Luận văn thiết kế vector baculovirus chứa gen m1 của virus h1n1 bước Đầu tạo vaccine thế hệ mới

Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bảo vật chủ 1.1.4 Các kháng nguyên quan trong eta virus cian 8 1.1.4.1 Hemagglutinin HA.... EDTA Tithylen Diamin Tetraacolic Acid PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIIOA HỌC TỰ NIIÊN

VŨ THỊ THANH NHÀN

THIET KE VECTOR BACULOVIRUS CHUA GEN M1 CỦA VIRUS

THN1, BƯỚC DẦU TẠO VACCINE THẺ HỆ MỚI

LUẬN VẤN THẠC SĨ KIOA HỌC

Hà Nội Năm 2011

Tôm tắt tnận vẫn Vũ Thị Thanh Nhân

DAI HOC QUOC GIA HÀ NỘI

VŨ THỊ THANH NHÀN

THIET KẾ VECTOR BACUILOVIRUS CHỨA GEN MI CỦA VIRUS

THN1, BƯỚC DAU TAO VACCINE TIE IIE MOI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Định Duy Kháng

Hà Nội Năm 2011

1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bảo vật chủ

1.1.4 Các kháng nguyên quan trong eta virus cian 8 1.1.4.1 Hemagglutinin (HA) coi HeHkomre

1.1.4.2 Neurominidase (NI) sessions

3.3.4 Nhân gon Ä⁄ƒ của virus cản A/H1N1 bằng PCR

3.3.5 Diện di trên gel agarose

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

2.3.7 Bién nap DNA plasmid vio 2, mm 30 2.3.8 Tach chiét DNA plasmid tir vi khudn E.coli - - 31

2.3.9 Kiểm tra DNA plasinid bang cnzym giới hạn - 32

2.3.10, Thu doan DNA tit gel agarose

Chương 3 KỬI QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số

3.2 Thiết kế hộp gen ÄZ) của vims cứm A/HINL 3⁄4

3.3.1 Gắn sản pham PCR chtra hop gon M1 vao vector pCR2.] 36 3.3.2 Bién nap vector tdi tô hợp vao 16 bao Z coli ching DISC 38

3.3.3 Tach chiét DNA plasmid ti tế bảo ví khuẩn coli - - 37

3.3.4 Chon loc vector tai t6 hop bang cắt với enzvm giới hạn - 38 3.4, Tinh sach cac plasmid tái tổ hợp +

3.5, Kết quả xác dinh trinh tự scchhn Hư H2 meeeerereriree 41 3.6, Thiét ké vector biéu hign baculovirus mang ng hộp g genMI 44 3.6.1 Thu nhận hộp gen MI từ pCRMI và chuẩn bi vector pBluBae1 S/VS-His-

3.6.2 Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen MI .46

EDTA Tithylen Diamin Tetraacolic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction

Những thập niên vẻ trước, thể giới đã có một thời gian sống khá yên Ên với các

bệnh đo các loại virus gây ra nhờ thành quả của các vaccine, thuốc kháng sinh Nhưng,

từ những năm 1970 đã dỏ các nghiện cứu cảnh bảo sưr xuấi hiện của các vì và siêu vì

trùng có thể gây đại dịch do khả năng kháng vaocie vẻ thuốc Sau đỏ, từ các năm

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

1980 đến nay thì cộng đồng y tế thế giới đã phải đương đầu với nhiều dịch bệnh xáy ra

như địch ATDS và tiếp theo là các địch bệnh khác kế cả SARS, cứm gã HSNI, cứm lợn THNH, địch bỏ điên, Ebola v.v Theo dự đoán các bệnh địch số oôn Hiếp lục phát triển

đo hậu quả từ việc thay đổi khi hậu và môi trường trên thể giới

Bénh chm Af HIN] là bệnh nhiễm trừng đường hồ hấp cấp linh do virus cúm A/HINI thuộc họ Otliomyxoviridac gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỹ, và một số quốc gia khác Ban đầu chí thấy nhiễm trên lợn nhưng sau đỏ phát hiện loại virus nay cờn nhiềm trên nhiều đối lượng động vật khác Vữrus được phân chúa thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bê mặt của hạt vưus, Nhỏm

virus cium A có 17 loại kháng nguyên HIA (từ T11 đến 1117) và 9 loại kháng ngưyên NA

(từ NI đến N9) |25] Sự tải tổ hợp giữa hai loại kháng nguyên này sẽ tạo ra nhiều phân type cúm khác nhau về độc tỉnh và khá năng gây bệnh Mặt khác, virus cúm A dễ dàng, đột biến trong gen/ hé gen (đặc biệt ở gen mã hóa NA và HA) hoặc trao đối các gen kháng nguyên với nhau trong quả trình xâm nhiễm, Lồn tại và lây truyền giữa cóc loài vật chủ đề tạo biến thê mới [30]

Các vaccine truyền thống Lay đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngắn ngừa và chỗng, địch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt dộng bien dai

của virus A/HINI trong tế bảo vật chủ đã gây ra những hạn chế vẻ tính hiệu quả của

vaccine Ngoài ra chỉ phí cho sẵn xuỗi vaocae khả cao và thời gian tương dối dai Do vậy van đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chong tao

ya vaccine thế hệ mới nhằm đổi phó với những hiểm họa cho công đồng trong tương,

lai VLPs (Virus like particles) vaccine la mot trong những hưởng đi mới trong công,

nghệ sản xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ưu việt sơ với vaccine thể hệ trước đây

Trừ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chủng tôi thực hiện dé tai : “Thiet ké tectar bacnlovirus chứa gen M1 của vừữus HINH, bước đầu tạo vaccine thÊ hệ môi”,

Đề lái được thực hiện tại phỏng Vĩ sinh vật học Phân tử, Viên Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

Chương 1: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tổng quan về virus cúm

