Luận văn phân tích Đặc Điểm sinh học phân tử gen np gen ns của một số chủng virus cúm a h5n1 mới xuất hiện năm 2011 tại việt nam

Tỷ lê %4 dồng nhất về nuelcotidc trên dường chỏo vả tương, đồng về amimo aeid đưới đường chéo gen NP giữa một số chủng củm A/HSN1 của Việt Nam va thé giới Danh: sách các chủng virus cúm

DẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Duyên

PHAN TICH DAC DIEM SINH HOC PHAN TU

GEN NP, GEN M VA GEN NS CUA MOT SO

CHUNG VIRUS CUM A/H5N1 MOI XUAT HIEN

NAM 2011 TAI VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC ST KHOA HOC

Hà Nội - Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI TRƯỜNG DẠI HỌC KHOA HỌC TU NIDEN

Phạm Thị Duyên

PHAN TÍCH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHAN TU GEN NP, GEN M VA GEN NS CUA MOT SO

CHUNG VIRUS CUM A/HSN1 MOI XUAT HIEN

NAM 2011 TAI VIET NAM

Chuyén nganh: Vi sinh vit hoe

Mi sé: 60 42 40

LUAN VAN TIIAC SI KIIOA IOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LỄ THANH HÒA

Hà Nội - Năm 2012

DANH MỤC CÁC KY HIRU, CHU VIET TAT VA GIẢI NGHĨA

DANH MUC CAC BANG

DANII MUC CAC DING

G QUAN TAL LIEU

BENH CUM GIA CAM A/HEN1

1.1.1, Tình hình bệnh cúm A/HSNI trên thể giới

1.1.2 Tình hình bệnh cúm A/IISNI tại Việt Nam

DAC DIEM SINH HOC VIRUS CUM A/HENI

1.2.1 Phân loại và danh phap virus chim A/HSNL occ csescessseesssst sien

1.2.3 Dịch tễ học phân tứ virus cũm AJIISNI

ĐẶC ĐIỂM CÂU TRÚC VÁ DẶC TỈNH DI TRUY

CỨM A/H5NI

CUA VIRUS

1.3.1 Dặc điểm hình thái và cấu tao clia virus cum AMTISNI oes

1.3.2 Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen virus cửn A/HSN1

1.3.3 Hiện tuong cdl — ghép mRNA 6 virus cim A/HSNT -

CÂU TRUC VA CHUC NANG CAC PROTEIN NP, M ¥A NS CUA

VIRUS CUM A/TISN1

T.4.1, Protein NB eoesensieneensnctiisie vents

1.4.2, Protein dim M (matrix protem)

1.4.3 Protein phi cdu ire NS (non structural protein)

TÂM QUAN TRỌNG CỦA NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ BIẾN

BOL DI TRUYEN CAC GEN NP, M VẢ N5 CỦA VIRUS CÚM

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1, Tach chiét RNA tổng s

3.3.6 Xử lý số liệu bằng chương trình lin-sinh học co

CHƯƠNG 3: KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Thu nhận, giải mã gen NP, genM, gen NS của virus cúm A/IISN] chủng Dk-VN-QT800 va Dk-VN-QT1603

3.1.1 tách HNA tổng số vả thực hiện phản ứng RT-PCR,

3.1.2 Thực hiện RT-PCR, thu nhận vả giải trình tự gen NP

3.1.3, Thực biện RT-PCE, thu nhận và giải trinh tự gen M 3.1.1 Thực hiện ET-PCR, thu nhận vả giải trình tự gen NS

au

Phân tích so sánh thành phần gen, mỗi quan hệ nguồn gốc phã hệ của

YN-QTR800 va Dk-VN-OTI1603 voi các chúng cửa Việt Nam và

3.3.1 Phân lich gen NP

ANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIỆT TẮT VẢ GIẢI NGHĨA

Luria-Bertam

Low Pathogenic Avian Influenza Matrix

Muscovy duck Molacular Evolutionary Geneties Analysis

Neuraminidase Nueleotide

Nuclear Export Protein Nueleoprotein

Non structural protein

Polymerase acidic protein

Polymerase Chain Reaction

11

"Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa

tiếng Việt

Axit amin Cap bazar

Gà Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein

Vit Axit deoxyribonucleic

Tién chat dNTP cho phản ting PCR don phân cấu tạo

Ngống, Ngg kết hồng cầu

Kilo bazo

Môi trường Luria-Bertani nudi cây

vi khuẩn Cum gia cam thê dộc lực thấp

Đrotein đệm Ngan

Chuong trinh phân tích tiến hóa

gen Enzyin phin gidi sialic Nucleotit

Protein vận chuyên

Protein whan

Protein không cau trac

Enzym polymerase 6 tính axit Phan ing PCR

Negative single-strand Ribonucleic Acid

Tris-Acetate-EDTA, Tumor Necrosis Factor-a

World Health Organization

Vv

Axit ribonucleic

Tế hợp protein lién két ribonucleic

Phan ứng PCR ngược ARN soi don 4m

Tris-Acetate EDTA 'Yếu tổ ø gây hoại tử khối tr

Danh sách các mỗi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ vả giải mã

cae gen NP, gen M va gen NS cia virus cam A/HSN]

Thanh phan phan tng RT-PCR

Thanh phan phan tng néi

Danh sách các chủng virus cúm A/HSN] của Việt Nam va thé

giới sử đụng gen MP trong phân tích so sánh thành phan gen và

mỗi quan hé ngudn péc pha hé

Vị trí sai khác nuoleotide và amino acid cúa gen NP chứng Dk- VN-QT800 và chủng Dk-VN-QT1603 với 20 ching virus com AVHSNI đăng kí trong Ngân hàng gen

Tỷ lê (%4) dồng nhất về nuelcotidc (trên dường chỏo) vả tương, đồng về amimo aeid (đưới đường chéo) gen NP giữa một số chủng củm A/HSN1 của Việt Nam va thé giới

Danh: sách các chủng virus cúm A/HSN1 của Việt Nam va thé

giới được sử dựng gen M trong phan tích so sánh thành phân gen

và mỗi quan hệ nguồn gốc phả hệ cccccccoien

Vị trí sai khác nueleotide và anuino acid của gen M1 va gen M2 chúng Dk-VN-QT800 và chủng Dk-VN-QT1603 so với 20 chúng virus củm A/H5N] khác

Tỷ lê (4) đẳng nhất về nuelcotide (rên đường chéo) và lương, đồng vẻ amine acid (đưới đường chéo) của gen MỊÌ giữa các

chứng cửm A/HSN1 của Việt Nam và thế giới

Tỷ lệ (9%) đồng nhất về nueleotide (trên đường chéo) và tương déng vé amino acid (đưới đường chéo) của gen M2 giữa các

chứng cửu A/H5N1 của Việt Nam và thể giới

38

3.9

Tanh sách các chủng virus củm A/IISN1 của Việt Nam và thế giới được sử đụng gen NŠ trong phân tích so sánh thành phẩn gen

và mỗi quan hệ nguồn gốc phả hệ ccooocrcec

Vị trí sai kháe nueleotide và amino acid của gen NSI chủng Dk-

VN-QTS§OU và chủng Dk-VN-QT1603 so với 20 chủng virus

Ty lệ (%) đồng nhất về macleotide (rên đường chéo) và tương

đồng về amino acid (đưới đường chéo) của gen VSI giữa các chủng cửm A/HSN1 của Việt Nam và thể giới

Tỷ lê (%) đồng nhất về nucleotide (én đường chéc) và tương

đồng về amino acid (đưới đường chéo) của gen VS2 giữa các chủng cửm A/HSN1 của Việt Nam và thể giới

vi

57

58

6l

Sơ đã danh pháp quốc tế các chủng virus củm A

Cứ chế xâm nhiềm của virus cúm A/HSNT ổ lế bảo chủ

Da nhiễm các clade virus cm A/HSNI thể độc lục cao tại Việt

Nam từ 2001 — 2ÓØ7 căn Hee

Anh chụp và mê hình tiểu phần virus cim A

‘M6 hình cấu trúc hệ gen virus cứu A/TISN]

Mö bình mình hoa hiện tượng cắt — ghép mRNA phân đoạn 7 (gen MO 6 virus cam A/ISNI

Cơ chế các hep phan polymerase cta virus cm A gay ra hién

tượng chuyén déi cde vi tri méi cat - ghép trong quả trình cắt —

ghép mRNA MI của virus

Mö hình mình hoa hiện tượng cắt — ghép mRNA phân đoạn 8 (gen NS) 6 virus cam A

M6 hinh vị trí các domain cia protein NP cia virus com

Su thay dỗi pH nhờ protein kẻnh ion M2 trong quá trình “cởi

Câu trúc bậc 2 của N51 và mó hình phức hợp NS1 va dsRNA

§ơ dễ các quá trình nghiên cứu phân tích 3 gom: gen NP, gen

M, và gen XS của vims cúm A/H5N1

Sơ dỗ bố trí các môi để thu nhận các phân doan gen P, gen M,

và gen NS của virus cúm A/HSN]

