Luận văn nghiên cứu tình trạng nhiễm norovirus Ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non Ở hà nam năm học 2014 2015

Các đường lây huyền Hầu hết các nghiên cứu về bệnh simh - dịch tễ cho rằng, gác tác nhân gây tiên chảy dễu chủ yếu truyền qua đường phân, miệng thông qua thie an hoặc nước uống, bi 6 nhi

DẠI HỌC QUOC GIA HA NOI TRUONG DAI HOC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KIIOA SINITIIOC

Dé Thi Viét Tuong

NGHIEN CUU TINH TRANG NHIEM NOROVIRUS

6 TRE KHOE MANH DUGT3 TUOT TAI MOT

TRƯỜNG MAM NON O HA NAM

NAM HOC 2014 - 2015

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

‘Ha NGi— 2016

DALHOC QUOC GIA HA NOL

TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHIOA SINH HỌC

Đỗ Thị Việt Huưng

NGHIEN CUU TINH TRANG NHIEM NOROVIRUS

G6 TRE KHOE MẠNH DƯỚI 3 TUÔI TẠI MỘT

TRUONG MAM NON Ở HÀ NAM

NĂM HỌC 2014 - 2015

Chuyên ngành Vi sinh val hoe

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hưứng dẫn khua học:

PGS.TS Nguyễn Vân Trang PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội — 2016

LOT CAM ON

Tôi xin bày tô lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyén Van Trang, người thấy đã tận tình chỉ bão, hướng dẫn tôi trong suối thời gian học tdp và

thực hiện luận văn nàn

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS T8 Hài Thị Việt Hà cùng các

thấy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thấp giáo, cô giáo

trong bộ môn Vi sinh vai học đã tận tình hướng dẫn, giúu đổ, giảng dạy và

đầu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận vẫn cũng như trong suốt thời gian hoc iap tại trường

Tôi xin gửi lời cắm ơn chân thành tới Th.s Vũ Thị Bích Hậu,CN.Nguyễn

Phương Anh, CN.Nguyễn Thanh Tâm làm việc tại Phòng Miễn dịch Lắc xin —

iện Vệ vinh Dịch tễ Trung ưng đã tận tình giáp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt

quá trình học tập và thục hiện huận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động

viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội ngây thing năm 2016

Học viên

DỗThị Viét Huong

BANG Ki IMEU VA CAC CIIC VIET TAT

Polymerase Chain Reaction

Open Reading Frame Origin

polymerase chain reaclion,

Thermus aquaticus DNA

Vũng kiểm soát dài của gen

Thân ứng chuấi tring hop Bau do gắn huỳnh quang

Mỗi ngược

Khung đọc mở của gen

Vị trí khối đầu tái bản

Mật độ quang của mẫu AI ting điểu hòa của gen

linzyme phiên mã ngược

Tế chức y tê thế giới

1.1.Giới thiệu chung về Viêm dạ đây ruột cắp ở trể em co 3 1.1.1.Dịnh nghĩa bệnh VIDDRC Ă sereire 3

1_.1.3.Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam 4

1.3.2 Phân loại, hình thái và tố chức bộ gen của NoV - 8 1.3.8ự lây truyện, đặc điểm lâm sảng và sinh lý bệnh - 12

1.2.5.Phuong phap real time RT-PCR (Real time Reverse transcription

1.3.Tinh hình nghiên eứu NV trong vả ngoài nước 16

1.3.1 Tinh hinh nghién evra trén thé gigi - 16

1.4.Kiểu gen FUT-2 ở người và tỉnh cắm nhiễm Nov 19

1.5 Kháng nguyên nhỏm máu tương dụng tổ chức gia6A) vá khá nẵng cắm

nhiễm của NoV .- 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cửu cccso ee seo 28

2.3.1 Máy móc, dụng cỤ nneniereeeerrre ¬

2.4.1 Thu thập bệnh phẩm co c2 2 ccccvzcrrrrree seo 25

iti

3.4.2 Kỹ thuật real time-RT PCR phat hign ARN cilia NoV 26 2.4.3 Kf thuat RT PCR khuếch đại đoạn gen vùng C của NoV 28 3.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FƯT-2 „.Ä1

