Luận văn thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vi rút prrs trong tế bào thực vật

Lé Thi Thanh K20 Sinh hục thực nghỉ vắcxin tiêu đơn vị được sản xuât đựa trên hệ thông thực vật để tha protein kháng Trguyên mong muốn.. Số với các hệ thẳng gân xuất vắcxin truyền thông

Trang 1

Lé Thi Thanh K20 Sinh hoc thuc nghiém

DAI HOC QUOC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

3

Lé Thi Thanh

THIET KE VECTOR CHUYEN GEN BIEU HIEN

KHANG NGUYEN VI RUT PRRS TRONG TE BAO THU VAT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội — 2013

Luận văn thạc sĩ 2011 — 2013 1

Trang 2

Lé Thi Thanh K20 Sinh hục thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lê Thị Thanh

THIET KE VECTOR CHUYEN GEN BIEU HIEN

KHANG NGUYEN VI RUT PRRS TRONG TE BAO THUC VAT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

T8 Nguyễn Tường Vân

PGS TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội — 2013

Tận vẫn thạc sĩ 2011 — 2013 2

Trang 3

Lé Thi Thanh K20 Sinh hục thực nghỉ

luc dau đỏ sẫm sau đó tim xanh Đặc trưng của bệnh là hiện tượng sAy thai ở lợn nái

đăng chữa hoặc các triệu chứng bệnh về đường hô hấp, đặc biệt là ở lơn cort cai sữa

Bệnh được phải hiện lần đầu tiên ở Hoa Kỳ năm 1987 Sau đó xuất hiện ö nhiều nước chăn nuôi lợn theo phương thức công nghiệp: Canada (1987), Nhật Ban (1989); Dức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Anh, Pháp (199L), Dan Mạch (1992)

Tử năm 1993, bệnh dõi gây ra các ỗ dịch lớn ở nhiễu nước khác thuộc Bắc Mỹ, châu

Âu và châu Á, gây tên thất lớn cho nghẻ chăn mudi lợn trên thế giới Ở Mỹ, thiệt hại

kinh tế (rực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong những năm gân đây là

lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ö lợn Ưúe tính hảng năm nước

Mỹ phất gảnh chịu những tên tắt do bệnh gây ra khoảng 560 triệu LL8D do việc tiêu

thuỷ lợn chết và lợn ốm, chỉ phí chẳng địch và xử lý môi trường,

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lẳn đu tiên vào năm 1997 trên đản lợn

thập từ Mỹ vúo các tỉnh phía Nam Tuy nhiên các dịch bệnh nặng chỉ được thông

báo vào dẫu năm 2007, lây lan khắp 17 tinh thánh, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Đến nay bệnh đã trở nên khó có thế kiểm soát được vả lây lan ngày cảng

Tổng hơn đo lập quán và hệ thống chữm nuôi heo phức tạp ổ Việt Nam

Đổ phòng chống bệnh lợn tai xanh, biện pháp vẫn được sử dụng là tiêm phòng vắcxin kết hợp các biện pháp thủ y Gần đây chí có một số lượng hạn chế các

vắcxin bắt hoạt và nhược độc cho bệnh lợn tại xanh sử đựng các chủng của châu Mỹ

hoặc châu Âu Tuy nhiên vắcxin đạng này có một số nhược diễm như vắcxm bất hoạt hiệu quá bảo vệ miễn dịch thường khô ng cao, còn vắcxin nhược độc tạo ra mức độ bảo vệ tốt đổi với các chủng tương đồng nhưng lại có nguy co phát triển

độc tính Irở bú Hiện nay trên thị rường Việt Nam cũng có høi loại vắcxin chẳng,

Trang 4

vắcxin tiêu đơn vị được sản xuât đựa trên hệ thông thực vật để tha protein kháng

Trguyên mong muốn Số với các hệ thẳng gân xuất vắcxin truyền thông, vẫcxin thực vật có nhiều wu diém như: dé dang tăng quy mỏ sản xuất và thủ sinh khối; các kháng nguyên biểu hiện trong thục vật ôn định ở nhiệt độ phòng nên dé bao quản và

sử đụng; có thể dùng qua dường miệng như ăn tươi (quả, lá) hoặc nu chỉn (hạt, cũ;

an toàn, đặc biệt vắcxim ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thông niêm

;nạc ruột hiệu quã hơn vắcxin tiêm

Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thục tiễn nói trên, chúng tôi đã tiền

thành để tài “Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện kháng nguyên vì rút PRRS trong

tế bảo thực vật”, được tài trợ từ dự án hợp tác quốc tế về KLI&CN theo nghị định

thư giữa hai nước Việt Nam — Vương Quốc Bì: “Nginiân cứu biểu hiện gen mã hóa

Glycoprotein v6 (GP5) ota virus g@y bệnh lợn tai xanh trong thuấc lá và đệu

tương” giai đoạn 2011-2013 Dê tài được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bảo

Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CK Việt Nam với mục

tid: i) Thiết kế vector chuyên gen nnã hóa cho một số kháng nguyên của vĩ rút PRRS vào tế bảo thực vat va ii) Đánh giá

Trang 5

CHUONG 1 - TONG QUAN TAI LIEU

1.1 HO] CHUNG ROT LOAN SINH SAN VA HO HAP G LON (PORCINE

REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME, PRRS)

1.1.1 Giới thiệu chung,

Hội chứng rồi loạn sinh sản vả hô hấp ở lợn (Poreine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vỉ rút gây ra, có

lan khả năng lây nhanh và có thể ghép với các loại mâm bệnh khác do đỏ lảm ôm va

chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh gây thiệt hại nặng nẻ cho ngành kinh tế [54, 59] Ổ

Việt Nam bệnh cẻn được gợi là bệnh “lợn tai xanh” do lợn mắc bệnh thường bị

xung huyết ở tai, tie dau dé sam sau dó tím xanh Đặc trưng của bệnh lả hiện tượng, say thai 6 lon nai đang chửa hoặc các triệu chúng bệnh vẻ đường hô hấp, đặc biệt là

ở lợn con cai sữa [61]

iệnh được mô tả lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào năm 1987 và ö châu Ân vào những năm 1990, dầu Liên là Đức, Pháp và Anh sau dé Jan wan khap châu Âu Năm

1998, bệnh được phát hiện ở châu Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc .}[7, 59]

Thời giản đầu da chưa xác định được nguyên nhân nên bệnh có nhiều tên gọi khác

nhau |59, 60:

+ _ Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease, MDS)

+_ Bệnh tai xanh (Blue Har Disease, BED)

® Hội chứng hô hấp vả sây thai ở lợn (Poreine Endemic Aborion &

Respiratory Syndrome, PIARS)

* Tl6i chúng hô hấp và vô sinh 6 Ion (Swine Infertility & Respiratory

Syndrome, STRS)

Nam 1992, trong hội nghị quốc tế về sức khée gia ste, Tổ chức Thủ y thể

giới (OIE) đã nhất trí đất tên cho căn bệnh này là “H ôi chứng rối loạn sinh sẵn và

hé hap 6 lon” (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) [7] Ké tu

đó, tên này đã trở thành tên gợi chính thức của bệnh

Trang 6

Lê Thị Thanh K20 Sinh học thực nghiệm

_—— F-==

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ

Đến nay, bệnh đã bùng phát và lây lan khắp các tỉnh thành trên cả nước [28]

1.1.2 Triệu chứng bệnh

Bệnh cỏ thể xảy ra ở tắt cả các lửa tuôi và thường biểu hiện ở hai trạng thải:

sinh san va hé hap [28, 61, 62]:

* R6i loạn sinh sản: tăng số lượng lợn con sinh ra bị ch ết hoặc chết trong bảo thai (25-35%), lợn con sinh non chiếm 10% đồng thời chứng biếng ăn, tắt sữa ở

lợn nải nuôi con làm tăng thêm tỉ lệ lợn con chết trước cai sữa

* Roi loạn hô hấp: lợn thở dốc, thở dồn dập, khi kiểm tra mô phỏi cho thấy

viêm phôi, hoại tử phôi rất năng

1.2 VIRUT GAY BENH LON TAI XANH

Năm 1991 Viện Thú y Lelystad, Hà Lan đã phân lập được vi rút gây bệnh

lợn tai xanh, sau đỏ là Mỹ, Đức [59, 61] Đền nay, các thông tin về loại vị rút nảy

