui

thuốc lá)

Khám cả chua Cucumber mosaie virus (Virus gay bệnh Khám đưa chuộp)

Ving chéthogi raudiép Lettuce necrotic yellows virus (virus đầy bệnh vàng chổi hoại

rau digp) trén Nicotiana glutinosa

Coi ege cay lac Peanut stunt virus

Tiệnh hình hoa hông Tải tổ hợn Tobacco vein distorting virux (virus bay bién dang

gan la thude 14) va Tohaceo moule virus (virus gay ban đm

thuốc lá)

Ky axit thuộc là Tobucco eich virus (Virus gây bệnh Ky œút Thuốc lá)

Xoăn vàng lá ở cà chua — Tomato yellow leaf curl virus(Virus gay xoan vàng lá ở cây cả

cha) Khám thuốc là Tobacco mosaic virus (Virus gay bénk khăm thuốc lá) và

Satcllite Tobacco mosaic Vus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá

vệ tỉnh) Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (Vinus gầy hoại tũ thuốc 14)

Bung hat thude lá Tobacco ratile virus (Virus gay bung hat thuốc lá)

Dam ving thude 14 Tobacco ring spor vữus (Virus gầy bénh dim vong thude lú)

Sọc thuốc là Tobacco streak virus (Virus gay bệnh sọc thuốc lá)

Côi cọc thuộc lá Tobucco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuộc lã)

‘Van gân lá thuốc lá Tobacco vein mottling virus (Virus gay banh van gan 1 thudc

lá) Heo dém ca chua Tomato spotted wilt virus (Vivus gay bénh héo dém ca chwa)

Viễn gân lá Potato virus ¥ (Vitus ¥ khoai tây)

U vet thurong Wound tanor virus (Virus gay bệnh Khối ú vết thương)

6

1.2.2 So luge v8 TMV, CMV, TYLCV, TSVV gy bénh trên cây thuốc lá

1.2.2.1 Virus khém thuéc lé (Tobacco mosaic virus - TMV)

Virus khim thuốc lal'MV la virus gay bénh kham phô biên trên thực

vật thuộc loài Tobawovirus và được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886) [30],

Iwanowski (1892) |25|, Allard (1914) [14] va Stanley (1935) [43] Virus

kham thuéc lá có phố ký chủ rông, gây bệnh trên hơn 120 loại thực vật khác

nhau, nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá TMV lây truyền theo cách thức tiếp xúc cơ giới thâm nhập vào trong các tế bảo qua vết thương, khí khổng 1a

hoặc qua rễ [7] Biểu hiện của bệnh khẩm lá đầu tiên là các lá non chuyển

sang màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, trên bề mặt xuất hiện các vết khám loang 14,

mnàu sắc chỗ đậm chỗ nhạt Bên cạnh đó, còn có các biểu hiện khác như phiến

lá hơi nhăn, mặt lá không được phẳng mả chuyên sang lỗi lốm do các gân lá

bị kìm hšm sinh trưởng, trong khi thịt lá vẫn phát triển bình thường

Dang tiém ấn của bệnh ở các mức độ khác nhau, bao gém (5):

- Dạng tidm dn toàn phan: cây hoàn toàn không có biểu hiện của triệu

trừng bệnh

- Dạng tiềm Ân cục bộ: triệu trứng bệnh xuất hiện ở phần lá non, lá ngọn nhưng không được rõ rằng,

- lạng tiềm Ấn tạm thời: chỉ xuất hiện ở một giai đoạn của bệnh,

thường là giai đoạn sau

- Tiểm Ấn vĩnh viễn: bệnh không biểu hiện triệu chứng trong suốt thoi gian phát triển của cây

Giải thích cho hiện tượng tiềm ẩn của bệnh là do thời gian ủ bệnh của

virus TMV tương dối đải nếu cây bị nhiễm bệnh trong giải doan trưởng

thành, TMV không kịp biểu hiện triệu trừng của Tuy nhiên, năng, suất và chất

lượng sản phẩm sau thu hoạch vẫn bị ảnh hướng nghiêm trọng Ngoài ra,

trong điều kiện nhiệt độ cao (> 30 °C) cing làm mất triệu chứng của bệnh

Hinh 1.1 Bénh khẩm thuốc lá do virus TMI” gây ra (Nguồn: imfernel)

Nghiên cứu ở câp độ phân tử, vật liệu di truyền của TMIV là 1 sợi đơn

RNA đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb và chứa 4 khung đọc mở

(ORF) Đầu 5' của RNA có gắn với 7-methyl guanosine Những khung đọc

mở (ORE) gần đầu 5` mã hóa 2 protein có trọng lượng phân tử lần lượt là 126

kDa và 183 kDa (Hình 1.2) [20]

Hình 1.2 Sơ đồ cẩu trúc genome của TMI

RdRp - replicase; CP - protein v6; helicase - enzyme lién quan toi qué trinh

duỗi xoắn; MP - protein vận chuyển Chiều mũi tên thê hiện chiều dịch mã 1.2.2.2 Uirus khẩm trên cây dưa leo (Cucwumber mosdie virus, CMV)