3.4.5 Xác định kiểu hình HBGA (ABO và Lewis) trong mau mde bot 33

2.5 Xử lý số liệu -

CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN cứu VÀ THẢO L¡ MAN

3.1 Tỷ lệ lưu hành của NoV ở trẻ không triệu chứng tại trường mâm noi ở

11ã Nam -ò 86

3.2 Biến động senotype của NoV hư hành ở trẻ a thing triệu chứng tại trường mâm

3.3 Môi liên hệ giữa tỉnh cảm nhiễm MoV với kiểu gen của FUT-2 se, 47

3.3.1 Tần số NP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 tén gen FLIL-2 47

3.3.2 Mới quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385 vá sự kháng nhiém NoV 52 3.4 Mỗi tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng câm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh tại trường mâm non ở Hà Nam 53 3.4.1 Kiểu hinh HBGA ở trẻ khóc mạnh tại trường mầm non Hà Nam 53 3.4.2 Mỗi liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với khả năng cắm nhiềm NGV si HrneHreiieerrrrrerrreerreeco, SỔ KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

TẢI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẰNG

Bang 2.1 Thành phẩn kỹ thuật Realtime RT-PCR don cép primer va probe phat hién

Bang 22 Thanh phân kỹ thuật Realtins RI-PCR đơn cặp primer và “a probe phát hiện

Bang 2.3 Thanh phan phan img RT-PCR don cap primer đổi với G1 29 Bang 2.4 Thanh phan phan ing RT-PCR den cặp primer dối với G2 2Ô Bang 2.5 Thanh phan phản ung PCR khuếch dại gen ZUf-2 se 32) Bang 3.1 Đặc diễm chúng NoV ở trế khỏe mạnh tại nhủ t Ha Nam 37

Bang 33 Các genotypes NoV phát hiện ö trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam

Bang 3.4 Đặc điểm genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại mốt số nhà trẻ ở Hà Nam vào một số tháng, khả nhau ¬ sittin AS Bang 3.5 Tân số các SMP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trén pon FLT-2 ở

Bang 3.6 Các tần số đột biết ở FUT-s ở các quần thể Châu Á Táng giểngvà Viet Nam 51 Đảng 3.7 Phân bó kiểu gen 3§5 trong 85 người có mẫu phân được xét nghiệm lây

Bang 3.8 Phân bó kiểu hình khẳng n nguyên nhỏm máu tương dung tổ chúc Lewis a,

°b ở trế tại trường mâm non ở I1ả Nam (n=1 18) - - 54

Bang 3.9 Phan bé kidu hinh khang nguyên nhỏm mầu long dung tb chize Lewis x,

y 6 tré tai trudmg mam non & Ha Nam (n 119) 54 Bảng 3.10 Tổ hợp kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis ab và xy Ở

Bảng 3.11 Tỷ lệ kháng nguyên nhóm máu tương, une tổ chức ABO (n= =3) 56

Bang 3.12 Tan suất kháng nguyên T.ewis theo tình trong nhiễm NoV (n 119) 57 Bing 3.13 Mỗi liên quan giữa kiếu hình ABO và tình trạng dơn nhiễm NoV (n 119) 57

DANH MỤC TINH

Tình 1.2 Biến đổi chũng NoV ở miền Bắc nước ta từ 201 0-2013 10

Tĩinh 1.3 Phân bổ genotype khác nhau của NoV ở miền Bắc và miền Nam nước ta

Hin 1.4, Céu trite ctla NOV cece esesscsssssesseesstessinssieeeiest ¬"” ,

linh 1.5 Cấu trúc bộ gen của NGV eo ccce cty 3

Tình 3.1 Sơ đồ tôm tắt các loại mẫu thụ thập sử dụng cho nghiên cứu 35

Hình 2.2 Sơ dễ tóm tắt nội dung nghiên cửu 235 Ilinh 3.2 Tỷ lệ lưu hành genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ 11à Nam 42 Tình 3.3 Cây phát sinh chứng loái dua trén down gen ving capsid cla ae ching NoV phát hiện trong nghiên cou ny sesssessesesseesineeeeesoneeieen "—

