Luận văn xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh Ở người bằng phương pháp pcr Đa mồi

Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh nhân có thể chuyên sang một pha mới nguy hiểm hơn, ¡ các quy trình cấy khuẩn không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các v

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

TRUONG DAI HOC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

"ca

ĐÀO THANII QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SO VI KHUAN

THUOC HO ENTEROBACTERIACEAE GÂY BỆNH Ở NGƯỜI

BANG PHUONG PHAP PCR DA MOI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ha Nội - 2015

ĐẠT HỌC QUÔC GIÁ HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

saa Ee eee

ĐÀO THANH QUYEN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỞ VI KHUẨN

THUOC HO ENTEROBACTERIACEAE GAY BRENH Ở NGƯỜI

BANG PHUONG PHAP PCR DA MOT

Chuyén nganh : DI truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KIOA HỌC:

TS Ngô Tất Trung

TS Dinh Nho Thái

Hà Nội - 2015

Tôi xin wan trong cim an PGS.TS L8 Hine Song, TS Bs Phan Qube Hoda

đã tạo điều kiện để tải tuạc biện luận văn tại khoa Sinh học phần từ - Bệnh viện Trang rơng quân đội 108, tới các anh chị tại khoa Sinh học phân từ - Bệnh viện Trang trơng quân đội 108 để giáp đổ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xii trân trọng cảm ơn các thấy cô giảo Bộ môn Di truyền học và lãnh

đạo Khoa để giảng đạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cửa,

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè để ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tật có thê hoàn thành được luận văn này

Tôi xin chan thanh cam on!

Hà Nội Ngày - thẳng năm 26013

Học viên

Đào Thanh Quyên

MUC LUC

1.1 Dịch tế học của các vi khuản thuộc ho Enterobucteriaceae gay bệnh nhiễm

khmắn huyết ở người

1.1.1 Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Z»rerobaczeriaceae gây bềnh nhiễm

khuẩn huyết trên thể giới

1.1.2 Dịch tế học của vi khuẩn thuộc họ Eøierobacreriaceae gầy bệnh ở Việt Nam 7

1.2 Dặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Emterobacteriaceae gây bệnh ở người 8

12.1 Vi uẩẩn Escericlia coh

1.2.5 Nhôm sáu vì khuẩn khác thuộc họ Znứerobaoferiaace ¬- 1.3.Phương pháp chấn đoán xác định vỉ khuẩn gây bệnh e e Tổ

1.3.1 Kỹ thật xét nghiệm truyền thống phảt hiện vi khuẩn 13

1.3.2 Phương pháp str dung sinh hee phân tử phát hiện vi khuẩn "

1.3.2.1.Kỹ thuật PCR ¬ - 14

1.3.2.2 Kỹ thuật PCR da mdi (PCR da mdi) 16

1.3.3 Tách chiết ADN sứ dụng công nghệ loại bỏ AIDX người

1.3.3.1 Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chấn đoán tác nhân

1.3.3.2 Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người "làm giảu” ADN ví

CHƯƠNG 2 VẬT 1,IỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 20

4.1 lỗi tượng nghiền cửu " 20

2.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cửu, ào eeneeeirrrrisrirrreru, 21

2.3.7 Các máy và thiết bị chính cee 21

2.4.7 Thiết kế các cặp môi xử dụng trong PCR và PCR đã mỗi 23

2.4.3 Quy trình lách đưết ADN lử cae ching vi khuẩn nghiên cứu - 2.4.4 Tách chiết ATDN tít các mẫu bệnh phẩm 27 2.4.5 Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tính sach bang may quang phé 28

2.4.9 Dánh giá độ nhạy, dic hiệu phần ứng PCR đa môi - 31 2.4.10 Phương pháp xứ lý số liêu bằng toán thông kê 33

3.1 KET QUA XAY DUNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR DA MỖI PHÁT

3.1.1 Kết quả tách chiết ADN trên chủng vỉ sinh 34

3.1.2 Kết quả PCR, dơn mỗi từ các mâm bệnh đơn lẻ «34

_3.1.3,Kết quá giái trình tự gen các mâm bệnh ceeeeoe, 3

3.1.3.1 Két qua xác định trình tự đoạn gen 1ó6S ribosomal RNA của ho

3.1.6.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các muẫn chứng âu và chuẩn dương Ad

3.2 THIET LAP CONG NGHE LOAI BO ADN NGUOI KET HOP “LAM

GIẢU"? ADN VI KHUẪN

3.2.1 So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN ciing nhu khá năng loại bỏ ADN

người bằng các dung môi khác nhau đ7

3.2.1 Kết quá so sảnh nông độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường

so với phương pháp phả bạch cầu làm giàu ADN ví khuẩn để

3.2.3 Kết quả realiime PCR định lượng nỗng độ ADN so sảnh các phương pháp

tách chiết

3.2.3.1 So sánh tính chất loại ADN bằng đung môi MCLB1 với phương pháp

3.2.3.2 So sdnh tink chal loai ADN bing ding nuôi MCI.BI với phương pháp sử

3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhân san khi xử lý bằng dung

33 KẾT QUÁ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỖI PHÁT HIỆN VI

DANH MỤC HỈXH

Hình L Các giai doạn tổng hợp của phản ứng PCR 13 Hình 2 Mô hình thi nghiêm thực hiện quá trình tối tu hỏa PCR da mdi 22 Hùnh 3 Mô hình nghiên cửu tiết lập phương pháp loại bỏ ADN người 23

Tình 4 Tình ảnh mỗ phỏng cho quá trình tiết kế mỗi phái tiện vì khuẩn gây hệnh24

Hinh 5 Hình ánh mô phóng kết quả điện di các sán phẩm PCR phát hiện vi khuẩn

Tinh 6 Ket quả PCR các mỗi đơn tiên ADN mẫu được lách chiết từ mẫu chuẩn

THnh7 Ilinh ảnh phố sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trưng cho họ

Hình 8 Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn 8ølwenella gp 37

Tĩnh 9 Kết quà giải trình tự đoạn gen dic trung cho vi khuan K pneumoniae 38

Hình 10 Kết quá giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Pro/eus múrabilix 39 Tình 11 Kết quả giải trình ne đoạn gen S-nidA đặc trưng cho vi khuỂn 2 coli 41

Hình 12 Kết quả PCR da méi phat hién ho vi khudn Brerobacteriaceae va méi noi

Hinh16 Két qua realtime PCR mỗi bewglcbin định lượng nồng độ ADN 40

Hình 17: Hiện quả loại ADN người (hông qua tồn du beta globin) giữa các Kit

Hình 18 Kat qua PCR méi don Z coli-Suidd trén ADN được xử lý bằng đung môi

SIIPT108@2dehumanDNA ¬ - 52

Hình 19 Sơ đề sơ sánh kết quả PCR đa môi và cấy máu co Š4

DANH MỤC BẰNG

Bang 1 Sự phản bỏ các mâm bệnh gay NKH tir nim 1990 đến 2010 cúa 17 nghiền

cửu khác nhau ở khu vực gân Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu

Bang 2 Danh mục các hóa chất sứ dụng irơng nghiền cửu 2

Báng 3 Danh mục các thiết bị sử dụng trơng nghiên cửu 21 Bang 4, ‘Trinh ty méi trong phan img PCR da méi phát hiện tác nhân vì khuẩn gây

I3âng 5 Công thức tỉnh đô nhay, đô đặc hiệu phương pháp 32 Bảng 6 Kết quả đo OD cac mau ADN sie dung trong nghiền dứa 34

Bang 7 Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bệ mỗi Ent/beta va EPKS thiết kế trên các

kaài vị khuẩn thuộc họ Enmterobaeieriacae và ADN khác 44

Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ Inủ máu ngoại vi chứa vi khuẩn