đã được nghiên cửu khá rõ Bệnh lợn tai xanh gây ra bởi vi rút PRRS thuộc chỉ

Arterivirus, ho Arteriviridae, b6 Nidovirales, cé genom la ARN soi don dương [18]

1.2.1 Đặc điểm hình thái

PRRSV là vi rút hình cầu, cỏ vỏ bọc ngoài với đường kinh virion vào khoảng,

45 — 55 nm, nueleocapsid cỏ đường kính từ 30 — 35 nm Đồng thời, PRRSV là vi rút

ARN, có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dương, mang những đặc diem chung

Trang 7

_—— F-==

Hệ gen của vi rút PRRS là ARN sợi đơn đương, có kích thước khoảng 15 kb

và chứa 9 khung doc mé (ORF - open reading frame): 1a, 1b, 2:

'b và 3-7 Trong,

đó ORFla và Ib mã hóa cho các protein phi cau tric nhu replicase, polymerase

tham gia vào quả trình nhân bản của vi rút Các ORE 2-7 mã hỏa cho 6 protein cầu

trúc bao gém 4 phan tir glycoprotein (GP2, GP3, GP4, E), 1 phan tử protein mạng

lưới (M) và 1 protein vỏ nhân vi rút (N) [18] (Hinh 1.2)

: Structural Protein 30~40 KD

: Envelope Protein = GPS (ORFS) 24-26 KD

: Membrane Protein 18~ 19 KD

: Nucleocapside Protein

15 KD

Hình 1.2 Mô hình câu trúc hệ gen của vi rút PRRS [61]

Dựa vào phân tích cầu trúc gen người ta xác tính được 2 nhóm vi nit PRRS: nhóm I gồm các vi rút thuộc chủng châu Âu (tên gọi phỏ thông là vi rút Lelystad)

gồm 4 phân nhóm (subtype) đã được xác định Nhóm II gồm các vi rút thuộc chủng

Bắc Mỹ (với tên gọi là VR-2332) [18, 62] Gàn đây, một biến thể của nhóm II cỏ

lên gây nhiêu tồn thất ở châu A [28, 61] Mặc dù đôi khi triệu chứng gây bệnh trên hai nhóm PRRSV có nhiều nét chung, nhưng các nghiên

độc lực cao hơn đã xuất

cứu cho thấy giữa hai nhóm có sự khác biệt lớn ve bộ gen (mức độ tương dong chỉ

55-8094), đặc tính gây đáp ứng miễn dịch cũng như độc lực vì rút [7, 42] Điều này

cỏ nghĩa là vắcxin được làm từ một chủng PRRSV sẽ không thể bảo vệ hoàn toàn cho đàn lợn

Luận văn thạc sĩ 2011 — 2013 ⁄Ỹ

Trang 8

Người ta đã chừng mình rằng có sự biển dị đi truyền mạnh trong cả 2 nhỏm phan lập, được khẳng định qua phan tich tinh ty nucleotide va axit amin của các

khung đọc mở (ORFs).Tương đồng vé trinh tr axit amin của VR-2332 so voi LV 1a

76% (ORE2), 72% (ORE3), 80% (ORF va 5), 91% (ORF6) va 74% (ORE7) [7, 54]

Phân tích trình tự cho thấy các vị rút dang tiến hoá Giải trình tự một phần hoặc tmg gen riêng biệt, hoặc toàn bộ hệ gen, đặc biệt là vùng gen chức năng vả

câu trúc (mã hóa cho GP2, 3, 4, E, M, N) cho thấy tiền hoá của các chúng vĩ rút là

do đột biển ngẫu nhiên và tải tổ hợp trong, các gen Vì dụ gen zz có độ dài 522 bp ở rhớm LV và 525 bp ở nhóm VR-2332 [9, 5⁄1]

Ngoài ra, trong một nhóm PRESV cũng có sự khác nhau giữa các phân nhỏm Ví dự Tổng độ dải hộ gen của chủng vị rút nhóm VR-2332 phên lập ti Mỹ

(số đăng ký: AY150564) là 15451 bp, trong đó phần mã hoá cho 7 khung đọc mở là

15071 bp Trong khi hệ gen của vi rút PRRS chủng GD (Quảng Dâng) (số đăng ký: TEU109503) đại điên cho ruột nhóm PRRS tới phân lập gắn đây có độc lực rất cao

ở Trung Quốc, cũng thuộc nhỏm VR-232 lại có độ dài là 15353 bp, trong đỏ phân

mã hoá cho 7 khung đọc mỏ là 14981 bp [26, 28, 5⁄1]

Về mặt độc lực, vi rút gây Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

PRRSV lên tại dưới 2 dạng: dạng cỗ điển có độc hựo thấp, ö dạng nảy khi km mắc

bệnh thì có tý lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tong dan va dang biến thể độc lực cao gây nhiễm vả chết nhiều lợn [54]

1.2.3 Cơ chế phát sinh bệnh

Dén nay co chế gây bệnh của PRRSV vẫn chưa được hiểu rẽ ràng Các phiên cứu chỉ thây rằng vi rút PERSV có ái lực đặc biệt với đại thực bảo, đặc biệt

là đại thực bảo phỏi,

mang nhay [54, 60] Sau khi xâm nhập, vi rút sẽ sao chép bền trong đại thực bảo

gay tốn thương đáp ứng miễn dịch tế bào, phá hủy các bễ mặt

Trang 9

Lé Thi Thanh K20 Sinh học thực nghiệm

———————ễ———————

thực bảo của các mô, tế bảo khác bao gồm cả mỏ cơ [54, 60] Hình 1.3 cho thay su

thay đổi hình thái của đại thực bảo trước vả sau khi nhiềm PRRSV

Hình 1.3: Hình thái của đại thực bảo khi bị nhiễm PRRSV A: đại thực bào bình

thường; B: đại thực bảo bị phả hủy [54]

Một khi hơn 40% đại thực bảo bị phả hủy, PRRSV hâu như đã loại bỏ hệ

thống bảo vệ

tủa cơ thể [54] Điều nảy tạo điều kiện thuận lợi cho những ví khuẩn

và vi rút khác gây bệnh Điển hình của trường hợp nảy là sự gia tăng nghiêm trọng

viêm phỏi Ngoài ra, lợn mắc bênh PRRS thưởng bị bôi nhiễm với các bệnh như dịch tả lợn, tu huyết trùng, phó thương bản, bệnh đo xoắn khuan Leptospira spp,

bệnh do Steptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân chính gây chết nhiều ở lơn mắc bệnh PRRS [7, 18, 54]

1.2.4 Đặc tính sinh miễn dịch

Trong những nghiên cứu phát triển văcxin chồng lại PRRSV đã được ghi

nhận trong hai thập kỷ qua, việc thiết kế vắcxin tiểu đơn vị, việc tạo ra đáp ứng

miễn dịch tế bảo và dịch thể là đặc biệt quan trọng vì e ả hai cơ chế nảy đều liên quan đến việc bảo vệ chồng lại vi rút Trong quá trình lây nhiễm, lợn thường sản

xuất kháng thể đặc hiệu đối với protein N Mặc dù protein N 1a protein cau trie phd

bien nhất vả cỏ tỉnh kháng nguyên cao „ nhưng môi liên quan giữa kháng th ẻ kháng

protein nảy với đáp ứng mién dich bao vé lai khéng chat ché , Vi the protein N chi

dùng để chuân đoán sự cỏ mặt của PRRSV mà không dùng laniiexin tiéu don vi [15]

Trong thành phản câu tao của vi rút PRRS, cả 6 phân tử protein cầu trúc đều

cỏ khả năng trung hoà kháng thẻ (bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein

Trang 10

sang (M) va 1 protein vé nhân virut (N)) nhưng hoạt dộng trung hoà chí xảy ra xuạnh với các protein GPS, M và GP3 [18, 19, 23, 26, 54] Do vậy, các protein này Thường được ding như mục tiêu bàng đâu để thiết kế vắcxin tiểu đơn vị chẳng lại sr xâm nhiễm của PRRSV GP5 được biết như yêu tổ kích thích vị ệc sản sinh khang

thể trung hỏa ở lợn và đây là một vẫn đẻ then chốt của miễn dịch dịch thế [L9, 23, 39]

Tuy nhiêu, các nghiên cứu cho thấy GP5 luôn luôn liệt kết với protem mạng lưới MI