1.1.1 Đặc điểm hình thải, cấu trúc của virus củm

Tiệnh cứmn là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dang RNA thuộc họ Onhomyxoviridae gây ra Họ Onhornyxoviridae đã được phái hiện, bao gồm

4 nhóm virus: nhóm virus cum A, cum B, cửa C và nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bể mặt capsid: 6 virus cm A va B Homagglutinin, ở virus clin C 1a Hemagglutinin Fsterasc Fusion, va 6 Thogolovirus là Glycoprotein

Virus cúm A có câu lao hình câu hoặc hình khối đa điện, đôi khủ cũng có dang

từnh sợi, dường kinh 80 120 nm, khỏi lượng phân tử khoảng 250 triệu La (Hình 1.1

A) Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thay một hạt virus có chứa khoảng 0,8 -

1,1% RNA; 70 — 75% protein, 20 — 24% lipid va $ — 8% carbonhydrate [25] Hé gen

virus cum A la RNA soi don 4m (-) ssRNA, bao gm 8 phan đoạn gen riêng biệt, mã

hóa cho L1 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (MI và M2), NP, N5 C31

và N82), PA, PBI, PBI - F2 và PB2|7| Mỗi phần đoạn RNA của virus cứm A od can

trúc bậc 2, xoắn ø đổi xứng, đài S0 — 100 rm, đường kính 9 — 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein cô bản chất là lipoprotein, tạo thành câu trúc ribonucleoprotei (RNP)

(Hình 1.1 B) Mỗi RNP kết hợp véi 3 protein enzym polymerase chiu trich nhi¢m trong quả trinh phiên mã vả sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ gen virus

củn A nối với nhau bằng các câu mỗi peptide tạo đựng vòm tại giới hạn cuốt của miỗi phân đoạn vả tạo thành một soi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10kb 15 kb (tuy theo từng chứng virus cứm A), chứa khoăng 13,5 kb thông tín đi truyền vả có cấu trủc xoắn

œ bên trong vé virus [25]

Bao bọc hạt virus là một lớp võ lipid kép có nguồn gốc từ máng tế bảo nhiễm được gắn protein màng của virus, đóng vai trỏ bảo vệ vật chất đi truyền RNA cilia

virus Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố day đặc Mỗi glyeoprotein có kích thước đài khoảng 10 — 14 mm, đường kính 4 - 6 nm Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trỏ quan trọng trong quá trình xâm nhiềm của

virus la haemagglutinin (HA) va neuraminidase (NA) Các phân tử HA và NA phân bố không đỏng đều (cứ 4-— 5 phân tử HA thi cỏ 1 phân tử NA) [25] Ngoài ra trên bẻ mặt

vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua mảng lipit kép và hoạt động như kênh vận

chuyển ion Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nén M1 (matrix),

Virus cim A/HINI tương đổi nhạy cảm với các tác nhân vật lí và hỏa học

Nguyên nhân vì lớp vỏ ngoài có bản chất là lớp lipid kép nên đề bị phá hủy bởi các

dung môi hỏa tan lipid, chất tây rửa vả các chất sát trùng Cac hat virus ton tai thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toản ở 100

°C và ở 60 °C trong 30 phút, bị bất hoạt ở 0 °C trong 30 ngày, chỉ tôn tại trong cơ thẻ

người trong 7 — 8 ngày

1.1.2 Đặc điểm các phân đoạn gen củavirus

Virus cúm có hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 — 8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11

protein (Hinh 1.2) Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2;

5; 7:8 có độ đải tương đổi ổn

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

định và có tỉnh bảo thủ cao Hai phân đoạn 4 và 6 mã hỏa cho các protein bê mặt của

virus (HA và NA) cỏ độ dài không ôn định vả đặc trưng theo từng chủng virus [7]

® Pot Pez PA

†-

Hình 1.2: Mô hình cầu trúc virus cúm 4/H1NI

> Phân đoạn 1 cỏ kích thước 2431 bp, mã héa téng hop protein enzym PB2

Enzym này có khỏi lượng phân tử khoảng 84 kDa, lả tiêu đơn vị thành phân trong phức

hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đàu phiên mã RNA của virus Tính thích nghỉ nhiệt độ cơ thẻ loài vật chủ có liên quan đến vi trí amino axit 627 ở protein PB2

> Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, ma hóa tổng hợp enzym PBI PBI có khổi lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym

polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong qua trinh tong hop RNA virus [5]

Gần đây, các nhả khoa học đã phát hiện thêm một protein PB] - F2 được mã hỏa bởi một khung đọc mở khác của phân đoạn 2 [24]

> Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA PA

cỏ khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polymerase chịu

trách nhiệm kéo dải sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus Phân

đoạn gen nảy có tính bảo tồn cao

> Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm mã hóa tổng hop protein HA - khang nguyên be mặt virus cúm Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HAI vả HA2 có độ dài thay đổi tuỳ

theo từng chúng virus cứm A, ở A/1IINI là 1778 bp Protein HA có khói lượng phân tứ

khoảng 63 kDa, đóng vai trỏ quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả xiắng gây ngưng kết hông cầu Vũng nội giữa HAI và HA¿ là một số amino axit mang, tính kiểm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleatide Vimg này chứa vị trí nhận biết

và cái đặc hiệu của ruột số enzymn prolease của vậL chủ và là vùng quyết định độc lực

của virus 11]

> Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hỏa tổng hợp nucleoprotein

(NP) Proteim KP là thành phân của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển

RNA giữa nhân và bảo tương tế bào chủ, cỏ khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tén tai trong các hạt virus ở đạng kết hợp với mỗi phan doan RNA trong hệ gen virus tạo cầu trúc mucleocapsid đối xứng xoắn bên vững

> Phân đoạn 6 mã hỏa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bể mặt capsid của virus Chiểu đải phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virw cúm A (ở cúm