Bệnh khẩm trên cây dưa leo CMV được mô tả lần đầu tiên vào năm

1916, là một trong những bệnh virus gây nên trên thực vật được phát hiện

sớm nhất Hiện nay, có nhiều dòng CMV đã được mô tả với dữ liêu di truyền

chứa khoảng 60 protein khác nhau và 1Š trình tự genome virus hoàn chỉnh

Virus kham dua leo thudc loai Cucumovirrus, ho Bromovirus va duoc

biết đến là virus có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài thực vật [33]

Phương thức lan truyền của CMV thông qua vật trung gian là các loài rệp,

trong đó 2 loài chủ yếu là A4yzus persicae và 4phis gossypii [27]

Hình 1.3 Cây thuốc lá bị bệnh khẩm do virus CMV gay ra(Ngudn: internei)

Cae ching CMV được chia thành hai nhóm I và II dựa trên các phân tích huyết thanh [24, 46], lai acid nucleic và giải trình tự gene [32] Giữa nhóm I vả II cỏ mối quan hệ khá xa nhau, hệ gene của chủng chỉ có 75% nueleotide tương đồng Trong nhóm I lại được chia thành 2 phân nhóm IA và

IB với độ tương đồng của chủng lên tới 92 ~ 95% [33, 37] Các chủng CMV

phân nhóm IA vả nhóm II xuất hiện gần như trên toàn thể giới, trong khi các

chủng thuộc phân nhóm I lại chủ yếu xuất hiện ở Châu Á [12]

Khi xem xét ở cấp độ tế bào và phân tử, CMV có dạng hình cầu,

đường kính khoảng 28 — 30 nm và trọng lượng phân tử từ 5,0 — 6,7.10° Da

Vật liệu di truyền của CMV gồm 3 soi RNA thông tin (RNA1, RNA2, RNA3)

va co 5 khung doc mé (ORF) RNAI gém cé 3357 nucleotide ma hoa cho

protein 1a (khoảng 111 kDa), RNA2 chứa 3050 nucleotide mã hoá trực tiếp protein 2a (97 kDa), RNA3 mã hoá trực tiếp protein di chuyển (30kDa) Ngoài 3 sợi RNA trên, còn có RNA4A gồm 691 nucleotide có nguồn gốc từ RNA2 mi hoa cho protein 2b (15 kDa) va RNA4 (1034 nucleotide) co nguồn

gốc từ RNA3 mã hoá protein vỏ (24,5 kDa) Hai protein la, 2a kết hợp với những protein của kí chủ tạo thanh enzyme “replicase” cia CMV [37]

Trong ba loại RNA của CMV, RNA3 thường xuyên xảy ra quá trình tái tổ hợp hơn so với RNAI và RNA2 [37] Do đó, đã có nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh giá về đa dạng di truyền vả xây dựng cây phát sinh của chủng CMV.

RNA1

3357 nt RNA2

3050 nt RNA GA

689 nt

RNA3

2216 nt RNA4

1031 nt

Satellite RNA

— -335 nt

Hình 1.4 Sơ đồ cẩu trúc hệ gene cña virus CMI”

1.2.2.3 Lirus héo đỗm ca chua (Tomato spotted wilt virus, TSWV) gay bệnh

xodn dot héo ngon trén cay thuốc lá

TSWV la virus gây bệnh héo đốm trên cây cả chua được mô tả lần đầu tiên vào năm 1930 bởi Samuel và cộng sự tại Australia [39], bênh héo đốm ca chua gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế nông nghiệp TSWV được đánh giá

là virus gây hại phổ rộng với hơn 370 loại cây trồng trong 50 họ thực vật khác nhau tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cân nhiệt đới [18]

Tại Việt Nam, virus héo đốm cả chua được phát hiện trên cây cà chua

tại Hooc Môn [7] và trên cây thuốc lá

Hình 1.5: Ảnh cây thuốc lả bị bệnh héo đỗm do virus TSWV gay ra(Nguén

internet)

10

Virus héo dém ca chua thuéc loại Tospovirus, họ Bunyaviridae, co cấu

tạo dạng thiên thể kích thước 70 - 90nm TSWYV được lan truyền thông qua tác nhân trung gian là côn trùng, chủ yếu la bo tri Thrips tabaci, Thrips setosus, Thrips parmi, theo kiéu [7] Hê gene của loại virus này gồm ba sợi RNA đơn âm hoặc lưỡng tỉnh, là các sợi L (8,9 kb), soi M (4,9 kb) va soi S (2,9 kb) (hình 1.6) Sợi L mã hóa cho các replicase liên quan tới quá trình

phiên mã của virus trong khi sơi M mã hóa cho protein vận chuyển (NSm) va

protein vỏ (Gy và Ge) còn sợi S mã hóa cho nucleprotein (N) và protein ức

chế quá trình bắt hoat gene (NSs) [28]

Hình 16 Sơ đồ cẩu tric genome cia TSWV

RdRp: replicase; Nsm: protein van chuyén; G)/Ge: protein v6;