132, 34, 55], Bên cạnh dó , người ta cũng tìm thấy g]ycoprotern vỏ GP 3 trong các znánh vỡ cũng rihư các tế bào bị nhiễm vi rút, loại protein này cũng kích thích sinh

xa kháng thể trung hòa ở mức cao [54]

1.3 TÌNH HINH RENH LON TẠI XANH TREK THẺ GIỚI VÀ Ở VIET NAM 1.3.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh trêu thế giới

Mặc đủ giữa những năm 1980 đã có những báo cáo vẻ bệnh song vẫn chưa xác định được nguyên nhàn gây bệnh Năm 1987 bệnh được phi nhận ở À

những triệu chứng lâm sảng về sinh sản kết hợp với hồ hấp Năm 1990 hội chứng

tương tự đã xuất hiện tại châu Âu, đầu tiên là Đức, Pháp và Anh sau đó lan tràn khắp châu Âu |6], 62|

Đến năm 1992, bệnh đã gây ra các ê dịch lớn ở nhiều nước khác thuộc Đắc

Mỹ, châu Âu và chau A gay tốn thất lớn về kinh tê cho nghề chăn nuôi lợn trên thể

giới |61, 63| Từ năm 2005 trở lại đây

37 mước và vùng lãnh thô thuộc lắt gã

chau luc trén thé giới dã báo cảo cho Tổ chức Thủ y thể giới khẳng dinh phát hiện

có bệnh lợn tai xanh lưu hành [59, 62] liiện nay, hội chúng này đã trở thành dịch

địa phương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chắn nuôi lợn phải triển như Mỹ, Ha Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức và đã gây ra những tổn thất rất

lớn về kinh tế cho người chin mudi lén dén hàng trăm triệu đô la [59] Ở Mỹ, người

ta di đánh giá thiệt hại kính tế (rực tiếp và gián tiếp) của bệnh lợn tai xanh trong, những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại đo các bệnh khác gây ra ở lợn Lióc tinh hàng năm nước Mỳ phải gánh chịu những tốn tất do bệnh gây ra khoảng 560 triệu USD do việc tiéu huỷ lợn chết và lợn ốm, chỉ phí chống dịch và xú lý môi

Trang 11

trường [59, 62| Ở Đức, trong năm đầu tiên của dịch bệnh khoáng 2 triệu lợn dã bị chết [59, 62] Các nước ở châu A có tỷ lệ bệnh lợn tai xanh hưu hành rất cao, ví đụ:

ð Trng Quốc là 80%, Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine 14 90%, That Tan là

97%, Malaysia là 949% va Han Quéc la 67,4% - 73,1% [59]

Tại Trung Quốc, theo bảo cáo của doàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia cửa

Trung Quốc đã được phát hành vào tháng 12/2007 cho thay kế từ nấm 2006, đàn

lơn của Trưng Quốc đã bị ảnh hưởng nghiềm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn"

do nhiều nguyên nhân, trong dỏ chủ yếu là vi rút PRRS và các loại màm bệnh này

đã làm bàng triệu lợn bị ếm, chết và phải tiêu hủy [28] Kết quả nghiên cứu toàn điện của Trung Quốc đã khẳng định chủng vị rút PRRS gây bệnh tại nước này là chúng độc lục cao, đặc biệt có sự biến đỗi của vị rút (thiểu họt 30 axit amin trong,

gen vùng NSP2) [28] Năm 2007, cáo tỉnh Anhui, Ilunan, Guangdong, Shandong,

Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hưởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu thủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan [28] Trước diễn biến phúc tạp của

dich lon tai xanh, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chương trình phòng

chống hệnh rất quy mô, riêng chương trình nghiên cứu, sản xuất vắc xin đã được cam kết chỉ khoáng 280 triệu Nhân dân tệ tương đương với 36,5 triệu USD [28, 3⁄1]

Tại Iléng Kéng và Dài Loan cũng đã xác định có cả hai chủng Châu Au va

Bắc Mỹ cùng lưu hành, đặc biệt treng củng một cen lợn ở Hồng Kông đã phát hiện

nhiểm cả hai chứng nêu trén [28] Dich lon tai xanh cũng dược thông bảo ở Thái Lan tu cae năm 2000 2007 [59] Các báo cáo cho thấy vị rút gây bệnh lợn tại xanh:

được phân lập từ nhiều địa phương thuộc rước này gồm cả chủng dong châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ Trong dỏ số vị rút thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, các vị rút thuộc chủng dòng lắc Mỹ chiếm 33,58% [59]

Phần lớn ở những quốc gia nảy hiện còn đang lưu hành vị rút gây bệnh lợn

tai xanh chủng chân Âu hoặc Bắc Mỹ là những chủng vi rút có điển độc lực thắp

126, 28] Thang 9/2007, Nga đã bảo cáo chính thức có dịch lợn tai xanh do chủng vĩ

rút PRRS thể độc lục cao gây ra [59]

Trang 12

Như vậy, có thể khẳng dịnh rằng Hội chứng rồi loạn sinh sản va hé hap ở lợn

là một trong những nguyễn nhân chính gầy ra nhiều tân thất nặng nễ cho ngành chăn nuôi lợn của nhiền quốc gia trên thể giới

lật Nam

1.3.2 Tỉnh hình bệnh lợn tai xanh ở

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào nắm 1997 trên đản lợn

nhập từ Mỹ vào các tĩnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dương tinh

với PRRS và cá đán được tiêu hủy ngay sau đó [28] Tuy nhiên từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa phát hiện các ở dich lam sang trén din ton Việc xây

ra các ö dịch lần dâu ở các tính phía Bắc có liên quan dén tinh hình dịch ở các nước láng giéng Theo théng báo của các lỗ chức quốc tế, trong năm 2006, dich xây ra nghiêm ong ở một số rước trong khu vực |59, 63J Từ tháng 3/2007, bệnh xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phương, gây tên thất lớn về kinh tế cho người

chăn nuôi, cụ thể như sau:

* Năm 2007: địch đã xuất hiện tại 32⁄4 xã, thuộc 65 huyện của 18 tỉnh, thành phó

tiêu huỹ là 20.366 con [1]

Tổng sé lon mắc bệnh là 70.577 con, số lợn chết và phâi

+ Năm 2008: địch xuất hiện lại 956 xã, phường, thuộc 103 huyện của 26 tỉnh,

thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ

là 300.906 con [2]

* Năm 2009: dịch xây ra ở 69 xã thuộc 26 huyện cửa 13 tính, thánh phố:

Tre, Bình Dương, Đẳng Nai, Tiểu Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc

Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Ba Rịa - Ving Tau va Dak Lak với 7.030

lợn mắc bệnh và 5.84? lợn buộc phải tiêu huỷ [3]

Trang 13

* Năm 2011: dịch lợn tai xanh xãy ra hai dợt, tuy nhiên số ô địch cũng nÏưư số lợn mắc bệnh, số lợn bị tiên hủy giảm rất nhiều (gân 20 lần cä về phạm ví, quy mnô địch và số lượng gia súc phâi tiên hủy) so với năm 2010 [5] Cu the:

1 Đợt 1: Tổng số lợi mắc bệnh là 14.759 cơn trong đó có 1.468 con lon mai, 5.346 con lon thit va 7.665 cen lon con; tông số lợn phải tiểu hủy lá 14.158 con

trong đó 1.373 con lợn nải, 4.850 con lợn thịt và 7.581 con lợn sen [5]

Bang 1.1 Thông kế tỉnh hình dịch lợn trả xanh tại Việt Nam năm 2067-2012 [1, 3, 3,4, 5, 6]

Trang 14

vũng nồng thôn, nơi người đân phải sông chủ yêu đựa vào chăn nuôi lợn

1.4 PHÒNG CHONG VA DIEU TRI BENH LON TAI XANHL

Trước những điễn biến phúc lạp và thiệt hại to lớn mà Hội chứng rỗi loạn sinh sản và hồ hắp dã gây ra trên dán lợn của nhiều quốc gia trên thế giới, cho dễn nay nhiều vẫn để liên quan đến địch bệnh này đã được nghiên cửu và đần sáng tỏ Đặc biết là các vẫn dé vé nguyên nhậu, cơ chế gây bệnh, triệu chứng, bệnh tích và các phương pháp chin đoản, phòng ngửa dịch bệnh Các biện pháp không ché bénh