vi

DAT VANDE Bệnh viêm dạ đây ruột cấp (VDDRC) bay còn gọi là tiêu chãy ở rẻ em là một vấn để sức khốc dang dược quan tâm trên toàn thể giới, đặc biệt thu hút được rất nhiều chủ ý của các nhả khoa học, y học bởi đó là một trong những nguyên nhân

hang dau pay bénh tật và tử vong cho trẻ em đưới 5 trôi ở các mước đang phát triển

Theo tổ chức y tế thẻ giới (WHO) và nhiều công trình nghiên cửu diều tra ở châu Á, châu Phi và châu My La Tinh cho thấy, ở các nước đang phát triển hàng năm có trên 750 triệu trường hop VDDRC, trong đó 500 triệu là trể em đưới 5 tuấi Tử vong do VDDRC hàng năm lên tới 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong, số này lỏ trẻ ern

đưới 2 tuôi Ở những nước đang, phát triển như nước ta, đây là bệnh có tân suất mắc

nhiểu thứ 2 (sau các bênh nhiều trùng đường hô hập) Tử vơng do VDDRC thường không dược dánh giá dúng và kịp thời, tuy nhiên trớc tính hàng năm có 6000-8000 trường hợp tử vong ở nước ta do VDDIC Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, cáo báo uáo cho thấy có ïL nhất 26 loại tác nhậm khác nhau có thê gây ra bệnh VDDRC ö trẻ em, trong dó có 60-70% của các trường hợp nguyên nhân là do các virus 7 nhóm virus thường gây VDDRC là rolavirus, NoV, sapovirus, adenovirus, aslrovirus, parccbovirus va aichivirus duge coi là các tác nhân thường gặp của bệnh viêm đạ dây ruột cấp ở người NoV lá tác nhân quan trọng nhất gây ra các vụ dịch VDDRC không do vi khuẩn ở người lớn và trẻ em Theo các báo cáo hảng năm trên toàn thể giới, có đến hợn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV NeV còn có khả

năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng

NoV thuéc ho Caliciviridae 14 virus ARN sợi đơn, đương có khả năng lây nhiễm chơ người và động vật NoV khá da dạng vẻ kiểu gen và tính kháng nguyên, bao gồm 5 nhóm gen (từ G1 dén GV) va 35 typ gen đã được phát hiện dựa vào trình

tự đoạn gen mã hóa proteim VP1 NoV ở người thuộc GL GII và GIV nhưng hâu hết cúc chững gây bệnh ở người dễu thuộc nhóm gen GT va GTI Cac virus thuộc họ Caliviidae cô Khả năng lây nhiễm người ở mọi lúa tuổi và thường hiên quan đến các trường hợp tiêu chảy câu lẻ tê và vụ dich tiêu chảy cấp lrên toàn thế giới Các

vụ dịch này thường xây ra ở điều kiện bán trủ (semi-cnelosed) như trường học, bệnh

1

viện, nhà dung lao, nha wé G nước ta, nhiều nghiên cửu giám sát bệnh tiêu chay & trẻ em đưới 3 tuổi tại bệnh viện cho thấy RV và NoV là hai tác nhân quan trong nhật NoV không những gây tiêu chảy cấp cho trễ, mà cỏn có khả năng nhiễm không triệu chứng, lả tảo nhân tiểm ẫn gây ra các vụ dịch vả là nguồn lây lan mạnh

trong cộng đồng đặc biệt ở nhà trẻ, lớp học

Mức độ câm ímg của cơ thể đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của gen 17-2, mã hóa cho enzym fucosyltransferase a(1,2) dé diéu hoa sự biểu hiện của kháng nguyên H Đã có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ piữa gen FUT- 2 va

sự nhiễm virus Nghiên cứu mới nhất trên gen tiết (secretor gene) ở các nhỏm quần thể người khác nhau dã xác dịnh được một vải dột biển của các gen này có thẻ làm mật hoặc giảm sự hoạt động cita enzyme fucosyltransferase Trong khi đó, kháng nguyên nhỏm 1uảu tương dụng tổ chức (IBGA) là thụ thể ương quá trình nhiều NoV Những kháng ngưyễn này được tổng hợp do kết quả hoạt động của một số erzvrne glycosylrans[erase được mã hóa chủ yếu bởi các họ gen ABO (FUT-T), Lewis (FUT-3) va scerctor (FUT-2)