A/HồN2 là 1413 bp, ở cứm A/HSN1 thay đối khoảng từ 1350 — 1410 bp) Cùng với

kháng nguyên HA, NA đóng vai trỏ quan trong trong việc thúc đây sự lây nhiễm của virus trong tế bảo vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus điển ra rửemh hơn và giải phỏng hạt virus ra khỏi tế bảo bị nhiểm |31 |

> Thân doan 7 cé kich thuée khoâng 1027 bp, mã hóa cho protein Mĩ của virus

gom bai Géu phần là M1 va M2 dược dịch mã từ những khung đọc rnö khác nhau của cùng một phản doan RNA Protein M1 4a protein nền, thảnh phần chỉnh của virus có

chúc năng bao bọc ENA tạo nên phúc hẹp RNP vả tham gia vảo quá trình nảy chỏi của

virus [25] Protein M2 là chuối polypeptide có khỏi lượng phân tử là 11 kDa Day la protein xuyén mang can thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi

áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

> Phân đoạn 8 mã hỏa tổng hợp protein không cầu trúc Phân đoạn nảy có độ dải

ấn định nhất trong hệ gen của virus cum A, kich thước khoảng 890 bp, mã hóa tang

hợp Tứú protem là NST và N52 có vai Irò bảo vệ hệ gen cia virus Protein NST co khối

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

lượng phân tử theo tính toan là 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyên RNA thông ti

của virus từ nhân ra bảo tương tế bảo nhiêm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng, như các quá trình cắt và dịch mã của tế bảo chủ, ức chế sự cắt dán tiên RNA thông tín

Ngoài ra, NS1 cỏ thể ức ché dap tmg interferon trong cac té bao nhiém virus, lam cho

sự sinh sản virus không bị cản trở NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, cỏ

khỏi lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyên các RNP của virus ra khỏi nhân tế bảo nhiễm đề lắp ráp với capsid tạo nên hat virus mới

1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ -

'Virus củm A/HINI thuộc dạng kỉ sinh nội bảo bắt buộc Quả trình xâm nhiềm và

nhân lên của virus xây ra chủ yêu ở các tế bảo biêu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thẻ nhiễm, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA va thụ thê thích ứng trên bề mặt các

tế bảo Màng tế bảo bị uốn dẫn vào trong, bao quanh hạt virus, đưa virus vảo trong tế

bảo và tách ra tạo thành các khoang âm bảo (endosome) pH trong các endosome giảm

dan đo tế bảo tích cực bơm ion HỶ vào môi trường thủy phân các chất Hoạt tính của

kênh ion M2 được gia tăng đẻ cho các ion tràn vảo bên trong vi hạt, dẫn đến pH tháp

Do kết quả này, cầu nối HA - MI bị nhiều loạn, vi hạt mở ra và HA hỏa với lớp mang

trong của mảng nội bào Các ribonucleoprotein được phỏng thích vào trong bảo tương

và được vận chuyên tới hân tế bảo Tại đây phức hợp bi pha v6 va su tong hop RNA

virus bắt đầu Quả trình cởi vỏ bọc hoản tất chỉ trong vòng 20 — 30 phút kể tử khi virus

gắn vào tế bảo [31], (Hình 1.3),

Hinh 1.3: Chu trink xâm nhiễm và sao chép của vừus cửn trong tế bào vật chủ

Trong nhân Lễ bảo, virus lợi dụng bộ máy lổng hợp của tế bảo vật chủ để tổng

hop nén RNA théng tin GnRNA) tir RNA hé gen virus, Cac soi mRNA được vận

chuyển ra bào tương tham gia vào quá trinh tổng hợp các protein virus Cáo protein mới dược tổng hợp được dưa trở lại nhân tế bào tham gia vào quá trình tổng hợp các

sơi RNA đương từ khuôn la sợi âm của hệ gen virus

Từ các sợi đương nảy chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ

RNA-polymerasc Các sợi nảy không được Adcnine hóa (gắn thêm các Adenine - gốn mil) 6 dau S'- và 3'-, chứng kết hợp với nucleoprotein tao thanh phitc hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyên ra bảo Lương tế bảo [30] Các phân

tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp dược vận chuyên gần lên mặt ngoài của mảng,

tế bào nhiễm nhò bộ máy Golgi Khi đạt đủ nồng độ tại mảng bảo tương, các RKT và

MỊ kết lụ lại thành những vì hại của virus Nhờ hoạt tính của neurnrninidise các bạt

virus nảy được phóng thích ra khối tế bảo vá lại tiếp tục xâm nhiễm vào tổ bào khác

theo chu trình tương tự [20]

1.1.4 Các kháng nguyên quan trong vita virus cam

L141 Hemagglutinin (HA)

HA là kháng nguyên bể mặt chủ yêu của virus cúm và là đích để kháng thé trung hòa Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế báo vật chủ, hỏa tan mảng tế báo,

giải phóng RNA hê gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bảo cảm nhiễm Có tới

400 phân tử HA trên bể mật capsid eda virus Mỗi phân tử có đang hình trụ, dài khoảng

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

130 A®, cau tạo gồm ba đơn phân Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị HAI

và HA2 liên kết với nhau bởi các câu nói disulfide Tiểu phân HA2 có dạng sợi, đóng, vai trỏ gan khang nguyên vào màng virus Phân đầu tự do hình chỏm câu được tạo bởi tiểu đơn vị HAI Tiểu phần nảy cỏ chứa những thụ thẻ đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus

vào mảng tế bảo chủ trong quá trình xâm nhiễm [11] Đoạn polypeptide liên kết giữa

hai tiểu phần HAI và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bảo vật chủ Đổi với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI),

vị trí liên kết hai tiều phân HA thường là một chuối amino acid kiểm, để dảng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thẻ Do đỏ, virus có thẻ nhân lên trong toàn bộ cơ thê, gây nguy hiểm tới

tỉnh mạng vật chủ

Hình 2.3: Mô hình cầu trúc phân tử H4

Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cảm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (HI, H2 và H3) Sự phủ hợp cau hình không gian giữa thụ thê chửa axit sialic của tế bảo đích với vị tri gan thu the nay

trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiềm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự nhiên, vị trí amino axit 226 và 228 của tiêu phản HAI quyết định khả năng liên kết của protein HA với thụ thẻ đặc hiệu trên mảng tế bảo chủ Sự thay đổi các amino axit trên làm thay doi

thụ thể đặc trưng của virus, giúp virus vượt qua rào cản loài và thích ứng với một loại

vật chủ mới Protein LIA của virus cửm gia cằm chứa gốc Gia 226 va Gly 228 hình thành nên một dạng hếc hẹp phù hợp để gắn thụ thể axit sialic đạng ø2,3 Trang khi