đã được ap đụng ở nhiều nước nhưng vẫn chưa đem lại hiệu quả như mong muốn Một sẽ nước phát triển có ngành chăn nuôi lơn công nghiệp với quy mô lớn, áp dụng kỹ thuật tiên tiến kiểm soát chặt chế con giống và có chương trình không chế

để thanh toán bệnh lợn tai xanh, kết quả là đã hạn chế được thiệt hại sau hàng thập

kỹ, nhưng bệnh vẫn tôn tại và lmu hành trong các đến lợn, gây nhiều thiệt hại về kinh tế [S4]

Tiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh lợn tai xanh, mả đề hạn chế thiệt hai

đo bệnh thường sử dụng một số thuốc kháng sinh như: Tylosin, Enrofloxacine nhằm điển trị các bệnh kế phát và tặng cường sức để kháng cho lợn bằng các loại thuốc trợ lực (B.comlex, vitamin ) kết hợp các thuốc điều trị triệu chứng như hạ

sối, chống ïa chải „ ho, viêm phối [6L] Tay nhiên hiệu quả đạt đuợc không cao

Do dó, phương pháp phòng bệnh được đặt lên hàng dâu, Để phòng chống bệnh lợn tai xanh độc lực cao, biện pháp vẫn được sử đụng lả tiêm phòng väcxin kết hợp các biện pháp thú y Gần đây chỉ có một số lượng hạn chế các vắcxin bất hoại và nhược độc cho bệnh lợn tai xanh sử dụng các chủng của châu Mỹ hoặc châu Âu Vắcxui đạng này có một số nhược điểm như vắcxin bắt hoạt hiệu quả bảo vệ miễn dịch thưởng không cao, côn vắcxin nhược độc tạoram ức độ bảo vệ tết đối với các chủng tương đồng nhưng lại có nguy cơ phát triển độc tính trở lại [18, 21, 24, 3#]

Trang 15

vắcxin chống vi rút PRRS độc lực cao [18], tuy nhiên họ vẫn chưa có giấy phép để

xuất khẩu loại vắcxin trên

1.5 VĂCXIN THỰC VẤT -THẾ HỆ Vị

CXIN MỚI 1.5.1 Ưu điểm của vắcxin thực vật

Việc sản xuất protein tái tố hợp trên quy mê lén đựa trên những ứng dựng của công nghệ sinh học dã tạo nên cuộc cách mạng trong việc phỏng và chống bệnh: trên người và động vật Một hệ thông biểu hiện protein hiệu quả và rẻ tiên vẫn dang

là mỗi quan tâm của các nhà nghiên cứu và sẵn xuất Hệ thêng biếu hiện trong thực vật đang được phát triển nhằm thay thể hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật hay

vi sinh vật đo c@ nhiéu uu thé vé giá thành, chất hượng protein cũng như quy mô sản

xuất Cụ thể nụ san [18, 25, 38]

au dịch ruã như

+ Tế bào thực vật có khả năng tiên hành quá trình biến đi

các sinh vật nhân chuẩn bậc cao, dâm bảo vắcxi có hoạt tính đói với

Thực chất vắcxm thực vật là vắcxin tiểu dơm vị, dược sân xuất đựa én he

thông thực vật để thu protein kháng nguyễn mong muốn Dây lả một xu thẻ phát

triển mới của công nghệ sinh học Nhiéu gen m4 hoa cho các kháng nguyên vì khuản, vi rút đã dược chuyển vào thực vật và biểu hiện với hiệu quả cao Các thực

vật chuyến gen hiểu hiện kháng nguyên quan tâm được sử dụng trực tiếp làm vaexin

Trang 16

dé dang bao quan va st: dung

+ Có thể dùng qua đường nriệng như ấn tươi (quả, 14), nấu chín (hại, củ)

+ Án toàn: vì vắcxim được sẵn xuất trong thực vật là vắcxin liễu đơn vị, có

khả năng gây dap ứng miễn địch mà không cần dén toàn bộ hệ gen của vị rút như vắcxin giảm độc lực hay bắt hoạt Do đó, vắcxin dạng này không thế gây b ệnh cho người và động vật, đồng thời cũng tránh được nguy cơ nhiễm rnâm bệnh khác như vắcxin sẵn xuất trong té bao déng vat

* “Vexin ăn dược” kích thích sản xuất kháng thể của hệ thông niềm mạc ruột hiệu quả hơn vắcxin tiêm Trong thực tế, hầu hết các vỉ sinh vật gây bệnh đêu xâm nhập vào co thé qua lớp mảng nhảy của đường tiêu hóa, hé hap và đường tiết

xiệu, Đây là những rơi L ấp trung các mô có kh ä năng dáp ứng xuiễn địch tôi nhất

của cơ thẻ, như là hàng rào bảo vệ đầu tiền chẳng lại những vi sinh vật đó

Phát triển vắcxim trong thực vật đánh dẫu một bước ngoặt quan trọng trên

ăn,

vắoxin dựa vào nguồn nguyên liệu 6

cơn đường tìm ra phương thức san xu

rẻ tiên và diều này rất có ý nghĩa đối với các nước dang phát triển Rất nhiều quy

\cxin trong thực vật đã được hính thánh như dừng thực vật chuyển gen, thực vật mang lục lạp chuyển gen, daze vài chuyển gen tạm thời, thực vật

trình sản xuất

nhiễm vi rủi vả nuôi cấy tế bao thực vật [LB] Trong quả trình sản xuất vắcxin thực vật, cáo cây trông cho củ, hạt vả quả làm thức ăn cho người và động vật thường được chọn để biêu hiện vắcxin vì đễ sử đụng và bảo quân Bénh cạnh việc

†ạo cây trồng biến đổi gen thì việc sẵn xuất vắcxin trong tế bảo thục vật được nuôi

cay in vitro cing có nhiều hửa hẹn và có ưu điểm hon so với việc sử đụng cây trồng,

ngoai Lự nhiên như khả năng tạo ra các chất với độ an toàn sinh học cao, ôn định,

không phụ thuộc mùa vụ, điều kiện môi trường và không có nguy cơ nhiễm bệnh từ

bên ngoài [18]

Trang 17

Nuôi cây té bao cô nhiều dang khác nhau nÏt nuối cây rễ phụ, khối mồ chối,

tế bảo cố định và tế bảo huyền phủ Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi sẽ chỉ tập trung vào cãi tao va phat triển kỹ thuật nuôi cây tế bào dang huyén pha vi dang nuôi cấy này có tình khá thì cao nhất trong việc tạo ra quy trình sin xuất có thẻ điều

khién được và việc chuyền lên quy mỗ lớn có thể tiền hành tương đôi đễ đàng,

Trong nhiều trường hợp, việc sản xuất vắcxin thực vật gặp phải trở ngại lớn

Idi phai déi mặt với hiện tượng dung nạp đường miệng, Tức lả bệ miễn dịch màng

nhây của đường tiêu hóa được thiết kê không gây đáp ứng miễn địch với thức ăn nó

tiếp xúc hàng ngày Như vậy, một số loại kháng sinh thực vật sau khi vào đường,

tiêu hóa sẽ không dược hệ miễn dich mang nhảy nhận ra nên "lờ đi", Ngược lại, một

số "thức ăn" lạ có thể gây phân từng tức thời hoặc lâu đài ảo đùng nạp đường miệng không lồn lại với chúng, LTB (L.abile Toxm B subunit - độc tổ không chịu nhiệt của

vị khuẩn E cøfi) thường gây đáp ứng miễn dịch với cơ thể ở mức cao Chính vì vậy,

ching thường được sử đụng làm tá chất cho việc chuyển tải kháng nguyên qua

đường miệng |20, 31, 37|

1.8.2 Sử dụng LỄ bào thuất lá siêu sinh trưởng BY — 2 làm hệ thống biểu hiện

TẾ bảo huyền phù đã được tạo ra từ nhiều loài thực vật khác nhau nhữ

Arabidopsis thaliana, Taxus cuspidate, Catharanthus roseus va cac cay tréng quan

trọng khác như thuốc lá, cỏ ba lá, lúa, cà chua và đậu tuong .[18] Tuy nhiên, trong nghiên cửu nay chúng Lôi sử dụng đòng tế bảo thuốc lá BY-2 làm hệ thông

biểu hiện 'Tế bảo thuốc lá BY-2 la dong tế bào siêu sinh trưởng, được các nhả khoa

học Nhật Bản chọn lọc từ môi cay mé lối của thân cây thuốc lá Micotiama tabacun

L ev Bright Yellow No 2 vào năm 1968 BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất

và n định trên môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiễn với tốc độ nhân dong khoảng

