Luận văn thiết kế vector biểu hiện mang gen scfv kháng cd47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn e coli

Tiếp thco, cm xin được gửi lời cắm ơn chân thành tới các thầy, cô của Khoa Sinh học — Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng đạy và tạo điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành l

DAI HOC QUOC GIA HA NOI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIET KE VECTOR BIEU HIEN MANG GEN scFy KHANG CD47 VA BIEU HIEN PROTEIN

TRONG VI KHUAN E coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ha Ndi - 2019

ĐẠI HỌC QUOC GIA HA NOI TRUONG DAL HOC KHOA HOC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIET KE VECTOR BIEU HIỆN MANG GEN

scFy KHANG CD47 VA BIEU HIEN PROTEIN

TRONG VI KHUAN E coli

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Nguyễn Quang [uy

2 T8 Lã Thị Huyền

Ila Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Không có sự thành công của một học viên nào mả không có sự hỗ trợ, giúp đỡ vả đóng góp của các Ihầy cô Irong suốt thời gian học tập, nghiên

cứu tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên — Đại học Quốc gia Hà Nội, Viên

Hân lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, em đã nhận được sự hướng dẫn

và giúp đỡ của các Thầy cô trong Trưởng và đặc biệt là các Thầy cô trong

Khoa Sau đại học

Lời đầu tiên em xin gửi lời cám on chân thánh và sâu sắc nhất lởi PGS

'T§ Nguyễn Quang Huy — Irưởng khoa Hoá sinh lrường Dại học Khoa học

Tự Nhiên IIà Nội, TS Lš Thị Iluyền — Thẻỏng công nghệ động vật viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và diu đất em trong

suốt thời gian em học tập và hoan thánh luận vấn

Tiếp thco, cm xin được gửi lời cắm ơn chân thành tới các thầy, cô của Khoa Sinh học — Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng đạy và tạo điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thé cic GS, TS, cin bd nghiền cứu

của Viện Han lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, luôn

tận tình sắt sao chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời

khuyên quý báu trong công việc cung như cuộc sống

Và cuối cing, bang tỉnh cảm chân thành và yêu mến em xin dược gửi

Tời biết ơn sâu sắc Lới gia đỉnh và người thân, những người luôn ủng hộ, động

viên và tạo cho em những điều kiện tốt nhất về tỉnh thần cũng như vật chất

trong suốt thời gian học tập và thực tập

Hà Nội, ngày - thẳng - năm 2019

Hoe vin

Nguyễn Thi Van Anh

LOI CẢM ƠN d

MỜ DẦU TH Hot

CHUONG 1 TONG QUAN TAT LIBU

1.1 Tổng quan về bệnh ung thư - 2.22222125112221

LLL Ung the

1.1.3 Ảnh hướng của bệnh ung tae

1.2 Protein khang nguyên CD47 và kháng thể Iháng CD47

1.2.1 Protein khang nguyên CDAT- địch mong điều trị ứng thực

1.3.3 Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng C47 trong điều trị ung th

1.3 Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư

1.4, Manh khang thé don chudi (scFv) -

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2

1 Húa chất và xinh phẩm 2.2 Thiết bị

3.31 Nhân gen mã húa su kháng CDM? bằng phân ing PCR

2.3.10 Quy trinh dign di protein SDS-PAGE cà

2.3.11 Tình sạch kháng thể anh-CDA7 tái tổ hợp bằng phuong pháp sắc ký

Gi lye vei Ni-NTA resin - eon

23.13 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20

3.1 Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CT7 - 22

3.2 Kết quả thiết kế vector biểu hiện tải tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47.,.22

3.2.1 Cat vector pET22b+ va sản phdm PCR bang enzyme cat gidi han 22

3

KẾI quả gắn tạo thành công vector ti (6 harp mang gen anti-CI4? .23

3.3 Kết quả biểu hiện gen mã hoa khang thé khang CD47 ở hệ thống biểu hiện

DANH MUC CAC HINA

Hinh 1.1 Ran dé ung thir thé gict

Hinh 1.2 Ban dé ung the tai Vig Nain _—

Tĩnh L3: Dột biến bắt hoạt gen ức chế khối tr gây ưng thor

Hình 1.6 Các cơ chế nhắm trúng dích con đường CD47- SIRPø trong tạ thư

Hình 3.1 Kết quả nhân gen ari-C7247 bằng phản ứng PCR

linh 3.9 Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anHi-CD4? với kháng nguyễn