đồ, chúng virus gây bệnh ở người chúa L.eu 236 và Ser 228 hình thành nên mét dang

héc rang để thích hợp với axit sialic đạng ø2,6 Do đó, đột biến điểm trên TIA có thể chuyển đối đặc Lính gần thích hợp sang axit sialic dang 02,6 Pay chính là điều kiên cân dẻ chúng tiền hóa thành một chủng, có khả năng gây nên địch cúm ở người |32J,

11.4 2 Neurominiäase (NA)

Đroleim neuơminidase côn gọi là sialidase là một prolein có bản chất là

glycoprotein dược gắn trên bẻ mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên

đặc trung theo từng phân typs NA Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử

HA trén bé mit capsid hat virus Phin tử NA có đạng nút lỗi hình nắm, dẫu bự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu phân dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên củng một mặt phẳng, và phản ki nước gắn vào vỏ capsid Protein NA có vai trỏ là một enzym cất dứt liên kết giữa gốc sialie acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydraLe của protein ITA, giai phéng hạt virus ra khỏi màng tế bào vật chủ, đây nhanh sự lây nhiễm cha virus trong cơ thể vật chủ, và ngắn cân sư tập hợp cửa các hạt virus mới lrên màng,

tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phản cắt liên kết nảy trong giai doạn “hòa mảng”,

đây nhanh quá trình cởi áo “tmcoadng” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bảo, giúp cho quá trùnh nhân lên của virus diễn ra rứemh hơn Ngoài ra, NÀ

còn phân cắt các liên kết gÌycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng, nhây bề mặt biều mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cân tê bảo biểu mô vá thoát khối các chất ức chế không dặc hiệu Củng với vai trỏ của kháng,

nguyên HA, cš 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lựo gây bệnh của virus cúm A ở co thể vật chú Do đó, KA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus khỏng đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamifiu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phỏng hạt virus mới khôi cáo tế bảo dich, bio vé cơ Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bể mặt cồn virus, tham gia

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

kích thích hệ thống miền dịch của cơ thẻ chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong töa protein NA Như

vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yêu của

cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, vả lả cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người vả gia cằm, nhằm ngăn chặn dịch củm 6 gia cam va han

chế lây truyền sang người

Men neuraminidase co dang nút lỗi hình nắm trên bề mặt virus No có một đầu gồm 4 tiêu đơn vị hình dạng gản hình càu trên củng mặt phẳng, và một ving kị nước gắn vào bên trong màng virus, Đây la gen mã hóa tổng hop protein NA, khang nguyên

bể mặt capsid của virus, có khỏi lượng phân tử khoảng 50.10” Dal Các nghiên cứu

phan tử gen NA của virus cúm cho thay phan dau Š`- của gen nay (hay phan tan cing

N ctia polypeptide NA) có tỉnh biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A,

sự thay đổi này liên quan đền quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiêu đối tượng vật chủ khác nhau Đặc trưng biển đổi của gen NA trong virus cúm A lả hiện tượng đột biển trượt-xóa một đoạn gen là 57 nueleotide, rồi sau đỏ là 60 nucleotide, làm cho độ dải vốn có trước đây của NA(N]) là 1410 bp còn 1350 bp

1.1.43 Matrix protein (M1) ciia virus cúm

MI là một loại protein nên bao quanh vRNP, liên kết vRNP với vỏ virus và

kênh ion ( Hiện nay đã biết được trình tự acidamine từ 91 đến 116 và từ 165 đến 252 thực hiện chức năng nảy) MI có trọng lượng khoảng 27.8 kDal Đơn phân của MI là

I

các cầu trúc hình que dai kho’ng 60A° Cac nghién cir vé protein Ml 48 chi ring M1 chứa hai câu trúc cơ bản là ø — Helicase ( được đánh dau tit H] dén H9) va cfu trúc

cặp tóc — loop ( được đánh dâu lừ 1,1 đến T.8) Theo tính chất hóa sinh MT được phân

chia thành hai vùng aoidamine tạo cấu trúc bình cần Ving thi nhit tir acidamine sé 1 đến 164 và vùng thứ hai từ acidamine 165 đến 252 Hai vùng này được nội với nhau

bởi vùng nhạy cắm với protease, do vậy trong quá trình tính sạch và biểu hiện nêu có xuặt của protease né thường bị loại bố [16],

Prolein MI không chỉ là thành phần cầu Irie eda virion, ma nd con thực hiện rất nhiều chức năng trong chu trinh sóng của virus, đỏ là

>_ Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyên vRNP ra vào nhân, MI là

yếu tổ diều chỉnh quá trình xuất nhập này Sau khi virus dị vào endoxom dưới tác dụng, của p1 thấp đo sự vận chuyên của ion LÍ” qua kênh tơn M2 của virus và phức hợp Ml -

vNP' bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân Ngược lại, khi các vENP tới được táo thành trong nhân thì MỸ và NS2 sẽ dì vào nhân và kết hợp với vRNP

cùng được vận chuyên ra khỏi nhân Sự tương tac của MI với vRNP đã được nghiên

cửu khá rõ Hai vũng trong MI bám vao RNA được xác định ö bai vùng độc lập: ngón tay kém (a zine finger motif, 6 vi tri axit anun 148 tới 162) và một chuỗi axit amin KKLKR (ở vị trí axit amin 101 tới 105)

