Luận văn nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây cốt khí củ reynoutria japonica houtt

Với việc đưa vào các phương pháp sàng loc hoạt tính sinh học nhanh đòi hỏi các nhà hóa lọc nghiên cứu các quy trính phân tách liệu quả các hợp chất thiên nhiên từ các nguồn thực vật, v

=== mdaa ===

Tran Thanh Ha

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC

RE CAY COT KHi CU

(REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT.)

LUAN VAN THAC SI KHOA HOC

Hà Nội - 2012

DAI HOC QUOC GIA HANOI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=== 9908 ===

Tran Thanh Ha

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC

RE CAY COT KHi CU

(REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT.)

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số : 604427

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Căn bộ hướng dần: PGS TS Nguyễn Văn Đậu

Hà Nội - 2012

học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường, Dai hoc Khoa học Lự nhiên, Dại học Quốc gia Là Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bảy tố lòng kinh trọng và lời cảm ơn chân thanh đến:

PGS T§ Nguyễn ăn Dậu đã tìn tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn

va lao các điều kiện nghiên cửu thuận lợi giúp tôi trong suốt thời gián thực

hiện luận văn

Tôi gửi lời căm on chân thành tới anh chị em dổng nghiệp tại Viện

Dược liệu - nơi tỏi công tác đã chia sẽ công việc, giúp dỡ tôi trong suốt thời

gian tôi học cao học

Dẳng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cả giáo, các

nghiên cứu simh, các bạn học viên cao học K21 và các em: siủt viên rong

Phòng thì nghiệm Hoá học các hợp chất thiên rhưê:

đã lạo môi trường nghiên

cửu khoa học thuận lợi giủp dỡ tôi hoàn thành tốt bán luận văn này

Hà Nỗi, tháng 12 năm 2012

Học viên

'trần Thanh Hà

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

1.4.7 đái tháo đường - 21

Chương 3: THỰC NGHIEM

3.1 THIET BI VÀ HỖA CHÁT 28

mm

3.1.2 Hỏa chất - - - 29

3.3 BINH TINH CAC NHOM CHAT CO TRONG RE COT KH cty 29

3.3.1 Định tỉnh các thành phan tong địch chiết cle dau héa 29 3.3.1 Định tỉnh các thành phần trong địch chiết clanoL 30

3.4 DIBU cit CAC PIIAN CIIIET TU RE COT Ki CO 33 3.5 PHAN TICH CAC PHAN CHIRT BANG SAC KY LOP MONG 34

3.5.2 Phân tích phân chiết etyl axetat (RTE) cece 35

3.5.3 Phân tích phân chiết n-butanol (RIB) ccccccsssessseesssseeseesnnseeerien 36 3.6 PHAN LAP CAC HOP CHAT TU CAC PHAN CHIET a7 3.6.1 Phân tách phần chiết v-hexan (RJH) .cccccssssesesersssesseessseeeinn dT

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

3.6.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (RIE) - 3g

3.6.3 Phân tách phần chiết ø-butanol (RJB) - ssocseeeecesso.v 4Ù

3.7 HANG SO VAT LY VA DU KIÊN PHÔ ecoeeceeeaea.4T

3.8 PHÂN TÍCH DỊNH LƯỢNG RESVER.ATROL VÀ PICEID 47

3.8.2 Chuẩn bị mấu phân tích: điều chế phần chiết metanel 47

3.8.3 Điều kiện phân tỉch sắc ký HPLC so55055eceesseeesre 47

Chương 4: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 DIEU CHE CAC PHAN CHIÊT „49 4.2 ĐỊNH TỈNH CÁC NHÔM CHẤT TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ Š1

4.3 PHAN TACH CAC PHAN CHIRT RE CAY COT RHI Ct’ 32

4.3.2 Phan tach phan chiét clyl axctat (RIF) Tả 34 4.3.3 Phân tách phần chiết n-butanol (RIB) cee $6

4.5.1 Phân tích IIPLC địch chiết MeOI1 của cốt khí củ 68

MUC LUC CAC BANG, HINH VÀ SƠ ĐỎ TRONG LUẬN VĂN

Băng 3.1 Hiệu suất điều chế các phân chiết rễ cốt Khí cũ

Bang 3.2 Phan tich TLC phan chiét n-hexan (RUH)

Bang 3.3 Phân tích phẩn chiết etyl axetat (RJE}

Bang 3.4 Phan tich phan chiét n-butanol (RIB)

Bang 4.1 Két qud dinh tinh cdc nhỏm chất trong rễ cất khi cũ

Bang 4.2 Nang dd chdt resveratrol va piceid trong hon hop chudn

Bằng 4.3 Han: hieong resveratrol vi piceid 6 trong các mẫu vễ nổi khí nổ

Hình 1.1 Af6t sé hinh ảnh về cây cốt khí cả

Hình 2.1 Phương pháp sắc ký cột

Hình 4.1 7ương đác HSQC của RIETS

TTình 4.2 Tương tác 1JMBC của RE 13

Hình 4.3 Sắc ký đồ HPC

Tinh 4.4 Phương trình đường chuẩn picsid

Hình 4.5 Phương trùnh đường chuẩn reaverdlroÌ co

Sự đỗ 4.1 Quy trình điều chế các phân chiết từ rễ cốt khi cũ

Sơ đề 4.2 Quy tình phân tách phần chiết n-hexan

So d6 4.3 Quy tink phan tich phan chiét ety! axerat

Sư đề 4.4 Quy mình phân tách phân chiết n-butanol

Sử đồ 4.5 Cúc mảnh cầu mie cha emodm

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

"Thin layer Chromatography Sac ky lop mong

PHSGCC" High-speed counter-cument

| TiBLE™ [Tigh-performance liquid chromatography | Sae ky long hign ning cao |

HPLC?’ | High-performance liquid chromatography- ` Sắc ky lòng hiệu nẵng cao

|UV/ |Ultaviole-cicerosprayiomizadon-Mass ghép nổi ion khỏi phố và|

| ESI-MS | Spectrometry UV

Các phương pháp phổ

4C-NMR

ong hướng lừ hat

bbbvi- \ Boiydivinyibenzene microspheres were

PG [prepared by Shirasu porovs-glass (SPG)

MỞ ĐẦU

Diễn kiên từ nhiên tu đấi cho đất nước và cơn người Việt Nam một hè sinh thái phong phủ và đa đạng, có tiểm nặng to lớn về tải nguyên cây thuốc, theo ước đoán hệ thực vật ở Việt Nam cỏ khoảng 12.000 loài Từ nhiên thể kỹ nay, thực vật

không chỉ là nguồn cung cấp đỉnh đưỡng cho con người mà còn là những phương

thuốn chữa bệnh hết sức quý giá Cho đến may, việc nghiên cứu và phát triển các

dược phẩm mới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên đang đóng góp mạnh mỡ vào các