DANH MỤC CÁC CHỮ VTIẾT TAT

BO mai LPKS Gồm cae gen dich phat hién vi klndn £ colt, Proteus

mirabilis, K pneumoniae, Salmonella sp

dNTP Deoxyribonucleotide tiphosphate

DTCs Dye Torminator Cycle Sequencing

EBV Epstain BaxrEpplabar virus

M100 Ladder marker 100

MCLBL Manrnanlian cellular lysis Buffer 1

NEI Whiéin khudin tuyết

DAT VAN DE

Nhiễm trùng là mmột bệnh lý thường gặp, trong đó nhiễm trừng đường múu

(nhiễm khuẩn huyết) gây biến chứng và nguy cơ tử vong cao nhất Có nhiều cản

nguyên khác nhau gầy ra bệnh lý nhiễm trùng như vi khuẩn, kí sinh trùng và nắm

Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thể giới chỉ ra rằng tác nhần

gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn trong đó nhiều nhất là các loài thuốc họ

Enterobacteriaceae nu Escherichia coli, Klebsiella sp v4 Staphylococcus aureus

Việc xác định cần nguyên gây nhiễm khuẩn là cần thiết cho việc chỉ định đúng kháng sinh Irong điều trị Cho đến nay cây khuẩn vẫn là phương pháp được

áp dụng thường quy trong chấn đoán các im bệnh gầy nhiễm trùng Tuy nhiên

phương pháp kih điển này đáng thể hiện mội số điểm yếu lrơng chấn đoán, đó Tà ï)

thời gian cấy khuẩn dài (từ 18-72h) Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh

nhân có thể chuyên sang một pha mới nguy hiểm hơn, ¡) các quy trình cấy khuẩn không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí

công thêm việc xử lý kháng sinh phổ rông trước đó cũng gây áp lực áp chế sự hình

thành khuẩn lạc sau nuéi cay, iit) Chân đoán nhiềm khuẩn huyết đòi hỏi một hương mâu lớn sẽ là thách thức đôi với bệnh nhân nhỉ sơ sinh hoặc người cao tuổi l2o đó,

việc triển khai những kỹ thuật chẩn đoán mới bỗ trợ cho phương pháp cây khuẩn

kinh điễn là điễn cần làm

Kỹ thuật phản ứng chuỗi tring hợp (Palynnerase Cluin Renction) Không côn

là điều mới mẻ trong sinh học phân tử, tuy nhiên ứng dụng của nó trong chân đoán, đặc biệt là chấn đoán các mảm bệnh gảy nhiễm trùng vẫn đứng ở tức tiểm năng là vi: DIMỗi một phản ủng PCR chỉ xác định được 01 loài vi sinh vật, trong khi đó nếu

số cặp mỗi quá nhiều trong mnột phản ứng (PCR đa môi) chứng có thể triệt tiêu lần nhau làm giảm đô nhay kỹ thuật của phản ứng ii) Các chất ức chế vốn có trong

bệnh phẩm hoặc bản thân lượng dư thừa ADN người trong bệnh phẩm cũng Tà

những táo nhân kìm hãm phẩm ứng PCR; iii) Ngoài ra, do tỉnh chất bảo tôn tiến hóa giữa các loài, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vỉ khuẩn sẽ được bảo tôn và có trình tự gần giống một phân bộ gsn của sinh vật bậc cao (trong đó có cơn

người) vì thế nền đoạn mỗi được thiết kế hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện tượng bất chéo của mỗi vào AL3N gen người sẽ điễn ra gầy nên đương tính giả Để

tách và loại bỏ ADN

gid thiểu các nguy cơ nởi trong nhiều trường hợp v

người trước khi thực hiện phân ứng PCR là cần thiết

Vì vậy trong khuôn khổ luận văn này tôi tiến hành tới rm hóa các tham số nhằm xây dựng miột quy trình PCR đá mỗi phát hiện một số vì khuẩn gây bệnh thuộc họ Zzwerobaeteriaceae Quy trình không chỉ hưởng tới thiết lập phản ung PCR đa mỗi phát hiện đặc hiệu chơ các vi sinh vật thuộc họ này má còn cần thiết

lập môt phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ALON vi khuẩn ở mức độ

chấp nhận được Do vậy đễ nâng cao chât lượng chân đoán cac mam bénh vi sinh gây bệnh, chúng tôi đề xuất đề tài "Xây dung quy tình phải hiện một số vị khuẩn

thudc hp Enterobacteriaceae gay bénh ở người hằng phương pháp PC đa môi”

với gấu nụ Liễu tử sau:

a)Xay đựng quy trừh phát hiện một số vì khmằn tộc họ

Rnterobacteriaceae (Ascherichia coli, Klebsiella pnawnoniae, Salmonella sp,

Proteus nairabilis) ây bình ở người bằng, phương pháp PCR da mỗi và thiết lập

công nghệ loại bỏ ADN người

b} Bước đầu đánh giá giá trị của PCR đa mỗi trong phát hiện một số vĩ

khuẩn thuộc họ Ezerebdeteriaceue gầy nhiễm khuẩn huyết trong thực hành tại Bệnh viện 108

tà

CHƯƠNG 1 TONG QUAN

1.1 Dịch tễ bạc của các vi khuẩn thuộc ho Enterabacteriaceae gây bệnh nhiễm

khuẩn huyết ở người

1.11 Dịch tỄ học của vì khuẩn thuộc họ Enterobacteriacede gâp bệnh nhiễm

khuẩn huyệt trên thê giới

Nhiễm khuẩn huyết (NKID) là một trong những bệnh Tỷ được quan tâm bởi tý

lệ mắc bệnh, tử vøng œao Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do

các vị khuẩn da kháng kháng sinh Triệu chứng lâm sàng của NÉH không đặc liệu

và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ Cac marker sinh học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đảnh giá mức

độ năng của tỉnh trạng viêm, phân biật tác nhân là vi khuẩn, gớp phan giúp thầy

thuộc chân đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn "giờ vàng”, rút ngắn thời

gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân XKH cỏ xu hướng gia tăng và

do các nguyên nhân xác định Trong đỏ, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là

nguyên nhân phê biên đấn tới NKIT hay sộc nhiễm khuẩn [39] Nhìn chung, nhiễm trmg đường hồ hấp chiếm khoảng suột nửa số ca NKH Ngoài ra, củn có các

nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ö bụng Với các nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên

quyết trong điều trị khỏi bệnh cho banh nhân Nghiên cửa của Houck EM ở những

bệnh nhân viêm phối và bệnh nhân NK]I chỉ ra răng việc sử dụng kháng sinh chậm trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ đẫn tới tử vong tăng lên đảng kể Đặc biệt với nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trế [21]

những kỹ thuật tiền tiễn nhật để phát hiện vi khuẩn gầy NKH được để xuất đáp ứng

nhu câu chấn đoàn nhanh tác nhân vi sinh gây bệnh

‘Ty 18 NKH thay đổi thao từng quốc gia, theo mùa, theo từng cơ quan xảm nhập và tủy từng đỗi tượng bệnh nhân Vào những thập niên 1970 tại Mỹ hàng năm xây ra

khoảng 164000 ca NKIUmãm Tuy nhiên 15 năm gần đây đã có 750000 ca NKIHãm, số ca tử vòng lăng lử 18500 cá lân 31000 cá NKTNnấm chiếm khoảng,

2% số bệnh nhân nhập viện và chiêm 75% các trường hợp nằm ó khoa Hồi súc tich

cực [40]; Mệt nghiên cửu tại Hàn Quốc thấy tý lệ nhiễm vi khuẩn Gram ẩm trên

tổng số ca NKH là 43%, trong khi đó chí có 20,4% là vị khuẩn Gram đương Người

ta cũng ghi nhân nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%, nhiễm nâm là 0,7% và vi

khuẩn ky khí là 0,6% Tần suất bắt gập các mầm bệnh ở các khu vực là khác nhau Khi phân tích trên lừng khu vực người ta thay Stapintococcus aureus va