ASs: nhân tổ ức chế quá trình bắt hoạt gen; N: nulceoproteim

Chiều mũi tên thể hiện chiều dịch mã

1.2.2.4 Virus gay bénh xodn vang la 6 ca chua (Tomato yellow leaf curl

Z tụ ragisire

Hình 1.8 Tổ chức bộ gene của TYLCL Khung mỡ đọc được chỉ định V (định

hưởng cña virus) hoặc C (định hướng ý nghĩa bỗ sung)

- Những nghiên cứu về thiệt hại do bệnh virus gây ra trên cây thuốc

lả tại Liệt Nam:

Tại một số vùng trồng thuốc lá lớn như Tây Ninh, Ninh Thuận, bênh

xoăn ngọn do Virus héo đốm cà chua TSWVgây thiệt hại năng cho sản xuất

khi xuất hiện ở giai đoạn sớm và không cho thu hoạch Theo báo cáo của

phỏng Đầu tư - Phát triển thuộc Công ty cổ phần Hoà Việt và Phân viên Kinh

tế Kỹ thuật Thuốc lá, thiệt hại về kinh tế chỉ riêng vùng Tây Ninh trong 3 niên

vụ tử 2001-2004 ước tính ở mức 40 - 50 tỷ đồng Tại các vùng trồng phía

12

Tắc, các bệnh kham lá do virus khảm thuốc lá TMY va virus khẩm đưa leo CMV gây ra có tỷ lệ nhiễm trung bình từ 15-20%, có khi lên tới 100% như tại

xã Lâu Thượng — Thái Nguyên và gây thiệt hại cho nông đân khoảng 10- 15

tý đồng/ năm{3|

1.2.3 Biện pháp phòng chống bệnh virus

Hiện nay, vẫn chưa có biện pháp nảo có thể xử lý trị bệnh do virus gây

Ta trên cây tréng Khác với những bệnh hại do nắm, vi khuẩn hay sâu bọ gây

ra, bệnh đo virus rất khó diéu tri Các biện pháp đưa ra chỉ nhằm mục đích

phòng bệnh là chính Một số biện pháp đang được sử dụng trong công tác phòng bệnh trên cây trồng như: Sử dụng giống sạch bệnh, giống kháng bệnh,

các biên pháp canh tác, [8]

1.2.3.1 Sữ dụng giống sạch bệnh

Giống sạch bệnh được thu từ các cây trồng khoẻ mạnh, không bị nhiễm

bệnh Lừ vụ trước Các cây trồng khoẻ mạnh sẽ được đem lai với giống cây dại

do cây dai có tỉnh kháng bệnh cao sau đó hạt giống thu được sẽ được xử lý,

bao quan dé st dung cho vu sau, Sir dung giống sạch bệnh được xem là một

trong những biện pháp quan trọng dé han chế các bệnh đo virus ở nhiều loại

cây trồng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp nay là cây trồng có thế bị nhiém bénh trong quá trình canh tác trên đông ruộng

1.2.3.2.Sử dụng giống khúng bệnh bằng phương pháp lai tạo

Sứ dụng các loại giống đã được nghiên cửu lả có khả năng kháng lại

nhưng virus gây bệnh được xem hữu hiệu trong sản xuất nông nghiệp hiện

nay Phương pháp này vừa mang lại hiệu qua cao, mả không gây ô nhiễm mỗi

trường sinh thái và tạo được cây sạch bênh 'Tuy nhiên, nhược điểm của

phương pháp này là số lượng biên pháp gặp nhiều hạn chế về nguồn vật liệu

di truyền kháng virus phục vụ cho công tắc lai tạo, cũng như chỉ phí cao.

1.2.3.3 Các biện pháp canh tác

- luân canh: thường là luân canh piữa cây trồng nước với cây trằng cạn

(vi dụ: thuốc lá — lúa — thuốc lá), khi thay déi cơ cấu cây trồng và thay đối

điều kiện môi trường đất (từ đất cạn — đất ngập nước} sẽ làm hạn chế sự phat triển của mầm bệnh hoặc mầm bệnh cỏ thể bị tiêu diệt Tránh độc canh hoặc

luân canh cây trồng can với cây trồng cạn

- Sử dụng biện pháp kiểm soát côn trùng gây bệnh: da hầu hết virus lây

truyền bênh thông qua vật trưng gian (côn trùng gây bênh) nên khi trồng

những cây có tỉnh kháng lại, xua đuối côn trùng xen với cây trằng chỉnh cũng

có tác dụng ngăn ngừa dịch bệnh (ví dụ trồng i khong hạt cạnh cây bưởi sẽ

xua đối bọ cánh trăng gây hại trên cây buởi), các biện pháp bắt côn trùng (bẫy

đón, ong mắt dé)