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHU VIET TAT

HEK TẾ bảo thận phôi thai ở người

Ke Khang thé don miễn và mánh kết tỉnh

SIRPø Signal regulatory protein alpha

MO PAU

CD47 1a glycoprotein chuyến màng thuộc siêu ho globulin mién địch CD47 có khối lượng phần tử 50 kDa bao gỗ vũng IgV ngoại bảo chứa dâu N, 5 vùng chuyển mảng và

đuôi nội bảo ngắn chứa đầu C CD47 liên kết đặc hiệu với một số protein bao gồm

Trlegrirs, tirombospendin-1, và liên quan điển các quá trình sinh lý tế bảo như di chú tế

‘bao, hoạt hóa tế bảo T và tế bảo tua, và sự phát triển của sợi trục thân kinh | 16] Ngoài ra, CD47 con la phéi tử đặc hiệu của SIKPø Protem nảy biếu hiện trên bể mặt của các tế

Đảo đại duye bảo Tương tác CD47-STRPG ức chế quả lrình thực bào bởi đại thục bảo và

48 bao tua [44]

CD4? được xác định là kháng nguyén ung tr budng trimg người lần đầu tiên

vào những năm 1980 |17] Sau đó, CD47 được xác dịnh biểu hiện ở nhiều loại khối u

người bao gồm AML, CML [L1], A1 [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào

NIIL [8], da uy tiy [21], ưng thư bảng quang [32] và các khối tì rắn khác [1E] Diễu

đặc biệt là, CD47 biểu hiện yêu ở các tế bảo bình thường và biểu hiện mạnh ở các tế

bảo khối u Xác định raức độ biểu hiện CD4?7 ở hai mẫu tẻ bảo [ISC vả tể bao LSC

bằng phương phap flow cytometry cha thay mat dé khang nguyén CD4? 6 té bao LSC

cao hon 618 bao HSC [10, 7], Pink luemg CD47 mRNA treng mau mau ngoai vi ota

một nhớm gồm 132 bénh nhan AML bang phuong phép real-time PCR cho thay ham

lượng CD47 miRNA cũa bệnh nhân AML cao hơn so với nhóm chứng [40] Các kết

quả đã công bộ cho thấy CD47 không rửững là marker hữu dung dé nban dang LSC,

AML và một số tế bào khôi tì khác mã còn là đích đề phát triển cáo loại thuốc đặc hiệu

và liệu pháp miễn địch tiêu điệt tế bảo ứng thư biểu hiện kháng nguyên CD47

Ung thu máu cấp tỉnh có tóc độ phát triển rất nhanh ở tủy xương củng với sự

biểu hiện của một số kháng nguyễn bể mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123,

va CD47 Trong đó, CD47 biếu biện mạnh 6 ca 16 bao ung thự máu và tế bào gốc 1g thư máu Tế bảo gốc ung thư máu là một trong những nhàn tổ tiểm tảng khiển cho bénh ung thư máu đai đẳng, khó điêu trị dứt điểm va đễ tái phát Do đó, CD47

là một trong các dịch dễ tấn công nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thư bạch cầu cấp

tính

Manh khang thể scFv là một trong những định dạng phố biển nhất của mảnh khang thé tai tổ hợp Mặc du chung là những đại diện khá nhỏ của dạng kháng thể

tái tô hợp (26-28 kDa) nhưng chúng cưng cấp đây đủ các đặc tính của kháng thế và

vị trì gắn kết kháng nguyên không bị thay đối So với các kháng thể đầy đô chúng íL phức tạp hơn, bao gém chỉ các miễn biển déi của chuối nặng kháng thé (VH) va vùng biển đổi của chuối nhẹ kháng thể (VL), các VH và VL được liên kết bởi một

polypeptide lirih hoat

Với sự ra đời của công nghé DNA tai tổ hợp từ những năm 1970, protein bat đầu được biểu hiện nhiều 6 dang tải tỏ hợp trong các tế bảo vị sinh vật một cách hanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên Trong những năm gần day, ky thuật sản xuất protein tải tổ hợp trong, các hê thống sinh hoc ngày cảng được ứng, dụng rộng rãi Irong đó, các “nhà máy” ví khuẩn được lựa chọn sử dựng nhiều do

cáo và điểm như chỉ phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh Chửng biếu

tiện Escherichia coli là chúng được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cửu cũng