100 lần trong vòng một tuần Một đặc điểm tư việt khác nữa là BY-2 đập ứng lốt với quy tinh chuyén gen bing vi khuan Agrobacterium [18] Do vậy, tế bảo BY-2

là dòng tế bào thực vật đang được dùng rộng rãi nhất cho việc sẵn xuất nhiều loại protein tai t6 hop

Trang 18

Lé Thi Thanh K20 Sinh học thực nghiệm

———————ễ——————— 1.6 CHUYEN GEN VAO THUC VAT THONG QUA VI KHUAN Agrobacterium

tumefaciens [12, 17]

Các vi khuẩn dat 4 tumefaciens và một số loài họ hàng của chúng cỏ khả năng chuyển một phần nhỏ ADN vảo tế bảo thực vật, qua đỏ kích thích tạo khối u

Khoi u tao thanh 1a khong gian sông, đồng thời là nơi tổng hợp một số chất đình

dưỡng có lợi cho vi khuẩn (opine) Nhu vay, 4 tumefaciens da thue hién “ky thuat

gen” véi muc dich tao ra “cay bien doi” gen có lợi cho nó Kha năng chuyên ADN

ciia A tumefaciens dude img dung trong céng nghệ gen hiện đại [12, 17]

Viée sit dung 4 tumefaciens bat dau tir nam 1970, khi ngudi ta phat hién vi

khuan nay co kha nang tao nén khoi u 6 cay hai la mam bị thương, được goi là khối

u cổ rễ (Hinh 1.4) Trong các chủng A tumefaciens tao khéi u co mét plasmid rat

lớn với kích thước khoang 200-800 kb Tir nhimg thi nghiém trén nhig ching A

tumefaciens khong déc (khéng cé plasmid nay), ngudi ta da khang dinh plasmid nói

trên là cần thiết cho việc tạo khỏi u Do vậy, chúng được goi la Ti-plasmid (tumor

inducing-plasmid) [12, 17]

Hình 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium œønefaciens và Khối ta: Ví khuẩn A

tumefaciens doi kinh hién vi điện tử; b: Khôi u ở cây vá từ khối ú này xuất hiền chồi một

cách tự nhiên [12]

Ti-Plasmid gồm bổn vùng A, B, C,D Trong đỏ, vùng A luôn luôn được

chuyển sang tế bảo thực vật nên có tên là T-DNA (Transfered DNA) T-DNA mang

2 hệ gen: Một hệ gen gây khối u cho thực vật có chửa ít nhất 3 gen tổng hợp các

phytohormone là auxin và eytokimin, đo đó có liên quan đền việc tạo ra và duy tri su

Trang 19

_—— F-==

phân chia tế bảo liên tục không phụ thuộc vào sự sinh trưởng của cây; hệ gen thứ hai

mã hỏa cho một số enzyme điều khiển tổng hợp các dân xuất của amino acid hay

đường gọi lả opine Vùng B là vùng tải bản mang điểm khởi đầu sao chép (oriT)

Vùng C liên quan đền sự tiếp hợp Vùng D cé tén goi la ving déc (virulence region)

cỏ chứa các gen vử, giữ vai trỏ quan trọng trong việc chuyên T-DNA vảo hệ gen

nhân của tế bảo thực vật Ngoài ra, môi Ti-plasmid còn chứa các gen nằm ngoải vùng, T-DNA mã hỏa cho các enzyme phân giải opine cung cấp nguồn carbon và nitơ cho

Region Origin of

Replication (ORI)

Hình 1.5 Sơ đỏ câu trúc Ti-plasmid [12]

Vùng T-DNA cỏ kich thước khoảng 10 kb ~ 20 kb, nằm giữa 2 trình tự lặp lại gồm 25 bp gọi là bờ trái (left border ~ LB) và bờ phải (right border — RB) LB va

RB là những yeu to can thiết để định hướng cho sự chuyên ADN Sư mắt đi 6 bp đầu tiên hoặc 10 bp cuối củng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyên của T-DNA

Quả trình chuyên T-DNA bắt đầu từ vị tri RB vả kết thúc ở vị trí LB Sự định

hướng nảy rất quan trọng, nêu thiêu yêu tỏ này việc chuyên gen sẽ không xảy ra

hoặc không hiệu quả

Hoạt động của vũng vi đóng vai trỏ quan trọng cho viée chuyén T-DNA sang tẻ bảo thực vật Vùng này có kích thước khoảng 40 kb và bao gồm 6 operon:

cac virA, B, D va G cản thiết cho việc tạo độc tính; con vir C va E lién quan đến

việc tạo thành khéi u Nhin chung, gen virA biểu hiện ở mọi điều kiên; gen virC

biểu hiện ở khắp các tế bảo sinh dưỡng nhưng biều hiện mạnh ở dịch chiết từ các

Trang 20

thương vừa có tác dụng dẫn dụ vi khuân xâm nhập, lại có vai trỏ như một chất kích

thoại vùng gen vữ thuộc Ti-plasid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (lại vùng bờ trải và bờ phải) để gắn vào lệ gen thực vật

Ý nghĩa của gen vử trong quá trinh chuyên gen dược giải thích như sau: Gen vữ-4 mã hóa cho một protein màng, là chất nhận hợp chất phenol ở tế bảo cây bị thương Sự nhận biết chất này din đến sự hoại hỏa sân phân gen vừŒ, đến lượt nó lại kích thích sự sao chép và sự biêu hiện của tắt cá gen vờ Sự hoạt hỏa của protein thuộc gen ưưG có thể do sự vận chuyển những nhỏm phosphate IĨai protein được

mã hóa từ gon virD2 va virE2 quan trọng dối với việc chuyển T-DNA Protein

virD2 là một endonuelease, cắt sợi đơn đặc hiệu ở bờ phái va trai ciia T-DNA,

Protein virE2 gắn lập tức vào sợi đơn và ngăn cán sự găn lại với Ti-plasmid (Hình

1.6) Sau đó, bằng cơ chế tổng hợp sửa chữa DNA, từ sợi đơn con lai trong Ti- plasmid xuất hiện lại một T-DNA hoan chính Ngoài ra, một protein virD2 gắn vac đầu 5` của T-DNA sợi đơn đã được cắt ra bằng liên kết đẳng hóa trị Bằng cách này

tao ra mdi phic he DNA-protein va được chuyển vào tế bảo thực vật Cơ chỉ

quả trình này vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là L1 protein được mã hóa từ gen

vữ tạo nên một lễ héng, qua 16 nay phức hệ DNA-protein được vận chuyển vào

thực vật Khu đến tế bảo thực vật phức hệ này di vào nhân tế bào, Protem viD2 và virH2 chứa trình tự định vị nhân đặc hiệu cho pháp phức hệ đi qua màng nhân và

gắn vào DMA thực

một cách ngẫu nhiên ở những chỗ gãy trên sợi của DNA của

tế bảo tưực vật Tuy nhiên, vị trí tái tổ hợp được quan sát là đặc hiệu, bao gồm

Trang 21

Hình 1.6 Sơ 46 minh họa quả trình di chuyển T-DNA cia Ti-plasmid 1: T-DNA

với bờ phải và bờ trái được chẻn vào Ti-plasmid; 2: Sợi đơn được cắt ra nhờ protein được

mã hóa bởi gen vwÐ2, 3: Sợi đơn của T-DNA được giải phóng và kết hợp với protein do virD2 va virE2 ma hoa, ché diit ở sợi đơn thứ hai được tổng hợp bồ sung; 4: Lập đầy chỗ trồng trong Ti-plasmid (đường gạch nỗi đâm) Sợi T-DNA tư đo được vận chuyển vào tể bào thực vật ở dang phức hệ DNA-protein [12]

Tir nhig phan tich trén cé the thay Agrobacterium tumefaciens la mét hé

thong chuyên gen tự nhiên Tuy nhiên, quả trình này không thích hợp cho việc ứng

dụng trong công nghệ gen vì những nguyên nhân sau [12, 17]