So dé cfu tao vector pCR°2.1 TOPO (Invitrogen) Kết qua diện di kiém tra RNA tong sé ctta cling Dk-VN-QT-

chúng IDk-VN-ỢI800 " ticuesceeceeeeeneectstissaesies

Kết quả điện đi kiểm tra san phim RT-PCR va DNA plasmid

(ai 4 hop gen NS

Phân tích điễn giải thành phan nucleotide và amino acid của gen

NS chủng Dk-VN-QTBOO

Cay pha he biểu thị mỗi quan hệ nguồn góc phả hệ giữa các

chứng cúm A/H5NI dựa trên phân tích trình tự nugleolide gen:

MP sứ dụng chương trình MLGA 4.0

Cây pha hệ biểu thị mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các

chủng cúm A/HSN1 dựa trên phân tích trinh lz nucleotide gen

MI va gen M2 sử dụng chương trình MHGA 4.0

Cay ph hệ biếu thi mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các

ching củm A/HSN1 dựa trên phân tích [rink Lr nucleotide cia

gen N81 và N82 sử dụng chương trinh MEGA 4.0

MỞ ĐẦU Virus cum A/LISN1 thuộc nhóm virus cam A, họ Orthomyxoviidae, bộ Mononogavirales, cé dic tính llích ứng đa vật chú, lưu hành chủ yêu ở quân thể

chùm hoang dã, nguyên nhân gây bệnh đường hỏ hấp phổ biến và gây ra dịch củm AATISNE d pia cdm từ năm 2003 đến nay

Dich ctun gia ci A/HS5N1 hén Lục tái phát bàng năm với tốc dộ lây lan nhanh

và điển biến phúc tạp tại nhiều quốc gia Việt Nam là một trong các nước có số

người nhiễm và tử veng đo cúm A/HSNI cao trong khu vực và trên thế giới, được

WHO xáo định là một trong các quốc gia “tiêu điểm”, có thẻ xảy ra địch cứm mới ở người cần đặc biệt quan tâm không chế

Hề gen của virus cúm A/HSNI có cầu trúc đặc trưng của hệ gen virus cúm A,

gồm 8 phân đoạn gen riông biệt mã hóa cho 11 proLoin khác rihau của virus

Trong quá trình lưu hảnh va gây bệnh, virus cứm A/IISN1 luôn có sự biến đải trong các phân đoạn gen thông qua các đột biến hoặc trao đổi các gen giữa các chủng virus A/HS5NI khác nhau, dẫn đến thay dối đặc tính kháng nguyên, khả năng

sây bệnh và thích ứng vật chú mới cúa virus Tính gây bệnh của virus cúm A/HSN]

thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức nắng tạo điểm cắt protease cia protein

đieasglutinin (HA) và hoạt tính enzyme của protein neurominidase (NA), mà còn cỏ

khá năng tối tổ hợp tạo virus mới, với đặc tính gây bệnh vả đóc lực khác nhau

Tiên cạnh các đối biến gen kháng nguyén HA (HS) va NA (NT) tao ra cae

NP chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và tê bào tương tế bào chủ, chủa

các đích tác động của thuốc ức chế và các epitope của vaccine Phân đoạn 7 (ren M)

xã hoá 2 protein đệm từ hai khung doe mé la protein nén M1 chịu trách nhiệm bao thọ các RNA tạo nên ribonncleoprotein (NT) và tham gia vào quá trình nãy chải

của vimuww; và prolem chuyển ràng M2 clnu trách riiệm “cối áo” virus trình diện hệ

gen trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ Một số chủng virus A/H5N1 xuất hiện các đột biến điểm kén ở protein M2 din tới kháng thuốc ức chế Amantadine Phân

đoạn 8 (gen NS) - phân đoạn ngắn nhất trong hệ gen virus cúm A/H5N1, mã hoá 2

protein phi cdu tric NS1 vA NS2 Protein NSI1 được coi là yếu tổ độc lực của virus nhờ khả năng tre ché tang hop imterferon của tế bào chủ, làm gia tăng độc hịc gây

bénh cia virus

Công tác nghiền cứu giảm sát chặt chẽ sự tiên hoá hệ gen cũng như các gen

cầu trúc của virus cứm A/TISNI là điều hết sức cân thiết hiện nay Qua đó, cho phép

dự báo địch tễ học virus A/TISN1 ở mức độ sinh học phân tử giúp định hướng sử

dụng vaexin phù hợp, tìm hiểu các vàng gen ổn định và đa biến giúp cho chiến lược phái triển vacxin thế hệ mới (đặc biệt là vaccime lái tổ hợp sử dụng kĩ thuật đi

truyền ngược (xeverse genetics-based vaccine)) đặc hiệu với chủng A/HSN1 dương

nhiễm

Nghiên cứu đặc tính phân tử các gen NP, M vả NS, không chỉ cho phép tìm

hidu đặc điểm biến đổi thành phan oucleotid va amino acid được mã hóa bởi các gen này của virus A/HSN1, ảnh hưởng cửa những hiển đãi đó đến độc lực, khả năng, xâm nhiễm trên vật chủ, mà còn cho phép phân tích mối quan hệ tiến hóa, xác định

phân type của virus cửm A/1ISN1

Xuất phát từ những yên cầu trên chúng tôi tiền hành đề tài:

“Phân tích đặc điễm sinh hoc phan th gen NP, gen M và gen NS cita một xố chững vius cùm A/HSNI mỗi xuất hiện năm 2011 tại Liệt Nam"

Vớ

1- Thu nhận các phân đoạn gen NP, M, NS vá giải trình trình tự 3 phân đoạn

gen này của một sỏ chủng virus củm A/TISNI phân lập từ bệnh phẩm gây bệnh củm

Cắt THIAC TIỂU SAU:

ga cảm G Viel Nam nam 2017

2- Phan lich, so sánh sự biển đổi trình tu nucleolid của 3 phân đoạn gen NP,

CHƯƠNG I

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Bệnh cúm gia cam A/HS5N1

1.1.1 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trén thé gidi

Năm 1996, virus cim A/HSN1 gây dịch cúm gia cảm ở Quảng Đông (Trung

Quốc) Một năm sau (1997) dich cúm gia cảm A/HSNI xuất hiện ở Hồng Kông, đã

có 6 người tử vong trong tổng số 18 người xác định nhiễm virus cúm A/H5NI trong

vụ dịch này, và là lần đầu tiên virus cúm chìm lây truyền trực tiếp sang người [75]

Thang 12/2003, dịch củm A/H5NI bùng phát trên gia cầm ở 9 quốc gia châu

Ả, trong đỏ có Việt Nam

Cho đến nay, dịch bệnh đã nhanh chỏng lan rộng và liên tục tải bùng phát ở

nhiều nước trên thẻ giới [36] Nhằm ngăn chăn dich cúm gia cảm A/HS5NI, hàng trăm triệu gia cảm đã bị tiêu hủy gây thiệt hại năng nẻ vẻ kinh tế

Đặc biệt, virus cúm A/HSN1 có khả năng gây bệnh được trên người, với

trăm người nhiềm vả tử vong trong các vụ dịch củm gia cảm xảy ra ở các quốc gia trên thể giới [77] [80] Virus cúm A/HSNI được coi là virus có độc lực cao nhất

cho đến nay [2], [70] Tuy nhiên vẫn chưa cỏ bằng chứng sinh học cho thây chủng,

virus cúm A/HSN1 đang lưu hảnh, có khả năng đề dàng thích ứng lây nhiễm từ gia cầm sang người và giữa người với người Các trường hợp người nhiễm virus cúm

A/H5NI được xác định là do tiếp xúc trực tiếp với gia cảm bệnh, hoặc do các yêu tô sinh học cá thể hay gia hệ có liên quan den khả năng tăng tính cảm thụ với virus [7],

[41], [80]

1.1.2 Tình hình bệnh cúm A/HS5N1 tai

Dich cum gia cam A/HSN1 bing phat lan đầu tiên vào tháng 12/2003, chỉ

trong hai tháng dịch đã nhanh chóng lây lan ở 52/64 tỉnh/thảnh trong cả nước, đã có

3 người nhiềm vả cả 3 đều bị tử vong (100%) trong vu dich nay [53]

lệt Nam

Cho đến nay, dịch bệnh liên tục tái bùng phát nhiều đợt hàng năm ở nhiều địa

phương trong cä nước, vả gân đây trong các tháng đầu năm 2012 dịch tải bùng phát

trở lại ở các tỉnh: Thanh Hoa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Sóc Trăng với 2

trường hợp tử vong trên người trong 2 tháng đầu năm 2012 [79]