“hư trong sẵn xuất protein tái tổ hợp

Do đó, tác giả lựa chọn để tài “Thiết kế vector biểu hiện mang gen selv

khang CD47 và biếu hiện protein trong vi khuẩn E.eaif” với mục tiêu: Thiết kế

thành công vector biểu hiệu mưng gen scFv dặc hiệu CD47 và biểu hiện dược

protem trong, vi khuân #.coli

CHƯƠNG 1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Téng quan vé bénh ung thu

1.1.1 Ủng thư

Ung thư là một thuật ngữ trong y học đề chỉ khối u ác tính Đây là một loại bệnh

mả một nhóm tế bảo biểu thị sự tăng sinh không kiêm soát (các tế bảo có sự phân chia vượt quá giới hạn bình thường), sau đó xâm nhập vả tiêu diệt các mô liền kể nó, đôi khi

tế bảo dị căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thẻ theo đường bạch huyết hoặc

mau) [1; 2] Có khoảng 200 loại bệnh ung thư đã được khoa học tim ra

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2018 công bố tỉnh hình ung thư hiệu

chỉnh theo độ tuổi tại 185 quốc gia vả vùng lãnh thổ

Hình 1.1 Bản đồ ung thư thể giới [18]

Trong đó, 10 quốc gia có tỉ lệ ung thư cao nhất đều là những nước phát triển: ỦỨc đứng số 1 với tỉ lệ mắc ung thư cả 2 giới ở mức 468/100.000 dân; New Zealand

(438); Ireland (373); Hungary (368); Mỹ đứng thử Š với tỉ lê 352, kể đó là Bi, Pháp, Dan Mach, Na Uy, Ha Lan

Trong khu vực Đông Nam Á, Singapore cỏ tỉ lệ mắc ung thư cao nhất, kế đỏ

là Philippines (163, vị trí 89 thể giới); Thái Lan vị trí 92 thẻ giới (152); thứ 4 khu vực là Lào (154, vị trí 97 thể giới)

Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư

151,4/100.000 dân, xếp 19 châu Ả vả thứ 5 tại khu vực Đông Nam Ả Vào năm

2015, Việt Nam xếp vị trí 107 và thời điểm 2013 xếp ở vị trí 108

Theo thông kê của WHO, số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam không ngừng

tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010 Năm 2018, số ca mắc mới tăng lén gan 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đỏ gần 70% trường hợp tử vong, tương

Tí lệ từ Vông: 70, trơng đương 116,000 ca (104,4109.000 din) '5 ung thư mắc nhiễu nhắt: Gan, phải ạ dày, vũ, đại tăng

(abu wo 201)

Hình 1.2 Bản đồ ung thư tại Việt Nam [18]

Tinh chung cả 2 giới, 5 loại ung thư cỏ tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam gồm: Ung thư gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó lả ung thư phôi (14,43%), ung thư

da day (10,6%), ung thu vu, ung thu dai trang

5 loai ung thu phô biên nhất ở nam giới Việt gồm: Ung thư phổi (21,5%),

ung thư gan (18,4%), ung thư dạ day, ung thư dai trang; ung thu hau họng Ở nữ

giới, hàng đầu vần là ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư phỏi, ung thư gan

Tổ chức sáng kiên toản câu vẻ ung thư (GICR, thuộc WH©) cho biết, các sở

liệu cỏ được dựa trên những nguồn tốt nhất được cung cập tại môi nước

WHO cho biết, ung thư dang lá một trong, những thách thức sức khoẻ cộng, đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21 Khoảng 40% trường hợp tng thư có thể được T:pắn ngừa bằng cách giâm tiếp xúc với các yêu tế nguy cơ bao gồm chê độ an udng, dinh dưỡng, boạt động thé chat

1.1.2 Ảnh hưởng của bệnh ưng thư

Bénh img the gay ảnh hưởng nghiêm lrọng đến đời sống và kinh tế ở mỗi quốc gia Không những dẫn dầu về nguyên nhân gây tử vong trên thể giới, bệnh tap, thư vẫn là một cần bệnh mà cho đến nay vẫn chưa có biên pháp điều trị triệt để Đôi với một nước phát triển như Mỹ, mỗi năm có khoảng 0,5% dan số được chan đoán 1ng thư Hiện nay, vẫn dang cỏn rất nhiều người phải sống va chdng chọi với căn bệnh này với chỉ phí điêu trị rất lớn Các nhà khoa học, bác sĩ trên toàn thể giới

dang nỗ lực không ngừng dễ tìm ra các Điện pháp phót hiện sớm, phòng ngửa và

chữa trị ung thư Đây là một vẫn đề rất quan trọng đối với mỗi quốc gia và thể giới,