Tinh vực điều trị bao gồm: chống ung thu, chỏng nhiễm khuẩn, chồng viễm, điều

chỉnh miễn địch và các bệnh về thân kinh Trong những năm 2000 — 2005, hon 20

thuộc mới là sản phẩm thién nhiên hoặc đần xnật từ thiên nhiên đã được đưa vào

sản xuất Với việc đưa vào các phương pháp sàng loc hoạt tính sinh học nhanh đòi

hỏi các nhà hóa lọc nghiên cứu các quy trính phân tách liệu quả các hợp chất thiên

nhiên từ các nguồn thực vật, vi nấm, sinh vật biển và thực hiện các chuyển hóa

lớa lọc, vi dụ như bằng các cou đường mô phông sinh học (biowimetic), để tạo 1a

các đẫn xuất mới

Reynoutria Japonica Hout tin thường gợi là cầy cốt khí củ, thuộc họ Rau

rim (Polygonaceae) la loai cay mọc hoang và được trổng phố biển ở nhiễu nơi trên khắp nước ta và nhiều rước trên thế giới

Rễ của cây cột khí củ rađix Polygoni euspidari) hay còn gơi là cũ cốt khí là mét trong những vị thuộc kinh nghiệm dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên

thể giới có tác dụng chữa lê thấp, thông kinh, lợi tiểu, tiên đờm, giảm đau, giảm

độc, đừng cho những người bị kinh nguyệt bẻ tác, kinh nguyệt khó khăn đan đón,

để xong huyết ứ, bụng trướng, tiểu tiên khỏ khăn Nó được sử dụng dễ điều trị các tốn thương viêm, viêm gan, càc khối u, hạ sốt vả tiêu chây Do đó, các vị thuốc từ

củ cởt khí được quan tâm nghiên cứu và đã được tiêu chuẩn hoá trong sứ dụng, các

tiêu chuẩn về kiểm nghiệm được liệu từ củ cốt khi có trong được điễn quốc gia

Reynoutria Japonica Hout (cây cốt khi cú) là một nguồn cung cấp các hợp chất anthranoid và sHIbenoid Do cỏ các hoạt tính chéng ung thư, chẳng oxy hóa,

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

kháng viêm, hạ lipit, đảng vai trò như các phy†oesirogen cừng với độc tỉnh thấp

các antranoid và stiibenoid đang là khuôn mẫu hóa học cho các nghiên cửu phát

triển các thuốc chong ung thư và phòng ngừa bệnh Em mạch thể hệ mới Do đó, chíng tôi đã lựa chơn 18 cây cối khí củ làm đổi lượng nghiên cửu của luận văn

thae si với tiêu đề: “Nghiên cửu thành phần hoá học rễ cây cốt khí cũ (#eynaupia Japonica Hout)”

Tan văn này có những nhiệm vụ nghiền cứu sau:

1 - Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phân chiết chứa

các hợp chất hữu cơ poliphenol từ rễ cầy cốt khí củ

2 - Phân tích thành phần hóa học của rễ cây cốt khi cũ bằng sắc kỉ lớp mồng,

3 - Phân tách các phần chiết bằng phương pháp sắc kỉ từ các phản chiết thu

được

4 - Xác định câu trúc cúa các hợp chất được phân lập

$ - Định lượng hai hoại chất là resverarol và piccid bằng phương pháp

HPLC, so sánh hàm lương cúa chúng trong các nguồn được liệu khác nhau

Chwong 1: TONG QUAN 1.1 THỰC VẬT IỌC

1.1.1 Họ Rau ram (Polygonaceae}

11o Rau râm hay còn gọi là họ Nghễ, họ Kiểu mạch có đanh pháp khoa học Tà Polygonaceae bao gồm khoảng 1.110-1.200 loài [24], phân bé trong 13-53 chỉ Các chỉ lớn nhất là Zdogomam (240 Toài), Rumex (200 loài), Cosolba (120 loi, Persicaria (100 loài) và Calligomm (80 loài) [22], [51] Họ này có mật rộng khắp

trên thể giới, nhưng da dạng nhất tại khu vực ôn đối Bắc bán cầu, còn trong khu vực

nhiệt đới thủ cỏ số lượng loài ithơn

Họ Polygonaceae lả một nhỏm thực vất hai l¿ mầm gồm các cấy Thân tháo,

cây bụi, cây thân gổ nhỏ, đôi khi là đây leo Lá thưởng mọc cách, cáo lá kèm ở gốc

lá đình lại với nhan hành 1 ông gọi là be chỉa Cụm hoa kép gồm nhiễu xim, hoa nhỏ thường lưỡng tỉnh ít khi đơn tính, hoa đến không có cảnh hoa, dai gdm 3-6

ông [9] Tân gọi này lả chỉ tới nhuều mất phòng lên trên thân của nhiễu loài Nó có

nguồn gốc từ tiẳng Hy Lạp poiy nghĩa là nhiễu và gom; nghĩa là đầu gỗi hay khớp

Ilo Rau râm (Polygonaeas) thuộc bộ Rau răm (Polygonales), phân lớp cẩm chướng (Caryophyiliadae), lớp hai lá mầm (Dicotyledoneae)

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, họ Rau răm (Polygonaceae) có 47 loài đánh số thứ tự từ 296E đến 3025 [2], có tài liện lại cho rằng cỏ 11 chỉ, 45 loài [107]

Đỗ Tắt Lợi cũng liệt kê 11 loài trong những cây thuốc và vị thuỏe Việt Nam [4]

Một số thành viên trong họ nay được biết đến như là kiểu mạch, chút chít, dai

hoàng, nghề, rau răm, hà thủ ô đồ, l gồn v.v,

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

1.1.2 Chi Reynoutria

Trên thể giới chi Keynoutria bao gồm 28 loài [LU#] gồm các loại cây mọc lâu

năm, cỏ hoa đực và hoa cái ở khác thần Thân rễ dày đặc Thân cây thẳng đứng, to, rũng Lá đơn, mọc so le, cỏ cuỗng lá, phiên lá hình trứng hoặc hình trứng - zhp, mép lá nguyên ven; be chia không đốt xứng IToa đơn tỉnh hình chủy mọc thành

cụm hoa ở nách lá, bao hoa liên tục cỏ 5 phiên; hoa có 3 cảnh, hoa cái có cánh nằm

xe trục Nhị hoa 8 với nhụy 3, đầu rửuyy có lông ở rỉa Quả hình lrứng, có mat cit tam giác |95]

Chi Reyzơuiria có nguồn gốc ở Đông Á, nó được di thực vào châu Au vào thể ký 19 dưới dạng cây cảnh Một số loái thuộc chỉ Reynowria bao gdm: Reynontria forbesii (Hance) Yamazaki (ut fargesii), Reynouiria Japonica vat compacta, Reynoutria baldschuanica (Regel) Shinners, Reynoutria cilinodis (Michx.) Shimers, Reynoutria convolvdus (L.) Shinners, Reynoutria Japonica Hout, Reynoutria sachalinensis (F Schmidt ex Maxim.) Nakai, Reynouria scandens (L.} Shinners var, cristata (Engelm & A Gray) Shinners, Reynoutria scandens (L.) Shinnets var dumetorum (L.) Shinners, Reynoutia scandens (L.)