~ VỆ sinh đồng ruộng: làm sạch cô dại, xử lý đất sau khi thu hoạch và

trước gieo trồng vụ mới, phát hiện sớm và tiêu huỷ cây bệnh

- Phỏng trị bệnh cho cây con ở vườn ươm: đây là biện pháp cho hiệu

quả cao Sử dụng đất sạch mắm bệnh để làm vườn ươm, cách ly vườn ươm

với ruộng sản xuất, chọn những cây con khoẻ mạnh đem trồng

Các biện pháp trên chỉ có khả năng phòng bệnh cho cây trồng, cây

trồng có thể bị nhiễm bệnh trong quả trình canh tác

1

+4 Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học

Ứng đụng công nghệ sinh học vảo trong sân xuất nông nghiệp được coi

là phương pháp tối ưu nhất hiện nay trong việc phòng chồng bệnh hại do virus

gây ra Thành công dầu tiên trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo

giống cây trồng được đánh dâu bằng công bố công trình nghiên cứu của

Beachy va công sự (1986) |36| trên cây thuốc lá chuyển gene mã hoá protein

vô của virus gây bệnh khẩm (TMV) Sau đó nhóm tác giả đã phát triển những

thí nghiệm của mình thành phương pháp chuyển gene CP tạo cây trằng kháng

virus Thương pháp này đã được áp dụng (hành công trên thựu vật hai lá mằm

14

và sau đó là thực vật một lá mâm [23] Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp

này là chỉ tạo được cây trằng chuyển gene kháng được duy nhất một chứng,

virus mang gene mã hoá vô protein mà nó chuyển vào Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng dựa trên phương pháp chuyển gone

CP do các virus gây bệnh thường có đô đa đang khá cao [41]

Dén cuéi thế ký 20, kỹ thuật RNA gây nhiễu (RMA interference, RNAi)

hay o6n gọi là cấu trúc dạng kẹp tóc (nươn-hairpin RNA, ihpRNA) ra đời

Tây được xem lả kỹ thuật hiện đại và hữu hiện nhất trong việc tạo giống cây trồng chuyển gonc kháng lại virus gay bénh Nim 2004, Baulcombe va céng

sự dã công bố cơ chế hoạt động của doan RNA gây nhiễu nhỏ (small

interfering RNA, siRNA) và xem đó là cơ chế quan trọng trong việc kháng lại

virus ở thực vật |I6| Các bước chỉnh trong kỹ thuật RNA¡ gồm: (1) Thiết kế vector chuyển gene mang cau tric RNAi; (2) Biến nạp vector chuyển pene

mang cấu trac RNAi vào cây thông qua vi khudn Agrobacterum tumefaciens

để làm bất hoạt các RNA thông tin (mRNA) của virus gây bênh, (3) Sảng lọc

các cây chuyển gene mang cấu trúc RNA¡ và kiểm tra tỉnh kháng virus của

các cây chuyển gene [41] Tính hiệu quả của kỹ thuật INA¡I là tạo cho cây

chuyển pene mã hoá protein của virus (gene mã hoá vỏ CP, enzyme phiên mã

RdRp, ) có khá năng kháng lai chỉnh vưus đó Năm 2007, Zrachya và cộng

sự đã công bố về việc đưa siRNA nhắm vào các bản sao CP của TYLCV dẫn

đến việc bất hoạt sự biểu hiện và kháng lại virus này [48]

Các cấu trúc gene có nguồn gốc tử virus gây bệnh được sử dụng chuyển

vào cây trồng để lạo tính kháng có thể là các loại khác nhau như : uác cấu trúc

của virus theo chiễu xuôi (sense) hay chiểu ngược (antisense) các cầu tric dang kẹp téc (inverted repeats/hairpin) va cic miRNA nhén tạo có địch là các

trình tự gene của virus gây bệnh _, hay kỹ thuật RNAi dang dược quan tâm

nhiều và ứng dụng rộng rãi.

13 KY TIIUAT RNA INTERFERENCE — CO SỞ KIIOA HỌC CỦA

DE TAI

1.3.1 Khai nigm vé RNA interference

RNA interference (RNAi) la co ché tu nhién của tế bào sống cé thé lam bắt hoạt một gene nào đó Hiện tượng này được quan sat lần đầu tiên trên những cây thuốc lá kháng bệnh do virus đếm vòng thuắc lá (Tobacce ring

spot virus, TRSV) ay ra sau lây nhiễm lần hai, trên các cây chuyển gene có

biểu hiện ức chế phiên mã nhờ RNA “chiều đổi ma" (antisense RNA) [16] va

xhhiểu kết quả từ những thí nghiệm gây bất ngờ đo các nhà nghiên cứu thực vật ở Mỹ và Hà Lan thực hiện vào những năm dầu thập niên 90 trên dối tượng,

cây đã yén thao (petunia)

Các kỹ thuật cơ bản của RNA¡ được sở dụng để làm rõ chức năng của gene Theo đó, để tích luỹ thông tin trình tự hệ gene trong các loài thực vật

khác nhau, việc phân tích các gene chức năng không xác định ting đáng kể

Những nỗ lực nảy giúp cho việc xác dịnh các pene có đặc diém quý Sự bất

hoạt các gene không mong muốn cũng được ứng dụng trong sản xuất giống cây trồng với việc tăng giá trị dinh dưỡng và quá trình xứ lý thực phẩm Ví dụ, kỹ

thuật RNAi được ứng dụng để tạo giống bông vải với hàm lượng stearic acid

va oleic acid cao cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất đầu đậu lành với tăng sự én định ở nhiệt độ cao Chất lượng hoa oũng là mục tiêu của kỹ thuat RNAi trong việc nhân giéng, tăng số lượng hoa hạt cái dầu, tạo giống hoa

hồng với cánh hoa máu xanh bằng cách sử dụng Công nghệ RNA¡

1.3.2 Cơ chế hoạt động của RNA¡i

RNAIi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất đi truyền ở giai đoạn RNA