đôi hỏi tập trung nguẫn nhân lực trinh độ cao vả tài chính lớn

1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư

Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư Các nhả khoa học xác định yang cfc dang ung thir déu ¢6 nguyén nhân từ những bất thường trong gen của các

tế bảo bị biến dỗi Sự bất thường này do ảnh hướng của các chất sinh tung thư như

khỏi thuốc lá, chất phỏng xạ, chất hỏa học, Một số nguyên nhân ung thư khác có

thể là đe sai sót mang tính di truyền trong, quá trình tự sao của ADN, đo đó tật cả các tổ bảo đêu tăng simh bi thường Sự dĩ truyền của ung thư dược xác định do ảnh thưởng của các yêu tổ gây ưg thư và hệ gen chủ Một số yếu tổ đi truyền khác ảnh

thưởng đến ứng thư là sự methyl hóa ADN va ARNs micro [1,24]

Binh thường sư cân bằng giữa tốc dộ của quá trình sinh sản và quả trình chết của tế bảo được điều hòa để đảm bảo tính toàn vẹn của cơ quan và mô Tuy nhiên khi các gen đột biển pay ung thư trong tế bảo được hoại hóa thì tế bào tránh được sự chết theo chuong trinh (apoptosis) và phân clua không kiểm soát, có khả năng hình thành các khối u lành hoặc ác tính (ung thư) [4]

Hai yếu tổ quan trọng trong hệ gen dan đến ung thư là sự tích lũy các đột

bien soma va ting cường tỉnh bắt ôn di truyền

Số lượng đột biển ở tế bảo ung thư nhiều hơn tế bảo bình thường Khi các

đột biến diễn ra ở các gen sửa chữa ADN, các gen ức chẻ khỏi u hay đột biên gen

tiền ung thư thành gen ung thư được kết hợp với nhau thì gây ra sự tăng sinh một

cách không kiểm soát của các tế bảo [2; 4]

Đột Điển bắn hoạn cạn sửa chữa ADN

©& bién gen tén ung

Hinh 1.3: Dot bién bat hoat gen tte ché khoi u gay ung thu [3]

Sự có mat ctia cac dét bién khác nhau dẫn den nguy cơ chọn lọc không mong

muốn trong quân thẻ tế bảo Trong trường hợp ung thư, tế bảo nảo mang đột biến

tăng cường sinh trưởng sẽ cỏ ưu thẻ được chọn lọc [2: 4]

Gan day, protein be mat té bao CD47 đã được phát hiện biểu hiện quá mức ở

nhiều loại tế bảo ung thư khác nhau[43] Biều hiện CD47 tăng cao trong 57 trên 115

(49,5%) mâu ung thư đạ dày giai đoạn đầu (T1b) Hơn nữa, họ phát hiện ra rằng tỷ

lệ sống sót sau S năm đổi với các trường hợp dương tính với CD47 thấp hơn đảng

kể so với các trường hợp âm tỉnh với CD47 (54,8 so với 79,9%; p = 0,0067), cho

thấy sự biểu hiện quả mức của CD47 co thé 1a mot yêu tổ tiên lượng xấu độc lập

cho ung thu da đây Tương tự, một nghiên cửu gan đây [44] tiết lộ rằng CD47

thường được biểu hiện quá mức trong khỏi u của bệnh nhân ung thư buỏng trửng va

có liên quan đến các đặc điểm lâm sảng bắt lợi vả tiên lượng xấu Các bệnh ung thư khác ở người cũng đã được bảo cáo, một số trong đỏ bao gồm ung thu bach cầu tủy

cắp tính, ung thir hach khéng Hodgkin (NHL), ung thư dạ day, ung ther gan, ung thư

phôi tế bảo nhỏ và ung thư vú [17] Trong hầu hết các trường hợp, biểu hiện CD47

cao có liên quan đến di căn xa vả tiên lượng xấu, cho thấy rằng liệu pháp chồng CD47 1a mét chien huge day hira hen dé chéng ung thu