Shinners Cac loai này thường thấy ớ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, công hòa

Séc [14, [109]

Ở Việt Nam cho đến nay cốt khi củ (8eynoutria Japoniea Houtt) là loài duy

nhất thuộc chỉ này được định đanh khoa học

1.1.3 Cốt khí củ (#eyneutria Japonica Houtt.)

Côi khi cũ có tên gợi khác là hoạt huyết đan, điển thất, hỗ trượng căn, phù

linh, nam hoàng cầm, co hó hưởn (Thái), mẻng kẻng (Tây), hồng liu (Dao) [1]

Tên khoa học: Reynoutria Japonica Houtt, tên đồng nghấu là Reynoutria

Mak, Polygonun: cuspidatm Sieb et Zuce, Reynoutria elata Nak [1] Theo phan loại thực vật học cốt khí cú thuộc: Giới: Thưo vật, Ngành: Magnoliophyta, Lớp Magnoliopsida, 9: Polygonales, Hg: Polygonaccae; Phin hg: Polygonoideaz; Chi Reynontria [107]

Cốt khí củ lả loại cây nhỏ, sắng lâu năm Rễ phình thành củ cứng, mọc bò

nghiêng đưởi đất, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu vàng Thần hỉnh trụ, nhãn, mọc thẳng đứng, cao 0,5-L m, thường có những đốm màn tla hong Lange so Je, cugng

ngắn, hình trứng, đẫn lù, hơi nhọn, múp nguyên, đài 5-12 em, rộng 3,5-8 em, mặt

trên màn Lue sfim, có khí nâu đen, bọ chìa ngấn Cụm hoa ngắn hơn lá, mmọp thành

chằm ở kê là, hoa nhỏ máu trắng hoa đực vả hoa cái riêng, bao hoa có 5 phiến; hoa đực có 8 nhị, hoa cải có bầu 3 góc Quả 3 cạnh nàu näu đỏ, mủa hoa quả vào thàng

10-1

Côi khí củ có nguồn gốc ở vừng Dông Á, sau lan xuống khắp các vùng cân

nhiệt đới và nhiệt đới, bao gdm Trung (ắc, Triểu Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lân

và một vài nơi khác Ở Việt Nam, cây mọc hoang đại ở vùng núi cao, từ 1000 -

1600 m và được trồng tải rác trong nhân dan ở vùng trung đu và đồng bằng Riắc Bộ

Côt khí cũ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng rảo nước (ứng ngập đễ làm thôi củ) thường mọc thành khém trong các thưng lững, nơi gần nguồn nước Cây rụng lá vào mùa đông, ra hoa quả nhiễu hàng năm, có khả năng mọc chỗi từ thân rễ Cảy sinh trưởng mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi, nên thu

hoạch vào những ngày nắng ráo trong mủa đông, khi phần thân lá bắt đầu héo hoặc

cũng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trước khi cây tái sinh

Củ cốt khi adix Polygoni augidat) là rễ phơi hay sây khô của cây cốt khú

củ, rễ cốt khí củ thu hải quanh năm, tốt nhật vào thu đông, rửa sach đất cát, cất bó rễ

con, thai thanh miéng nhỏ đày chừng 1-2 em, phơi hoặc sấy khô Dược liệu có mặt

ngoải nâu xám, sẵn sùi, nhân nheo theo chiểu đọc, có các mân đốt và gióng, mặt cắt ngang màn vàng bẵn, lối gẫn như rỗng, phần không rỗng só màu nâu sẵm Chất nhẹ,

hơi củng, xuủi không rõ, vị hơi đẳng [1]

+Cuận tấn Thạc rĩ “ 2012

‘Trin Thanh Ha Cao fige HoaK21

Hình 1.1 Afôi số hình ảnh về cây cốt khí củ 1.2 ỨNG DỤNG

Theo y học cổ truyền, rễ cột khi củ có vị đẳng, tỉnh âm Quy kinh can, tâm

bảo với công nang hoạt huyết thông kinh, chỉ thông, trừ phong thấp, thanh thap nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn Ở Việt Nam rễ cốt khi củ thường được dùng để chữa tê

thấp, tổn thương đau đớn do bị ngã, bị thương, lả một vị thuốc thu liễm cầm máu

Trong bộ Ban thảo cương mục của Lỷ Thời Trần (Trung Quốc - thế kỷ 16),

vị thuốc này có tác dụng lợi tiểu, thông kinh, giảm đau, giảm độc, dùng cho những

người bị kinh nguyệt bể tắc, kinh nguyệt khỏ khăn đau đớn, đẻ xong huyết tr, bung

trướng, tiểu tiện khỏ khăn [4]

“Trong y học cỗ truyền Trung (ốc cit khi củ được gọi là Zhang Hu, được sử

đa, vô kinh và huyết áp cao [31]

1.3 THANTI PILAN 110A TIOC

“Trong thành phần hóa học nổi bal của vỄ cốt khí củ, hai nhóm chất chính

chiếm hàm lượng lớn là các antranoid (chủ yếu là anthraquinon) và các stilbenoid

Đây là các thành phần hóa học quyết định chơ nhiễu hoạt tính có giả trị cúa cốt khí

cũ như kháng khuẩn, kháng u, chẳng ung thư, chỗng oxy hóa, phòng ngửa bệnh từu

mạch Bên cạnh đỏ nó cũng bao gồm nhiêu nhóm hợp chất khác như flavonoit, phenylpropanoid, phenol, ancaloit, quinen, axit amin véi nhiéu tac dung sinh hoc

đáng chủ ý tương hỗ, bỗ trợ với hai nhóm hợp chất chính làm cho cốt khi củ cỏ hoạt

tỉnh sinh được học cao

1.3.1 Anthranoid

Nam 2005, nhóm của Chu X và cộng sự đã phân lập được các anthraquinon

tử cặn chiết ctranol 25% của củ cốt khí là emolin (1), physcion (2), anthraglycosid

O-fED-glueosid) (3) [21] Hợp chất (3) cũng duge Dalei Zhang

B Ghay cmođin

phân lập với độ tinh khiết 98,6% [23] Liu và công sự phân lập được anthreg]ycosid

A (physcion-8-O-B-D-glucopyranosid) (4) [72]

Tir cn chiét metanol 80% sit dung phương pháp sắc ký lỏng ghép nỗi khối

phổ (LO-ESI-MS), Bin Shan và công sự đã xác định sự có mặt của ermodi-8-O- (6'-O-malonyl)-glueosid (5), smodin-1-O-glueosid (6) [13] (4), (3) cũng đã được

phân lập với quy mê lớn (large-scale) bằng phương pháp sắc ký phân bỗ ngược dòng tốc độ cao (IISCCC ) bởi Fuquan Yang và cộng sư [35]

tử cốt khi củ trống ỡ Việt Nam [5] Nó cũng được phân

oostrogcnic ruới là cifreorosein (7?) vào nam 2009 [105]

+Cuận tấn Thạc rĩ " 2012

lập 1A polyganins A (emodin-8-O-B-D-(6’-methyimalonyl)-glucopyranosid) (13) va polyganins B (physcion-8-O-B-D-(6" -methylmalonyl)-glucopyranosid) (14) từ căn

chiết ELOAc của địch chiết TIOH 939% rễ cối khỉ củ [46]

Năm 2009, bằng phương pháp sắc kí pha đảo với chất hắp phụ PDVB-SPG

và kết tỉnh lại, Dalei Zhang và công sự đã phân lập, tỉnh chế được (16), (15) đạt đô

tỉnh khiết tương ứng là 98,M%, 98,2% [23] Hai hợp chất này cũng được phân lập bảng phương pháp sắc ký phân bỗ ngược đông tốc độ cao (HSGCC) từ căn chiết

EtOAc với hiệu suất 2,18% (15) và 1,07% (16) so với khối lượng mẫu khô ban đâu

[68] Một dẫn xuất của siilben là 1-(3”,5'

etan-1,2-diol (17) cũng được phần lập từ dịch chiết 60% axetot nước của rễ cốt khí