Xuất phát từ những lý do trên chủng téi tién binh dé tai “Nghién citu tink

rang nhiém Nol’ 6 wé khde mank đưới 3 tdi tai mot trường mẫm non ở Hà

Nam năm hoe 2614 - 2015" voi cáo mục tiêu như sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh

2 Đánh giả mỗi liên quan giữa tỉnh câm nhiễm NoV và kiến gen FUT-2

3 Banh gid méi tương quan giữa kháng nguyên nhỏm máu tương dựng tổ

chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh

Để tài được chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn địch Vắc xin, Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương

CHU 3 1 TONG QUAN TAT LIEU

1.1 Giới thiệu chung vé Viém da day ruột cấp ở trẻ em

1.1.1 Dink nghĩa bệnh VDDRC

Viêm dạ dày ruột cấp hay còn gọi là tiêu chảy là một bệnh nhiễm trừng đường

tiêu hóa, phố biến và thường gặp ở mọi lửa tuổi, đặc biệt là trẻ em Theo tổ chức Y tế

Thể giới VDDRC dược định nghĩa là “di ngoài phân lõng, hoặc tỏe nước trên 3 lẫn trong 24 pid, phan lỏng là phản không thành khuôn” [96] Dộ rắn mềm của phân do thành phản nước trong phân quyết định: Phân có 85% nước gọi là nhão: phân có 88% nước gọi lä lông: phân có 90% nước gọi là lóng như nước [1] Số lượng phân được bải

tiết ra ngoài bình tường mỗi ngày thay đối tủy theo chế độ ăn, tuổi của tùng cá thể

Klủ có tiêu chầy, phân chứa nhiều nước hơn bình thường gọi là phân nước hay phân

lỏng Trong những trường hợp ly, trực khuẩn phản có thể chứa máu [2|

Mỗi nguy hiểm chính của VDDRC là tử vong vả suy định đưỡng Tử vong

do VDDRC hậu hết thường gây ra bởi vì mất một lượng lớn muối và nước Lừ cơ thế

[E] Những biến chứng do VDDRC thường gặp là kém an, déi khi kem nén mita

[1] Tré ăn ít đi và kha năng hap thu các chất dinh đưỡng bị giảm so với nhu câu đính đưỡng của trẻ, chính những yếu tổ đó góp phần làm cho tr bi suy đính dưỡng

và bệnh cánh lâm sảng cảng trở nên phức tạp hon

1.1.2 Phân loại

VDDRC dược phân loại tủy thuộc vào thời gian kéo dải các triệu chúng,

trong đỏ một đợt VDIRC kéo đái Ít hơn 2 tuần là VDDRC cấp tỉnh Theo Chu Văn

Tường, VDDRC cập tính ở trẻ em thường xây ra dưới 5 ngày, VDDRC kéo đài 2 tuần còn gọi là VDDRC kéo đái |7

Ngày nay, người ta xác định 3 hội chứng lâm sảng khác nhau của VDDRC gồm:

-_ Tiêu chây phân lông cấp tỉnh: gồm các trường hợp khởi bệnh cấp tính, kéa

dài dưới 14 ngày

-_ Tiội chúng ly: gồm các trường hợp tiêu chảy phan có đảm máu

~_ Tiêu chảy kéo đài: gồm các trường hợp khởi đầu với tiêu chảy cấp tính rồi

kẻo đài trên 14 ngày.