» Điều hòa sao chép vRNP; vỀNP chỉ được sao chép khi tách khỏi MT

>_ Tương tác với protem vỏ của virus HA, NA, M2 trong quả trinh này chồi

> Huy động các thành phần cia virus voi

trí lắp ráp và khải đâu nảy

chối

Ð> MI là yếu tế trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus phân

tử M1 liên kết với vRNP, màng tế bảo qua các đuôi hướng tế bào chat của cả hai

glicoprotem la HA, NA, mét sé phan ti M1 Khac thi tạo thành một lớp dưới vỏ bọc của

virus Liên kết của MI với màng đựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện wa ky

Trước cũng như sự tương: lắc của protem đặc hiệu với proleim vô

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

>_ Huy động các thành phần của tế bào chủ cho việc hoản thiện nảy chổi vả

sự giải phóng virus

> _ Tỷ lê MI/NP của phần tử virus ảnh hướng đến hình thải của virion và sự

lan truyền của virus khi được giải phóng,

Tinh 2.5 Anh liền vi điện từ chụp các thể vữus cứu A dang tién hank nay chéi va vai

trò của các yếu tổ tham gia trong quả trình này chỗi

(nguén: www.ncbi.nlm.nih.gov)

1.1.5 Tỉnh hình dịch bệnh HLXI

Chúng virus củm A/HTN1/09 được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới @ México vào tháng 3/2009, dén thang 4/2009 bệnh lây nhanh thành dich sang các bang Texas, California, rồi lan sang nhiều nơi tại Mỹ và các móc Bắc bán câu Trước tỉnh hình cúm diễn biến ngày 25/4/2009 tổ chúc y tế thế giới (WHO) chỉ đưa cảnh bao dich lay ke

cấp độ 3 (chưa lây người sang người), nhưng sau 5 ngảy sau nâng lên cấp 4 (đã xuất hiện cúm lây từ người sang người), sau 6 tuần sau nâng lên cấp 6 cập đại địch ( lây lan xông khắp công đồng) Theo thông báo của Tổ chức Y lế Thế giới (WHO) ngày 06/8/2010, toàn thế giới đã ghi nhận 214 quốc gia và vùng lãnh thổ cỏ xét nghiệm

dương tính với virus cửa A(HTNI), rong đó 18.449 trường hợp Lữ vong rãi rác tại các

khu vực như Trung Mỹ, Nam châu Á, An D6, Nepal va Bhutan

Ngày 10/8/2010, sau 14 tháng tuyên bố đại dịch cửa A(I11N]) trên toán cầu tỏ chức Y tế Thế giới đã dưa ra Thông báo: Thế giới không còn trong giai doạn đại dịch cum (giai đoạn 6) mà đã chuyển sang giai đoạn sau đại dịch ( theo

http://nede.gov.vn)

Tại Việt Nam trường hợp nhiễm cúm A/ HIN] dau tién la mét du hoe sink tu

Mỹ Sau 08 tháng từ khi địch lây ra cộng đồng đã có tới 7156 trường hợp nhiễm bệnh

trong đó có 09 ca tử vong Nguyên nhân do biến chứng phải nặng dẫn đên suy hô hấp cấp rỗi suy da tạng Theo ghí nhận của các nước xôi khi địch bệnh bung phát tốc độ lan truyền sẽ tăng theo cấp số nhân, nguy cơ mắc bệnh và tử vong sẽ tiến dẫn tới đính cao Ngày 22/01/2011 đã xuất hiện cá tử vòng đầu liên do cum HINT trong nam 2011

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

( theo www.soyte.banoi.gov.vnJ Tĩnh hình hiện tại của 111N1 bat đầu đáng lơ ngại thông tin trên cho thấy cũm A/HINI vẫn đang tiểm tảng nguy cơ bủng phát cao khuyến cáo mọi người cân Iiục hiện lột công láo phòng chồng địch để bạn chế sự tái trùng phát của địch cứm AHNI Trước tỉnh hình cửm hiện nay cho thay việc tạo ra vaccine lỗi ưu hóa trong việc phòng chông cúm đặc biệt là cứm HINT 1 van dé cap

thiết

1.2 Vaccine phòng chẳng cúm

Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thưởng có những biện pháp kiểm soát

vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xả phòng đặc biệt là san khi ho, hắt hơi vì virus cản A/HIN] có sức dể kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xa mắt trời, tia cực tím

và các chất tây rita thông thường (xả phòng, chất tây natri hypochiorite 0,05%, côn Bthanol 70 ° ) Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghỉ là bị

xhiễm lại khú vực có dịch Tuy nhiên, việc lãm này là chưa đô để ngăn chăn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đồng dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì

virus cứm A/HINI có thể tổn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biết khi thời Hết lạnh Ngoài ra bệnh còn gây ảnh hưởng nặng nể tới nên kinh tế mỗi quốc gia và đặc biệt là

người nông đân, mỗi trường sinh thái bị ô nhiễm ảnh hưởng tới sức khỏe cơn người

Trên thực lẻ, thế giới đã sử dựng phỏ biến một số loại thuốc đùng trong diểu trị cúm A,

cơ chế hoạt động của thuốc dựa trên chu trinh hoạt động của virus củm Cụ thể là:

Amantadine vd Rimantadine: Day là hai loại thuốc cản trẻ sự hoạt động của

kênh ion M2 Dẫn tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vỡ ngoài của virus vRNP không