Ở thực vật có ba con đường ức chế RNA Còn đường đầu tiên là sự ức chế gene sau phién m3 PTGS (Post-Transcriptional Gene Silencing) qua trung

gian là các RNA gây nhiễu nhỏ có vai trò ức ché (short interfering RNA,

siRNA}: Con dường thử hai gỗm có các téu RNA (micro-RNA, miRNA)

Con đường thứ ba là sự bất hoạt gene phiên mã ‘IGS (transcriptional gene

16

silencing) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA bao gdm su methyl héa histone và ĐNA Ba con đường này có vai trò nhất định trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như kháng virus hoặc sự xâm nhập của các DNA/RNA lạ, điều khiển biểu hiện geno hay

ngưng tụ chất nhiễm sắc thành thế dị nhiễm sắc [16] Các phần tử quan trọng

tham gia vao co ché RNAi nay là hai enzyme Dicer và Argonaute trong phức

hé RISC (RNA-induced silencing complex) kich hoal qua trinh ire ché RNA,

cdc siRNA và miRNA [16]

Trong ba con đường ức chế RNA, sự ức chế gene sau phién mi (PTGS)

qua trung gian là các siRNA được sử dụng phế biển nhất trong nghiên cứu tạo

oây trồng chuyển gơnc kháng virus Quá trình này xây ra ở lễ bào chất và là con đường quan trọng trong tổ bảo thực vật bị nhiễm virus, nơi ma các sợi

RNA mạch kép hoặc cầu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thé sao chép gián tiếp Cầu trúc này sé tao ra RNA CPi dang kep toc bỗ sung chính nó có intron Gntron-hairpin RNA, ihpRNA) sau khi được chuyển vào cây trồng Khả năng cầu trúc ihpRNA bổ sung chính nó có hiệu quả làm bất hoạt gene ở

thực val di duce Smith va công sự chứng minh vào năm 2000 |42| Trong trường hợp là DNA virus, cdc doan dsRNA (double strain RNA) cé thé duce

tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp [16] Cơ chế này cũng xây ra

tương tự như ở động vật Khi có sự xâm nhập của đsRNA., các Dicer có bản chất là Nasef đặc hiệu cho đsiÈNA sẽ cắt những chuỗi kép RNA này ra

những đoạn ngắn hơn , khoang 21-25 nucleotide, goila siRNA Sau dé, cdc

siRNA mach kép hình thánh được tách ra làm hai chuỗi doạn và chỉ mét chudi

đơn RNA với đầu 5' cé luc bat c Ap base (base-pairing) nhỏ nhất được giữ lai

để tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ RISC Tiếp đó, phức hệ RISƠ

đã gắn đoạn siKMA nhận biết các mRNA của tê bảo có trình tự tương đồng

với trình Lự của đoạn chuỗi đơn siRNA này Sau khi nhận dang mRNA qua

việc bắt cặp các base tương ding với trình tự của chuỗi don siRNA , các mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA_ -nRNA thành những

đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3” Sau khi bi cit dirt , mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuolease [17] (Ilinh 1.9),

17

1.4 NGHIÊN CỨU TẠO CÂY TRÒNG CHUYỂN GENE KHÁNG

VIRUS TẠI VIỆT NAM

'Virus là nguyên nhân gây hai tới nhiều loại cây trồng trên thể giới cũng

như ở Việt Nam Hầu hết các bệnh thực vật do virus gây ra cho tới nay chưa

có thuốc đặc trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiều nghiên cứu tại nước ta Từ năm 1999, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viên Công nghệ Sinh học phối hợp với 5 nước trong khu vực ASEAN tham

gia vào chương trình nghiên cứu phát triển cây đu đủ chuyền gene khang bénh virus dém vong (Papaya ringspot virus - PRSV) do tổ chức ISAAA