Theo só liệu thông kẽ tích lũy qua các vụ dịch xây ra tại Việt Nam (tỉnh đến

tháng 4/2012; đã cỏ 61 người tử vong trong tổng số 123 người được xác định nhiễm

virus củm A/HSNI, đứng thứ 2 sau Indonesia (156/188) trong số các nước có tỉ lệ

người nhiêm vả chết do viưus củm A/HSNI cao nhất thể giới [79] Tỉ lệ người tử

vong/nhiêm do virus củm A/HSNI được thống kê qua các vụ dịch xây ra ở Việt

Nam từ 2003 đến nay, giảm tử 1009 (3/3) năm 2003 xuống còn 0% năm 2006 (năm Việt Nam khống chẻ thành công dịch cúm A/H5NI; nhưng tỉ lệ nảy lại tăng tới 62,5% (5/8) năm 2007 và 100% (5/5) trong năm 2009 vả 50% vào tháng 2/2012 [7], [41], [79], [80]

Số gia cảm mắc bệnh cúm cũng như số gia cảm chết, tiêu huỷ trong những, năm gân đây khá cao Năm 2011 toàn quốc có 22 tỉnh xảy ra dịch cúm gia cam với

số lượng gia cảm mắc bệnh cúm và lượng gia cảm chết hoặc tiêu huỷ gia tăng: lân

lượt lên tới 110.311 con và 151.356 con (Bảng 1.1) [85]

Bảng 1.1 Thống kê dịch cúm gia cằm tại Việt Nam từ năm 2007-2010 [85]

Nam | Số | Số huyện Số xã, phường Số gia cầm mắc | Số gia cầm chết,

Đặc biệt tỉnh Quảng Trị là nơi liên tục xảy ra dịch cúm gia cằm trong những

năm gần đây Trong đỏ từ tháng 3 đền tháng 9/2011 ở tỉnh Quảng Trị đã xảy ra dịch

cúm gia cảm tại 12 xã của 4 huyện (huyện Hải Lăng, Gio Linh, Triệu Phong, thị xã Quảng Trị) với 35.000 con bị bệnh Đặc biệt ở huyện Hải Lăng dịch cúm đã xuất hiện tại sáu xã: Hải Hoà, Hai Dương, Hải Que, Hai Thiên, Hải Ba, Hải Tân với hơn

2.120 con gia cảm từ 16 đến 58 ngày tuổi phải tiêu huỷ Từ 01/01/2012 đến ngày

22/2/2012 dịch cúm gia cằm đã xây ra ở 36 xã/phường của 29 quận/huyện thuộc 12

tỉnh của cã nước trong đỏ có tỉnh Quảng Trị với tông số gia cảm mắc bệnh, chết vả

bị tiêu huỷ là 51.983 con [85] Điều này cho thấy rất có thể chủng A/H5NI lưu hành

đã có biến đổi làm gia tăng độc lực trở lại hoặc cỏ sự kháng với các thuốc điều trị,

đây là vẫn để dang can được tìm hiểu đánh giá [7], [41], [79] [S0] WHO đã xác đình Việt Nam lả một trong các quốc gia “điểm nóng” có thể xây ra đại dịch cúm

cần được quan tâm ngăn chặn, do virus củm A/H5N1 có được các điều kiện thuận

lợi đề tiền hóa thích nghĩ lây nhiềm trên người [77], [79]

1.2 ĐẶC ĐIỀM SINH HỌC VIRUS CỨM A/HSN1

1.2.1 Phân loại và danh pháp virus cúm A/HSNL

- Vitri phân loại cũa virus củm A/HSNI1

Virus cúm A/HSNI thuộc nhóm vius cúm A, ho Orthomyxoviridae, bộ Mononegavirales [6], virus cỏ đặc tính thích ứng đa vật chủ, lưu hành chủ yêu ở

quan thé chim hoang đã, gây bệnh đường hô háp phỏ biển và gây ra dịch cúm ở gia

cam từ năm 2003 dén nay [21]

Nhóm virus cúm A duoe phan chia thanh nhiều phân type (subtype), cac phan

type nảy được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính protein kháng nguyên bẽ

mặt của HA và NA [S0], [73] Cỏ 16 phân type HA (kỷ hiệu HI - H16) và 9 phân

type NA (ký hiệu N1 — N9) đã được phát hiện, về lý thuyết sự tổ hợp giữa các phân

type này có thẻ tạo ra hơn 144 chủng virus khác nhau [75], [77]

~_Kí hiệu và danh pháp virus cúm /HSNI

Cac phân nhóm virus trong nhóm virus cũm A du — oc ki hiéu theo kiêu hình

phân type (serotype) kháng nguyên HA va NA , viết tắt là A/HxNy Phân type virus cúm A/H5NI thuộc nhóm virus cúm A., kiểu hình phân nhỏm kháng nguyên HA là

Hồ và NA là NỊ, viết tit i A/HSNI [6], [49]

Các trình tự nucleotid gen /hệ gen của cac bien ch ủng virus củn A được đăng,

ki trong Ngan hang gen [88], hoặc Trung tầm dữ liệu các gen virus cum (ISD:

Tnfluenza Sequence Database) [S6] được quy định theo danh pháp của Tổ chức Y tê

Thế giới (WHO) baogòmth wu tự kí hiệu Tén Serotype/Loai dong vat bi

nhiềm/Vùng địa li phân lâp/Số hiệu đăng kí/Thời gian phân lập/Loại hình phân type

[HA(H) va NAGN)] [77] Vi du: virus cúm A /HSNI phân lập trên v it bệnh tại An

Giang - ViệtNamnăm 2005, sóhiệu đăngkiAG /05 códanhpháp là

A/Duck/Vietnan/AG/05/H5NI1 Đổi với các chủng virus củm A/H5NI phân lập

được ở người bị nhiễm, không có phân loài động vật bị nhiễm trong danh pháp Ví

Hình 1.1 Sơ đồ danh pháp quốc tế các chủng virus cứm A

(A: Phân lập ở các loài động vật; B: Phân lập trên người)

1.2.2 Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/HSNI trong tế bảo vật chủ

Virus củn A/HSNI kí sinh nội bảo bắt buộc, quá trình xâm nhiềm vả nhân lên

của virus xây ra chủ yêu ở các tế bảo biểu mô đường hồ hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], [54]

Quả trình xâm nhiềm của vưus củm A/HSNI được mở đầu bằng sự kết hop của HA(H5) với thụ thể thích ứng trên bẻ mặt các tế bảo và cuối củng là giải phỏng,

hệ gen của virus vào trong bảo tương của tế bảo nhiễm (Hình 1.2),

Quả trình nhân lên của RNA virus củm A/HSNI chỉ xây ra trong nhân của tế

bảo, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quả trình này xây ra trong

nguyên sinh chất) và cuối củng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bảo nhiềm nhờ

vai trỏ của enzym neuraminidase.

Thời gian một chu trình xâm nhiễm vả giải phỏng các hạt virus mới của virus

củm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ) Sự tạo thành các hạt virus mới không,

pha tan té bao nhiễm, nhưng các tế bảo nảy bị rồi loạn hệ thông tổng hợp các đại

phân tử, và rơi vào quả trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tôn thương mô của cơ thê vật chủ [72], [75]

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm vả nhân lên của virus củm A/HSNI ở tế bảo chủ [49]

Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bảo nhiễm, hệ gen của virus

sử dụng bộ máy sinh học của tế bảo tổng hợp các protein của virus và các RNA vận

chuyên phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein —

Trong nhân tế bảo các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương tử

khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương nảy chủng tổng hợp nên RNA hệ

gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi nảy không được Adenine hóa

(gắn thêm các Adenine - polyA) ở dau 5'- và 3'-, chủng két hop voi nucleoprotein

(NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh vả được vận chuyên

ra bao tương tế bảo Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thông enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 -

12 nueleotid Adenin ở đầu 5`-, sau đó được vận chuyền ra bảo tương và địch mã tại

lưới nội bào có hạt đề tổng hợp nên các protein của virus

Các phân tử HA và NA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên

mặt ngoài của màng tế bảo nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chỏi” (budding) của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyên trở lại nhân tế bảo đề kết hợp voi RNA tao thành RNP của virus Sau củng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nay chéi”, tao thành các “chỏi” virus gắn chặt vào màng tế bảo chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và

giải phóng các hạt virus trưởng thảnh tiếp tục xâm nhiễm các tế bảo khác [49], [50]