được đưa vào nhân cải xen vào gemone của tế bảo chủ Ở nông độ nhỏ Amantadine

gây hiệu quả cao với virus củm A song kém hiệu quả với virus cửa B và ( đo sự

khác biệt về kênh ion) Amantadine còn hoạt động như một bazo yếu, trung hoa H*

trong endesome và bộ máy golgi Trong hai loại thuốc nay thi Rimantadine được sử

dụng phổ biến hơn vi gây it tác dụng phụ Luy nhiên thực tế chứng đều gây tác đông

phụ tói hệ thắn kinh đồng thời cũng xuất hiện những chủng cứn kháng thuốc Sự

kháng thuốc này chủ yếu liên quan tới cáo đội biến xây ra trong trình lự nueleolid mã

hóa cho kênh M2

Leplomycine B: Cú chế của loại thuc này là ngăn cân sự van chuyén vRNP ra

*höi nhân tế bào

Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltnav): hai loại này có câu hình không,

gian Lương tự như NÀ Do vậy chúng ngăn cần sự liên kết của NA với các thụ thể

sialic acid, cn trở quả trình giải phóng virus, ức chế sợ lan nhiễm virus

Việc tiêm phòng được xem là lựa chon đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây lan của dịch củm Trên thể giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cửu sắn xuất vaccine phòng củm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp,

Đức, Hà Lan, Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dich bảo

hộ, linh khang nguyé

tỉnh đặc hiệu và lính không độc ViệL Nam dang trong giai doan

tap duyệt sản xuất vaocine để phòng cúm IIENI Các vắc-xin ngừa bệnh cửn mùa

trước đây không có hiệu quả đối với cảm A JAIN madi Cac vaccine phòng bệnh hién

nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine tuyén théng va vaccine thé hé mdi

¢ Vaccine truyén thống:

- Vaceme bal boat:

Vaccine nay được tạo ra từ các chủng virus ngoài tự nhiên, đã bị làm bất hoạt

bằng oác táo nhân lý hóa khác nhau và không còn khả năng nhân lên trong vật chủ [S]

Hiệu nay, phương, pháp tạo vacoine nảy dược sử dụng phỏ biến nhất là nuôi virus trong, trứng rồi làm bat hoạt bằng các tác nhân vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tỉa tử

ngoại, hay các tác nhân hóa học như các loại thuốc nhuộm, axit, formol Loai vaceine

mây có ưu điểm dễ săn xuất vả bảo quản, giả thành rẻ, độ an toàn cao Tuy nhiên,

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

và hiệu quá không cao

- Vasclne giảm độc lực:

T;ả loại vaccine đã được làm nưược độc hoặc vô độc nhưng vẫn bảo Loan tinh

kháng nguyên Thường vacoine được tạo từ các loại virus đã bị làm mắt các gen quy

định tính độc, do đó không còn khả răng gây bệnh nhưng vẫn còn khả năng gây đáp đứng miễn địch Vacoe này có khả nắng sinh đáp ứng miễn dịch nhanh chóng và tốt

hon vaccine bắt hoạt, tác dụng báo vệ phỏng bệnh hiệu quá, không phái tiêm nhắc

uhtéu lần Theœ một số nghiện cửa, loại vi

cine này có khẽ năng bão về chéo giữa c;

chúng virus cứm A khác nhau Tuy nhiên, mức độ an toàn của loại vaccine nảy thắp hon so vai vaccine bất hoạt do có khả nàng biến đổi thành kiểu hoang đại và gây bệnh

ở vật chủ

* Vaccine thế hệ mới:

aecine tải lỗ hạp:

Cáo gơn mã hỏa cho kháng nguyén virus ed kha wing sinh dap émg mién dich

thảo hộ được đưa vào các hệ biển hiện khác nhau như: vi khuẩn, nắm men, tế bao động

vật hay virus để tổng hợp Các kháng nguyên sau khi lổng hợp ra có thể được sử dụng

làm vaccine Vaccine TrovacAIV - H5 eda hing Merial (Pháp), được tạo ra tử gen HŠ

của chúng A/Tuukey/relDNA/§3 (H5N2) là một ví dụ về loại vaccine tái tố hợp Loại vaccime này được sử dụng được cho gia cam lúc T ngày tuổi và có khổ rững bảo vệ trong hon 20 tuần, hiện được sứ dụng rất rỗng rãi Tại Việt Nam, vaccine TrovacALV-

HS được áp dụng tiêm phòng củm cho ga tir nim 2006,

Vaccine DNA:

Gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào một vector biểu hiện củng với một promoter mạnh cỏ khả năng biếu hiện tốt trong tê bào vật chủ Khi biển nạp thánh công vào vật chủ, protein kháng nguyên sẽ được tổng hợp ra từ gen mã

hóa cho kháng nguyên và kích thích cơ thể sinh miễn địch chẳng lại proter đỏ, Vaocme DNA rất gọn nhẹ, an toàn, phương thúc gây miễn dịch đơn giản do chỉ chứa

DNA thuan khiét nén bén voi nhigt độ

Vaccine virus nhuoe độc nhân tao sản xuất bằng kĩ thuật di trưyển ngược:

Phương pháp này được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồm nhiều phan đoạn nhỏ Cáo phân đoạn được lắp ghép tạo thành virus với đầy đủ hệ gen Trong

đó, các gen khang nguyên HS có vũng độc được biên đối bằng kỹ thuật gen Có 3 loại vacoine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về dộ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sẵn xuất vaccime trên thế giới hiện nay đỏ là NIRG - 14

(NIBSC), VN/04xPR8 - rự (SICRH) và VNH5NI - PR8/CDC - rự (CDC)

Vaccine dusi don vi:

Là loai vaccine chi str dung một phần của hạt virus để kích thích đáp ứng miễn

dịch Do các kháng nguyên đã dược tỉnh chễ khi sử dụng làm vaccine nên có độ an

toàn cao, không gây các phan ủng phụ Quy trình săn xuất lượng lớn vaccine đưới đơn

vị khả đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiến

1.2.2 Tổng quan về VLPs

Công nghệ VLPs đã được khai triển bởi nhiều trưng tâm nghiên cứu và đại học

quốc tế để lạo vaccine thể hệ mới cho nhiều lác nhâu vừus như HN, HSNI,

Adenovirus, HIV, Hepatitis C, Respiratory Syncytial (RSV), Varicella Zoster (VZV),