Năm 2007, Nguyễn Dinh Tuân vả cộng sự đã định lượng hợp chất (15) trong

cốt khí cú trồng ớ Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lóng ghép nổi khối phố (LC-

MS) là 0,27% [6]

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

Sự có mắt của các hop chit piceatannol glucosid (18), resveratrolosid (19), piceid gallate A (20), picied gallate B (21) trơng cốt khí cú được xác định nhà sư kết hợp của kĩ thuật sắc ký Tổng kết hợp với UV và lơn hóa khỏi phố GIPI.C ¿UV / FSEMS) [87] Hai chất (18), (19) đã được Brot C Vasisno và cộng sự phôn lập

©-B-D-glucopyranosid-4’-natri sunfat (27) [35] Nhỏm tác giả này cũng phân lập durac hai dime stilben glycosid 14 (28), (29) [58]

Vinod R Hegile va cộng sự tách được Lừ địch chiết 70% 1netsmol của

khi củ hai dẫn xuất của (15), tuy nhiên hai chất nảy mới chỉ được đự doán có cầu

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

Các nghiên củu sơ bộ vÌ thành phần hóa học của rỄ cây cối khí cú cho thấy

sự có mặt của các favonoit nhu catechin (43), (C) cateehin-5-O-J-D- glucopyranosid (44) [57]

‘Nam 2009, Peihong Fan va céng su dai sti dung k¥ thuật sắc ký lỏng kết hợp

với UV và ion héa khdi phé (HPLC/UWESI-MS) xác định su co mặt của các flavonoit 14 (43), epicatechin (48), quercetin-3-O-galactosid (46), avicularin (47), qusrcetin-3-O-rhamnosid (4#) trong cặn chiết metanol của rễ cốt khỉ củ [R7]

Sử dụng kỹ thuật 2D-LLC cũng đã xác đính được các hop chit flavonoit khác

tử cốt khí củ là kaempferol (49), quercetin (5U), rutin (51), hyperosid (82) [79]

Năm 2010, Hong-Wei Lin và công sự tách được (—)-cpicalechin-5-O-J-D-

glucopyranosid (53), (+)-eatechin-7-O-B-D-glueopyranosid (54) từ dịch chiết EFOH

70% rễ côi khí cũ [41]

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

1.3.5 Các thành phần khác

Lignan sunfat: Hai lignan sunfat được phân lập tr căn chiết nước của rễ cốt

khí cũ là nai (—)-lyonirosinol-2ø-sunlat tức natyi (—}-1R-3-hyäroxymethE1-(47~ lydroxy-3,5’-dinnethoxyphenyl)-7-hydroxy-6,8-limetoxy-1,2,3,4-tetrahydra-2- naphthalenyl metanol sunfat ($5) va nati (+)-isolaricircinol-2a-sunfat tie nati G)- 18-3-hydroxymethyl-1-(4 -hydroxy-3’-methoxyphanyl)-7-hydroxy-6-methoxy-

1,2,3,4-tetralrydro-2-naphthalenyi mnetanol sunfit (56) [55]

khí củ là lapathosid A (58), lapathosid C ($9), hyäropiperosid (60), vanicosd A (61), vanicosid lš (6) [87]

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

1.3.6 Thành phần hóa học cửa hoa, lá, thân cây cốt khí cú

Cáo nghiên cứu về cây cốt khí củ phần lớn tập trung vào bộ phân rễ của nó

bởi các hoạt tính sinh duoc hoc quý giá Vì thế có rất it công bố về thành phan hóa học cũng như hoạt tình sinh học cúa các bộ phận khác của cây như hoa, lá, thân

Công bộ của Nadezda Vrchotova và công sự (2010) gần như là công bế dan tiên về thành phân hóa học của họa và thân của cây này [§1]

Các lợp chất phenolic trong vin chidl metanol vila ba loài Polygorum cuspideton Sich ct Zuce, P sachalinense FF, Schmidt) va P bohemicun (Chrtek ct

Chrtleová) Zika (Polygenacsas) dã được nghiên cứu bằng cách sử dụng sắc ký lỏng

hiệu năng cao và điện di mao quán

“Theo đó, trong hoa của cốt khí củ có chứa các hợp chất (43), (16), (50), (52),

va mot lượng lớn quercefin toàn phần Trong thân chứa (5U), (46), (45), (41), (15), (16) vả (19) Kết quả nghiên cứu cho thấy ham long ctia quercetin toan phân ở trong hoa nhidu hon thân cây, và thân cấy giảu (16) và (41) (tương Tíng với 238 và

103 ng / kự họng lượng khô) [81]

Trong hỗn hợp lá và thần Iuang và công sự đã phát hiện ra glycosid của quzrcetin và apigenin, smođin và cấu dẫn xuái của nó, rhein, axil gallic, piceid [47]

“Trong lá phái hiện thấy có cnicchin, các đẫn xuất tia caffeie axil, ube

glycosid ctia querectin [82], stilben và catcchin trong mam [80], các hop chat dé

bay hơi trong lá cũng được tim thấy trong dịch chiết dietyl ete bang phuong pháp

sảo ký khi như 2-hexenal (73,36%), 3-hexen-1-ol (6,97%), n-hexanal (2,81%), 1- penten-3-ol (2,55%), 2-penten-1-ol (2,219), va etyl vinyl xeton (1,13%) [102]

Guoging Li-va Yukio Ishikawa sit dung két hop phương pháp sắc ký khí và

phân tích quang phố đã xác định được trong sáp lá của cốt khí củ cỏ chứa ankan mach dai Cy, C3; chiém tdi 48% tổng lượng sap, trong dé øi-nonacosan (-C›s)

chiếm hàm lượng cao nhất, các axit béo tự do (2y~Ca› chiêm 22.3% chủ yếu là axit

Hexndoemnoie [37| Lá của Revmoupia Japonica (dt khi cử), Fallopia

sacbaliwensds, và Fallepia bolemica còn là nguồn nguyên liệu giàu các hợp chất

phenolic va polysaccharit Him hương của tro, protein, lignin, axit uronic va a- cellulozơ trong lá của £ sachalinensis, F bohemica va R Japonica tuong tmg la

63,3%, 64,1%, 63,4%, còn lai là hemieellulozơ và mnuổi cacbohydral của

polysaccharit pectic [103]

Theo mat công bỗ của Naoharu Mizamo và công sự, trong nhựa của lá cốt khí củ có chứa các kim loại như Ni, Mn, Fe, Zn, K, Mg, Ca Trong dé Ni, Fe, Mn chidiw hin lugng cao nbdt, Ham lang nay thay đổi phụ thade vio oie phần của lá,

vào từng loại đất mà cây sinh trướng [83]

1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC

Sự phong phú vẻ thành phần hỏa học và các nhóm chất có hoạt tỉnh sinh học

cao làm cho cốt khi củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá: chống oxy hỏa, bảo vệ

tim mạch, điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống vi khuẩn, chống nắm, chủng virus hiệu quả