(International Service for Acquisition of Agri-biotech Applications) tải trợ

Trong khuôn khổ đề tài nhóm thực hiện đã phân lập được gene CP của một số

chủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bô Gene CP đã được sử dụng để

thiết kế các cầu trúc chuyển gene vao cay du du nhằm tao cay chuyén gene

kháng virus đồm vòng Một số dòng cây đu đủ chuyển gene đã biểu hiện tính

18

kháng virus sau khi thử nhiễm bệnh nhân tạo [2] Thời gian gần đây đã có một

số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng,

chuyển gene kháng lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bảo thực

vật — Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam

thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNA¡ trong tạo cây chuyển gene

kháng virus Tiếp đó, đề tải oấp nhà nước "Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả khang bệnh virus phố rộng bằng chuyển gene da đoạn” (KC.04.03/06-10) dã thiết kế thánh công 2 đoạn gene nhân tạo mang đa đoạn gene CP, Nib và HC-

pro cia PRSV va 2 đoạn gonc đa đoạn RdRp-CP và RRp-CD-p20-p23 của

virus Citrus fristeza virus (TTV) cũng như dã thiết kế thành công những cấu

tric RNAi mang cde gene đa đoạn này [1] Phân tích phân tử cho thấy sự có

mặt của các cầu trac RNAi trong nhiều dong cây chuyển gene |4| Đặc biệt,

trong để tải cấp Viên HILKH_ &CN Việt Nam được tiển hành trong hai năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tao giống cây trồng

chuyển gene kháng bệnh virus” đã tạo được một số kết quả dặt tiền để cho

nghiền cứu tạo giống thuấc lá kháng bệnh khẩm lá và xoăn đọt Các kết quả

đạt được cụ thế như sau

~ Phân lập được đoạn pene CP của một số dòng virus TMV và CMIV tại

một số tỉnh phía Bắc

- Thiết kế được một số cầu trúc RNAI mang đoạn gene CP của virus

‘TMV va CMV ding thời tạo được các dòng cây thuốc lá chuyển gene mang

cấu trúc này

- Khả năng kháng virus TMV hodc CMV ctia 100 dang c:

ene trên quy mô nhà lưới đạt tỷ lệ khoảng 75-841⁄ Phân tích ELISA những

y chuyển

đồng cây biểu hiện kháng hoản toán đều không phát hiện được sự có mặt của virus TMV

- Tạo được một số dỏng cây kháng đồng thời cả hai virus TM và

CMIV bằng chuyển cấu trúc mang doạn pene của cả hai virus

19

Kinh nghiệm trong đánh giá lính da dang di truyền virus, thiết kế cầu

trúc RNAi chuyễn gene, tao và phân tích cây thuốc lá chuyển gene đồng thời

kiểm tra tính kháng bằng lây nhiễm nhãn tạo được nhóm nghiên cứu học hồi

và phát huy trong để tài này Những kết quá nghiên cứu trên là bằng chứng quan trong chứng tô tỉnh hiệu quả của công nghệ R NAi trong tạo cây thuốc lá

chuyển gene kháng virus và khả năng làm chủ công nghệ của các nhá khoa học Việt Nam Tuy vậy, do thời gian thực hiện đề tài cấp Viện HLKH = &CN

Việt Nam hạn chế nên những dòng cây chuyển gene tạo được còn bộc lộ một

số nhược điểm khó phát triển thành dòng sẵn xuất:

- Mới nghiên cứu tạo cây thuốc lả kháng bệnh khám lá trên nền giống

326 Nghiên cứu tạo cây kháng bệnh xoăn ngọn còn bô ngỏ Nghiên cửu tạo

cây thuốc lá kháng dồng thời hai bệnh khám lá vả xoăn ngọn cũng chưa được

để cập trong nghiên cứu trước day

- Virus có tính đa dạng di truyền cao nên chỉ phân tích gene CP của

các dòng TMIV phân lập tại một số địa phương phía Hắc chưa dai diện được cho virus TMV va TSWV gay bệnh trên cây thuốc lá tại Việt Nam Cần thiết

phải phân tích bễ sung thêm các gene chính khác của hai virus này nhằm xây

dựng bức tranh toàn cảnh về virus gây bệnh khẩm lá va xoăn ngọn trên cây

thuốc lá ở Việt Nam, đồng thời làn cơ sở nghiên cứu tạo cây chuyén gene có

Chương 2 - VẶT LIỆU VÀ PIIƯƠNG PHIÁP NGIIÊN CỨU

2.1 VẶT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguẫn gene CP của virus

Plasmid pENTR/TCY mang vùng genc mã hoá cho CP (Coat protein)

của các loai virus TMV, CMV, cTYLCV Plasmid pENTR/TSWV mang trinh

tu gene mi hoa cho CP của virus TSWV do Phỏng Công nghệ tế bảo thực vật

- Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Các loại vector: pK7OWIWG2(D), pNOV-gusplus, BENTRTM/D-TOPO®

do Phòng Công nghệ tế bảo thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Chủng vi khuẩn

E colt DIISa va One Shot® TOP 10 (Invitrogen), Agrobacterium

tumefaciensCV58do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viên Công nghệ sinh học cung cÃ

Kit tinh sach DNA (AccuPrep” Gel Purification Kit) va tich chiết

plasmid”, (Plasmid Hxtraction Kit, Bioneer, Han Quéc), bd kit nhân dòng

pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit

Bacto pepton, yeast extract, NaCl, mannose, sucrose, glucose, tryptone, KCI, Tris HCl, EDTA, MaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol

70%, nước khử ion Các loại khang sinh rifamycine, cefotacime,

streptomycine, spcctinmycinc, và các hóa chất thông dụng khác (agar, agaroso, ) của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham

Pharmacia Biotech

2.1.ã Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Diosystem, Mỹ), máy điện di