1.2.3 Dịch tễ học phân tử virus cúm A/HSN1

~ Trên thế giới

Ching virus củm A/HSNI được phân lập lần đầu tiên ở gà mắc bệnh tại

Scotland năm 1959 (A/Ck/Scotland/1959(HSN1)) Các công trình nghiên cửu hệ

gen cho thay chủng A/HSNI có nguồn gốc từ A/H6N2 trao đổi gen với A/H9N2

trên lợn, thuộc nhóm HPAI [49] Hiên nay, người ta lo ngại virus cim A/HSN1 co

thể lây truyền từ gia cầm sang người trực tiếp qua môi trường bị ô nhiễm, hoặc

thông qua vật chủ trung gian là lợn

Các chủng virus củm A/H5NI đang lưu hành hiện nay trên toàn cau đã biến

đổi khác xa so với chủng được phân lập ban đầu từ năm 1959 [33] Năm 1996,

HSNI được phân lập từ ngồng tại một 6 dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) và chủng, nảy được coi là chủng nguyên thủy tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cảm

trong 12 năm qua Chủng virus nguyên thủy này, lúc đó cung cấp nguồn gen HA(HS) cho tiền trình tái tô hợp tạo nên các chủng gây dịch bệnh trên gia cằm và

người ở Hồng Kông năm 1997, và nguồn gen khung khác của virus củm A/HSN1

Hồng Kông được kiên tạo tử virus củm A có ở chìm cut Riêng nguồn gen NA(N1) trong quả trình tiền hỏa, câu trúc của gen cỏ hiện tượng xóa di 57 nucleotide mã hỏa cho 19 amino acid hoặc 60 nucleotide ma hoa 20 amino acid tai ving dau N của

protein neuraminidase, va dét bién “xéa gen” nay của N1 cỏ liên quan đến tính

thích ứng của virus cúm từ thuỷ cảm lên gia cảm trên cạn và người [46] Đối với

gen HA(H5) đột biển giãn nở chuồi nỏi của điềm cắt protease giữa HAI và HA2 mã

hóa cho các amino acid kiểm (Arginine va Lysine) cỏ liên quan đền tiến trình tăng

cường độc lực và các amino acid nảy ở phân dòng Quảng Đông cỏ motif là - RRRKK- [17], [46] hoặc -RRRK- ở phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải

Sau một năm gây bệnh tại Hỏng Kông, do toản bộ đàn gia cam bị tiêu diệt, virus củm A/HSNI nguyên thủy gốc Quảng Đông không cỏn gia cam can đề gây bệnh, người ta tưởng chúng đã biến mật, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngồng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp

hình thành chủng mới [14], [76] Trong các năm 1997 - 2002, nhiều chủng virus

cum A/HSNI mang nhiều đặc tỉnh kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên clade 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, đề rồi bị

đảo thải trong những năm 2001 — 2002 [41] Tiếp tục, trong năm 2002 - 2003, gen HA(HS) có những đột biển mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên

(antigenic drift; dé r6i tao nén chting cé tinh gay bệnh cực kỷ cao, đặc biệt đói với

vịt, và có khả năng lây sang người [67] Dic tinh thich tng gay bénh trén ngudi

cảng ngày cảng cao dân, cùng với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ bao gồm vit, gà, ngan, ngống, chim cut, chim hoang dã vả người, đề rồi hình thành nhiều

chủng xâm nhập các nước phia Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [26], [57]

Có thể nói sau giai đoạn 1997 - 2003, virus củm A/HSNI đã đạt đến mức độ

hoàn thiện vẻ đặc tính gây bệnh và thích ứng đa vật chủ, trở nên môi nguy cơ gây

bệnh rất cao đôi với gia cảm va người trong cae nim 2004 — 2005 [41], [66] Tuy

nhiên, xét về di truyền học và tính kháng nguyên, các chủng HSNI giai đoạn 1997 -

2002 vân mang tính đồng nhất kháng nguyên củng với chủng nguyên thuỷ

A/Gs/Gd/1/96 và bat dau phân hỏa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 -

2005 [20] Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh ác liệt trong những năm

nảy ở các nước Đông Nam Ả là bằng chứng của sự đột biển “lệch kháng nguyên”

của củm A/HSNI [41], [81]

Cudi năm 2005, có nhiều đưới dòng của virus củm A/HS5NI cùng lúc được hình thành, đỏ là sự xuất hiện phân dong Thanh Hai (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage; tràn ngập

chau A bao gồm Trung Quốc, Hỏng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thai Lan [41], [66] tran sang Trung A, chau Au va chau Phi có tính gây bệnh cao đổi với người [82] Cac chủng thuộc dưới dòng Phúc Kiến có cau tric gen NA(N1) khéng thay đổi nhiều, nhưng gen HA(H5) cé motif amino acid ở vùng nối của điểm cắt protease

là -RRRK-, giảm mắt một Lysine (K) so với các chủng dưới dòng Quảng Đông [66] Trong các năm 2006 - 2008, tuy bình diện dịch cúm gia câm không ác liệt như

những năm 2003-2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng A/HSNI có biến động kháng nguyên và độc lực, vân đẻ dịch tế học cúm A/HSN1 có thể đã trở nên phức

tap hon [82]

- Tại Việt Nam

Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam trong những năm 2004 - 2006, thuộc dỏng, Quảng Đông, tập trung chủ yêu là genotype Z với đặc điềm các gen NA và NS đều

bị mắt đoạn và vùng chuối nổi HAI - HA2 (điểm cat protease) mang amino acid

qui định độc tính cao Gân đây xuất hiện thêm genotype G, nhưng được phân biệt

lam thành 2 nhỏm: nhóm N (North) phô biến ở Bắc Việt Nam và nhóm § (South) phân bổ ở miễn Nam [20], [66] Năm 2007, ngoài các chủng vả genotype thuộc

phân dòng Quảng Đông gây dịch cúm gia cầm, còn có một phân dòng khác đã được

phân lập vả xác định bằng sinh học phân tử phân tích gen H5 vả NI, đỏ là dòng

Phúc Kiến Tiến hóa chủng/type và dỏng tải tổ hợp mới thường định hình và xuất phát từ các tĩnh ở Nam Trung Quốc [82]

Cho đến nay, tại Việt Nam đã tôn tại 9 nhóm di truyền (clade) được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn đề tái tô hợp hình thành genotype, do

là clade 3 (VNI, năm 2001); clade 5 (VN2, năm 2003; clade 1 (VN3 năm 2003- 2007); clade 2.3.2 (VN4 năm 2005 ; clade 0 (VNS năm 2005) ; clade 2.3.4 (VN6

năm 2007) ; clade 2.3.4 (VN7, năm 2007) ; clade 2.3.4 (VN8, năm 2007) ; clade 2.3.4

(VN9, năm 2007) và clade 7 thuộc dòng Á-Âu đã xuất hiện ở gả nhập lậu tại Lạng,

số chủng chỉ xuất hiện rồi biến mật trong vòng 1 năm và chỉ trao đổi nguồn gen trong quá trình tiền hoá; một số khác chỉ tôn tại vài năm rồi sau đó không phát hiện

được [3]

13 DAC ĐIỂM CÁU TRÚC VÀ ĐẶC TINH DI TRUYEN CUA VIRUS CUM

AJHSNI

1.3.1 Đặc diém hinh thai va cau tao cua virus cam A/HSN1

- Hinh thai: Virus cam A/HSN1 cũng như nhóm virus cúm A tổn tại dưới

dang các hạt virus (virions) Hạt virus (virion) có cầu trúc hình khối đa diện, đường kinh khoảng 80 — 120 nm, đôi khi là dạng hình khối kéo đài thành hình soi đường,

kinh 20 nm và dài từ 200 - 300 nm (Hinh 1.4) Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu dalton [49]

- Câu tạo hạt virus cúm A/HSN1:

Thành phần hóa học: Thành phần hoá học của 1 hạt virus cúm A/H5N1 bao

gồm: RNA chiếm 0,8 -1,1%; protein 70 - 75%; lipid 20% - 24% va 5 - 8% carbon

hydrate Cac hợp chat hữu cơ cht yéu ctia virus 1a glycoprotein Lipid tap trung 6 mang virus, phan lớn là lipid cỏ gốc phospho, con lai la cholesterol, glucolipid va

một it cacbonhydrate gồm các loại enzym galactose, mannose, ribose, fructose,

glucosamin

Cầu tạo hạt virus cúm A/H5N1: Hat virus cam A/HSN1 c6 cau tạo đơn giản,

bao gồm: vỏ capsid và lõi là RNA sợi đơn âm (Hình 1.4)

Capsld ˆ Hamaggludin

Hình 1.4 Ảnh chụp và mô hình tiều phần virus cũm A [2]

(A: Ảnh chụp các tiểu phan virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử truyền qua B: Mô hình

câu tạo hạt virus cảm A, Hemagglutinin: phan tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân

tử khẳng nguyên NA, Capsld: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: hệ gen

virus),

Vỏ virus còn gọi là capsid có bản chất là lipoprotein, cau tao béi mang bao

lipid kép (envelope) có nguồn gốc từ mảng tế bảo nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các

protein ctia virus trên bẻ mặt mảng Các protein bề mặt đỏ là những gai mẫu cỏ độ

đài 10 - 14 nm, đường kinh 4 - 6 nm, bao gồm: các protem kháng nguyễn HA và

NA va protein dém (MA ~ matrix)