1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn

Bề cốt khi củ và hoạt chất của nỏ là zmodin (1) đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp khang lai Vibrio vulnificus, mat loai vi khuẩn gây ra nhiễm trùng huyết đễ dẫn đến tử vong Trong một khảo nghiệm, Kim JR va công sự

nhận thấy rằng rỄ cốt khí gủ ngăn chân sự chết cấp linh, ngăn ngữa tổn hại về hình thái của tẾ bào HoLa và RAW264.7 gây boi F vuhnifices, ức chế sự sông sót, lãng,

trướng của Ứ vus/ies trong nước thường và nước biến |60]

Dịch chiết metanol của rễ cốt khí củ và các phân doan chiết khác nhau cỏ khả năng ức chế các vi khuẩn gây sâu rãng gram (—) và gram (-) bao gồm 20 ching

vi khuẩn Streptococcus nasans va Sireplococeus sobrinus với nỗng độ ức chỗ tôi thiểu MIC 0,5-4,0 mg/ml, va néng độ diệt khuẩn tôi thiêu MBC cao gắp 2-4 lân so với MIC [90], [91], [92]

Các stilben và đấn xuất như (15), (16), (19), antlraquinon vả dẩn xuất nh (1), Ớ), (6) đã được chứng minh là có tác dụng điệt khuẩn đổi với các vi khuẩn thực

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

phim Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia

coli va Salmonella anatum [13]

1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa

Nự peroxit hỏa lipt, peroxit protein và làm tổn thương ADN gây ra bởi các gốc tự đo là nguyên nhân đần đến nhiền loại bệnh Theo nghiên cứu cia Hsu CY va

cong sy, dich chiết ethanol với hàm lượng phenolic va ÍlavonoiL là 641,1 + 42,6

ing/g và 62,3 = 6,0 mgíg có lắc đụng loại các gỗu tự do, gốc supcroxil, gốc lự đo

peoroxy hóa lipit và các gốc hydroxyi gây ra sự duit chuỗi AND với các giá trị IC tương ứng là là 110 pg/ 1ml, 3,2 pg/ml, 8 p/m [43]

Hợp chất (3) có tác dụng chồng oxy hóa vả bảo vệ thần kinh ngăn ngửa tÈ

bào chết gây ra bởi cáo tác nhân oxy héa tert-butyl hydroperoxid (T-BHP) trong 18

bào PC12 Hop chat này có tác đụng chông oxy hóa mạnh hơn (15) và axit lipoie [69]

Hop chất (15) và resveratrol liposome có thể bảo vệ tế bào thần kinh ở chuột

mac bénh Parkinson Sau 14 ngay diéu to (18) hoac resveratrol liposome (20 mg/kg mỗi ngày), hành vi quay bất thường, sự mắt, tự chết cña các tế bào nigral đã giảm rõ rệt và khả năng chống oxy hỏa của các mô nigral cải thiện đáng kế [100] Chất (15) lăng cường khả năng chống oxy hóa, bào vệ chống lại cáu lễ bảo chết gãy ra bởi

khỏi thuốc Ia trong nhân tế bảo biểu mô phé quân (HBEI) [40]

Hợp chất (16) dược chứng mình làm giảm sán sinh ra malondialdehyd

(MDA), giảm thương tốn t4 bào thần kinh nhận thức gây ra bởi oxy gluoozơ

(OGD), lam ting cac hoat ding ctia superoxid dismutase (SOD) va catalase (CAT)

cãi thiên tình trang suy kẻm về nhận tite 6 chuét mat tri nhớ Diễn này được cho là

có liên quan đến hoạt động chông oxy hóa và trực tiếp bão về tễ bào thân kinh [88]

Tac đụng chống oxy hóa không chỉ cỏ ở phần rễ cốt khí củ mà các thí

nghiệm cũng đã chứng mứnh lá và thân của cây cũng có khá năng này Tống khả năng chống oxy hóa và hảm lượng yicnolic đo được là 56,22 mmol trelox/100 g

trọng lượng khô va 6,33g axit gallie/100 g trọng lượng khô [47] Qua các nghiền

cứu này cho thấy răng rễ, lá và thân cốt khí củ đều biểu hiện tính chất chồng oxy hóa mạnh và là nguồn tải nguyên tiểm năng của tự nhiên chửa các hoạt chất chẳng

có tác dụng chẳng viêm qua tác dụng ức chế NF-xB và sự tổng hợp nitợ oxit (XO)

trên tế bảo biểu mổ đường hỗ hập chính [Cạy 3,6 + 2,9 uM), we ché bach cau hat,

héa enzym cyclooxygenase-2 trong cac té bao Diễu nay cho thay rằng táo dụng

chẳng viêm của (15) cỏ thể ímg dụng để điều trị các bệnh viêm nhiém [29]

Cận chiết nước rễ cốt khí củ đã được phát hiện có tác dụng chống viêm qua tác đựng ức chế sự tổng hợp mitơ oxit (NƠ) và ức chế sự hoạt hỏa enzym cyclooxygenase 2 (COX-2) gily bai lipopolysaccharil (LPS) tréu tổ bào RAW 264.7 [64]

Khi một chảt có tác đụng ức chế NI-KR thì nó có thể thể hiện tác dụng chẳng viêm và cơ chế tác dụng này cững uỏ liên quan đến các tác dựng chống ung thư

1.4.4 Tắc dụng khẳng u, chống ung the

Các nghiên vita cha thay các hợp chất phần Tập được tử côi khi củ đặc biệtTà

anthranoid (cmodin va din xual) và stilbenoid (resvcratrol và dẫn xuất) thể hiện các

hoạt tính chồng ung thư

Hoạt đông chồng ung thư của rễ cốt khi củ đã được chứng rninh theo cơ chế

chẳng gây đôi biển hoặc là ừc chế protem-fyrosine kinase (1) được chứng mình chống gây đột biển bởi tác nhân benzo [a] pyrene (B (a] E), 2-amino-3-

methylimidazol [4,5-£] qunelin (1Q) va 3-amino-1 -methyl-SlL-pyrido [4.3-b] indol

ác đông làm giảm đột biển trực tiếp

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

cta I- nitropyren (1-NP) [44], [67] Các chất ủe ché protein-tyrosine kinase, anthraquinon, stilben và các fñavonoit được xác định từ rễ côi khí cú thông qua sinh thử nghiệm phân đoạn, (1) hiển thi hoại đông chơn lọc cao đối với hai oneogen (gen

đội biển gay ung thị) khác nhau, Src-Her-2/nen vi tas oneogtne [20]

Pang chủ ý, tác dung chéng ung thr của (15) là ngăn chặn sự sinh trưởng

của một loạt các tẾ bảo khôi u, bao g6m ung thu mau, da u tủy, ung thư vú, tuyển

tiến Hội, dụ đảy, đại tràng, luyển tụy, tuyến giáp, u ác tính đầu, ưng thư biểu mô tế bào vảy cổ, ung thư biểu mỏ buồng trứng và ung thư biếu mô cố tử cung [7]

(15) là một tác nhân chống ung thư mới, ít dộc tỉnh và hiệu qua cao Khi vào

cơ thể nó được phân bỏ chủ yếu trong da day, ta trang, gan va thận [28], [73] Nó có Khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thu L-02, HepG2, SHZ-888, MCF-

7, MCF-7/ADM nhưng không gây độc cho cáo tế bảo thường [33], ức chế tăng sinh

và tự diệt tế bảo theo chương trình ở tŠ bào lympho không biệt hóa ALCL [99]