Điều hỏa tăng biểu hiện CD47 là một cơ chẻ đặc biệt quan trọng được các tế

bảo gốc ung thư sử dụng đẻ vượt qua hệ thông miễn dịch, điều này dân tới sự tái

phát của bệnh ung thư [6] Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự gia tăng biểu hiện

protein CD47 trên các tế bảo tạo máu ở người, đặc biệt là trong bệnh ung thư bạch

câu tủy bảo cấp tính (AML) và trong bệnh bạch cầu tủy mãn tính, các tế bảo chống

lại quá trinh thực bảo thông qua tương tác CD47-Sirpơ [7; 9]

1.2.2 Kháng thể kháng CD47 và liệu pháp điều trị đích CD47 trong điều trị ung thư

Nhiều hướng nghiên cửu đã được xây dựng nhằm vô hiệu hóa tương tác

CD47-SIRPø theo các co che khác nhau [37] Cơ chế thứ nhật, kháng the kháng CD47 có thẻ khỏa tương tác giữa CD47 trên tế bảo khói u và SIRPø trên các tế bảo thực bảo cho phép quá trình thực bảo diễn ra

Co che thir hai, khang thé khang CD47 có thể loại bỏ các khôi u thông qua

cơ chế phụ thuộc vảo Fe bao gồm gây độc tế bảo phụ thuộc kháng thẻ và gây độc tẻ bảo phụ thuộc bé thé Mét kháng thé kháng CD47 đã được chimg minh co tac dung

kích thích gây độc tế bào qua trung gian NK đề kháng lại dòng tế bảo ung thư ở

người [39] Cơ chế thử ba, kháng thẻ kháng CD47 loại bỏ khỏi u bằng cách kich hoạt trực tiếp quá trình apoptosis.Kết quả của một số nghiên cửu đã công bố cho thấy, một vài kháng thể kháng CD47 kich thích các tế bảo ung thư chết theo chương

trình thông qua cơ chế không phụ thuộc caspase [38; 41; 24, 42] Cơ chế thứ tư ,

kháng thẻ kháng CD47 có kha nang bat hoat tuong tac CD47-SIRPa dan đến tế bảo

tua cỏ khả năng tỏm bắt khối u vả trình diện kháng nguyên cho tế bảo T-CD4 va T-

CD8, kich thich co thé dap img mién dich khang lai khdi u [15]

1.3.3 Cúc thành tựu sử dạng kháng thể khủng CD47 trong điều tri ung the

Tiện nay, một số các liệu pháp nhằm dich CD47/ SIRPa dang duce nghiên cứu thử nghiệm lâm sảng và tiền lâm sang bao gầm các khang thé thông thường, polypeptide tai té hop và cáo phân tử bispeoific (Báng 1.1)

Bang 1.1 Liệu pháp nhắm đích CD.17/SIRPa [8.9,35]

Điền trị wham mue tiêu CD47/ SIRPø theo phái triển lâm sàng:

Công ty Kháng thế Giai đoạn M6 ti

khang CD47 thử nghiện Forty Seven Inc ThaSF9-G Giai đoạn I Khang thé khang CD47

được nhân hoa, phan lớp IgG4 của người

Celgen CC-90002 Giai đoạn L Khang thé khang CD47

được nhân hóa Trlữum TH 621 Giai đoạn L Đrotein SIRPo:Fc, phân

lớp IgG1 của người

Therapeutics Ine ALXI48 Giai đoạn 1 Biên thể SIRPø có ái lực

Tioma Therapculics Undisclosed Tién lan sang Khang thé khang CD47

Surface Oncology Tiénlam sang — Kháng thếkháng CD47

day đủ

OSE Effi-DEM Triển lâm: sàng Khang thé khang SIRPo Immunotherapeutics

Cac khang thể khang CD47 là các liệu pháp dặc hiệu tốt nhất nhằm tới phúc

hệ CD47/ SIRFø Chúng đã được chủng mỉnh higu qua m vitro va in vivo va cdc

kháng thể kháng CD47 đã được thử nghiệm chống lại nhiêu khối n máu ác tính và bệnh lý khối u rắn, và chúng đã bắt đầu được thử nghiệm lam sang (Bang 1.2)

Bang 1.2 Cac kháng thể nhắm địch CD.47/SIRPa [8,9,35]

Thứ nghiệm lâm sảng trị liệu nhấm mục tiêu CD47/STRPa

Ngày bái đầu Tên Khángthể Thửnghiệm irểnrấchệnh Giai đaạn

thử nghiệm

8/2014 HuSF9-G+ Khỗi u ác thữt, ung thư hạch — Gii đoạn]