~ Do tạo khối u nên không thẻ tái sinh được cây hoàn chỉnh và khỏe mạnh từ

tế bảo biến nạp gen

~ Sự tổng hợp opine lả không mong muôn vi cây tiêu tốn năng lượng không

Trang 22

_—— F-==

Khắc phục những khỏ khăn trên, các nhà khoa học đã thảnh công trong việc

sửa đổi Ti-plasmid va T-DNA de các phytohormone không được tạo nên Trong những bước tiếp theo gen tổng hợp opine được cắt ra và thay thế bằng những gen

chi thi, vi du: gen khang kanamycin [12, 17, 18] Ngảy nay, người ta sử dụng hệ

thống được gọi là vector hai nguồn (binary vector), trong đỏ chức năng của Ti-

plasmid được thực hiện qua hai plasmid Plasmid lon mang ving vir va plasmid nhé

mang bờ trải và phải của T-DNA Đây là những vùng của T-DNA duy nhất cân

thiết cho việc vận chuyên gen vảo thực vật Giữa bờ phải và trải một gen chọn lọc

và những gen lạ được chèn vào [12] Sơ đồ cầu tạo của một vector hai nguồn được

minh họa trên hình 1.7 Ưu điểm của veetor nảy là các thao tác chỉ thực hiện với

plasmid nhỏ Tất cả những công việc tao dong, dua DNA la có thể thực hiện trong những tế bảo # eoli, còn plasmid lớn đã hoàn thiện và được chuyển vảo A

tumefaciens Cac mé can bien nap duge ti voi vi khuan A tumefaciens, sau dé vi

khuẩn được loại bỏ và mô tái sinh thành cây hoàn chỉnh [12 17]

Tepnsmid \ Không cT-DNA |)

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa hệ thông vector hai nguồn biển nạp gen vào tế bảo thực

vật bằng vĩ khuẩn 41 ømeƒueiens Các gen tạo khối u và tổng hợp nopalin được loại ra, T- DNA mang một gen đảnh dâu để chọn lọc trong thực vật Các gen khác được chèn vào 4.t ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong A mmefaciens, E.c øri: Khởi đầu sao chép để

Trang 23

nhân Jén trong ¥ coli, Km: gen khang kanamycin dé chon loc trong # coli va 1

tumefaciens; P|, P2: Promoter, 7], T2: Terminator, vir: Ving vir [12]

1.7 THUỲ KÚ VUCLOR CHUYỂN GIN THỤC VẬT BẰNG KỸ THUẬT

GATEWAY

Các veclor chuyển gen thực vật thường có kích thước rất lớn (1 8 — 15 kb)

‘béi ngoài các thành phần cơ bản của một vector tái tổ hợp như tâm tải bản, vị trí đa điểm của eryme giới lựn, gen chợn lọc/chỉ lhủ , vector chuyển gen can mang mot

số trình tự giúp cho sự chuyên, biểu hiện của gen cân chuyên trong hệ gen của tế bảo

vật chủ Ví dụ: trình tự khỏi động(prometer), trình tư tăng cường (enhanoer),

‘Trude đây, quá trinh thiét ké vector chuyển gen thường sử dụng phương pháp kinh điển thông qua phân ứng cắt ADN nhờ ca⁄yrne giới han sau đồ nối ADN nhờ enzyme nói AIDN ligase Tuy nhiên phương pháp nảy tổn tại một số nhược

điệm sau:

- De vector chuyên gen thực vật có kích thước rất lớn nên việc tìm ra vị trí nhận biết đơn (single recognition siđes — SRS) của một loại enzyme giới hạn đề cắt đồng thời vector và đoạn gen quan tam thường rất khó Như chúng ta da biét, ADN

chứa 4 loại nucleetide A, T, G, C Theo quy luật xác suất thông kê, tỷ lệ 6

nucleotide bất kì thuộc 4 loại nueleotide mày sắp xếp một cách ngẫu nhiên là 1⁄45

(tức 1/4096) Như vậy, cử 4069 bp sẽ bắt gặp một trình tự lắp lai gém 6 nucleotide

Mặt khác, các enzyme giới hạn sử dựng phổ biến trong chuyển gen thường có trình

tự nhận biết gồm 6 nueleotide [14], hon nữa mội số enzyme dee vi sinh val sit

dụng phê biến thường có xác suất bắt gặp cao hơn bình thường Như vậy, với những, vector chuyến gen đải lên đến khoảng 10 kb thì việc tìm ra trình tự nhận biết đơn cla mL enzyme giới hạn ở vị trí thích hợp trên gen và vector rất khỏ khẩn và uất thời gian Mặt khác, không, phải đoạn gen nào cũng đã được nghiên cứu biết rỡ trình

Trang 24

phương pháp mới, đó là kỹ thuật GateWay Nguyên lý của kỹ thuật này là sử dụng

các enzyme đặc hiệu cho phân ứng tái tổ hợp giữa hai trình tự đặc thủ trên phân tử

ADN (gọi là các vị tri “attachment” —att) theo co ché nhu sau [30]

~ Trong phản ứng BP, gen can chuyên mang hai vi tri attB] va attB2 6 hai

dau được tái tổ hợp một cách đặc hiệu với hai vi trí tương ứng attP1 và attP2 trong vector “đonor” được cung cấp trong bộ kít dưới sự xúc tác của enzyme BP clonase

Qua trinh tai t6 hop thanh céng tao ra vector “donor” mang gen can chuyên (kí hiệu

la “entry clone”) dong thoi mang hai vi tri att moi là attL1 va attL2 (Hinh 1.8)

Hình 1.8: Sơ đồ minh họa phản ứng BP [30]

~ Tiếp theo, gen cản chuyên trong vector “entry clone” duoc chuyền sang

vector chuyén gen (vector nhan — “destination vector”) thong qua phản ứng tải tỏ

hop dic hiéu gitta attL1 va attR1, attL2 va attR2 dudi su xuc tac cia enzyme LR

clonase Qua trinh tai t6 hop thanh céng sé tao ra vector chuyén gen mang gen can

chuyên (Hình 1.9)

aa an an a s0 ap ra CEE + PEE) uœ=" =I ứ Per]

Trang 25

'Tử những phân tích trên, dê thực hiện dễ tải “Phiết kế vector chuyển gen tiểu hiện kháng nguyên vi rút PRRS trong tế bảo thực vật”, chúng tôi tiến hành

chuyến các gen mã hóa cho các kháng nguyên GPSM, GP5, GP3 của vi rút PRRS

vào tế bảo thuốc là siêu sinh tudng BY-2 théng qua vi khuin Agrobacterium

namefaciens Dé tai nim trong khuôn khổ đự án hợp tác quốc té vé KIICN theo nghi

định thư giữa Việt Nam — Vương Quốc Bỉ: “Mgbin cứu biểu hiện gen mã hóa

Glycoprotein vô (GP5) của vi rút gây bệnh lợn tại xanh trong thuốc lá và đậu tương", được thục hiển tại Phòng Công nghệ Tế bào Thục vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nanu

oO

Tận vẫn thạc sĩ 2011 — 2013 2:

Trang 26

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyễn vật liệu

a- Các veclor

~ Vector pBlueseripL II K§— mang doạn gen gpŠm đã dược tối ưu hóa mã phù

“hợp với sự biểu hiện trong tế bảo thực vật Kí hiệu: pI3SK-gp5m

- Vector pl3luescript II K8+ mang gen øp3 đã duoc tdi ưu hỏa mã phủ hợp với sự biển hiện trong tế bảa thực vật Kí hiệu: pBSK-gp3

- Vector pSHELP mang gen It (Lê Văn Sơn và cộng sự, 2008) Ki hiệu:

pSHRI.P-bb

~ Voclor tách dòng pBT/T (Phòng Công nghệ Tế bảo Thực vài, Viên Công nghệ Sinh học, Viện Hản lâm KH&CN Việt Nam)

- Vector pDONH 201 nằm trong bộ kit Gateway (Invitrogen)

- Vector chuyển gen thực vật pCB-GW-358 (Phỏng Công nghệ Tế bảo Thực vật, Viện Công nghệ Sinh hạc)

b, Chủng vỉ sinh vật

~ Dòng tế bào vi khuẩn £ coli DII Sa ding cho bién nap vector tai té hop

- Dòng té bao vi khudn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 stt dung

cho việc chuyển các gen cuam tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2