1ìng thư biển mô tế bào gan (IICC) là môt trong các khôi u ác tính ngny hiểm nhất và cho đến nay chưa có thuốc điều trị liệu quả Gần đây (15) được công

bổ có khả năng ức chế tế bào ung thư gwn Hep-G2 théng qua vide gidin cvcn DI, p38 MAP kinasc, Akt va Paki [84]

(18) lụ một chất ức chế rưạnh các yêu tổ NF-B kích hoại

nghiệm chống lạ ung thư vủ gây rz bởi 7,12-dimethylbenz(a)anthracen (DMBA) trên chuột cải Spraguz Dawley [11] Năm 2012, (15) cũng được chứng minh khả

động của protein kings

mang lễ bào Hién quan đến hoại động của protein kinase C [101]

1.4.5 Tac dung ha lipit

Sự lăng lipit mau, tang mite cholesterol, hay ding hon, ting LDL-c

Gipoprotein-cholesterol ti trong thấp) phổ biên ở những người béo phì là nguyên nhân chính của chứng xơ vữa làm nghẽn mạch vành tim gây ra đau thất ngực, nhỏi mắn cơ tim, suy tim và chết bất ngờ Khi giảm lượng [.DE-e, tầng IIDI~e

(lipoprotcin-cholesterol ti trọng cao) trong máu sẽ giảm nguy cơ mắc phải bệnh

xrạch vành tần Các nghiên cửu trước đầy đã chỉ ra rằng nhiều loại thuốc có thể te chế cholesterol trong huyết thanh Tuy nhiên, chủng cỏ thế gây ra tác dưng phụ

nghiêm trọng trong các điều tiết lam sang khác nhan (16) được chứng rninh có tác

dụng hạ lipit máu ở chuột cống và trên thỏ đã làm táng triglycerid thông qua sự gidm cholesterol, triglycerid, LDL-c, lam tang IIDL-c [30], [94]

Dịch chiết nước của rễ cốt khí củ cũng được chứng minh làm giảm sư hình

thánh este cholesteryl trong té bao gan của con người theo cơ chế tíc chế acyl-

coenzyme A-cholesterol acyltransferase [18]

1.4.6 Tac dụng chống virus

Can chiét etanol cé kha nang tte ché virus viêm gan B- ITBV (p <0,0001) với Tiểu lỗi thiểu là 10 nginÌ, cặn chiết nước có lắc dụng ð liền cao hơn (36 ngàn) [54]

(18) được chứng mình có Khả năng chống lại xốt virus trên lợn châu Phi đo

ức chễ sự sao chép ADN virus, cham tong hop protein virus [49]

Cáo nông bỏ ch thấy (15) có khả năng điều tị lây nhiễm nhân bản virus herpes simplex (HSV), HSV-1, HSV-2 [26], VZV (varicella-zoster virus), HCMV (human cytomegalo vius) va EBV (Epstein-Barr virus) [27], [32], [59] Nó còn có

kha ning ức chế sự sao chép polyoma virus bing cách ngắn chặn tổng hợp AND

virus (in vitro) [12], khéng virus cm (in vitro va in vive) [85], ức chế tăng trướng,

của virus vaccinia [17]

1.4.7 Trị đái tháo đường

Protein kinase AMP déng vai trô trung tâm trong việc điều tiết chuyển hóa

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

glucoze va lipit, do đó nó được coi là một mục tiêu trị liệu mới cho hội chứng,

chuyển hóa như bệnh đái tháo đường typs 2 (15) đã được chỉ rõ là làm tâng hắp thu

glueozơ trong tẾ bào C2ƠI3 thông qua kích hoại prolsin kinase AMP, nó làm giảm:

HG-do superoxid sản xuâi thông qua việc lãng SIRT] trong bạch cầu đơn nhân, đầy

la một dấu hiệu cho thấy tiểm năng trị đái tháo đường của (15) [86], [53]

Các chất phân lập từ rễ cốt khi củ cớ kha nang lam tang leptin - mRNA trong

tổ mỡ (P <0,05) va ha cholesterol triglycerid (P <0,05), cải thiện chuyển hóa chất béo trong huyét thanh 6 chudt NAFLD (Non-aleoholic fatty liver disease) là mỗi

trong những nguyên nhân gây ra gan nhiễm mỡ, xảy ra khi chất béo được lưu kỷ

trang gan không phải do sử đựng rượu quá mức Nó cỏ liên quan đến sự đề kháng insnlin, hội chứng trao đổi chất và có thể đáp từng với điển trị ban đầu được phát

triển kháng ineulin khác, vi đu như đái tháo đường type 2 [S0]

Nghiên cứu được đêng học chỉ rõ (1) được hấp fhu và phân bỗ nhanh ở gan

sau khi vào cơ thể [52] (1) đang được nghiên cứu như một tác nhân tiểm năng có

thể làm giãm tác động của bệnh đái thảo đường typc 2 Nó là một chất we chế chọn lọe mạnh của các enzym 11-HSD1 [34]

1.4.8 Các tác dụng khác

Gidm dan, ching twrdm cém

Ở Việt Nam, độc tính cáp và tác dụng giâm đau, an thần của cối khí củ cũng

đã được nghiền cửu, theo đó ở liều 80g/kp ở chuột nhất trắng- gấp 200 lần liểu đừng,

lâm sàng, cởi khí củ vẫn chưa gây ra độc tính cáp, đây cũng là liêu tỗi đa cho chuột

công uỗng được Kết quả nghiề

đau theo kiểu Morphin (tảo động lên vỏ não và trung tâm đưới vỏ gây ra một phân

cứu về tác dựng giảm đau cho thây cốt khi củ giảm

ứng kích thích hệ thẳng giảm đau) và theo ca chế ngoại biên Ngoài giảm đan, cốt khí củ còn có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, làm giảm các hoat đông của

chuột riưng không gây ngủ, làm giảm đáp ứng kích thích tiếng đông, ánh sáng, ức

chỗ đượo mội phần trạng thải hưng phân đo cafoin gây ra [3]

Tác dụng chống trầm cảm của (18) thể hiện ở việc làm gia tăng đảng kể

+Cuận tấn Thạc rĩ kỳ 8 2012

serotonin và noradrenalins ở mức 40 hoặc 8U mg/kg ở các vùng não, có thế liên quan đến kích hoạt serotonergic và noradrenergic, ức chế hoạt động của monoamin

oxidass Á (MAO-A ) [98]

DI với xưang khop

Các lac dung bao vệ xương của (15) đã được chíng mảnh trong mội số mô

tỉnh loỡng xương, Tảu ZP và sông xự chỉ m rằng (18) có thể tăng một độ Khoảng và

ức chế sự giảm hàm lượng canxi gủa xương đùi ở chuội OV%, cho thấy Tầng nỏ vỏ

thể đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chẳng lại sự mật xương gây ra

bởi sự thiếu hụt estrogen |71] Trong khi đó Xu He công bổ (15) ngân cán yếu tô

kich hoạt thụ thé xB ligand (R.AXKL) trên tế bảo RAW 264.7 [97]