Streptococcus pneumoniae là phố biển nhật ở Châu Phi, trong kiú đỏ Kiebsiella gặp

tỷ lệ cao nhất ở Đông Mam Á, đồng thời tý lệ kháng thuốc gặp nhiều nhất ở Kiebssella [41] Một nghiên cửu đa trung tâm tại Hàn Quốc gần đây cho thây trong

số 1192 bệnh nhân NEH là người lớn được điều trị tại 22 đơn vị hồi sức cấp cứu từ

2005 đến 20U9 thì có 740 (63,1%) bệnh nhân bị shock nhiễm khuẩn Trong đỏ có

422 (5,1%) bệnh nhân xác định đươc vi khuẩn trong máu, tý lệ tử vong là 28%

[B2] Về tý lệ phân bố các mẫm bệnh phụ thuộc vào vùng địa lý, đặc điểm, điều kiện kinh tế, xã hội Trơng nghiên cửu lại Hàn Quốc, một nước phát triển thầy tý lệ vì

khuẩn gian Bm là 43%, trơng khi đó chỉ có 20,49 lá vì khuẩn gram đương, Người

ta cũng ghi nhân nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nắm là 0,7% va vi khuẩn ky khí là 0,6% Các vi khuẩn nhiễm nhiều nhất là Eseberielie coli (22,134),

tigp theo 14 Klebsiella sp (12,6%) va Siaphylococcus aureuz (8,496) [32] Nghiên

cứu của Deen và công sự về sự phân bổ các mắm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến

2010 là báo cáo tổng hợp của 17 nghiên cứn khác nhan tại khu vực Nam và Dộng Nam Châu Á lại cho thấy tác nhân gầy nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất là loài Salmonella eweric serotype Typhi với 52/1798 tổng số ca đương tính (chiếm 30%)

ở người lớn và 432/1723 tổng số ca đương tỉnh (hiểm 25%) ở trẻ cm Ngoài ra, các

mẫm hệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S aureus, ⁄ coli và

nhồm vị khuẩn Gram âm khác Vi khuẩn thưởng gặp ở trẻ em như S$ preumoniae,

77, influenzae, KEL quả được thể biện ở Bàng 1 đưới đây

Bang 2 Sự phân bố các mâm bệnh gây NRH từ năm 1990 đến 2010 của 17

nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Viét Nam (Nam va Dong Nam Chau A)

‘3 enterica serotype Typhi 96474) 532 (29,6) | 432 28.1)

Như vậy, các nghiên cứn trên cũng đã phân ánh rõ ràng về tần suất xuật hiện

các vị khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hon nhém vị khẩn Cram đương, đặc biệt là họ vì khuẩn #mwarabaokertaceas như Escherichia coli, Klebsiella spp,

Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp va Enterohacteriaceae khae 1a nhữmg:

tác nhân làng đầu gây bệnh lý NKH

1.1.2 Dịch tỄ học cửa vi khuẩn thuộc họ Eeröbacieriaceae gây bệnh ữ Việt

Nam

'Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cửn về các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trừng vét mổ,

NKH Nhìn chung các vì khuẩn gây bệnh rất da dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn

thường gặp gây bệnh được thông kẻ vin pho biến nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae Tac pid Trần Thị Ngọc Ảnh năm 2007, tại Viện Nhi Dong 2

phân lập được 2738 chứng vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lâm sảng Vì khuẩn thường, gap nhất là: E coi (14,6%), K pneimoniae (11,7%), S aureus (11,4%), P aeruginosa (5.1%), S pneumoniae (3,196), Enterococci (4%), Acinetobacter beamanti

(2,4%) Trong đỏ, hần hết các chủng vi khuẩn phần lập được có tỉnh khang với

nhóm kháng sinh belalacam, kháng và nhạy với carbapenem, tỷ lệ tụ cầu vàng, kháng raethieiline lá 33,5% trong tổng số các chủng vì khuẩn phần lập được [1]

Do vậy, trong thực hành lâm sàng, việc xác định cân nguyễn vi khuẩn gảy bệnh nhanh chóng và xác dink tính kháng kháng sinh sẽ tró nên hữu ích và cần thiết cho

các bác sĩ trong việc điển chỉnh phác đồ điển trị cho bệnh nhân Thống kê của chương trinh giám sắt quỏo gia về tính kháng thudc của vi khuẩn năm 1996 thu được 1082 chủng từ các đơn vị tham gia trên toàn quốc chỉ ra rằng tỷ tệ NKTT chiếm

21,6% trong số các loại bệnh phẩm thu được [7] Phạm Văn Ca nghiên cửu ong, thời gian 3 răm lại Bệnh viện Bạch Mai (1989-1993), tý lệ bệnh nhân cấy mún

đương tính lả 11,8 % ; Phạm Hùng Văn và cộng sự trong kết quả nghiên cứu từ 1ó

bệnh viển trên toàn quốc thu được 1602 chủng từ nhiều nguồn bệnh phẩm khác

nhau trong đỏ có 188 bệnh phẩm màu chiếm tỷ lệ 11.7% [3], Nghiên cứu của

Nguyễn Thanh Liém va cs tai Banh vién Nhi déng J tir nim 1999 đến 2004 nhóm vĩ khuén gay bệnh Gram am chiém tdi (61.3%), trong đó hãng đầu là Klebsiella spp

(4490, B sali (19%0 [4] Một nghiền cứu về các câu nguyên gây NKIT lại Bệnh viện TƯQĐ 108 do tic gid Bui Thanh Thuy

trên §.]34 mãn máu từ nã: 2010 đến

nằm 2013 có 952 mẫu cầy máu dương lính (chiểm 11,2%) Trong đó, các vì khuẩn thường gặp là Z coli (25/8490, K, pmeuuoniae (15,02%), P serriginosa (9,8796) và

hau hét các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các

kháng sinh thường dùng trong bệnh việu [6]

Như vậy, không chỉ ở trên thể giới mà cả ở Việt Nam, địch tế học các cần

nguyên chỉnh gây nhiễm khuấn huyết thường gặp nhất, mức đồ gây hại lớn vẫn tập

trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đáo biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ

Thưarobacteriaceae Điều này cho Thấy, trong thực hành lâm sảng tại Bệnh viên,

việc chân đoán xác định chỉnh xắc và nhạnh chúng chúng là việc làm rải cần thiếL

1.2 Dặc điểm cửa một số loài vi khuẩn thuộc họ #Zzerobacferiaceae gây bệnh ữ

người

nwrobacteriaceae là các chủ vì khuẩn đường ruột Giam âm có hình que, chiều đài dién hinh tir 1 pm dén $ jun kị khí không nghiễm ngặt, lên men đường thánh acid lactic Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrt, ngoại trừ một số vì khuẩn như #jœœrhabẩ&a Trong lâm sing vi khuinEycherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Proteus mirabilis va Salmonella sp chiêm trên 90% số cáo vì khuẩn

thuộc họ Ez/erabacferiaceae đã được nhận điện

1.2.1 Vì khuẩn Escherichia coli

Vi khuẩn # eøií được Theodor Escherich tìm ra năm 1885 và mang tên chính thức là scherichia col? năm 1919 Vì khuẩn ÿ col; thưởng sông trong ruột

Đây là trực khuẩn Gram âm điễn hình với kích thước trung bình tir 2-3 um x 0.5

púị có lồng quanh thân nên đi động được, không có bào tử, gó một lỷ lê nhỏ các chúng có vỏ Vừa ưa khi, vim ky khủ, đỗ nuôi, phát triển đổ đãng trén whe môi trường thông thường mọc được ở nhiệt độ tử 5 đến 40°C, thuận lợi ở 37°C, pH thích