3/2015 CC-90082 Khéi u rắn, đa ư tây hoặc ứ Gini dom I

1ympho non-hodekin

11/2015 Hu5t9-04 Bệnh bạch cầu tủy cắp tink Giai đoạn L

03/2016 ŒC-90002 Bénh bach câu tủy cáp tính, Giai đoạn Ï

hỡi chứng myelodysplaziec có Nguy Cơ ao

09/2016 TTI- 621 Khéi u rin, nam mycosis Giai doan I

11/2016 Iiu5r9-G4 Ư Iympho không 1IodgEin tê Giai đoạn [TL

bào B

112016 Hus¥F9-G4 Khdi u ac tinh Giai đoạn II

09/2017 ALXUAR Khỗi trấn, lympho Giai đoạn Ï

Hiện nay các nghiên cứu về kháng thể kháng CD47 vẫn đang phát triển trên

thể giới

1.3 Khang thể và khang thé đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư

Tế từ khi cấp phép cho liệu pháp kháng thé dom dory (mAb) đầu liên OKT3 vào năm 1986, tình dặc hiệu, tính linh hoạt và tính da dạng của kháng thể và dẫn xuất kháng thể đã trở thành nhóm được phẩm sinh học lớn nhất [27] Kháng thé don dang

có tiên sử sử đựng an toàn, cơ sở khoa học rõ ràng Tính đến tháng 10 năm 2018, hơn

80 khang thé đã được HMAA/FDA đưa ra thị trường hoặc phê duyệt cho nhiều chí đạn:

bệnh bao gồm vine thu, viêm/tự miễn địch, cảy ghép, bệnh truyền nhiễm va tim mach,

tuyết học, đị ứng và nhân khoa Hơn 500 sân phẩm, bao gồm các sân phẩm thế hệ 2

10

và các định dạng khang thé mới, hiện đang được thử nghiệm lâm sảng trên toan thé

thông qua tách dòng phân tử, kỹ thuật kháng thẻ và thậm chỉ các phương pháp

enzyme Các mảnh kháng thể sau đó cỏ thẻ được sử dụng một mỉnh hoặc liên kết

với các phân tử hoặc mảnh khác đề tạo ra các phân tử lưỡng tỉnh, đa đặc hiệu, đa

liên kết hoặc đa chức năng đẻ đạt được nhiều hiệu ứng sinh học [4]

Các mảnh kháng thể có thể cung cấp một số lợi thẻ so với việc sử dụng các

khang the thong thường

1.4 Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv)

Mảnh kháng thể đơn chuỗi (seFv) tạo ra một protein đơn chuỗi có ái lực với

kháng nguyên tương đương với kháng thẻ gốc Trình tự và độ dài peptide liên kết có thể khác nhau giữa các seFv đề tối ưu ái lực đối với khang nguyên vả tăng sự bền nhiệt Chiều đài của peptide liên kết có thẻ tạo ra khoảng cách ~ 3,5nm giữa VL và

'VH mà không làm gián đoạn sự hình thành vi trí liên kết kháng nguyên [34]

N’

¢

Hình 1.5 Cầu trúc của seFv SeFv có một số lợi thể so với mAb thông thường Đầu tiên, kích thước nhỏ

lý tưởng cho sản xuất quy mô lớn trong các hệ thống vi sinh vật [35] Ngoài ra, vì

các chuỗi mã hóa VL và VH được mã hóa trên cùng 1 gen, không cần phải cân bằng

11

vùng hing dịnh chuối nhẹ (CL) vả chuối nặng (CH) Điều nảy cho phép các mảnh được sẵn xuất nhanh hơn, với năng suất cao hơn và vi chỉ phí thấp hơn sa với nAbs kích thước đây đủ, thường yêu cầu hệ thang biếu hiện động vật có vú [36] Kích thước nhỏ cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập của mô và gắn kết với các

epitones, đặc biệt hữu ích cho sự thâm nhập khối u trong liệu pháp miễn dich ung,

thư [37, 38] Việc thiểu vùng Fe sẽ loại bỏ nguy cơ kích hoạt tế bào miễn dịch và

các khang thể như gây dộc tế bảo phụ thuộc kháng thẻ (ADCC), thực bảo tế bảo phụ

thuộc kháng thế (ADCP), hoặc gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) [32]

12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

"- Các chúng vì khuẩn Z.eol DH5ø, BI.21(DE3)