Theo một số nghiên cửu gẫn dây đã chí ra rằng, tiẻu chấy phân lỏng cáp tỉnh

ñ, tiên chây kéo dài chiêm 1,48%

chiếm 47,29%, hội chứng ly chiém 51,

+

3 Tình hình bệnh VDDRC trên thể giới và Việt Nam

Cáo bệnh về VDDRC là nguyên nhân chính của dịch bệnh và tử vong ở trẻ

em tại các nước đã và đang phát triển [73] Bệnh thường lây qua đường tiêu hóa và thường gắn ở các khu đân cư có điều kiện sống không đâm bảo, trình độ dân trí thấp, kiến thủc về phỏng chống VDIDRC bị hạn chế Trên thể giới, ước tính có 712.000 trường hợp tử vong đo VDDRC, chiếm 9.9% trong tổng số 6.9 triệu trường hop tử vong ở trẻ dưới Š tuổi (thống kê năm 2011) [56] G Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latinh đã cỏ 744 triệu dến 1 tỷ trường hợp viêm da dây cấp va 2,4 dến 3,3 triệu

trường hợp tử vong hàng năm ở trễ em dưới 5 tuổi [73] Tứ vong do VDDRC hàng

1iắm từ 3-6 triệu tré em, co 80% trong số này là trẻ em dưới 2 tuổi [6]

Tại Việt Nam, theo thống kê của Bệnh viên nh Trung ương cho biết, ung bình mỗi té bi VDDRC 3 Mary nắm, nhóm trẻ lại vừng nông thôn có tỷ lệ mắc cao hơn do ý

thức vệ ainh kém, trẻ không được chăm sóc cản thận Do đỏ, bệnh VDDRC dược dưa

vào số 26 bệnh bảo cáo thường xuyên Số ca bệnh VDIDRC trong năm 2012 ở 28 tính

miễn Bắc là 433.000, chỉ đứng sau số ca cẻ triệu chứng cúm (870.000) [92], [91], [23], [94] Số ca tứ vong ước tính (năm 2005) là 9600-12.400 ca tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi do

VDDRC Trong năm 2005, ước tính chỉ phí điều trị trực tiếp cho những trường hợp

'VDDRC lên đến 3,1 triệu đô la Mỹ, 685.000 đó la cho chỉ phí trực tiếp khác và 1,5 triệu đỏ dành cho ch phí gián tiếp [33] Trong số trễ dưới 5 tuổi 15% sẽ phải nhập viện

do VDDRC và 50% cần tới phòng khám [16] Những con sé trén cho thay gánh nặng

của bệnh VDIDRC cho bản thân trể, gia đình và nên y lế nước la

1.1.4, Dich té hoc bệnh VDDRC

a Các đường lây huyền

Hầu hết các nghiên cứu về bệnh simh - dịch tễ cho rằng, gác tác nhân gây tiên chảy dễu chủ yếu truyền qua đường phân, miệng thông qua thie an hoặc nước uống,

bi 6 nhiễm hay lây do tiếp xúc trực tiếp với phân người bị bệnh VDDRC, hoặc trung gian truyền bệnh như ruồi, đản

b Một số hành vị làm gia tăng sự lan truyền tác nhân gdy bénh VDDRC

- Không nuôi con hoàn toàn bằng sữa mẹ trong 4-6 tháng đầu tiên sau khi sinh: theo tế chức Y tế Thẻ giới, những trễ không được nuôi bằng sữa mẹ trong 4-6 tháng, đầu tiên của cuộc đời có nguy cơ mắc VDDRC gấp nhiều lần so với những trế

được nuồi bằng sita mẹ hoản toàn, nguy cơ tử vong do tiêu chảy của những trẻ này cũng lớn hơn một cách đáng kể Bồi siia mẹ có chứa globulin miễn địch chñ yêu là