[87] Vĩ khuẩn # soi là một trong những thành viên chính của hệ

thường ở ruội Tuy nhiên, trưng những điểu kiện thuận lợ, chỉnh # cofi lại là căn nguyên gây nhiều bệnh nguy hiểm như các hội chứng viêm đường ruột và các bệnh: cấp tính nguy hiếm như viêm màng não, viém van tim, NKH © Viét Nam, NKH do

# coli luôn là vẫn để quan trọng và khả năng vi khuẩn kháng lại nhiều loại khảng

smmh (trong đó có các kháng sinh có hoạt lực manh) là rnột khỏ khăn thực sự trong qgủ trình điều trị [24]

Các chủng Z col¿ gây NKII do chứng số đặc tỉnh sau: có hoạt tính tan mâu (lemolysin); có khả năng tao Colixin V; có khả năng gây độc của kháng nguyên K

tạo cho vị khuẩn xâm nhập sâu hơn và lăn rộng hơn; có khả năng kết đính hồng cầu

cũng như nhiều tế bảo có khả năng miễn địch làm gid kha nding howl doug bint thưởng của chúng, chính vì vậy sẽ tạo điều kiện cho ví khuẩn phát triển nhanh và mạnh bơn [28]

Các yếu tổ độc lực chủ yếu làm cho vi khuẩn này có khả nâng xâm nhập vào

mau trong điểu kiện và hoàn cảnh thuận lợi Trong 20 năm gần đây phần lớn các

công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thay # coi: là vi khuẩn thường gập nhất trong NKII đo vi khuẩn Cram âm 'Theo tác giả Canada cho biết tý lệ NKÍI do

7 coli Canada là 52,5% ở Pháp khoảng 20%, và ở Mỹ khoảng từ 12 đến 25 1⁄4,

ỷ lệ nhiễm trừng ảo vì khuẩn này tày thuộc vào mắc phải ở cộng đồng bay nhiễm trìmg bệnh viện[26]

1.2.2 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella Ya wit trong rhimg chi quan trọng của họ vì khuẩn đường rut, được đặt theo lên nhà vi khuẩn người Đúc, Edwin Klcbs (1834-1913) Trong chỉ này thí loài quan trọng nhất và cũng là đại diện điễn hình cúa chỉ này là Klebsiella pneumoniae, Day 14 trực khuẩn Gram âm, thường đứng thành đôi, không di động,

có vỏ polysacharide đặc trưng Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào

phòng vệ của tẻ bào chủ £ pzermomiae sông kị khi tùy ý: moc dé dang và nhanh

đường tiết niệu, Theo các tac giã A

trọng trong NKH cả bệnh viện và công đồng chiêm tỷ lệ 4- 17% trong các trưởng hợp NET néi chung TY 12 We vong du Klebsiella sp cau lit 20-60 % thy adi tượng

va dja phucmg khic nan Thoo Hang J-B cho thiy ty 1¢ Klebsiella spp giiy NKH ở

Nauy tir 4,1dén 8,5 %

Nguồn lây vì khuẩn này chủ yêu từ đường ruột hoặc có thể xâm nhập theo các đường khắc nhau nhị đụng cụ phẫu thuật, ông dẫn lưu, ông thông tiểu K22hsiella

bám vào niêm mạc đường hô hắp, đường tiết niệu nhờ ñmbriac và một số kết dinh

có khả năng ức chễ manose.Vi khuẩn này cỏ khá nãng xâm nhập vào mô hoặc tuần

hoàn gây ra tỉnh trạng bệnh nghiêm trọng Một điểu đáng lưu ý, song sơng với cơ chế gây độc thì vi khuẩn này còn có sự để kháng kháng sinh mạnh, đặc biệt là đôi

với những bệnh nhãn sử dụng kháng sinh không phủ hợp [5]

1.23, Salmonella sp

Salmonella 14 mét trong nhiig tác nhân hàng đầu gây bệnh ở đường ruột ở các nước Salmonella là trực khuẩn Cram âm, kich thước trung bình đài khoảng 2-3

am và rộng khoảng 0.5-1,0 um Chỉ này hiểu khí tùy tiện, phát triển được trên môi

trường nuôi cây thông thưởng, không lên men laclose, lên ren đường gÏucose

thường sinh hơi

Salucmella là ruột trong những chỉ quan trọng nhất thuộc họ ví khuân đường

một Đẫn nay hơn 2500 type huyét thanh Salmonella dã được xàc định Những

Salmonella gầy bệnh ớ người thường được xép thanh hai loai: che Salmonella gay

bénh thuong han (Salmonella 2yphi) va Salmonella gay banh Khac Cac Salmonella gay bệnh thường gặp ở người như: X pphi, S paranphi A 8 sendai vé S choreraesuis là căn nguyên thường gặp trong các NKTT do Saionalla gây rên ở nước ta Cơ ghế gây bệnh thương lám đo Š phi và cáo S pphi A, B, Ở gây rà: Cấu

yếu tô độc lực chính của vì khuẩn thương han bso gồm khả năng bảm và xâm nhập

vào tế bào vật chủ, khả nãng xâm nhập và nhản lên trong đại thực bào và nội độc

tổ Kháng nguyễn VI ở $ pgíi và 8 paraiypii C là yêu tổ độc lực quan trọng những chủng vi khuẩn thương hàn không có kháng nguyên này thì số lượng cằn

thiết để gây bênh cao hơn nhiều Kháng nguyên Vi được mã hỏa bởi các gen nằm

trên SPL-7 (Saönonaffa Pathogenicily Tsland 2) [37] Vì khuẩn theo đường tiêu hóa xuống ruột rơn và nhận Tân ở vừng nảy Tiếp đó vì khuẩn thương hản vào hạch rdạc treo ruột nhờ các tổ bào M (lại thực bảo của màng Payer) Từ mu, vì khuẩn đến lách và cơ quan khác Tại ruột vị khuẩn chết giải phóng nội độc tỏ Xôi độc tổ kích

thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử, chảy máu và có thế gây thủng ruột

Những trường hợp năng có thế có đầu hiệu ly bì, hôn mẻ, trụy tim mạch, không,

được chữa kịp thời có thê dẫn tới tử vong[24]

Déi với khả nàng gây bệnh nhiễm khmẩn và nhiễm độc thức ăn, chủ yếu là vi khuẩn S enteritidis va S gphimurium Nbiéu Salmonella niu S tphimurian, S

choleraesnis, S dublin cd vac plasmid mang cau gen dic luc spv (Salmonella

Plasmid Virulence) Cac en spv định vị trên mét regulon gdm gon digu hos spvR va 4, bến gen cầu lrúc spvA-B-C-D Cac gen spy gidp lăng cường sự phát triển củn Salwonella trong đại thực bào và các tẾ bào thực bảo khác, Sự hủy hoại của tẾ bảo

và sự chết của vi khuẩn giải phóng đòc tô gây tổn thương cho cơ thả chủ và tạo nên

các triệu cling lam sing

Các phương pháp chấn doán vi khuẩn này hiện nay ở các trung tâm xét

nghiệm vẫn sử dụng là nhuệm soi trực tiếp tử bệnh phẩm, cây máu, cây phân hoặc tiễn hành chấn đoán gián tiếp bằng phản ứng Widal (phản img ngưng kết phát hiện khang thé chéng vì khuẩn thương hản trong huyết thanh) Tuy nhiên, với múc độ nguy hiểm của loại vì khuẩn này, thí việc chân đoán sớm là yếu tô tiễn quyết giảm

thiểu nguy co bién chimg cho bệnh nhân Chỉnh vì vậy ngày nay các phương pháp

sử dựng kỹ thuật sinh học phân tử lại được chú ÿ đến bởi tính nhanh, nhạy và đặc

Be ate as a

r đề nhận biết đó là các

a DA od ut Mad pout akg

hiệu Đổi với ví khuẩn nay, có nhiều đâu Ấn sinh học phi

gen độc lực, gon ma héa cho các kháng nguyễn đặc Irưng, một số phải kể đến như gen Salmonella plasmid virulence (spv), invA gen, 16s rRNA [19]