Ebola, Chikungunya Novavax Inc 14 một trong những công ty đâu ngành khai triển VIPs cho các vaxin cúm ở Họa Kỳ và một số nơi trên thế giới Các thú nghiệm của Novavax inc, trén sinh vat va Jam sáng ở người đã cho kết quả tốt đẹp, an toàn va co

khã năng oao cho việc thương mại hóa trên thị trường trong tương lai

Về mặt cẩu tạo VLPs được gọi là hạt giá virus vị hình thái cầu trúc của nó tương,

tự như một virus tự nhiên Phía ngoài là lớp vỏ chứa thành phần chủ yêu là lớp kép

photpholipid của tế bào vật chủ và các loại protein đặc trưng của từng chủng virus

‘Tuy vay bén trong của VLPs lại trồng, không cỏ lõi chửa vật liệu di uuyén đây là nguyén nhan khién VLPs không gây hại cho tế bào vật chủ san khi xâm nhiễm

Luận văn thạc sĩ sinh học Vũ Thị Thanh Nhàn

Về phân kỹ thuật, VLPs là phương pháp cloning trình tự DNA của các siêu vị đề

tao protein tai t6 hop lam khang nguyên cho vaccine Điểm đặc biệt là các protem

khảng nguyên nảy có hình dạng vả kích thước giỏng một virus nhưng không cỏ DNA/RNA ciia virus Cac uu diém ctia VLPs vaccine bao gồm:

Độ an toàn rất cao vì kháng nguyên VLPs không còn DNA/RNA của nhân

Ngoài ra, phương pháp của VLPs an toàn hơn phương pháp dung trứng trong việc sản

xuất vaceine cô điện Do tính an toàn, việc tạo VLPs cho hàu hết các tác nhân bệnh lý

được thực hiện trong điều kiện thường của phòng thí nghiệm, không đỏi hỏi những kỹ

thuật hoặc phòng thí nghiệm độ an toàn quá cao như đổi với các trường hợp tạo vaceine cổ điện

Khả năng tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt Các kết quà nghiên cứu và thử

nghiệm đã cho thấy VLPs thường gây miễn dịch nhiều hơn các tiêu đơn vị hoặc các

protein khang nguyên tái tổ hợp, và có thẻ kich thích cả miễn địch dịch thê và tế bảo T của hệ miễn dịch [19] Vì vậy VLPs sé kich thich hệ miễn dịch tạo kháng thể chóng

cau trac ba chiéu (3D structure) va hai chiéu (linear structure) cia VLPs khang nguyên

Sản xuất nhanh đề đáp ứng khi dịch bệnh bộc phát Phương pháp cloning va dung

té bao nhu Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) của côn trùng ( bởi hãng Novavax Ine.) hoặc

tế bảo thực vật của cây thuốc lả và Alfalfa (dùng bởi hãng Medicaga Inc.) dé tao

protein tai t6 hop VLPs lam khang nguyén có thể được thực hiện từ vải tuần đến hai thang thay vi sau tháng như vaceme cô điển dùng trửng Ưu điểm nay rat can dé tao vaccine dap ứng sự bộc phát vả thay đổi gen (mutation) một cách nhanh chỏng của các

VHUS

Giá sản xuất thấp và khả thi ở Liệt Nam Các định giá về mặt sản xuất VLPs cho

thây phương pháp VLPs có giá thành thập vì cloning có khả năng tạo số lượng khang nguyén rat cao, gap nhieu lan so voi vaccine co dien

Để khai triển ứng dụng kết quả nghiên cứu vaceine VLP - HINI, trước hết xét về mặt kĩ thuật sẽ phải biểu hiện 3 loại protein tương ứng của gen NA, HA, M1 của virus HINI, sau đó VLPs được tạo ra bằng việc tổ hợp của ba loại protein, đng thời cân

thiết lập những thử nghiệm lâm sàng dé minh chứng độ an toàn và hữu hiệu trong công

đồng Nghiên cứu thành công VLP/HINI sẽ mở ra một đường hưởng mới đề tạo

những loại vaceine cân thiết cho việc tiêm chủng ở Việt Nam đề góp phần vảo nỗ lực

ngăn ngừa dịch bệnh hàng năm hoặc đột phá xây ra trong tương lai

Luận văn thạc st sinh hoc Vat Thi Thanh Nhan

Hình 2.7: Mô hình chung của phương pháp tạo VLPs của HINI (A) va các bước

cơ bản trong quy trinh tao VLPs HIN1(B)

1.3 Hệ thống biểu hiện Baculovirus

Baculovirus là nhom virus ki sinh ở hơn 600 loài côn trùng khác nhau Cải tên

Baeulovirus bắt nguồn từ chữ baculum trong tiếng Latinh - có nghĩa là hình que, mô tả

hình dạng của virus Khi những côn trùng bị nhiễm độc baculovirus sẽ gây biến tinh

câu trúc keo, đặc biết đối với các polyhedrm protein Trong môi trường sông của virus,

polyhedrm protem có chức năng bao vé virus khỏi tia cực tim

disulfua, và sự photphoryl hóa

Nhiều năm qua, hang ngàn gen đã được tải bản thành công vả nhanh chóng

trong tế bảo côn trùng Với hệ thống sản xuất BEVS, protein có thể được sản xuất thời

gian tính theo tuần, thay vì tính thời gian theo tháng hay năm, bởi vi dang gen của virus được biến đối về mặt đi truyền để gây độc cho tế bảo cồn trùng,