"_ Vector biểu hiện: pET22b+

" Enzyme cắt giới hạn gồm BamHI và Xhol, eazyme gắn nổi T4 ligase

(Biolabs)

" Hoa chat: Cao nim men (Yeast extraction), ‘Tryptone, Agar, NaCl, Tris-

base, Tris-HCI, EDTA, SDS, FtPr, Agarose, Polyarylamide Bis-acrylamide, IPTG,

X-gal, va cde hoa chal khác do hãng Merck cung cấp

" Kháng sinh và môi trưởng nuôi cAy: Ampicilin, Penicilin-Streptomycin,

RPMI 1640 (Thermofisher), FBS, méi trudng LD léng, LB dic

" Dung dịch: các dung dịch dém TAE, SDS-PAGE running buffer, PBS, va các dung dich (dung dich 1, dung dich I, dung dich LN) véi các thành phân chủ tiết được trình bảy trong bảng phụ lục 2

3.2 Thiết

‘May PCR, may chạy điện di, máy lï tâm lạnh, máy lắc ẳn nhiệt, bể ôn nhiệt,

lò vi sóng, tủ lạnh sân(-80*C), máy vartex, máy đo pH, tả cấy vô trùng, Pipetman

13

các loại (Gilson, Pháp), máy soi chụp sel, kinh hiển vị diện tử vá các trang thiết bị

khảo của phòng thị nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Cóng Nghệ Sinh Học „ Vién Han Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cửu

2.3.1 Nhân gen mã hoa scl'v khang CD47 bang phan img PCR

Đoạn gen mã hởa mãnh kháng thể seFv kháng CD47 được khuếch đại bằng, phân ứng PCR với cặp mỗi I.H47F/H47R Thành phản phân ứng gồm 12.5 HT,

GoTaq master mix, 1 pL primer LH47F 10pM, 1 pL primer LH17R 10pM, 2 ¡l, khuôn, 8.5 pL 1,0, Chu kỳ nhiệt của phán ứng: bước 1: biển tính 94°C trong 3 phat, bude 2: chu tinh tip lai 30 chu ky (94°C trong 45 gidy, $2°C trong 45 giây, 72°C trong 1 phút 20 giây); bước 3: hoàn thiện sân phẩm ở 72°C trong 8 phút; bước

4: lam mat san phẩm PCR ở 10”C trong 30 phút

2.3.2 Điện đi trên gel agarose

" Chuẩn bị gel agarose 0,894 : cần 0,8g agarose cho vào 100 ml dung dich TAT 1X, đưn trong lò vị sóng cho agarose tan hoàn toàn Dễ nguội xuống khoảng, 50°C réi rót dung dich agarose vào khay điên đi có cải sẵn răng lược Sau khoảng

30 phút khi gel đã dông, gỡ luợc ra, đặt bản gel vào bể điện dị, Rót đệm TAE 1X

vào bế dé đưng dịch ngập cách mặt gel 5mm

"Tra mẫu DNA : Tay miu DNA trộn với loading dyc 6X rồi tra vào các

giống trên bản gel

" Chạy điện di ở điện thế 95-100V, trong thòi gian khoảng 25-30 phút

TƠNA di chuyển lừ cực âm đến cục đương, Quan sát sự cá chuyển mau bromophenol blue dé biét khi nao can dime dign di

" Soi gel: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khay và ngâm vào dung dich EtBr nông độ 2 ugáu| rong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nước Hiển thị kích thước

TDNA dưới ánh sáng đèn cực tùm (UV) của máy soi gel Uớc tỉnh kích thước của

DNA bang cách đối chiêu với thang DNA chuẩn

14

2.3.3 Cal vector va san phim PCR bing enzyme cat gigi han

San phim PCR nhan gen anti-CD47 véi cặp mỗi LII47F/LIIHI7R và vector

pET22b1 được cắt đồng thời bằng hai enzyme cat gici han BamHT va Xhol

Thành phan phan ting cat san pham PCR gém 20 pl sản phẩm PCR, 3 ul

Bamllf, 3 pL Xhol, 5 pL Buffer, 19 pL 11,0

Thanh phan phan ứng cắt vector pET22b+ gdm 15 pl vector, 3 wl BamHT,

3 uL Xhol, 5 pL Buffer, 24 pL HạO

Thén hop phan ing 6 37°C, qua dém

2.3.4 Tình sạch san pham PCR va vector pET22b+ san phân ứng cắt bang kit

tình sạch

Trong nghiên cứu này chủng tôi sử dụng bột kỉt GenelTIT PCR purification

(Fermentas) Cac bude tinh sạch được thục hiện theo chỉ dẫn kí!