IgA (95%) IgM, IgG có tác dung báo vệ cơ thể chống các bệnh đường ruột vả một

sẽ bệnh khác đo virus gây ra [14]

dén suy dinh dưỡng,

- Dùng nước uống đã bị nhiễm tác nhân đường ruột Nước có thể bị nhiễm

ban ngay tại nguồn của nó hoặc trong suốt quá trinh đự trữ tại nhà Sự 6 nhiém tai

nhà lê đơ báo quản hoặc sử dụng không hợp vệ sanh

- Không rửa tay sau khi ẫt ngoài, sau khi xử [0 phân, truc khu chuẩn bị thức

ấn: Thói quen rửa tay là một hành vị tốt bảo về sức khỏe chung, đặc biệt có hiệu lực đối với việc phòng VDDRC

- Không xử lý phân (đặc biệt là phân trẻ nhỏ) một cách hợp vệ smũ Nhiều

‘bac cha mẹ thường cho rằng phân trế em là không nguy hiểm, thung thực ra, chúng chửa rất nhiều virus và vị khuẩn gây bệnh Phân súc vật cũng chứa nhiều vị sinh vật

có thể truyền bệnh cho người

œ Cáo yếu tô vội chủ liên quan đến sự gia tăng chỉ xỗ mắc, mức độ trẫm trọng,

thời gian bị bệnh VDLDRC

- Suy định dưỡng: VDDRC và suy định đưỡng liên quan chặt chế với nhau

nhất là đổi với những trể suy dịnh dưỡng năng, những i đỏ sự hồi phục niêm mac

ruột bi cham té do thiéu vitamin A, giảm sức dễ kháng của cơ thể Sự nghiệm trọng, kéo dai và nguy cơ dé tử vong doVDDRC sẽ gia tăng đối với những trẻ bị suy dinh đưỡng Ngược lại điểu này sẽ làm cho tỉnh trạng suy đỉnh dưỡng trở nên tram trong hon [8]

- 8đ†: Theo nhiều nghiên cứu cho thây, tiên chảy và ly thường gặp ở trẻ đang

tì sởi hoặc mới khỏi bệnh sởi trong vòng 4 tuần lễ, do trong thời gian này hệ thống

miễn dịch bị sưy giảm [1]

- Bệnh suy giảm miễn địch hoặc tác chế miễn địch: Tình trạng nay co thé tam thời do một số bệnh nhiễi ï nụ (như sở), hoặc có thể kéo đài như ở những người

có hột chứng suy giảm miễn dịch mắc phai (HIV/AIDS) Nếu tình trạng ức chế miễn địch nặng thì VDDRC có thể xây ra do các tác nhân bật thường và bệnh cũng

có thể kéo đài

- Tuổi Hầu hết tiêu chảy xảy ra trong hai nim đầu cuộc đời Chí số mắc bệnh cao nhất là ở nhóm trề 6-11 tháng, khi mới tập ấm đấm [6] Theo tổ chức Y tế Thể giới cho biết, nhóm tuổi này dễ mắc bệnh VDDRC bởi vì thời kỳ này trẻ phải ăn thức ăn bd sung, trong khi đó các yêu tổ báo vệ chồng tiêu chảy trong sữa mẹ lại giãm

d Tỉnh chất mùa

Người ta nhận thấy tình trạng VIDDRC tré em có sự khác biệt theo mùa ở

nhiều địa đu khác nhau Ở những vùng ôn đới, VDDRC do vị khuẩn thường xây ra

vào mùa nóng, ngược lại VDDRC áo virus, đặc biệt là RV lại xây ra cao điểm vào

ia đông Ở những vùng nhiệt đới,VIDRC do RV xảy ra quanh năm nhưng tăng, vào cáo tháng khô và lạnh, ngược lại VDDRC đo vi khuẩn lại xuất hiện cao điểm

vào giao điểm giữa rùa mưa và nóng Tỷ lệ mắc VDDRC kéo dài címg dao động theo mùa

ø Các vụ dịch

Hai tác nhân gây bệnh có thể gây thành địch lớn và tử vong cao la Vibro

cholerae 01 va Shigella dysenteriae typ 1 Những vụ dịch xay ra gan day là năm

1961, dich xay ra do Vibrio cholerae 01 & Indonesia lan dén Chau A, Trung Can

Déng va Chau Phi, một sổ mrớc chau Au va Bic My Shigella dysenteria Typ 1 pay

dịch ly lớn ở Trang Mỹ và gắn dây ở Châu Phi va ving Nam Á Ngoài ra, còn có mật số vụ dịch ly trực khuẩn ở Trung Mỹ, Trung Phi va Nam Phi