Dịch chiết nước của thân rễ cốt khí củ đã được chứng mình te chê mạnh

xanthin oxidase enzym (xúc tác của quả trình oxy hóa hypoxanthin thánh xanthin và

sau đó cho axit trie), với giá trị ICay=38 pg/ml Điều này cho thấy cốt khí củ đóng một vai trò quan trợng trong điện trị bệnh gút [65]

cholesterol trong mâu, tr

hôi, đỗ nỗ hôi v3 đêm và trâm cảm) Vì vảy cân có liệu pháp cstrogen thay thể để

có thế hạn chế các bệnh nảy Các hợp chất có trong rau, cú, quả cỏ khả nang thay thé estrogen duoc goi la phytoestrogen

Theo điều tra của Zhang CZ và cộng sự thi trong tống số 32 cây thuốc được điều tra, dịch chiết EtOH 70% từ cốt khi củ chứa hàm lượng estrogen cao nhất [104] Hai chất (1) và (3) được phân lập từ địch chiết metanol cúa rễ cốt khi củ đã được chứng mỉnh là nhĩmg hợp chat phytoestrogen te ché 17f-estradiol liên kết với

thụ thể esrepen của người Rõ ràng hơn, (1) và (3) 6 (1-10 pM) lam tang sinh 18

bảo MCP-?, một đồng té bio nhay cm véi estrogen [39] [16]

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

Khả năng chẳng đị ứng

Co ché tae động của khả năng chồng đị ứng của rễ cốt khi củ đá được Lin

BO va céng sự nghiền cứu Theo đỏ cáo dịch chiết từ rễ cốt khí củ cho thây hoạt động ức chế mạnh trơng các tế bảo mast (tế bào thường trủ của một số loại mê và chứa nhiền hạt giàu histamine và heparin, tế bào mast đồng một vai tro quan trong

tham gia mật thiết trong việc chữa lành vết thương và bão về chồng lại tắc nhãn gây

là 62 =2,L ngắn] cho té bao mast RBL-2H3 và 46 + 3,2 ngín]

bệnh) với giá tị Ï

cho tủy xương có nguồn gốc từ tế bào mast bằng cách kích thích khàng nguyễn

[70) Năm 2011, Lu Y và công sự chỉ rõ hoạt chất (1) có tác dụng chẳng dị ứng do

tức chế quả trình tế bảo giải phóng các phân tử kháng simh gây độc tế bào từ các túi tiét (degranulation), tre ché cae eicosanoid (prostaglandin D2 và leukotriene C4), bài tiết các cytokin (TXT-a và TL-6) [74]

Anh hưởng trên sình sản

“Theo công bố mới nhất (15) có tác động tỉch cực trong quả trình Thụ tỉnh trơng ông nghiệm ở lợn và sự tưởng thành trong ông ngliệm của tế bảo trừng lợn

TẾ bảo trứng được điều trị với 2 pM (18) có tỷ lệ phôi nang hình thành cao hơn

đáng kế và điền chỉnh biểu hiện gen trong tế bảo trứng trưởng thành [63]

Khả năng chữa lành vất Hương

Dịch chiết ctanol 50% ở

năng chữa lãnh:

3, 7, 14 va 21 ngày trong nhóm chuột điều trị với địch chiết (p <0,05), kết quả mô

học và mô miễn địch cho thây ở chuột điều trị với địch chiết cốt khi củ các tổ chúc

°C của rễ cốt khí củ được chứng minh là có khả

ết thương ở chuột Tỷ lệ chữa lành vết thương cao hơn đáng kế sau

collagen, nguyên bảo sơi, nang lông nhiễu hơn, TGF-BI tăng và các tễ bảo viêm it hơn so với chuột không được điều trị [96]

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Nguyễn liệu mẫu thực vật được chiết với EKOH 909% ở nhiệt độ phong Dich

chiết T'tOII 80% được phân bố giữa I1-O và các đưng môi hữu cơ khác nhan nhằm

làm giàu các lop chat theo dé phan cue ting dan

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÄ PHIẢN

a Sắc ký lớp mông

Phương pháp sắc ký lớp mẻng (TLC) là một phương pháp được sử đụng rất

rộng 1ãi Irong các ngành khoa học hoá học, sinh học, hoá được với nhưều mục đích khác nhau đo các đặc tính ưu việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ

(thường từ I dén 100 x 10° gì, tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích để thực hiện Phương pháp TLC với chất hấp pha silica gel duoc ding để phản tích định tỉnh hay định lượng hoặc kiểm tra độ tĩmh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương phán sắc ký cột để kiểm soát điều kiện phân tách

b Sắc ký cột

Sắc ký cột thường (CƯ) được thực hiện đưới trọng lue của dung môi trên

siliea gel theo co ché hap phụ và được sử đụng để phân tách các phân chiết, phân

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

7 THƯƠNG PHTÁP PHÔ KHẢO SÁT CÁU TRỊ

Hiện nay, các phương phốp phổ là công cụ hiện đại và hữu hiệu nhất để xác

đình câu trắc của các hợp chất hữm cơ Các phương pháp được sử đụng để xác định

cau trúc các hợp chất trong luận văn này bao gởnn:

- Phố khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);

- Phổ cộng hưởng từ hại nhân prolon H -`MR),

= Phd cộng hưởng từ hại nhân caebon 13 C2C-NMR) với dhương

- Phổ công hưởng từ hại nhần hai chidu (2D- NMR)

2.4 PHƯƠNG PHÁP DỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆUL NẴNG CAO (ITPLC)

APLC 1A chit vidt vit 4 chit cdi dau bing dng Anh cila phucmg pháp sắc ký

léng higu nang cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phuong phap sic ky long cao ap (High Pressure Liquid Chromatography)

Sắc ký lóng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lông và pha tĩnh chứa trong cột lá chất rần đã dược phân chia duới dạng tiếu

phân hoác một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chât mang đã được biển đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữn cơ Dựa vào sự khác nhan về

thường và sắc ký lông pha đão

Hiên nay phương pháp HPLC được sứ dụng rộng rãi trong việc phân tích các

hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phu gia thực phẩm trong Tinh vite

với cột sắc ký pha đáo đựa trên nguyên tảo hâp phụ xác định các thông số thời gian lim, dién tích pic để định lượng các chat cd trong được liệu

+Cuận tấn Thạc rĩ tà 3 2012

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và sắc ký cột tỉnh chế (Mini-

€) được thực hiện trên silica gel (Merck, Đức), cỡ hại 63-200 pum, 63-100 jam va

quốc gia Hà Nội

Phỗ công hướng từ hạt nhãn proton ('H-NME, 500 MH2), phỗ công hướng

tử hạt nhân cacbon-13 (C-NMR, 125 MHz) với chương trinh DEPT và phố cộng

hưởng tứ hạt nhân hai chiếu (2D NMR) được ghi trên thiết bị Bruker AV SOU speR.rometer Đồ chuyển địch hóa học (8) được biểu thị theo ppm 'Tetrametyisitan (TMS) là chất đuuẩn nội zero- Viên hỏa học, viện Khoa học và công nghệ Việt Nara

Iiề thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (IIPLC), Prominence, Shimadzu,

Detecto UV Phan tích được thực hiện trên cột sắc ký Ascentis Cg (oi hat $ pm, 4,6 tant x 250 mmy va cdl bao vé C18 (cd hat 5 pm, 4,6 man > 2,5 mn) Kiểm soát hệ

thống sắc ký và xử lý số liệu được thực hiện với phần mềm LC solutien- Viện Dược

liệu

Đo điểm nóng chảy trên máy SMP3 (Stuart) - Vién Dược liệu

Dé quay cực được đo trên máy phân cực kể Electronic Polarimeter- P3001 - Viên Dượu liệu