Poworpao 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminalior, Bio-

Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Phanmacia Biotech, Thuy Diễn), máy

Vortex (Mimishaker, IKA, Dire), may hut chan khéng Speed-Vac 110A

21

(Savant, MY), may ly tam, may xung điện Gene Plulser, cùng với các trang

thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bảo thực vật và Phỏng thí nghiệm trọng,

điểm công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học

2.2 THƯƠNG PHIÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế cấu trúc gene da doạn

Bảng 2.1 Danh sách các mỗi Tên mỗi Trình tự (5'-3')

Boan ‘TMV-CP-Hi-2 được bé sung thêm 4 nucleotide CACC dé tong

thích với đầu 3' GTGG của vector nhân đòng pENIRTMD-TOPO&

(Invitrogen) can hai mai cTYLCV-TSWV-Fi-1 và eTYLCV-TSWV-Ri-1 cd

20 nucleotide gối lên nhau (10 nuecleotit đầu 5” của TMIV và 10 nueleotide đầu

3° ofa TSWV)

Việc thiết kế mỗi dược thực hiện lại các vung bao thú nhất, vi vay,

ngoài những trinh tự gene CP đã có, một trình tự nhân tạo gene cTYLCV gồm

112 nucleotide cha CF, 101 nucleotide C1/C2, 128 nucleotide C1/C4 va 56

nucleotidectia C1 dã dược thiết kế thêm

Ghép nối các đoạn gene theo các phương pháp của Sambrook 1989 [38],

TCR khuốch đại và ghép ni tao TCYS dược thực hiện cụ thể thco 5 bước sau

Bước 1: PCR khuếch dại đoạn gene da đoạn TCY từ pBNI

Bước 2: PCR khuếch đại đoạn gene CP bảo thủ của TSWV bằng cặp

mỗi gl'Y1.CV-ISWV-Ei-1/ISWV-CP-RI-I Sản phẩm có kích thước khoảng

280 bp

Thước 3: Điện di, chụp anh và thôi gel tỊnh sạch sắn phẩm PCR ở bước

1 và2

Bước 4: Thực hiện PCR với thinh phin gim 5 yl dém PCR, $ pl dNTPs, 0,5

nÌ Taq PÍu, ]-2 ng sắn phẩm DCR dược lĩnh sạch từ bước 1 và 2 Thực hiện chu kỳ nhiệt: 94°C 3ˆ; 5 chu ky (94°C 1°, 60°C 17; 72°C 1°), 72°C 10’, 4°C ø

Bước ã: Bổ sung 2 pl mỗi mỗi loại TMV-CP-Ei-2 va TSWV-CP-Ri-1 vào ống PCR, thực hiện tiếp phin img PCR với chủ kỳ nhiệt như sau: 94°C 3'; 25 chu ky (94°C 17; 52°C 1°, 72°C I'30”), 72°C 10; 4°C œ Sản phẩm PCR cuỗi củng có kích thước khoáng 1000 bp

Cấu trúc 'IUYS gồm CP của bến loại virus được ghép nối vào vector

pENTRTM/D-TOPO® (Invitrogen), tạo thành pIöNTR/TCYS Cấu trúc đã

được xác dịnh trình tự trên máy đọc trình tự tự dông Sử dụng các phần mềm

DNAsiar, DieEdit và MEGA 4 để sosánh các trình tự gene

2.2.2 Thiết kế vecfor RNAi

2.2.2.1 Thiết kế vecter RNAI tiến nhận mạng gene chọn loc manA

Vector RNAi gốc chọn lọc bằng đường mannose được tạo ra bằng cách dất và nối giữa vootor chuyển gonc pK7GWTIWG2(T) với vcotor pNOV- gusplus cé cha gene mand (Hinh 2.1)

23

Hình 2.1: Mô hình thiết kế vector pK7M

Sử dụng các enzyme cắt giới han Sphl, HindIllva enzyme tao dau bang

T4 DNA polymerase dé tao trình tự RNAi tir vector pPK7GWIWG2(II) Trinh

tu gene mand thu duoc tir vector pNOV-gusplus nh& phan ứng cắt bởi 2 enzyme Pmel va HindIII San phẩm cắt của hai vector sau đó được ghép nối

với nhau nhờ enzyme T4 ligase dé tao ra vector RNAi mang cấu trúc gene

chọn lọc bằng đường mannose (ký hiệu: pK7M) Sản phẩm sau đó được biến

nạp vào vì khuẩn E.coli chủng DHSơ và được kiểm tra bằng phản ứng colony-

PCR va phan ứng cắt bởi enzyme hạn chế Xbal, HindIll

24

Bang 2.2: Thanh phan phản ứng cắt, 'pK7GHWTWG21) enzpme Sphl'