1.2.4 Proteus mirabilis

Proteus là trực khuẩn, Can âm, kích thước đài khodng tir 0,4 dén 0,8 pun và

ròng khoảng tử 1,0 dẫn 3,0 um, di dong dé dang bing cac tiền mao Ky khi tủy tiện,

là vi sinh vật dj dưỡng, có cš hai kiểu trao đối chất: hồ hấp vá lên men Nhiệt dé

tăng trưởng tôi ưu la 37°C Proeus thuộc ngành Proieobaeteria, lớp Gamma

Proteobacteria, dang Enterobacteiales, ho Enterobacteriaceae Dua vio tinh chat

sinh vit héa hoc nguéi ta phan loai Proreus thanh cic loi: Proteus mirabilis,

Proteus wilgaris, Proteus myxofaciens, Proteus permeri, Proteus 1a vi khuẩn “gay

bệnh cơ hồi” Có khả năng gây bệnh cho con người, tạo ra enzyme protease phân giải prolein làm nhiễm trùng Ông miệu, và gầy ra thững thương tốn khác cho cơ thể

Neo độc Profeuz vì khuẩn này nhiễm trong thịt và càc sán phẩm thịt có thể gây ngộ

độc cho người Ngoài enzyre prolease, vi khuẩn này còn có các yêu tổ độc lực và

các nội độc tố khác nint hensolysin, flagella, immunoglobulin A(led), [24]

Như đã nói đền ở trên, vi khuẩn Profews xirabilis là vị khuẩn cơ hội thường

gây viễm tiết niệu, đây cũng được xác đình là một cứa vào gầy NEH trong trường

hợp nhiễm trùng đường niệu nặng, cỏ tổn thương Do vậy, việc xác định vi khuẩn nảy sớm giúp Ích cho việc điều trị cho bệnh nhân

1.2.5 Nhóm các vì khuẩn khác thuậc ho Enterobacteriaece

Ngoài các vi khuẩn kế tên trn nhur £ coli, K pneumoniae, Sanonella sp,

Profeus sp cồn cỏ các vị khuẩn khác thuộc ho Enterobacteriaece nh Citrobacter

sp, Enterobacter spp, Shigella sp, Yersaiia sp Những vì khuẩn này thường gầy bệnh đường ruột mà ít khi là tắc nhân gây NEH [20]

1.3.Phương pháp chấn đoán xác định vi khuâu gây bệnh

1.3.1 Kỹ thuật xút nghiệm truyền thẳng phút hiện vi khuẩn

a Xếi nghiệm trực tiến

- Nhuộm Gram: nói chung, theo phương pháp thông thưởng, xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyễn gẩy bênh ví lần nhiêu loại vi khuẩn Chỉ các tiều bản của các bệnh phẩm là máu,

dịch não tủy hay các địch cơ thế mới có giả trị trong chẩn doan cản nguyên phế cầu

'Nhuộm Cram tiêu bán đờm cũng có giá trị xác định căn nguyên [37]

- 'Thử nghiệm sinh hỏa: với mỗi loại vì khuẩn có các thử nghiệm sinh hóa khác nhau, phôn biệt dựa vào cáo đặc điểm của Lng loài nữưư khả rồng lên men đường, lay không lên men, khả năng sản sinh những chất hóa học đặc trưng hay khả năng thủy phân, khả năng phát quang khi nhuộm hỏa chất [23], [37]

b Nuôi cẩy phân lập

- Tủy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cây phù hợp

- Câu mẫn bệnh phẩm được nuôi cẩy lên môi trường nuôi cây thích hợp Phương pháp xác định vĩ khuẩn qua quan sát hình thái khuẩn lạc và các đặc tỉnh sinh hóa của từng loài vị khuẩn Khác nhau

Nuôi cấy phân lập đương tỉnh được coi là tiêu chuẩn vàng trong chấn đoán

bệnh Một bệnh nhân được tiến hành cấy máu trong trường hợp có sối hoặc nghỉ 'NEH Cẩy máu theo một chu trình kín vô kuẫn (lẫy 3-5ml máu tĩnh mạch cấy vào

canh thang brain-heart infusion hay canh thang thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu

10 phần canh thang hoặc cho vào chai cấy máu do cáo hãng sản xuất sắn, sau đó ủ ở

37?%/ 5% CO/18-24 giờ Nếu dương tinh cây chuyển sang các mỗi trường thạch

(thạch mâu 5%, thạch sôcôli) [24]

c Chấn đoán ngưng kết

- Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kinh: Lựa trên nguyên lý của phản ứng kết

hợp kháng nguyên vỏ của vi khuẩn với kháng thẻ đặc hiệu tương ủng tạo sự ngưng kết Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dựng cho thử nghiệm ngưng kết

trên phiến hôn có sẵn, giúp cho việc xác đình các khuẩn lạc nghỉ ngờ có phải là vi khuẩn nào gây bệnh

-_ Chẩn đoán huyết thanh học: Phương pháp chơng pm huyết behơng pắchthanh

của bệnh nhân, dựa trên cơ số: huyết thanh người mắc bệnh có chứa kháng thể phản ứng đặc hiệu với yếu tổ gảy bệnh (kháng nguyễn), thường là vi khuẩn (phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể) được gọi là thử nghiêm Elisa Phức hợp

khang nguyên-kháng thể sẽ được nhân biết bới công hợp kháng huyết thanh tương img gan với enzyme peroxidaza hoặc phosphafaza gây chuyển mầu cơ chất phủ

hợp Kết quả phản ứng được đo bằng thiết bị đo quang phổ và thông qua độ đậm đặc khác nhau của mâu säc mà đảnh giả mức độ phản ửng của mẫu xét nghiệm [23],

Nguyễn lý cơ bản cũu PCR

Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một đoạn gen mong muôn lên

hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hai đoạn mỗi oligonneleotide gắn với

hai đầu 3° 4 ca hai soi ctia doan ADN dich (target sequence) véi su tham gia của

ADN polymerase Phan tng PCR là một chuỗi chu kỳ nỗi tiếp nhau, mỗi chu kỳ

gồm 3 bước:

Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cân thiết

cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng

chảy (Tm) của phân tử, thường là 94°C dén 95°C trong vong 30 giây đến 1 phút Day là giai đoạn biển tỉnh (Denaturation)

Bước 2: Nhiệt đồ được ha thập (thâp hơn Tm của mỗi) cho phép các môi bắt

cặp với ADN khuôn, nhiệt độ này giao động trong khoảng từ 40°C dén 70°C tuỳ thuộc vào Tm của môi, thời gian gắn môi kéo đài từ 30 giây đến 1 phút 30 giây Đây là giai đoạn lai (Anealing)

Bước 3: Nhiệt đô tăng lên đến 72C giúp cho ADN polymerase hoạt đông

tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào đô đài của trinh tư ADN cần khuếch đại

Thường kéo dài từ 30 giây đền nhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp hoặc kéo đài

(Extension)

‘Taq polymerase synthesizes

T .xẽ

spor mit Erect Rapa

Hình.1 Các giai đoạn tông hợp của phản ứng PCR [10], [36]

Một chu ky gom 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây lả sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo tỉnh toán sau 30 chu kỷ sự khuếch đại sẽ là 10 so với lượng mẫu ban đầu.