Vật chất đi truyền hệ gen virus cim A nói chung va virus ctm A/HSNI nói

riéng 1a RNA soi don am, ky hiéu ss(-)RNA (negative single stranded RNA) [49]

1.3.2 Đặc điểm sinh học phân tử hé gen virus cam A/H5N1

Virus củm A /HSNI có câu trúc hệ gen đặc trưng của nhóm virus cúm A , là

phân tử RNA sợi đơ n âm, cầu trúc xoắn alpha (ø helix) bên trong vỏ capsid của

virus, kich thude khoang 13,5 kilobases (kb)

Hệ gen của virus cam A/HSN1 gém 8 phan doan gen riéng biét tn tai 6 dang

cau trac ribonucleoprotein — RNP, méi phân đoạn RNP kết hợp với phức hợp

polymerase (PB1, PB2, PA) chịu trách nhiệm phiên mã và sao chép RNA của virus

trong tế bảo nhiễm Tám phân đoạn RNP nỗi với nhau thành một sợi duy nhất theo

thứ tự: PB2; PBI; PA: HA (HS); NP; NA (N1); MvàNS (Hình 1.5) Hai dau tan

cing 5°

cao là: 5`- AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC

và 3`- của mỗi phân đoạn được gắn hai trình t u nucleotid co tinh b ảo tồn

(A: Các phân đoạn gen của virus củm A B: Câu trúc một phân đoạn gen (RNP) của virus

cúm A PBI, PB2, PA: ba dưới đơn vị plute hop enzym polymerase ctia virus)

Tam phân đoạn gen trong hệ gen của virus cứu A /HSN1 ma hoa 11 protein

khác nhau của virus gôm: PB2, PBI(PBI và PB1-F2); PA, HA; NP, NA; M (MI va M2) và NS (NS1 va NEP) [49], [75]

Các phân đoạn tông lợp phức hợp enzym polymerase

Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzym trong

phúc hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ đài ổn định và có tính

bảo tồn cao, bao gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) chứa khung gen PB2 cỏ độ dài 2.280 bp, mã hỏa

tổng hợp protein enzym PB2 gồm 759 amino acid (aa), là tiêu đơn vị thành phan

trong phức hợp enzym polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [54], [75]

Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.10) Da (trên thực

tế là 87.10°Da) [49]

Tính thích nghỉ nhiệt độ cơ thẻ loài vật chủ được chứng mình cỏ liên quan đến

vị trí aa 627 ở protein PB2 (ở virus củm gia cảm vị tri nay la Glu - thích ứng nhiệt

độ cơ thể gia cằm khoảng 40°C, còn ở virus thích nghĩ trên người là Lys - thích ứng, nhiệt độ cơ thê người khoảng 37°C) [74]

~Phân đoạn 2 (gen PBI) cũng có kích thước 2431 bp, chứa khung gen PBI

bảo tên độ dài 2.322 bp mã hóa tổng hợp enzym PB] - tiểu đơn vị xúc tác của phức

hop enzym polymerase trong qua trinh tng hop RNA virus, chịu trách nhiệm gắn

mii RNA [49]

Gần đây, đã phát hiện thêm một protein (PB1-F2) chứa được mã hóa bởi một khung đọc mở khác kích thước 273 bp của PBI [72] Protein PB1-F2 kích thích sự

nhạy cam voi TNFa (a - tumor neucrosis factor) va khdi déng quá trình chết theo

chương trình (apoptosis) của tế bào nhiễm, qua đỏ tham gia điều biên đáp ứng miễn

dịch của vật chủ với virus, dẫn đến kéo dài thời gian đào thải virus, gia tăng độc lực

gây bệnh vả quyết định tỉnh trầm trọng của bệnh học củm A/HSNI [15], [18]

~ Phân đoạn 3 (gen PA) (polymerase acidic) chứa gen PA cũng bảo tồn độ đài

2254 bp, ma hoa tong hợp protein PA gồm 743 aa, một trong 3 tiêu đơn vị của phức

hợp enzym polymerase , chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quả trình

tong hop RNA ctia virus [54], [75]

Các phân đoạn mã hóa tông hợp protein kháng nguyên bỀ mặt

Các phân đoạn 4 và 6 mã hỏa cho các protein (HA và NA) bê mặt capsid của

virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm À, bao gồm

~Phân đoạn 4(gen HA) chửa gen HA (H5) có kich thước thay đ ổi trong

khoảng 1704 - 1707 bp, mã hóa tổng hợp protein HA(HS) chứa 567 - 568 aa - một

kháng nguyên bẻ mặt vỏ capsid virus có vai trò quan tr ọng trong đáp ứng miễn dịch

trung hỏa virus của cơ thẻ vật chủ [29], [54]

Protein HA có khỏi lượng phân tử khoảng 63.107Da (nếu không được

glycosyl héa) va 77.10°Da (nêu được glycosyl hóa, trong đó HA, la 48.10° Da va

Ngoài ra, protein HA(HS) còn có vai trỏ quan trọng xác định loại thụ thẻ đặc

hiệu của nó trên bề mặt t ê bảo cảm nhiễm, liên quan đến khả năng xâm nhiễm vả

mở rộng biên độ vật chủ của virus [29], [54]

- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus) chứa khung gen NA(NI) có kích thước thay đổi trong khoảng từ 1350 - 1410 bp ở virus HPAI

A/HSNI, mã hỏa protein NA(N1) khang nguyén bé mat capsid virus g ôm 449 — 469

aa [12], [26] Protein NA có khỏi lượng phân tử theo tính toán khoảng 50.10” Da

(trên thực tế là 50 — 60.10” Da) [13], [14]

Các nghiên cửu phân tử gen NA của virus cúm cho thay phan dau 5`- của gen này (hay phần tận củng N của polypeptide NA) cỏ tính biến đổi cao và phức tạp

giữa các chủng virus củm A, sự thay đổi nay liên quan đến quả trình thích ứng và gây bệnh của virus củm trên nhiều đổi tượng vật chủ khác nhau [10], [13], [14]

Đặc trưng biển đổi của gen NA trong virus cúm A/HSNI là hiện tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide (nÐ, rồi sau đó là 60 nt, lâm cho độ

dai vến có trước đây của NA(NI) lả 1410 bp còn 1350 bp [13], [47]

Các phân đoạn gen mã hóa tổng hợp các protein chức năng

Cac phân đoạn gen M, NP va NS ma hóa tổng hợp các protein chức năng khác

nhau của virus, có độ dải tương đối ồn định giữa các chủng virus cúm A/H5NI, bao

gồm:

~ Phân đoạn 5 (gen NP) chứa khung gen NP có kích thước 1.554 bp được bảo

ton 6 virus HPAI A/HSN1, ma hoa téng hop protein NP - thành phản của phức hệ

phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyên RNA giữa nhân vả bảo tương tế bảo chủ

~ Phân đoạn 7 (gen M) Phân đoạn gen M (matrix) bảo tồn kích thước 1.026

bp ở virus HPAI A/HSNI, chứa khung gen M1 759bp vả khung gen M2 hình thảnh

do hiện tượng cat — ghép (splicing) 2 doan RNA thông tin của phân đoạn gen M, gồm: 26 nucleotide đầu 5’- va 268 nt đâu 3`- [54], [75] Có 4 vị trí chủ yếu trong protein M2 lién quan dén tinh khang amantadine của virus Chi can thay thể một

amino acid ở các vị trí 26 (L-»F), 27 (V—»A hoặc T), 30 (A—>T hoặc V) và 31 (SN hode R) trong vùng xuyên màng của protein M2 có thẻ làm cho virus có khả

năng kháng thuốc [69]

- Phan doan 8 (gen NS; là gen mã hóa 2 protein không cầu tric (non structural protein) la protein NS1 va protein NS2 (NEP, nuclear export protein; cé vai tré bao

vệ hệ gen của virus nếu thiêu chúng, virus sinh ra sẽ bị thiểu năng [50], [62]

Phân đoạn NS có độ dai ồn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kich

thước thay đổi tron g khoảng 874 - 889 nt, chứa khung gen NS1 678 nt ma hoa protein NS1 vả khung gen NS2 mã hoá Protein NS2 hình thành do hiện tượng cắt —

ghép (spheing) 2 đoạn mRNA gồm: 30 nt đầu 5`- và 336 nt đâu 3`- [54], [75]