Bang 2.5: Thanh phan phan ung cdt ‘PNOV-gusplus bdi HindIII va Pmel

Kỹ thuật này cho phép chuyển doạn DNA giữa các vector lách dòng với

vector dich khác nhau và nội các đoạn DNA trong một trinh tự xác định trước,

định hướng theo khung đọc mỡ,

26

Phuong phap

Kỹ thuật Gateway gồm hai loại phản ứng 1.R (là phản ứng tái tổ hợp

giữa các vị trí ai, và a4) và BP (là phản ứng tái tổ hợp giữa các vị trí att

và af?) Trong nghiên cứu này, phán ứng LR được sử dụng để chuyển gene

CP cha bén loai virus TMV, CMV, TYLCY va TSWV co trong vector

pBNTR/TCYS chứa trình tự atfL ở 2 đầu doan gene TCYS vao vector liếp nhận pK7M có chứa các vị trị a//R dưới sự xúc tac eta envyme LR Clonase™

1 Kết quả tạo ra một vector biểu hiện mang cấu tric RNAI (ký hiệu là pK7M/TCY®8) với hai vị trí chèn đoạn TCYS thco chiều sense va antisense

được ngăn cách bởi một doan intron, đưới sự điều khiển của promoter 358

2.2.3 Biến nạp sản phẩm vào tế bào vi khuẩn

2.2.3.1 Biến nạp vào tế bào E cali

Nguyên lý

Phương pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào kha bién E.coli

DH5e duoc tiển hành theo Cohen va cOng sự (1972) [19] Mang té bao vi khuẩn đưới tác dụng của hóa chất trở nên xốp, mỏng hơn va tao các lỗ cho

các phân tử DW-A chui vào Sau đó các tế bào được phục hải trong môi trưởng

nuôi cây vả các thể biến nạp trên môi trường thích hợp

Các bước thực hiện

Quá trinh biến nạp được thực hiện theo phương pháp sốc nhiệt, gồm

các bước sau

Hước 1: lây tế bảo khuẩn từ tủ -84 °C để trên đá lanh 10 phút

ước 2: Bỗ sung 10 ul san phẩm ligate vào và để trên đá lạnh 10 phút Bước 3: Sốc nhiệt bằng Micro wave ở I5Ow với thời gian 1 phút L5 giây Bước 4: Lấy ra để trên đá lạnh 10 phút

(* Lặp lại bước 3 và 4 thôm một lần nữa)

Hước 5: Bỗ sung 500 pÌ dung dịch LB lỏng, nuôi lắc 120 vip, 1 giờ

27

Sau khi phục hồi, địch tế bảo được cấy trải lên đĩa chọn lọc có chứa

kháng sinh streptomycine 40 mg/l, spectinomycime 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l

Một số khuẩn lac được chọn ngẫu nhiên nuôi qua đêm 37°C trong 4 ml

LB léng c6 bd sung streptomycine 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l va

chloramphenicol 50 mự/1 để tách chiết plasmid Sau dé, phan (mg cit plasmid

bing ha enzyme Xbal va HimkTTT dược thực hiển để xác định sự có mặt DNA

Bang 2.7: Thanh phan phần ứng cắt bằng enzyme han ché

2.2.3.2 Biên nạp sảo tế bao A tumefaciens

Bước 1: Chuẩn bị tế bảo A tumefaciens khả biên trong các cuvet đã

khử trùng

Bước 2: Dặt các ông cuvet đã khử trùng vào đá

Bước 3: Bễ sung 5 ul plasmid tai té hop vào 100 nÌ dịch đựng sẵn tế

bao 4 tumefaciens kha biển

Bước 4: Dảo nhẹ, đặt trong đá thời gian 5 phút, chuyển dich sang

ống cuvet mới

Bước 5: Xung điện 6 2,5kW, 25uF va 4002

28

Buéc 6: Chuyén ngay ống dịch khuẩn vào đá, sau 5 phút bd sung 1

ml môi trường I,B, mix nhẹ, chuyễn sang ổng eppendorf 2ml nuôi lắc

120 v/p ở 28 °C trong 1 gid

Sau khi phục hồi, địch tế bào được cấy trải lên đĩa chọn lọc có chứa

kháng sinh spectinomycin 100 mg/l, nfamycine 25 mg/l va chloramphenicol

50 mg/l Nudi & 28 °C qua đêm

Các tế bào sau đó được kiểm tra bằng phần ứng colony -PCR

2.2.4 Kỹ thuật PCR và colony-PCR

Nguyên lý hoạt động

Kỹ thuit PCR (Polymerase Chain Reaction - Phin ứng chuỗi

polymorasc) dua trén nguyên tắc băt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có Irình

tự bổ sung va phin img kéo dai đoạn trình tự mỗi nhờ cnzyme7ag DNA

polymerase để khuếch dai theo ham mũ các đoạn DA mục tiêu lên hàng

triệu lần

Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là

mau DNA duoc thay bằng khuẩn lạc Ở nhiệt độ cao (94-95°C), mảng tế bảo

vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hop Plasmid tai t hop nay sé

làm khuôn cho phan (mg PCR nhin gene bing cặp mỗi đặc hiệu

Các bước thực hiện

Phản ímg PCR khuếch đại vùng gene CPi quan tâm được tiến hành với

cặp mỗi TMIV-Ti 2/TSWV-Ri 1 [10], với trình tự như sau

29