Do kỹ thuật và phản ứng PCR rit nhay nén phai tinh sx nhiém chéo giita

các AL?N khác có trong phòng thí nghiệm và điểu kiện làm việc thực hiện các phân

ứng phải nghiêm ngặt

1.322 Kỹ thuật PCR đu mỗi (PCR da méii

PCR là một trưng những kỹ thuật phố biến hiên nay trong nghiên cửu và

được sử đụng rộng rãi trong chân đoản Tuy nhiền, chân đoán bằng PER có nhược

điểm là chỉ thực hiện được phản ímg đơn lô phát hiện một tác nhân vi khuẩn gãy bệnh, như vậy giá thành sẽ cao Để tăng cường khả nắng chấn đoán và vượt qua

những thiểu sót cúa PCR, Chamberlain và công sự là những người đầu tién mé ta, phát triển kỹ thuật PCR đa môi vào năm 1988 Trong kỹ thuật PCR đa mỏi, nhiều

gen dich duge khuốch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mỗi trong củng một phán ứng Kỹ thuật PCR đa mỗi tiết kiêm théi gian, công sửc và đóng vai trò rất quan

trợng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tỉnh đa hình AI2N, phân tích định lượng, phân tích đột biển [10]

Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chan đoàn

xác định virmml, vì khuẩn, tằm va ky sinh trùng và xác định kiểu gan [9, 17, 39] Xét

nghiệm chân đoán xác định sự cỏ rnặt của mẫm bệnh dựa trên sự tổn tại của axit

nhân cúa vi sinh vật trong chân doán NEH cỏ thể được chia ra Thành 2 nhỏnt (0)

xác định ADN cứa mẫm bệnh từ chai nuôi cẩy và (1i) xác định vi sinh vật trực tiếp

từ máu, huyết thanh/huyết tương Hiện nay, người ta có thể chia thành ba chiến lược khác nhau trong thiết kế các xét nghiêm xác định các AI3N của mắm bệnh Chiến

lược thứ nhật là thiết kế các bộ mỗi (primers) đặc hiện cho từng mảm bệnh, chiến lược thử hai là thiết kế các bộ mỗi cỏ thể bắt cặp với một đoạn gen chung cho nhiều

indie nh như khu vực 168, 3S, vi 238 cia RMA hoặc 18; 588, và 288

xibosomal của DNAs DNAs); chiến lược thứ ba là äp dung PCR da mỗi dé phat biện đồng thời nhiều mâm bệnh Việc nghiền cứu phần tứ rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất được sứ đựng đỗ xác định mỗi quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật,

vi rRNA eó mặt ở tắt cả cáo loại vi sinh vật, có khá năng xác định, có tính bảo thủ

cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhám vi sinh vật Trong ba gen mã hỏa

MRNA của vi khuẩn như 5§ rRXA, 168 rRNA va 238 rRNA thi gen mA héa 16%

xRNA có lính đặc liệu cao Gen táy có kích thước khoảng 1500 nrucleolid, il thay đổi và phô biến trong các loài vi khuẩn cho phúp xác định cỏ họ vì khuẩn mày hay

không trong mội mẫu bệnh phẩm Tìo vậy, trong đề tại này chímg tôi thiết kế một cấp mỗi bắt trỉnh tự bảo tồn của khm vực 16S rRNA phát hiện các tác nhân vi khuẩn

thuộc họ vị khuẩn Ewerobacteriaccae Tương tự với các loài vì khuẩn khác thuộc

họ này qua tham khảo các tai liệu, chủng tôi sử dụng gen đỉch là øi44 mã hóa cho

enzyme beta-D-glucuronidase dé phat hện sự có mặt của vi khuẩn £ coli [8], [13], [19], [26] Với vị khuẩn Klebsiella pneumoniae dé xdc định sự có mặt cửa vì khuẩn

này bằng PCR người ta sir dung gon mud héa cho cuzyanc Tdchyde dehydrogenase A (al44) tìm gen đích [17], [33], [27], [36] Vì khuẩn Samanelfa có nhiều loài khác nhau Nhém gây bệnh thương hàn và phỏ thương hàn ở người là 5 gi, # paralyphi A, § parapphi Việc chẵn đoán Không phản biệt ba loài vì khuẩn trên, người ta sử dụng gen đích là 768 rRNA [11], [19] Déi von vi khudn Proteus

mirabilis người †a sử dụng gen đích phỗ biển nhật là gen Ure mã hóa cho enzyme

Urease [18], [22], [34], [34], [35]-

1.ã.â Tách chiết ADN sử đựng công nghệ loại bỗ ADiV người

1.3.3.1 Sự cắn thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong châu đoân tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết

Để giảm thiểu ảnh hướng của các yên tổ bát lợi quá trình PCR đa mỗi cần phải

được côn nhắc từ khâu thiết kế môi, quy trình tách và làm sạch ADN bệnh phẩm

thay dối các thành phần phụ giá cho phám ứng Một khó khăn nữa

trong việc triển khmi kỹ thuật PCR vào chân đoán tác nhân vi sinh vật gây NKH đó

là lượng ADN người có trong mẫu bệnh phẩm máu: thông thường một bệnh nhân

NKII (nhiễm £ eal) sẽ có những biểu hiện lâm sàng đầu tiên khi mật độ vi khuân trong máu ở mức 100-1000CFUAml [2], [25] Trong khi đó mét phan img PCR str

dung ADN thu nhan tir Kit tach Qiagen, chi cé thế phát hiện được ribosomal 16%

DNA vi khudn néu mat a6 otta chúng vượt quá ngưỡng 300 CEU/ml Vì thế với

trường hợp bệnh nhân nhiềm khuẩn nhập viện có mật độ vi khuẩn trong máu quả

thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẻ không thể phát hiên được, gây nên hiện tượng âm tính giá Ở một khia cạnh khác, các giá thuyết gắn đây cho

rằng sự tiến hoá hình thành tế bào nhần chuẩn (bao gém cả tế bảo người) là kết quả

của sự lại ghép giữa nhóm srcbaeal với proteobacterial hoặc cyanobacterial

prokuryoie, điều này cò nghĩa sẽ tôn tại cáo trinh tự tương đồng có tính bảo tồn cao giữa các nhóm tế bảo vi khuẩn, nắm men và tế bảo động vật có vú bao gồm cả tỶ

bào người [16], [29], [33], 138] Vi thé néu phim img PCR sử dụng các chuỗi mồi có

trình tự bắt cặp và khuếch đại các khu vue bao tồn cao (thuật ngữ Hỗng Ảnh là

highly conserved mnolil), hiện tượng dương tỉnh giá sẽ xuât hiện Để lạn chế các

hiện tượng âm tỉnh giả đo độ nhạy kỹ thuật thấp và đương tính giả đo bắt cập của

hiệu ADN vi khuẩn H

nay Kit lam gid ADN vỉ khuẩn đo hãng MolYsis, pó thể

cho hiệu quả là giàu 40000 lần nhưng giá thánh rãi cáo (khoảng E1MIn tách) [31]

ất khó được chấp nhận ở những nước †hm nhập thấp trong đó có Việt Nam

Để khắc phục nhímg khó khăn trên, chứng tôi thiết lập phương pháp loại bỏ ADN

người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn: Ý tưởng kỹ thuật này lả rnột điểm mới chưa

vi

tứng được triển khai tại bất cứ phỏng thi nghiém hay trung tâm chin đoán nào ở nước ta Các bệnh phẩm máu ngoại vi hoặc các dịch cơ thể có nghỉ ngỡ mang vi khuẩn được rửa bằng dich phd bach chu Mammalian cellular lysis (MCLBL) [14], 131], nhờ đỏ loại bê các thành phẩn ức chế phản img PCR như heparin, huyết sắc tổ