= BA sung dung dich binding buffer với thể tích bằng thể tích của mẫu cẩn

tính sạch, trộn đêu

"Chuyên loàn bộ hỗn hợp ở trên lên cột tình sạch T.y tâm cột 13 000 v/ph

trong 1 phút, loại dịch qua cột

= Bé sung 700 UL dung dich washing butter lén cột Ly tâm cột 12 000 v/ph trong 1 phút, loại dịch qua cột

"Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để loại hoán toàn dịch, bỏ dịch qua cột

"Chuyên cội sang ông eppendorf rưới Đỗ sung 45 HÌ, HạO lên cột, để cột ö

nhiệt dộ phòng khoảng 1-3 phút

"Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để thu sản phẩm tỉnh sạch qua cột

Chúng tôi tiến lành nuôi chúng E,cøli BL2I tải tổ hợp ương 50 mĩ, môi trường LB

có BG sung Ampicilin 1000 pg/mL va cam ứng IPTG 5 mÀM 3 h ở 379C, tốc đô lắc

bào Đẳng hóa tế bào trong dung dich Guanidinium Lysis Buffer (Guanidine LICL 6M, sodium

phosphate 20 mM, pH 7.8, NaCl 500 mM), sau dé sigu 4m pha vé té bao va ly tam

200 vong/phit Ly tâm loại địch môi trường nuôi cây để thu sinh khối tê

thủ địch nổi cho quá trình lính sạch Do kháng thể múi-CD4? tải tổ hợp có 6 Histidine ở dầu C nên có ái lực cao với NỈ”, vi vậy chúng tôi tình sạch kháng thé

15

này bằng phương pháp sắc ký ái lực voi Ni-NTA resin Trong quá trình tỉnh sạch, Tmidazole được sử dựng như chất cạnh tranh Ni” trong phức hợp NỈ”- histidine Các protein lần trong địch chiết kháng thể tái tổ hợp được loại bô khôi kháng thể tái

tổ hợp ở nổng độ Imidazole 50 mM Sau đỏ khang thể tái tổ hợp được đây ra khỏi

cột nhờ buffer đấy (Native Ekuien Du£fer), chúng tôi thu 2 phản đoạn với thể tích I x1 phân đoạn ở nông độ Imidazol 250 mMT

2.3.5 Gắn nỗi sản phẩm PCR vào veetor pET22b+

Thể tích phản ứng gắn nổi 10 pử, gềm 3 WL sản phẩm PCR, 2 HL, vector

pRT22b+, 1 pl buller, 1 pi T4 ligase, 3 pl HO U phan dmg & 16°C qua dim Sau

đó, sản phẩm ghép nối gen được biến nạp vào tế bảo khả biển E.eol DH5u

2.3.6 Biến nạp sản phẩm gắn nối vàu tế bảo khả hién E.coli DHSe bing phương pháp sốc nhiệt

Chuấn bị tế bào khả biến

" Lấy chủng tế bảo được cất ở - 20°C, cấy vạch tế bảo trên đĩa mỗi trưởng

TP đặc, ủ đĩa cấy qua dém 4 37°C

= Nhat mot khuẩn lạc nuôi cây trong 2ml môi trường I.B lồng, nuôi lắc ở

37°C qua dé

ay chuyển 19% địch muối tế bảo qua đêm sang môi trường LB mới Nuôi

tắc ở 37°C đến khi ODaps đạt 0.5-0.7

"Chuyên dịch tế bảo sang ông cppendorf vô trùng, dễ trên dã 1Ó phút

" Ly tâm thu tế bào ở 4°C, 4000 v/ph, 5 phút

= Loại dịch nổi, hòa tan edn 14 bao beng 300 pl CaCl, 0.1M, đặt trong đá

10 phút

" Ly tâm ở 4°C , 4000 v/ph, 5 phút, loại địch

= Hoa tan ida trong 100 yal (CaCh 0.1 M, glyecrol 3085), giữ ở -80°C,

Biến nạp

= Ly té bao khả biển giữ trong tủ -RO®C ra, đặt trên đá khoảng 30 phút

" Bổ sung dung dich sau phan ung gắn vào ổng cppcndorf chứa bảo khả biến, đặt trong da 30 phút,

16