Độc lực của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) nay được tìm thây ở chủng A/H5N1/97 [75] Đột biến xóa 15 nt từ vị trí 240 - 255 6

vùng đầu 5°- dân đến thu hẹp độ dài phân đoạn gen NS , chi con 874 bp so vai 889

bp ban dau e ủa gen này ở chủng virus nguyên thủy A/Gs/Gd/1996(HSN1) và được chứng mình cỏ liên quan đến giảm độc lực của chủng virus mới [54], [84] Các

nghiên cứu gần đây cho thấy, các chủng virus cúm A/H5NI phân lập trong vụ dịch

1997 cỏ chứa motif EPEV 6 dau C của protein NS1, còn ở các chủng phân lập giai

đoạn 2003-2004 thì motif này là ESEV, và chúng được cho là các yêu tổ tiêm năng

quyết định độc lực của virus virus [83] Các aa S42, R38, K41 vả A149 trong

protein NS1 cũng liên quan đến khả năng của virus ức chẻ tế bảo san xuat interferon

và kháng lại đáp ứng của chúng [42], [83]

Virus cúm A/HSNI có hệ gen được câu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và

không có gen mã hóa enzym sửa chữa RNA, tạo điều kiện cho sự xuất hiện các đột

biến điểm trong các phân đoạn gen/hê gen qua quả trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên

cùng một tế bao, rat co thé dan dén thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các

chủng virus cúm A mới [22], [68]

1.3.3 Hiện tượng cắt - ghép mRNA ở virus cam A/HSN1

Virus cúm A/HSN1 cing với đột biến điểm và trao đổi các phân đoạn gen,

hiện tượng cắt — ghép (splicing) các mRNA xảy ra ở tiên mRNA - sản phẩm sau phiên mã, tạo ra các mRNA khác nhau và xảy ra rất phô biên ở virus củm A Hiện

tượng nảy có ý nghĩa quan trọng trong điều hỏa biểu hiện gen của quả trinh dịch

mã, làm giảm kích thước bộ gen cũng như là một cơ chế đề tạo ra các gen mới [39],

[64]

Hiện tượng cắt - ghép mRNA xảy ra ở phân đoạn 7 (gen M) vả phân đoạn 8

(gen NS) voi cơ chế tương tự như ở sinh vật nhân thật Sự cắt - ghép nay được tiền hành bởi hệ thông cắt - ghép tế bảo diễn ra trong nhân tế bào chủ [6] [39]

~ Đặc điễm cắt ~ ghép mRNA xây ra ở phân đoạn 7 (gen M)

Phân tử mRNA phân đoạn 7 của virus củm A được cắt - ghép có biên đổi đề

tao ra mot sé mRNA khac nhau: mRNA M2, mRNA M3 va cả mRNA4 trong một

vài trường hợp (Hình 1.6) [60], [64]

Phân tích trình tự mRNA M2 từ 2 chủng virus củm A cho thây một phân trình

tự đầu 5° của mRNA M2 giống với trình tự đầu 5° cùng chiều cia mRNA MI ma

hoá cho 9 aa gióng nhau Có một phân trình tự bị ngắt quãng ở mRNA M2 so với

mRNA M1 Sau đó, là vủng trình tự chính của mRNA M2 được dịch mã bằng

khung đọc +1, trình tự nảy sẽ gặp đầu 3` của mRNA MI, khi trình tự này được địch

mã sẽ tạo ra 14 aa gồi nhau giữa protein M2 so với protein MI (Hình 1.6 ) Trong,

quả trình cắt - ghép mRNA MI đã tim thấy một mRNA nhỏ khác - mRNA3 có trình

tự gồm 11 nt ở đầu 5° giống với mRNA MI và mRNA M2 vả 271 nt đầu 3` giống

ngoại biên mRNA3 nên chỉ sản sinh ra mRNA3 ma chua tao mRNA M2 Vi tri nay

tiếp tục được sử dụng trong giai đoạn đầu của sự cảm nhiễm đến tân khi phức hệ

polymerase duoc tông hợp đủ Phức hệ nảy kết hợp với trình tự đặc biệt đầu 5` tận

trong mRNA MI va ca đầu mii 5°, vi thé khoa trinh tu cat 5° mRNA3 tai nucleotide

thứ 11 Hệ thông cắt - ghép của tế bảo sau đỏ bắt đầu chuyên sang vị trí cắt 5° M2

(Hình 1.7)

Như vậy, yêu câu cho tổng hợp ưu tiên các hợp phan polymerase dé hoat hoa

vị trí cắt 5M2 và tăng cường sản phẩm của mRNA M2 đâm bảo protein M2 chỉ tạo

ra khi nỏ cần thiết [64] Một nghiên cứu khác vẻ điều hỏa sự cắt - ghép ở mRNA

MI cho rang protein NS1 có thể dong vai trò điều hỏa cắt - ghép mRNA MI Theo

đó, sự đồng biểu hiện NS1 và sự tái tao RNP đã thay đổi sự tích lũy của mRNA MI

được cắt — ghép, so với khi không đồng biểu hiện và hoạt động nảy phụ thuộc vào

khả năng kết hop RNA cua protein NS1 [60]

'Tếbào không cảm nhiễm

nhiem giai doan da

áchợp phan spliceosomekhac

Hình 1.7 Cơ chễ các hợp phần polymerase của vi-rút củm A gây ra việc chuyển đổi các vị

trí mỗi cắt - ghép trong quá trình cắt ~ ghép mRNA MI của virus [34]

Phân đoạn 7 (gen M) ở virus A/HSNI, chứa khung gen MI kích thước 758 nt (từ vị trí 26 - 784) và khung gen M2 hình thành do hiện tượng cắt - ghép hai đoạn

mRNA cia phan đoạn gen M, gồm: 26 nt (vi tri 26 — 51) dau 5'- va 268 nt (vi tri

740 - 1007) dau 3°- [54], [75]

Nhu vay, gen M của hệ gen virus củm A/HSNI mã hỏa cho it nhất 2 protein

là: protein nên MI vả protein nội mảng - kênh ion M2, bởi các khung đọc mở khác

nhau Protein MI gồm 252 aa được mã hóa từ một mRNA của phản đoạn M không,

cắt - ghép Protein M2 gém 97 aa duoc ma hoa tir mRNA M2 da cat - ghép tir

mRNA phan đoạn MA nguyên thuỷ:

~ Đặc điểm cắt ~ ghép nINA xây ra ỡ phân đoạn 8 (gen NS)

Phân đoạn gen 8 (gen NS) là phân đoạn cỏ kích thước nhỏ nhất trong genome của virus củm A, ma hoa 2 loai protein la protein NS1 va protein NS2 tir cac MRNA riêng biệt, được tạo thảnh do quả trình cắt - ghép từ cùng một mRNA (Hinh 1.8)

Cac protein NS1 gồm 225 aa được dịch mã từ mRNA nguyên thuỷ không cắt - ghép trong khi protein thứ 2 N§2/NEP gồm 121 aa được dịch mã từ một mRNA ghép nôi Sự cắt - ghép ở phân đoạn gen 8 nảy đã được xác định ở độ dài và thông, qua một số cơ chế kiểm soát Theo đó, độ đải mRNA NS2 so voi mRNA NS

nguyên thuỷ chiếm khoảng 10% (trong thí nghiệm lả 159%) [61] Phân tích trình tự

cla mRNA cho thay mRNA NS1 va mRNA NS2 cé mét phan trinh tự giống nhau dau 5°, Do do, 2 protein tuong tmg được dịch mã giống nhau 9 aa mở đâu Tiếp đó,

trinh tu mRNA NS? bi ngắt quãng một phan so với mRNA NSI, rồi sau đỏ địch mã

protem NS2 tiếp tục tại khung đọc +1 (Hình 1.8) Sự cắt - ghép này đã tao ra 2 loại

mRNA NS cé 2 ving ma héa gi lén nhau 70 aa [58]

Có 2 cơ chế cơ bản mả mRNA NS2 của virus củm A có thể được sản sinh ra

Một là bởi cơ chế cắt nucleotid đặc biệt của mRNA NSI trong cảm nhiềm giai đoạn

muộn hoặc bởi mở đầu phiên mã của mRNA N§2 trong nội phân đoạn 8 Cơ chế

đầu có thể gồm cắt 1 nucleotid hoặc loại bỏ một đoạn nucleotid không mong muốn

Phân đoạn gen NS (non structural) cia virus cam HPAIA /HSNI có kích

thước thay đổi trong khoảng 874 — 889 bp, chứa khung gen NS1 678 nucleotide (tit

vi tri 6 — 683) va khung gen NS2 hinh thanh do hién tuong cit — ghép (splicing) 2

đoạn RNA thông tin của phân đoạn gen NS, gém: 30 nt (tir vi tri 6 — 35) dau 5'~ và

336 nt (từ vị trí 493 — 828) đầu 3'- [54], [75]