1.3.3.2, Co sở lý tuyết của công nghệ loại bà A1W người "làm giàu” ADN vi kiuẩn

Mục đích: tạo ra một loại dưng môi có khả năng phá bẻ tế bào người nhưng

bảo tôn được tế bảo vị khuẩn trong môi thời gian nhật định

Cơ sở lý thuyết: Mang tế bảo người và màng tế bào vĩ khuẩn có sự khác nhau

về thành phần cầu tao: Mang tế bào người yêu ởt, chú yếu là lipid vỉ thẻ đễ bị phá

hữy bởi dụng mời ky nước hoặc dưng môi phân cue (SDS, Triton X, NPAO chaps

Mặt khác các sợi nhiễm sắc thể là các đại phân tử đỗ bị đứt gấy trong các điều kiện

kiểm tinh cao, pH cao Trong khi đỏ, đối với vì khuẩn, màng lẾ bào được cầu tạo

chủ yêu là peptidoelycan, cũng cớ lipid nhưng thành phân không chiém tru th, đặc biệt co glycan (aluxiÐ), aiúp vi khuẩn chống chịu được các điều kiện hóa chất nghiệt ngi (pH, chit tay rứa) Chính vì thế, chủng tôi sử dụng các chất tẩy rửa và các chất

phân cực như SDS, Trion X-100, NP4, Chaps và sứ đụng các bufer có bước nhảy pÏ1 kiểu tính [14], [31] Sau khi thứ nghỉ hủ được đụng môi cần tìm, dụng

môi này số loại bỏ được ADN người trong khoảng thời gian nhất định, chứng tôi sử dụng đụng địch sát yếu để trung hòa, khí đỏ pH trở về pH trang tính Ở pH này tế bào vị khuẩn sẽ không bị ảnh hưởng, Quá trình ly tâm tiếp theo sẽ thu được tẾ bào

vi khuẩn lắng cặn ở dưới, phản phía trên lả các nhiễm sắc thể của tế bảo người bị

đứt gãy sẽ được loại bỏ Quả trình tách chiết ADN vi khuẩn sẽ được tiễn hành theo

quy trình tách chiết thông thưởng hoặc sử đựng các kít tảch chiết ADN thương mại

Hiệu quả loại bỗ ADN người sẽ được đánh giá băng việc định lượng nồng

đô gen betaglobin cỏ trong mẫu tách chiết có xử lý và không qua xử lý loại bỗ ADN người và có so sánh giữa đúng môi tự chế với kít loại bỏ ADN người Molysis

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIEN CUU

2.1 Đối trựng nghiên cứu

+ — Các loài vi khuẩn được phân lập và nuôi cấy đo Khoa Vì sinh vật tại

Bệnh viện TƯỢP 108 cung cấp

- Nhém vi khuẩn chứng đương: nhằm kiếm tra và đánh giá bộ mỗi thiết kế, độ nhạy kỹ thuật là ADN được tách chiết từ các loài vi khuẩn thuộc họ

Emerobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp,

Proteus mirabilis, Enterobacteriaceae sp} 48 biét néng độ và được pha loãng nông độ từ 10” đến 109CFLJ/ml),

- Nhóm chứng âm: nhằm kiểm tra độ đặc liệu của các bộ mời tiết kế có bắt

cặp chéo với các loại ADN người hoặc ADN của các loài vi khuẩn khúc gãy hiện tượng duong tính giá hay không, bao gồm: ADN được tách chiết từ các loài vi sinh vật khác không thude ho Enterobacieriaceae: Staphylococcus

aureus; Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

bawnanii ; ADN được tách chiết từ mẫu máu nguỡi khỏe manh; ADN virut

viêm gan B; HSV, EBV và nắm

+ Nhóm mẫu bệnh phẩm máu thứ nghiệm: nhằm đánh giả hiệu quả sử đụng

bộ sinh phẩm tạo ra lá sinh phẩm loại bẻ ADN người làm giàn ADN vi khuẩn và phan ứng PCR đa mỗi đã tôi mu trên các mẫn bệnh phẩm lâm sảng Kết quả PCR da

xôi được dỗi chiểu song song với kết quả nuôi cấy vì sinh Nhóm này lỏ mẫu ADN, tách chiết từ bệnh phẩm máu được thu thập từ các bệnh nhân nghỉ ngờ NKH

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Tháng 01/2014 — 13/2014

- Địa điểm nghiên gứu: Khoa Sinh học phân tử ~ Khoa Vĩ vinh - Bệnh viện TƯQỢĐ

108.

2.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.3.1 Cúc hoá chất, sinh phẩm

Các hoá chất, sinh phẩm, trang thiết bi được sử dựng tại Khoa Sinh học phân

tứ và Khoa xét nghiệm Vi sinh vật, Bệnh viện TƯQĐ 108

Bảng 2 Danh mục các hứa chất sử dụng trong nghiên cứu

"Thang chuẩn DNA ladder Fermentas

Hotstart DNA polymerase Themo (Mỹ0

“May sequencing CEQ 8800 Beckman

May soi gel & chựp ảnh Gel-Doc — Dolphin

Máy đo quang pho DU 730 Beckman

May ly tâm lạnh Eppendorf

May khuay tir gia nhiét model RCT | IKA

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2 Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ưu hóa PCR đa mỗi

Hình 3 Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người

2.42 Thiết kễ các cặp môi sử dụng trong PCR và PCR đa mỗi

Nguyên tắc thiết kế môi

`- Các cặp môi đơn được thiết ké bắt cấp đặc hiệu vào các khu vực ít thay đổi nhất cho mỗi loài như các gen mã hóa cho protein độc tô đặc trưng của loài

- Các cặp môi không bắt cặp chéo với nhau (khi thực hiện phản ứng đa môi)

và không bắt cập với genome ADN người

~ Ngoài các bô mỗi đơn đặc hiệu cho mỗi loài, chủng tôi còn thiết kế một cặp môi bắt vào khu vực it thay đổi nhất phát hiện họ vi khuẩn Euerobacteriaceae

- Sự khác biệt về kích thước giữa các đoạn sản phẩm tạo ra nằm trong khoảng 80 đến 100 bp, nó đảm bảo cho việc các đoạn sản phim cé thé dé dang

được phân biệt khi điện di trén gel agarose 1,5-2,5%

Các cặp môi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong để tài được sử dụng

cho phan ứng PCR nhân các đoạn gen đích cỏ trình tự tương ửng:

(A) _ Hinh ảnh blast trình tự môi với các trình tư gen của vi khuẩn Z coli đã công

Đổ trên ngân hàng gen

(B) - So do thiét ké méi K pneumoniae stt dung phần mềm Vector NTI 11.0

Các cặp môi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng

cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích co trình tự tương ứng (Bảng 4):

Bang4 Trinh tự mỗi trang phan imy PCR da moi phat hién tic nban vi khuẩn

Š TIGTTGIT-3

SGTTGTAAAG(Œ7DACT Emi-F 1/G)GG(T/G)G

Enterobacteriae | PtP toa im FOGGTOVGA | 16s ribosomal | 424

Fur | SOCCTCAAGGGCACAA RNA gane

° CCTCCAA-3”

Gen nội chuẩn : Bgiebin | ’ AGAAGAGCCAAGGA Seance hemoglobin 180

, CAGCTACG-3 beta globin

Belobin | sractracrGaacacag | chai" HBB)

Hình a: là bộ môi nội ehuẩn Ent xác định họ vi khuẩn Euterobacteriaceae và môi

nội chuẩn betaglobin;

Hình b là bộ môi phát hiện một số tác nhân vì khuẩn cụ thể thuộc họ Enterobacteriaceae

2.4.3 Quy trinh tich chiét ADN tie cde chiing vi khudn nghién cira

Chúng tôi tham khảo tải liệu của Sambrook I và es năm 1989 [36], quy trình tách như sau:

2.44 Tách chiết LDN từ các mẫu bệnh phẩm

Với những hiểu biết về nguyên lỷ và cơ chế loại bỏ ADN người “làm giàu” ADN vị khuẩn chủng tôi đã tiễn hành các bước xử lý ADN và tách chiết như sau:

1 1000 HÌ máu tổng số + 120001 dịch phá bạch cầu MCLB], lắc 1200 vòng/ phút ở nhiệt đỏ 37°C trong vòng 3 phút

2 Hỗ sung 2ml 1M Tris-HCI, pH4 lắc đều

3 Ly tâm 5000 G trong 05 phút

4 Loại bỏ pha trên

3 Bố sung 9001 mước muỗi sinh lý (NaCl 0,9%), vortex đều trong 1 phút

6 Ly tâm 5000 G trong 2 phút

? Loại bó pha trên thu cặn Đến bude nay khéi hồng câu, bạch cầu đã bị vỡ và

tị loại bố gân như hoàn toàn

8 Thêm 300 l NaOH 200 mM + SDS 2%

9 U 95°C trong 5 phút

10 Trung hỏa bằng 250 „1 Tris-HCL 1M pH 4.2-4,6

11 Thém 400 yl dung dich phenol, chloroform iscamylalchol 25:24:1 đắc đều}

12 Ly tim tde dé 161 da trong 20 phat

13, Thu dich néi

14, Thom 0.7 V isopropanul

15 Ly tam téc 6 161 da trong 30 phat

16 Thu tủa

17 Thân 700 pil Côn 75% rửa 2 lần ( ly tâm tốc độ 13,200 rprS phút)

18 Làm khô bằng máy speedvac trong 5 phút

19.Thêm 100 n1 Tihution buffer

tỳ a]

20 Do OD (ng/ul) Thông thường nếu quá trình loại bỏ ADN người thành công,

néng d@ ADN bênh phẩm sẽ tất thâp (đưới 1ùng/ml) thậm chỉ không thể xác định được nồng độ

2.4.5 Phương pháp xác định nẵng độ và đo độ tình sạch bing mdy quang phố

Đây là phương pháp cho phép định lượng tương đổi nẵng độ nucleic acid cd

trưng nấu

guyên tắc đựa vào sự hắp tu mạnh anh sảng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của

các base Giá trị mặt độ quang ở bước sóng 260 nmn của các mẫu đo cho phép xác

định nẵng độ nuclcie seid trong miểu dựa vào muối tương quan: | don vị OD260mm

tương ứng với nông độ:

+ 50 ngámL, cho một dung địch ADX sợi đôi

+ 40 ngámL, cho mét dung dich ADN hay RNA sợi đơn

Hàm lượng ADN được xảo định bằng công thức:

[ADN]= OD260 50 x X (ngán)

“Trong đó Ä lá số lần pha loăng từ dung địch ADN gốc ban đâu

Ngoài rà phương pháp này còn có thể xác định được độ sạch mẫu phần tích dua bến

Đã có được kết quả PCR như mong muốn đảm bảo về đồ nhay và đồ chính

xác của kỹ thuật bắt buộc ta phải có cào phương pháp tỗi ưu hoả nhản ng PCE và

PCR da méi Do vay, trong nghiền cứu này để tỉm được một quy trình chuẩn và

nằng độ tối m nhất cho phân ứng PCR vả PCR đa mỗi chứmg tôi lân hượt thử các

thành phan phan ứng với các nỗng đồ khác nhau dựa tiên quy trình PCR chuẩn

- Tổi tru dung dich đêm, nồng độ MgCl: (Mg”" được thứ ở những nàng độ khắc nhau từ 1,5 đến 4 mM, nông độ môi, nồng độ en⁄yme ADN Polymerase và

28

néng độ ÁI3N khuôn Sau mỗi lần thực hiện phản ứng với mối nông độ thành phân tham gia phản ứng, kết quả sản phẩm PCR duoc kiểm tra bằng điên di trên gel

Agarose Tăng sản phẩm PCR được lựa chọn lá những băng đêm nét nhất, đặc hiệu

đứng kich thước cần nghiền cửu và không e6 sin phẩm phụ Các thông số về nồng

ược Tới chọn cho các lần iến hành

độ của oác thành phẫn [ham gia phản ứng

phan ứng tiếp thco tương ứng với bảng sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu Đối với chu trình nhiệt cũng lần lượt thử với các nhiệt độ biến tính, gắn môi, kéo đài chuỗi khác nhau dựa trên đặc điềm, thành phân mnỗi, kích thước đoạn gen dich cần khuếch

đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản img PCR [15], [36], [37]

- Dua vào nhiệt độ gắn mỗi của từng cặp †a tìm được một nhiệt độ gắn mỗi tôi ưu nhất cho từng bô mỗi đơn, nhằm mục đích ở nhiệt độ đỏ hiệu quá gắn mỗi khméch đại đoan gen qnan tâm tốt nhất Do vậy, khi thiết kế mỗi nhằm đạt hiệu quả phần ứng PCR đu mỗi cao nhất chúng tôi đã thiết kế các mỗi có nhiệt độ gắn môi gần giống nhan Theo cáo lới liệu nghiền cửu và thực tế chúng tôi tiền hành khảo sắt các nhiệt độ gắn mời biến thiên trong khoảng + $°C so với nhiệt độ gẫn mỗi lý thuyết đỏ lá nhiệt độ nớng chãy của môi và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR Nhiệt đô nóng chảy của mới được tính bằng công thức m = 2 x (A+T) + 4x (G1C) Tuy nhiên nhiệt đô gắn mỗi thưởng tháp hơn nhiệt độ nóng chảy của môi từ

3 dén $°C [15], [36], [37]

247 Phuong pháp điện đi

Diện đi ADN là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vi đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sắt được các phân tử

ADN bằng mắt thường Trang nghiên cứn này chúng tôi sử dụng phương pháp điện

di én gel Agarose Sản phẩm ADN được điện d trên get Agarose sé lao thành các giải băng khác nhau ADN mang điện tỉch âm di chuyên từ cực âm sang cực đương,

tốc đỏ di chuyễn phụ thuộc vào kích thuớc phản tử, đạng cấu trúc ADN, nồng độ

Agarose, điện thể, nhiệt độ và thánh phản chất điển di Dựa vào kích thước từng

đoạn gel được nghiên cửu và khả nảng phân tách của gsl Agarose, chúng tồi sử

dụng kỹ thuật điện đi trên gel Agarose 2% nhằm mục đìch xác định khoáng kich

thước các băng khi được điện di cùng thang ALN chuẩn

- Chuẩn bị gel Agarose 2 %:

- Quá trình điện đi và kiểm tra sản phan PCR:

+ Điện di thực hiện thao phương nằm ngang với đòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 40 phút

+ Ran khi nhuêm gel được quan sắt và chụp ảnh bằng máy sơi gel Dolphin-

DOC(38]

2.4.8 Giải trình tự gcH

“Tất cả mâm bệnh san khi được xác định bằng PCR đơn mãi đều được tiền

hành khẳng định bằng phân tỉch giải trình tự gen (Sequencing) Xét nghiệm này được liển hành trền hệ thông Seq 8800 (Xeckruan Coulter, M§) tai Khoa Sink hoc phân tử - Bệnh viện TUQD 108 Quy trình kỹ thuật được tiến hành như sau:

Tình sạch sâu phẩm PCR giải trinh tực

a Chuẩn bị ống 9.5ml (đã khử lrùng, số lượng ông tương đương với số lượng 1uấu cần tỉnh sạch)

b Thêm vào mỗi ống 0.3m] hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop Sơlution)

với các thành phần và thể tích như sau:

20mg/ml Glycogen (Cung cip kém theo 0.3p1 DTCS Quick Start kif}

¢ Chuyén toàn bộ đụng dịch phần ứng PCR giti trivtr tr vào ông 0.3m di ed

hn hgp Stop Solution và vortex trong, vai giây,

30