3.12 Hĩa chất

Cée dung mơi dùng đễ tách chiết và phân lập các chất như EtOH, MeOH, ø-

butanol, EtOAc, diclometan, -hexan céng nghiệp, được tình chế lại

Các dung mơi dừng phân tích HPLC như ACN (Merek), II;PO; (Merck), MeOII (Merck) Mẫu đối chiếu: resveratrol, pice

3.3.1 Định tính các thành phan trong dịch chiết ctc đầu hỏa

Cân khoảng 5g bột được liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng ete dẫu hỏa đến khi đung mơi trong bình chiết khơng mân Dịch chiết đem cất thu hỗi bớt

dung méi Dich chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản từng định tính chất béo, tỉnh đầu, phytosterol và carotenọt

“trần thank Wi Cao đạc 1iũa K21

Cơ 5ml địch chiết ete dầu hỏa tới cắn Thêm 1-2 giọt axit sunfiric đặc, thấy

xuất hiện màu xanh ve

đỏ, Tae nhẹ, lớp chải lỏng trên cĩ màu xanh

3.3.2 Dinh tinh các thánh phần trang dịch chiết etanaÏ

Bã được liệu sau khỉ chiết bằng ste dan hỏa để bay hơi dụng mơi đến khơ

Chiết hồi lưu với 50ml cồn 90° trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cơ cịn 10m]

để làm cáo phản ứng định tính flavonoit, coumarin, saponin, axit hữu cơ và axit

amin

(1) Dinh tink saponin

- Phân ứng tạo bọi: Lấy 2 ơng nghiệm cỡ Uằng nhau, cho vào ơng thứ nhất

3ml HCI 0,IN và ơng thử 2 là 5ml NaOH 0,1X Cho thêm váo mỗi dng 2-3 giot

địch chiết cơn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 Ơng trong 15 giây Dễ yên, thấy

ng kiểm cỏ cột bọt bổn và cao gấp hai ơng kia

- Phân ứng Salkowski: Lấy 10ml địch chiết cẩn cho vào bình cần và thêm

10ml axit sunfric lộng Đun cách thủy sinh han ngược trong 4 giờ Để nguội và

chiết với clorofom

Lấy khoảng 2ml dịch chiết clorofom cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1ml axit sunftmi đặc theo thành ơng nghiệm, mặt tiếp xúc gia lui lớp xuất hiện vờng

ru tín

- Phầm ứng Tácbenmam - Burchardl: Lấy 0,2m] dich cliét clorofem ở liên cho vào một Ống nghiệm rồi cơ tới cắn Cho vào cắn 0,3m] anhydnit axetlic, lắc đều,

đặt nghiêng ơng 45° rồi thêm 0,5rnl axit sunftic đặc theo thành ơng nghiệm dé dich

lịng trong éng chia thành 2 lớp: Lớp axit ở đưới và lớp anhyảnt ĩ trên, Mặt tiếp

xúc giữa hai lớp chất lỏng trong ống nghiệm xuất hiện mãn tỉm đỏ

(2) Dinh tinh coumarin

- Phản ứng mở và đóng vòng laoton: Cho vào 2 éng nghiệm mỗi éng ]ml dịch chiết cồn, ông 1 thêm 0,5ml đưng địch NaOlI 10%, éng 2 48 nguyên Sau đó dum ca 2 Ông nghiệm trên cách thủy sôi trong vải phúi Ông thử nhất có màu vàng, xuất hiện Sau đó cho thồm vào mỗi ứng 2ml nước cất thấy ông thử nhất trong hon

ống thứ 2, nhưng sau khi axit hóa thi od 2 dng đều đục

tinh)

hau (phan ng đường,

- Phân ứng với thuốc thử địaze: Cho vào ông nghiệm Irl địch chiết côn,

thêm vào đó 2ml dung dịch XaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài

giọt thuốc thử đĩazo (mới pha), thây xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phán ứng dương

tính)

- Vi thăng hoa: Cho vào trong một lọ penicilin một ít dịch chiết cần Cổ

cách thủy cho bay hơi hết cồn rồi đây lên miệng lo một phiển kính, trên có một ít bởng thâm nước và tiếp tụe dun Lav phiến kinh và nhỏ 1 giọt KT 10%, soi kinh hiển vi thây có tạo tỉnh thể màu nâu

(3) Dịnh tính flavonoit

- Phân ửng cyaniđin : Cho 2ml địch chiết cồn vào một ông nghiệm, thêm một

íL bội magie kiu loại, rồi Tuêm vài giọt axit clohydric đặc; đun nóng trên cách thủy

sau vài phút thấy xuất hiện mân tím đồ (phẩm ứng đương Bình),

+ Phan img voi dung dich TeCl; 5% : Cho 2ml địch chiết côn vào một ông

¡, thêm 2-3 giol FeCl,

nghig 39%, thấy dung địch có màn xanh sấm

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vải giọt địch chiết côn lên một mảnh giấy lọc, hở

khô rồi đặt mãnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc thây màu vàng hiện rõ, khi sơi

dưới đẻn tứ ngoại thây có màu vàng sáng (phản ứng đương tính)

(4) Định tink acid hitu ca

“trần thank Wi Cao ñạc 1iũa K21

Cho vào ông nghiệm 1ml địch chiết cồn và cô tới cắn Hỏa cắn trong Iml nước và thêm vài tĩnh thể natri cacbonat thây có bọt khí nỗi lên

(5) Dinh tink axit amin

Lay 3ml địch cồn cho vào ông nghiệm Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, dun s6i 2

phút, dưng địch chuyển mau tím

3.3.3 Dịnh tính các nhóm chất khác

() Dinh tinh ancaloit

Lay 1g bét duge ligu cho vio binh nén dung tich S0ml, thém 15ml dung dich

11;SO, 2%, đun sôi vài phút Để nguôi, lọc địch chiết vào bình gạn, kiểm hỏa địch lọc bằng đụng địch NTNOH 6N đến pÏT kiêm Chiết ancaloil bang clorofem (HC)

3 lần, mỗi lần 5ml TRch chiết CHCH; được gộp lại và lắu với H;O, 29% Gặm lây

lớp nước axit, cho vào 3 ông nghiệm, mỗi ông khoảng Lml để làm các phản ứng

sau:

- Với thuốc thử Mayer (tủa lrắng lay vàng nhạt)

- Với thuốc thử Bouchardat (túa nâu)

- Với thuốc thử DragsndorfT (tủa vàng cam hoặc đổ)

(3) Định tính anthranoid: (Phan img Borntraeger)

Cho vào ông nghiện 1g bột được liệu, tiêm đúng dịch H-SO, 25% tới ngập được liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào binh gan, dé nguội rồi lắc

voi Sul ete, Lay Lml dich ete cho vào éng nghiệm, thêm Iml KOH 10%, quan sát

mau cia lop dung dich KOH (48)

(3) Diath tink tanin; (Phan ing voi gelatin 1%)

Lẩy 1g bột được liêu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm nước ngập

được liệu rồi đưa sôi vài phút Lọc nỏng, lấy 1ml địch lọc cho vào ống nghiệm,

thêm vải giọt dung dich gelatin 1%, quan sat tủa (bông trắng)

(4) Dinh tink giycosid tim