- Dong té bao thuc lá siêu sinh trưởng BY-2 được lưu giữ tại phòng Công,

nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Bình học

id Méi sử dụng cha phân ứng PCR

Danh sách mỗi sử đụng cho các phân ng PCR trong loan bộ nghiên cứu

được trinh bảy trong Bảng 2 1

Trang 27

- Bộ kít tỉnh sạch sản phẩm PCR “GeneJET PCR Purification Kit" (Thermo Scientific)

- BO kit tink sach ADN us gel “GeneJET Gel Extraction Kit’ (Thenwo Scientific)

Trang 28

- Hộ kit GateWay (Invitrosen)

- Bộ kíL lách ARN tổng số “GeneJHTTM RNA Purfication Ki” (Thenna

- Các héa chat sir dung cho tach ADN téng sd tt té bao thực vật CVAH

(uvitrogen), NaCl (Sigma), Tris base (Sigma), EDTA (Sigma)

- Các hỏa chat ding cho dién di axit nucleic: Đêm TAE với các thành phân

theo Sambrook va Russell [44] (40 mM ‘Iris acetate, 1 mM LIDIA , pli 8.2 - 8.4);

đệm loading mau 6 X, cdc joai thang chuan ADN (Thermo Scientific, Eurogentec,

Trang 29

2.2, PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.2.1 Sơ đỗ nghiên cứu

Toàn bộ quy trinh nghiên cứu được tóm tắt qua Sơ đồ 2.1

Trang 30

gp5-for/emye-rev Itb-for/ltb5-rev hoae gp3-for/emye-rev

Doan gen gpSm gen [th5 [ gen /b3 | gen gp3

Overlapping-PCR véi Overlapping-PCR véi

cặp môi Ith-for/emye-rev cặp môi lib-ƒor/cmye-rev

Chuyển các đoạn gen quan tâm vào tễ bào thuốc lá siều sinh trưởng BY-2 thông qua vỉ

Khudn Agrobacterium tumefaciens Sang loc cde dong BY-2 mang gen cẩn chuyền bằng

kháng sinh chon lọc và bằng phương pháp PCR với cặp môi đặc hiệu cho gen

Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã bằng RT-PCR và ở mic độ dịch mã

bằng điện di kiểm tra protein tổng sé trén gel polyacrylamide, lai miễn dich Western Blot

Trang 31

Quả trình nghiên cứu gồm 4 bước chỉnh

Bước 1: Thiết kế các đoạn gen /tb-gp5m, Ith-gp5, Ith-gp3

- Trinh tu gen /tb được nối vảo đầu 5` của các gen gp5m, gp3 bằng phản ứng

overlapping-PCR Sản phẩm của phản ứng nỏi bằng PCR được đưa vào vector tách

dòng pBT/T và biển nạp vào tế bảo khả biên E coli DH 5a Kết quả biến nạp được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) và phương

pháp cắt plasmid tai t6 hop vai enzyme gidi han BamEIL

~ Tiền hành giải trình tự để chọn ra dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp pBT

mang đoạn gen #ð-gp5m hoặc i/-gp3 có trình tự không làm thay đổi trình tự axit

amin tương ứng khi dịch mã phục vụ các thí nghiệm tiếp theo

- Theo tinh toan ban đâu, đoạn gen gp3m được thiết kể có chứa hai vị trí cắt

của enzyme giới hạn Neol nam 6 hai dau ctia gen m Do vay, de tao ra vector pBT- Itb-gp5 chi can cat vector pBT-Itb-gp5m voi enzyme Neo! nhim loai bé gen m

Mô hình cấu trúc các đoạn gen /th-gp5Sm, Itb-gp5, Itb-gp3 duoc minh hoa

trên Hình 2.1

Hình 2.1 Mô hình thiết kế câu trúc các đoạn gen /th-gp5m, Ith-gp5, lth-gp3

Bước 2: Thiet kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật sử dụng kỹ thuật

GateWay

~ Việc thiết kế vector chuyên gen vào tế bảo thực vật bằng ky thuat Gateway

được thực hiện qua hai phản ứng: BP vả LR, sử dụng vector nhận la vector pCB-

GWW-35S Cuối củng tạo ra các vector chuyên gen pCB-GW-358-//b-gp5, pCB-GW-

Trang 32

- Chuyển các đoạn gen quan tâm vào đỏng tê bảo thuốc lá siêu sinh trưởng

BY-2 thông qua chủng vi khuẩn 24 nønefaciens CV58 pGV2260

- Bude dau sàng lọc các đỏng tế bảo BY-2 mang gen cẩn chuyển trên môi trường đặc có bổ sung khang sinh chợn lọc thích hợp

- Các dòng phát triển tốt trên môi trường có kháng sinh chọn lọc được kiếm tra sự có mặt của gen cân chuyển bằng phương pháp PCR với cặp mỗi đặc hiệu cho gen

Bước 4: Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyén vao trong té bao BY-2

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã: Sử dụng phương pháp RT-PCR

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ dịch mã: Sử dụng phương pháp

điện đi kiểm a protein tang sé trên gel polyacrylamide và phương pháp lai miễn dich Western Blot

3.2.2 Phương pháp nghiÊn cúu

2.2.2.1 Phuong pháp PCR

œ PCR khuếch đụi các đoạn gen gp5m, gp3, Ïlb từ các khuôn tương ứng

Với mục đích tăng cường khá năng đáp ứng miễn địch của cơ thể trong việc chuyến tải kháng nguyên qua đường miệng, gen mã hóa cho protein LTB (Labile Toxin B subimi - độc tổ không chịu nhiệt lây từ vì khuẩn E, coi) được nối vào mỗi aen gp5m, sp3 bằng overlapping-PCH

Để phục vụ cho phân ửng nỗi, trước tiên cac gen gpsm, sp3, tb được khuếch đại từ các khuôn tương ứng bằng phản ứng DCR sử dụng các cặp mỗi đã

Trang 33

được thiết kế dặc thủ Thánh phần phản ửng và diễu kiện chủ trình nhiệt dược mô tả

trong Bang 2.2 va Bang 2.3

Bang 2.2: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các gen gpấm gp3, lib tit cic khuôn tương ứng

HO

én Pfr ADN polymerase 10%

MgSO, 25 mM

@NTPs 2 mM méi loai Mỗi xuôi 10 pM

Tổng thể tích Bằng 2.8: Mời, ADN khuôn và chủ trình nhiệt sử dựng cho phân ứng PGR khuếch

đại các gen guãm, g3, lib

Gen cin khuếch đại | Mỗi ADN khuôn Chu trình nhiệt

api Epler sector pBSK- am | Biển tính lên đầu : 94°C

omye-rev + Tổng hợp : 72°C trang 90

giây 1Ih-fr A 5 ke nay : „ ons - Tổng hợp bước cuỗi : 72*C lib3 — Vector pSIILP-B | trong 10 phúc

'Trong đó: /65: !6 dùng đã nối với gen gø5m; /ib3: lab dùng đề nỗi với gen gp3

Trang 34

b Overlapping-PCR noi gen ith vao dau 5" ctta các gen gpSm, gp3

San phim PCR khudch dại các gen gÌúa trên dược sử dụng trục liếp làm khuôn cho phản ứng overlapping-PCR nhằm nối gen ?⁄° vào đầu 5' của các gen

gp3m gp3 Phần ứng được tiễn hành với các thành phân và điều kiện như Đăng 2.4

Pfs ADN polymerase (5 U/ji) 0.4

Bang 2.5: Mii, ADN khuôn và chu trình nhuột sử dựng cho phần ứng overlapping-

PCR nỗi gen f0 vào các gen gu5m, gp3

- Sin phim PCR khuếch | - Biến tính lần đầu : 9⁄4”C trong 5 phút

Nốigen/b — đại gen gpẩm

vào gen guốm _- Sản phẩm PCR khuếch

đại gen 155 Biển tỉnh : 94C trong 30 mây

- Lặp lai 28 chu ky:

— Gắn mỗi : 52°C trong 30 giây

- Sản phẩm PCR khuắch

Nộigenftb — đại gen gp3

vào gen ạp3 - Sản phẩm PCR khuếch | - Tống hợp bước cuỗt : 72° trong 10 phút có

đại gen//b3 ‘bd sung 1 1 Dream Tag ADN polymerase

Tổng hợp : 722C trong 1 phúi 40 giây

Trang 35

tử gel (thỏi gel) sử dụng bộ Kít “GeneJET Gel Extraction Kit’ (Thermo Scientific)