22

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

2.2.1 Vector tach dong

Chúng tôi dã sử dụng vector pCR2.1 (Inviuogen, Mỹ) dễ tách dòng gen ÀZ/

liệu

trong tế bảo /2 coli chimg IIl5ø Vector pCR2.1 mang nhiều ưu điểm cho mục đích

tách dòng gen Vector có kích thước kích thước nhỏ 3,9 Kb (bình 2.1), được thiết kế có

gắn một operon chuyển hóa đường lactoza là operon lac Tại vùng ranh giới giữa romotor của operơn này và gen câu trủc mã hóa cho beta- galactosidase có vừng cắt gân đa vị Với đặc trưng trong cầu tạo như vậy sản phẩm beta- galacLosidase có thé được tạo ra khi đó khuẩn lạc sẽ có máu xanh (ong trường hợp vector không được gắn thêm DNA ngoại lai), hoặc có thể không được tạo ra (vector dive gan thém DNA Trguại lạ), khi đó khuẩn lạc có màu trắng Dựa vào đâu chuẩn nảy người la có thê chọn lọc những tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra vetor pCR2.1 còn

chữa gen kháng kháng sinh là Amp và Ka, nhờ đó vì khuẩn có veelor này có thể sinh

trưởng và phát triển bình thường trong môi trưởng chứa Amp vá Ka với nông độ ức

chế tôi thiểu

23

Wi3 Reverse “He | Hod IN T Ken — Ssel i i Ba Spe!

GAG GAA ACA SCT EG AIC ATG ATT ACG CCA £6C T7O GTA COS AGO TCO GAT CDA CTA

FC GIT TST DSA TAC TUSTAC TAA TOR OF CG AAG CAT GSC TOS AGC CTH GET GAT

ax ee ee SiR 108 one axe Ho" GI2Ì21e dục Tre co YTEDTEDNEEH GP do TC T08

AE GAG Tes TAT TAGARI IUA [T6 ŒÓE GIỮGI - TA

WOR ÚC AtE: BIA AI[GELA AB:

CASRN CLG ACE CI iG

Hinh 2.1: Sor dé vector pCR2.1

2.2.3 Vector biéu hign trong té bao cén tring ¬

Vector pBluBao4.5/V5-His-TOPO được sử dụng để biểu hiện gen M1 trong 18

‘bao côn trùng, Vector có ưu diém nỗi bật là sử dụng, promoter polyhedrin của virus đa nhân (AcMXDPV -Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) dé biéu

Tuện các gen mong muốn ở iite dé cao (Crawford, Miller, 1998) Ngoai ra, veclar nay

còn có thêm một số đặc điểm ưu việt cho việc biểu hiện, gồm có

234

Lugn vin thac si sink hoc Vii Thj Thanh Nhân

Co doan peptide diu C mã hóa epitop V5 và 6 1istidine thích hợp cho việc phát

thiện và tỉnh sạch protein tái tổ hợp

Có tín hiệu polyadenin hóa của 8V40 tứng cường kết thúc dịch mã và tỉnh ôn

dinh cho mRNA

Mang promoter early-lo-late (ETL) dé biéu hign B-galactosidase thich hap cho

việc chọn lọc các dong tế bảo côn tring mang virus tai t6 hop bang X-gal (Vialard ct

al, 1990)

2.2.3, Hóa chất và sinh phẫm

Sinh phẩm:

« Bộ Ki tách đồng —TA cloning Kit Invitrogen}

Kit tinh sach plasmid —S.N_A.P.™ Gnvitrogen)

© Kitthéi gel-SNLAP free UV (Invitrogen)

Kit tinh sach san pham PCR (Termentas, Ditc)

Hóa chất:

Các hóa chất dùng cho nghiên cửu được cung cấp từ các hãng I3ioRad, Invitrogen, New EngIDNA Biolabs, Sigma (My), Fermentas, Merck (Buic): cao nam men, trypton,

agar Ainp, X- gal, FDTA, MgCh, SDS 10%, ethanol, NaCl, Soll, Sol TT, Sol TII

Cac enzym gidi han BamIl I va [ind II (New EngIDNA Biolabs, Mg), Ty DNA Tigase (uvitrogen, Mỹ)

2.2.4 Trang thiết bị:

= Lê vi sông (Samsung)

=- Máy lắc Ôn nhiệt 37°C (Multitron-Đức)

=- May khuấy từ (Rotolab,Osi)

= May ly tim (microcentrifuge-sorvall, My)

= Ta lanh sdu (Sanyo)

= May khudy trén vortex (rotolab,osi)

= May soi anh gel (BIO-RAD)

25

= Cfn phan tich (mettle toledo)

= Tu cay v6 tring (Sanyo)

= Nai khử trùng (Nhat Ban)

= May ly tam lanh (sorvall biofuge fresco)

= Badién di DNA

=_ Máy xác dịnh trình tự DNA tự động (ABI 3100, applied biosystems-Mỹ)

= May PCR (MJ Ressarch-Mỹ); pipettman các loại (gilson)

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

3.3.1 Tách chiết RNA tổng số

= Virus được bắt hoạt bằng trizal với tỷ lệ 1:1 bằng xy lanh trên đều

= Đổ sung dung dịch chrophorm vào huyền địch vưus đã dược bất hoạt trong trizol, đáo đều trong khoảng 1 giây

= Luu gitt onhiet d6 phéng trong 5 phitt, li tâm 10.000vip trong L0 phút

= Chavén pha tréu vao dng efpendof mai

= Bé sung 0,5ml isopropanol Dão đều để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

= Li tâm 12.000v/p trong 30 phúi Lai 420 để thu tủa RNA

= Rita tia bing 1 ml ethanol 70%, li tam 12.000v/p trong 15 phut & 4°C

= Lam khé RNA trong box, hòa lại mẫu với 20 ml nước vô trùng đã loại

RNAse

2.3.2 Kiểm ra RNA bằng quang phổ kễ

Nguyên tắc: đựa vào sự hắp phụ ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của

cae bazo nito la purin va pirimidin

Nông đô RNA soi don (ug/ ml) được tính theo công thức:

Cra = Ages x 40x d

dla 46 pha loãng, mẫu cân đo Cach tién hanh:

= Pha lodng dung dich ARN 20 lan trong nước vô trùng ( 5 yl dung dich ARN trong 95 pl H2O

26