Protein NS1 của virus củm ngăn cản vận chuyên mRNA NS2 ra tế bảo chất Khi tế bào đang tổng hợp protein NS1 chỉ có khoảng 10% mRNA NS2 được tìm

thấy trong tế bảo chất Loại bỏ tổng hợp protein NS1 bằng các đột biển amber lam

tăng mRNA N§2 gấp khoảng 5- 6 lần Cả mRNA NSI và mRNA NS2 được giữ lại trong nhân của tế bảo vật chủ khi có sự biểu hiện của protein NS1, điều này không

thấy trong nhân chỉ có protein NS2 biểu hiện [9] Nhưng sự cắt - ghép tạo mRNA

N§2 không phụ thuộc vào sự biểu hiện của protein NS1 [61]

1.4 CAU TRUC VA CHUC NANG CAC PROTEIN NP, M VA NS CUA

VIRUS CUM A/HSN1

1.4.1 Protein NP (Nucleoprotein)

Protein NP (nucleoprotein) 1a mét loai protein duge photphoryl hoa, biéu hiện

đặc tinh kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tôn tại trong hạt virus liên kết với

mỗi phân đoạn RNA dạng xoắn anpha, tạo thánh dạng cấu trúc ribonucleoprotein {si}

Protein NP cé phan tir lung tinh toan khoang 56x10°Da (trén thue té 1a 50- 56x10°Da) voi khoang 1000 phân tử /virion [45], [49]

Nghiên cửu câu trúc bậc 3 của NP cho thay, NP có cau tạo bao gồm 3 vùng

(domain): Vùng đầu câu tạo gồm 2 đoạn polypeptide, từ vị tri amino acid (aa) 150

đến aa 272 vả từ vị trí aa 438 đến aa 452; ving thân gồm 3 đoạn polypeptide, từ vị

trí amino acid 21 đến aa 149, aa 273 đến aa 396 và từ vị trí aa 453 đến aa 489; vùng

vom (loop) tan cing tit aa 402 tdi aa 428 Trong dé, các đoạn polypeptide nỗi giữa

các vùng có vai trò quan trong trong câu tric bac 3 cia NP, nhu: phan noi dau tan tir

aa 397 dén aa 401 va aa 429 đến aa 437, két noi phan tan cing va phan dau củavùng

thân của NP (đầu tận 73- 91; nằm trong một câu trúc rãnh giảu argininen (Hình 1.9)

21

Hình 1.9 Mô hình vị trí các domain của protein NP của virus cm A/HSNI

Vị trí arginine 174 và arginine 175 là vị trí quan trọng đẻ RNA két hop voi NP

(Hình 1.9) Vị trí rãnh kết hợp với RNA cũng là các đích tác động của thuốc và là

cae epitope ctia vaccine [51]

Dét bién thay the chi 1 aa thanh valine 6 vi tri 105 trong NP cia virus cum

A/duck/Yokohama/aq] 0/2003 dân đến đáp ứng trong việc tăng khả năng gây bệnh ở

gả [71]

Bên cạnh đó, protein P có nhiệm vụ vận chuyên các RNA virus tit bao tong

vào nhân của tế bảo nhiễm, khởi động sao chép hệ gen và tổng hop các RNA thông, tin trong quá trình tạo thánh các hạt virus mới Sự biến đổi các vùng trình tự protem

NP tương tác với protein PB1 và PB2 trong phức hợp polymerase, dẫn đến đên thay

đổi hoạt tỉnh của polymerase và khả năng thích ứng nhiệt độ cơ thẻ nhiềm của virus

củm A/H5NI [48], [65]

1.42, Protein dém M (matrix protein)

Protem đệm M là một trong các hợp phản chính câu tạo của hạt virus cúm A/H5NI, gồm 2 loại: protein nên MI và protein nội màng M2, được tạo ra bởi 2

khung đọc mở khác nhau của củng 1 phân đoạn RNA

~ Protein nên M1

La thinh phan chỉnh của virus, phân tử lượng tỉnh toán của MI là 28x10" Da

(quan sát thực tế: 25x10”) có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP vả

tham gia vào quả trình “nảy chổi" của virus Với 3000 phân tử/virion, các protein

nên nảy sẽ lỏt phần bên trong mang bao lipid ctia virion [11], [45], [49]

22

~ Prolein nội măng — kính ion M2

Protein M2 lă chuối polypeptide bẻ, có khối lượng phđn tử theo tính toân lă

11x10” Da (trín thực tế lă 15x10” Da)

Với khoảng 20 — 60 phđn tử/virion, tham gia vảo cđu tạo vỏ capsit của virus

(protein nội mảng) củng với câc phđn tử HA vă NA Protein M2 lă protein nội mảng,

~ kính ion (ion chamel) điều chỉnh độ pH trong virion (Hình 1.10) cẩn thiết cho khả

năng lđy nhiễm của virus, chỉu trâch nhiệm “cới ẩ” virus trình điện hệ gen ở bảo

tương tế bảo chủ trong quả trinh xđm nhiễm trín vật chủ [S4]

Bĩn cạnh đó, protein M2 còn tham gia quâ trình gắn câc protein HA va NA của virus lín mảng tế bảo nhiễm, thông qua điều chỉnh pH bộ mây Golgi, đích của câc thuốc ức chẻ virus: amantadin va rimantadin [49], [54]

Protein M2 liĩn quan đến sự thích ửng của virus trín vật chủ mới cũng như sự lđy truyền giữa câc loăi Hai đột biển thay thể amino acid leucin thănh ¡soleuem ở vị trí 26 vă serim thănh asparagin tại vị trí 31, Leu26lle vả Ser31Asn, trong chuối polypeptide M 2, liĩn quan dĩn su khâng thuôc Amantadine_, đê được phât hiện ở

virus A/H5NI [40]

Endosomal membrane

Hình 1.10 Su thay đổi pH nhờ protein kính ion M2 trong qua trinh “cdi 40” ctia virus cúm A (Nguon: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge) [87]

1.4.3 Protein phi cdu trite NS (non structural protein)

Protein NS] va NS2 la hai phi cau tric (non structural protein) của virus cúm

A được tạo ra bởi hiện tượng cắt — ghép (splicing) từ mRNA của phan doan gen 8

(gen NS) [54], [75] cỏ vai trỏ bảo về hệ gen của virus, nêu thiếu chúng virus sinh ra

sẽ bị thiểu năng [49] Cụ thể

- Protein NS1:

Protein NS1 duoc téng hop tir mRNA phan doan 8 khéng cat ghép [61] trong

lượng phân tử theo tính toán là 27x10” Da (trên thực tế là 25x10” Da) [75] NS1 có

câu trúc bậc 2 đói xứng hai bên gồm 6 nếp gap xoắn anpha Câu trúc không gian 3

chiều mới của nó không giéng nhu bat ki cầu trúc nào khác hiện tại trong cơ sở đữ

liêu đặc tính protein Môi chudi đổi xứng chửa 73 aa và có khối lượng chuỗi

polypeptide lả 18 kDa (Hinh 1.11-A) [2], [59]

Hình 1.11 Cấu trúc bậc 2 của NS1 @& = Mô hình phức hợp NS1 và dsRNA (B)

59

Protein NS1 chịu trách nhiệm vận chuyên mRNA của virus từ nhân bảo tương

tế bảo nhiễm va tac đông lên các RNA vận chuyển cũng như quả trình cắt và dịch

mã của tế bảo chủ [75] Quá trình NP ngăn cản dịch mã mRNA của tế bảo chủ gồm nhiều giai đoạn phức tạp Đầu tiên, NS1 kết hợp với đuôi poly A trên mRNA mới sinh của tế bảo chủ trong nhân tẻ bảo, ngăn cản vận chuyên các mRNA nảy ra tế

bảo chất Tiếp đó, NS1 ngăn cản nối mRNA mới sinh bằng cách kết hợp với phan

đầu phình ra U6 trong snRNA, qua đó bắt hoạt tương tác giữa U6-U2 hoặc U6-U4

cân cho việc nồi mRNA mới sinh Cuối cing, NS] co thé ket hop RNA soi đôi với

trình tự đặc hiệu tương đổi thấp và duy trì ái lực cao dé ngăn chăn sự hoạt hỏa

kinase PKR (Hinh 1.11-B) [59]

Đặc biệt, protein không câu tr úc NS1 là một yêu tổ độc lực quan trọng của

virus cum A , phân cắt RNA của tế bảo chủ giải phỏng cac ribonucleotide lam

nguyên liệu tổng hợp RNA của virus Ở các loài động vật có vú, protem NS1 ức chế sản xuất interferon type I và ngăn cản dân truyền tin hiệu kích thích đáp ứng miễn dịch với virus ở m tie té bao, dan đến giảm đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể

nhiễm chồng lại virus [42] Cùng với việc ngăn chăn đáp ứng của IEN, protein NS1 còn liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phả vỡ chức năng của chúng [55] Đột biển mất đoạn 15 nueleotide dẫn tới sự thiếu hụt 5 amino acid (vi tri aa