ấm phẩm cắt ADN với enzyme giới hạn được tình sạch

theo các bước như sau [50]

(1) Điện đi hẫn hợp ADN trên gel agarose 1%, sử đụng máy soi gel cắt lây

băng ADN quan tâm tử bản gel bỏ vào các ông cppendorf 2 mÌ vô trùng

Xác định khối lượng của mỗi miếng gel;

(2) BS sung dung dich Binding theo tỷ 12: Vega: Vaa— 1) 1 (100 pil dung dich

tương ứng v6i 100 1g mau) 0 6 60°C dén khi miếng gel tan hoàn toàn,

Œ) Chuyên hẳn hợp lên cột thôi gel, ly lâm ở điều kiện 13.000 vòng/phúi, trong, 1 phút,

(4) Loại bỏ địch chây qua cột,

(5) Bễ sung 700 jul dung dich rửa;

(6) Ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút,

(7) Loại bỏ địch chây qua cột,

(8) Lập lại bước (6), (7);

(9) Chuyển cột sang dng eppendorf võ wimg 1,5 ml,

(10) Đỗ khô cột ở nhiệt độ phỏng trong 5 phúc,

(11) Bỗ sung 25 — 30 pl nước đeiơm khứ trùng vào chính giữa cội, giữ cột nhiệt độ phòng 2 phút, sau đó ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong ï phút Thu lây địch chây qua cột

2.2.2.3 Phương pháp nội các đoạn ADN hằng ensyme nỗi T4 ADN ligase

a

Trang 36

Săn phẩm của phản ứng overlapping-PCR nối gen #“b vào các gen gpŸ, sp3 sau khi tỉnh sạch được đưa vào vector pIST/T bằng phản ứng nối nhờ enzvrne T4

ADN ligase với các thành phản và điều kiện như Bảng 26

Bang 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng nỗi sán phẩm PCR vào vector tách đỏng pI#LT sử đụng enzyme T4 ADN ligase

'Thành phần phản ứng ‘Thé tich (ju)

2.0 Đệm T4 ADN Tigase l0 X 10 Tinzyme T4 ADN ligase (5 U/nD 10 Vector pBI/T (100 ng/jl) 1.0 Săn phim PCR di tinh sach 5.0

Than hyp ở 222C trong 2 giờ

3.3.2.4 Phương pháp biên nạp plasnnd vào tê bảo vì khuẩn E cohiDH Sa

Tổ biển nạp plasmid vào tế bảo vi khuẩn Z cøfi DHT 5ơ chúng tôi sử đựng

phương pháp sốc nhiệt Bay là phương pháp dơn giản , phỏ biến và tiện lợi dễ dua

'plasmid tái tế hợp vào tế bảo vị khuẩn , Quá trình biến nạp được thực hiện theo theo

Sambrook va Russell [46] v6i các bước như sau:

(1) Tế bảo E eofi khả biến được lấy từ tủ -80°C, để tan trên đá trong 5 phút,

() Bồ sung 10 HÌ sản phẩm nổi, búng nhọ, ủ trên đã 30 phút,

(3) Sôc nhiệt hỗn hep & 42°C tong 60 giây,

(4) Đặt lại hỗn hợp trên đá 3 phút,

(5) Bỗ sung 1 mì môi trường LLB lỏng, chuyển hỗn hợp sang ống pcnicillin, ủ

ở 37C trong 20 phút sau đó lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 30 phút, (6) Trãi 200 pH địch khuẩn lên đĩa thạch có bễ súng chất chọn lọc thích hợp

3.2.2.5 Phương pháp tách pÏaamid bang SPS-kiém

Trang 37

Quy trình tách plasmid bang phương pháp biển tính kiềm dược tiến hanh

theo Sambrook và Russell [46] với các bước như sau:

(1) Ly tam 1,5 ml địch vị khuẩn nuôi cấy qua đêm ở 10,000 vòng/phút trong

5 phil; bé dich trong, thu lay can 18 bao;

(2) Hoa căn trong 100 pl dung dich I (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA pH 8), vortex, 1 & nhiét 46 phong 10 phat;

(3) Thêm 200 il dung dich TT (0.2 N NaOH, 1% SDS), dio ihe, ñ trên đá 3 phúi, (4) Thém 150 pl dung dich LIL (3 M KOAe pH 5.2), ú trên đá 5 phút,

(5) Ly tâm hỗn hợp ở 4°C, 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dich trong; (6) B6 sung 1 thé tich Phenol: Chloroform: Tsoamy! (25:24:1), dio nie;

(10) Rửa tủa bằng 0,5 mi cên 7094 lạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4°

trong S phút Loại bỏ dịch trong:

(1) Để tủa khô, hòa tam tủa trong 20 - 30 pl nude bode TE e6 bd sung RNase A đến nằng đệ cuối cùng là 20 ¡rg/mlL

2.3.2.6 Phương pháp kiểm tra kết quả biển nap plasmid vao té bao vi khudn

Cáo khuẩn lạc m ọc trên đĩa thạch có b ổ sung kháng sinh chọn lọc bước đầu

được kiếm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm bằng,

phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Đây là phương pháp nhanh, đơn gián bởi sử dựng trực tiếp các tế bảo vị khuẩn làm khuôn cho phần ting PCR

Tuy nhiên, để có kết quả chính xác hơn, các khuẩn lạc đương tính từ phân ứng,

colony-PCR được nuôi léng qua dém rỗi tién hanh tach thu lay plasmid Sau do tién

hành cất các plasmid này với enzvre giới hạn thích hợp hoặc sử dụng chính

Trang 38

plasmid làm khuôn cho phán ửng PƠR với cặp mỏi dặc hiệu cho gen, vector hoặc

gitia gen va vector

Trong nghiên cứu nảy, để kiểm tra kết quả nói sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT/T, bước đâu chứng lôi sử dựng phương pháp PCR trực tiếp Lừ khuẩn lạc, sau đó các dòng cho kết quả PCR dương tỉnh dược nuôi lỏng qua dém dé tach

thu lây plasmid va cat cdc plasmid nay với enzyme giới hạn BamHI Thanh phan va

điều kiện phân ứng cắt được mô tả Irong Bâng 2.7

Băng 2.7: Thành phần phan img cat plasmid voi enzyme giới hạn 8z HT

Plasmid tai t6 hop

Ủ hỗn hợp ớ 372C trong 2 giờ

3.3.2.7 Phương pháp thiết kế doan gen lib-gp5

Theo tỉnh toản ban đầu, đoạn gen gp5m duge thiết kế có chứa hai vị trí cất cia enzyme giới hạn Nec! nằm ở hai đầu của gen m, đo vậy để tạo ra đoạn gen nói

hb-gp5 chi can cat vector pBT-ith-gp5m véi enzyme Neol Thanh phân và điều kiện

phan ứng cắt duoc minh hea trong Bang 2.8

Trang 39

hỗn hop 3 37°C trong 2 giờ

L Phương pháp thiết kế vector chuyên gen bang kf thudt GateWay

gắn thêm trinh tụ attäl hoặc atl32 ở đầu 5') Thành phần và điêu kiện cho phan

ứng PƠR được trình bày trong Băng 2.9

Trang 40

Bang 2.9: Thanh phan và điền kiện chu trình nhiệt cho phản ứng PVR gắn các vị trí

211, atB2 vào hai

dNTPs 2 mM mỗi loại 20 | Bién tink: 94°C trong 30 Mãi attB1-ltb 10 pM 20 giây

Môi allB2-crnye 10 pM 2.0 | Gan tdi: 58°C trong 30

iy

Pfit AD polymerase (SUipl) 0 my

ADN khuôn (plasmid pET 20 phút 40 giây

mang đoạn gen tương ứng) - Tổng hợp bước cuỗi: 72%C

(haặc at4B I-Ith-gp S-atf2

hoặc attli I-lth-gp3-att12)

2.0

10

Tiêu đề	Thiết kế Vector Chuyển Gen Biểu Hiện Kháng Nguyên Virus PRRS Trong Tế Bào Thực Vật
Tác giả	Lộ Thị Thanh
Người hướng dẫn	PGS. TS. Vừ Thị Thương Lan
Trường học	Đại Học Quốc Gia Hà Nội
Chuyên ngành	Sinh học thực nghiệm
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2013
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	81
Dung lượng	2,54 MB