80-84) đầu C tận của chuỗi polypeptide NSI, gia tăng hiệu quả vận chuyên RNA

thông tin của virus (mRNA) từ nhân ra bảo tương tế bảo chủ, tác động lên các RNA

vận chuyên (RNA) trong quá trình dịch mã mRNA và phân cắt RNA của tế bảo

chủ giải phỏng ribonucleotide làm nguyên liệu tổng hợp RNA của vừus A/HSNI [4]

Trong các chủng virus cúm A/HSN1 độc lực cao, NS1 luôn mang một trong

hai đột biển: đột biển điểm lam thay the aspartate 92 thanh glutamate (D92E) , hoặc xóa đoạn làm mất Saa từ aa 80-84 trong chuỗi polypeptide NS1 Những đột biến nảy rất quan trọng tương quan với sự gia tăng độc tính, sự kháng cytokine hoặc cả hai trong một số chúng cúm A/H5NI [47]

- Protein NEP (nuclear export protein):

Protein NEP còn gọi là protein NS2 véi 130 -200 phan ti/virion, phan tt

lượng tính toản lả 14x10” Da (quan sát thực tế: 12x10”), đảm bảo chức năng vận chuyên các RNP của virus ra khỏi nhân tế bảo chủ đề lắp ráp với capsid tạo nên hạt

virus mới [54], [75]

1.5 TẦm quan trọng của nghiên cứu đặc tính và biến đổi di truyền các gen NP,

M và NS của virus cúm A/HSN1

Tên cạnh các đột biển xảy ra trên các gen kháng nguyên HA(HS) va NA(N1)

của virus cúm A/HSNI, tạo ra hiện tượng ”/£ch kháng nguyên” hình thành nên các

clade virus mới Các đột biến xáy ra trên các gen NP, M và NS củng với hiện tượng,

cắt — ghép gen, xảy ra ở các gen này trong hệ gen virus củm A/IISNI, đến có liên

quan đến độc tính và khả năng gây bệnh của virus

Điều đặc biệt nguy hiểm lả thông qua những đột biến này củng với sự trao đổi

chéo cáo phân đoạn gen trong hệ gen, giữa các chủng virus cúm A/IISN1 đang lưu

Thành sẽ tạo ra các chủng virus mới Các chẳng virus nảy sẽ có thể thu nhận và lăng, cường khả năng gắn vảo tế bảo của người bị virus xâm nhiễm Bên cạnh đó, rất có

thể những biển đối này cũng là bước chuấn bị cho việc phân hỏa đòng virus hiện tại

thành những dòng vữux khác Bởi vì đã mg có tiến lệ cho thấy, vữus A/HSN1 phân hoa thành những dòng virus khác nhau như ở Trung Quốc từ 1997 tới năm

2001 có tới 6 đông virus A/HSNI hưu hành trên thủy cảm (đó là các đồng A, D.C,

D, E và Xo) Thể nhưng dến năm 2002, xuất hiện 8 dong virus mdi la V, W, XI,

X2, X3, Y, ⁄ vá ⁄+ được xảo định Cho đến nay phản type HSN] type ⁄ tồn tại và tiên tục lm hảnh cũng như gây dịch trên người và gia cảm và gần đây là type G,

cồn vac type khác thị không thấy xuất hiện

Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân tích vá tầm hiểu các đặc tính di truyền ở các phân đoạn gen M, NP và N5 của virus cửn A/HSN1, gop phân đánh giá kha năng biến déi và thích nghĩ lây nhiễm tử gia câm sang người, cũng như những biến đổi di truyền liên quan đến gia tăng độc lực và khả nang kháng thuốc của các chúng virus mới Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng gớp phân bố sưng dữ liệu di

truyền giám sát địch tễ học phân lử virus cam A/H5N], làm cơ sở dễ nghiền cửu

sản xuất vacoine thế hệ mới phòng chẳng địch cứm A/1I%N1 đang có điển biển ngày

cảng trở riển phức tạp hiện rray.

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị

- May PCR (máy PTC-100) của MJ Research Ine

- Máy ly tâm lạnh Máy soi gel và chụp ảnh Doiphin- DOC (Wealtech- Mỹ),

Bộ dign di DNA (Bio-Rad) May léc cé diéu nhiét, may khudy tu, may vortex Lo

vi sóng Samsung, box Laminair vé tring, tủ lạnh -20%C và -80°C (Sanyo-Nhật Hân)

- B6 pipetman (10 pL, 20 wl, 100 pil, 200 jul, 1000 pl) và đâu côn các loại, đĩa

Tetri, lọ đựng môi trưởng, và ống môi vi khuẩn

2.1.3 Húa chất

- Hoà chết Yeast Extract va trypton (DIFCO-Mÿ); EDTA, SDS, ‘Tris-HCl (Sigma-My); Acid acetic (Merk-Dirc), X-gal (Sigma-My), Kanamycin, Ampicilin (Merk-Ditc), Agar (Sigma, My), Agarose (Sigma, My), cén tuyét déi, BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, My)

- Bộ kit tách chiết RNA tổng số “QLAamp Viral RNA Mini Kit”, bé kit ding cho phan tg RT-PCR, bé kit tach ding “TA cloning Kit” (hang Invitrogen); bé kit

tách plasmid tai t8 hop “QLAprep Spin Miniprep Kit”, kit tinh sach san pham PCR

déu do hang QIAGBN cung cấp

- Cáo mỗi cho phân ứng RT-DCR/PCR đặt cia hang Siema-My, enzym giới Tuấn: EeoRI và các enzyan khác

2.2, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp thu nhận mẫu và xử lý bệnh phẩm virus cam ATISNI

- Phương pháp tách RNA tổng số, phương pháp thực hiện RT-PCR

- Phương pháp đòng hoá sản phẩm trong vector tách đng,

~ Phương pháp giải trình trình tự và truy cập Ngân hang gen thu nhận chuỗi

gen phương pháp phân tích và xử lý chuối gen

~ Phương pháp so sánh đối chiếu kết quả bằng chương trình tin-sinh học

~ Phương pháp xác định hệ sỏ tương đồng vả nguồn góc phả hệ

2.2.1 Tách chiết RNA tổng sé (genomic RNA)

Sử dụng B6 QiaAmp Viral Mini Kit ctia Hang QIAGEN cung cap Ki thuat

tách chiết được được tiền hành theo hưởng dẫn của nhà sản xuất

RNA tổng số sau khi tách chiết được bảo quản trong lạnh ở -20°C hoặc -

70°C, và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR nhân bản đoạn gen cản

nghiên cửu với các cặp môi đặc hiệu

‘Tach chiét DNA eda plasmid

(plasmid tái tổ hợp đương)

¥ Giải trình tụ

Hình 2.1 Sơ đồ các quả trinh nghiên cứu phân tích 3 gen: gen NP, gen M, va gen NS virus

cum A/HSNI

28

2.2.2 Thực hiện phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction)

Ki thuat RT-PCR (phản ứng PCR ngược) là phản ứng nhân một đoạn khuôn

RNA theo nguyên lí của phản img PCR, bao gồm 2 giai đoạn:

~ Tổng hợp doan cDNA (DNA bé sung) tit soi RNA lam khuôn nhở enzym

phiên mã ngược (enzym reverse transcriptase; con goi la giai doan chuyên ngược

(RT-Reverse Transcription)

- Thuc hién phan img PCR tir khuén cDNA san pham ctia giai đoạn chuyên

nguoc theo chu ki nhiét [2]

Bang 2.1 Danh sách các mỗi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ và giải mã các gen NP, M, va

MAF | ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC Môi xuôi | Gen

Cách tiên hành phản ứng RT-PCR va thanh phan nhu sau (bang 2.2

Bang 2.2 Thanh phan phan img RT-PCR

Sản phẩm RT-PCR được kiêm tra bằng điện di trén thach agarose 1%, néu co

kích thước đúng như với tỉnh toán của cặp môi thiết kế, sẽ tiền hành tính sạch san

phẩm bằng bộ hoa chất QIAquick PCR Purification Kit va tién hanh dòng hoá lưu

72°C -2 phút 72°C - 10 phút

0 C

Sân phẩm được bảo quan 6 4°C

2.2.3 Kĩ thuật dòng hóa (cloning)

Dòng hoá là gắn nói (ligation) một đoạn DNA ngoại lai (sản pham PCR/RT-

PCR) vào trong hệ gene của một vỏng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid mang (vector dân truyền) tạo ra vector tải tô hợp va chuyên nap (transformation) vào tế bao chủ thích ửng (thường là tế bảo E.coli thuần ching) tao dong tai to hop

Sau khi chuyên nạp tiền hành nuôi cây để nhân lên với số lượng lớn các bản sao ĐNA ngoại lai (plasmid tái tổ hợp) vả chọn lọc vi khuẩn tải tổ hợp theo hai cơ chế:

cơ che X-gal va co chế kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không tái tổ hợp,