1.1.5 Cúc tác nhân gây VDDRC

Tác nhân gây VDDRC khả đa dạng, nhiều nghiên cín miêu tả 26 các loại tác

nhân khác nhau br virus nhu: RV, NoV, adenovirus (Adv), astrovirus, đến vị khuẩn

nhur eae ching E.coli gay liéu chay (DEC) thu: vi kbuin thuéc ho Vibrio trong đó

có phay khuẩn tà (Vcholera), Samonelia, Shigella, ky sinh trùng như họ Cryptosporidium, Ciardialamblia, Rntamoeba histolytica [S5, 60] Tuy nhiên, đù

1a 26 tac nhan trong một số ít nghiên cửu, hay 2-6 tác nhân trong đa số các nghiên

cứu, tỷ lệ phát hiện íL nhất một tác nhân không vượt quá mnúc 80% Trong số đó, 60- 70% do vi rut gay ra, thường gặp la RV, Nov

Một số tác han gay ligu chy

- Nhóm vi rút: RV, NoV, ađenovirus

- Nhóm vì khuẩn: Viðrio cholera, Salaonella, Shigella, E coli

- Ký sinh tring: Crytosporidium

1.2 Giới thiệu chung về NuV

121 Bénk VDDRC do nhiém NoV

NoV duge coi la nguyén nhan chinh gay viém đạ dày ruột cấp tỉnh ở trẻ em

và người lớn Bệnh do NoV thường xây ra va tim thây ở các nơi khác nhau: nhà hàng, trường học, các trung tâm chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, nhả điều dưỡng vả

tàu da lịch Hằng rắn có đến hơn 267 triệu trường bợp nhiềm đo NoV' trên toàn thé giới [68] Con đường truyền chính của virus nảy thưởng lan truyền qua đường thực

phẩm, đường móc, không khí và lan truyền từ người sang người [35], [62]

NoV dược phát hiện lần dầu tiên bởi Kapikian và cộng sự vào năm 1972

dưới kính hiển vi điện tử (EM) Trước đây, các virus được kí hiệu la “Norwalk-like virwses” Chủng nguyên thủy của NoV là virus Norwalk, chủng được phát hiện từ

một đợt bùng phát viên đa dày ruột cấp tính tại một trường tiểu học ở Norwalk,

Ohio năm 1968 [46] NeV là thánh viên của chỉ NoV, củng với chỉ Sapoviue trong,

họ Calioiviridus |38| Các virus này thường nhỏ và không có màng bao quanh, sRNA (+) véi duéng kinh khoang 27-35 nm (hinh 1.1)

7

Hình 1.1 NoV dưới kính hiển vi điện tử [65]

1.2.2 Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của Nøl”

Trước đây, việc phát hiện lây nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV gây bênh ở người nhưng khỏ nuồi cấy được trên tế bảo vả cũng không cỏ động vật thí nghiệm nảo thích hợp cho sự gây nhiễm NoV Tạo dòng của bộ gen virus Norwalk được thực hiện năm 1990 đã dân đến sự tiền bộ lớn trong sự hiểu biết vẻ virus học phân tử và dịch tế học của NoV [42] Gần đây, các phương pháp chân đoán phân tử

cỏ đồ nhạy dựa trên phản ứng RT-PCR và các kỹ thuật giải trình tự bộ gen đề phát hiện, mô tả đặc điểm NoV: đã góp phan nâng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về dịch tế học của sư lây nhiễm NoV [98] Những kỹ thuật này đã chứng minh rằng các NoV có tính di truyền và đa dang vẻ kháng nguyên [99] Dựa vảo trình tự giỏng, nhau vả phân tich cây phát sinh chủng loài, NoV có thẻ được phân loại theo nhỏm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) va cum gen (genocluster) Hiện nay, NoV được phân loại thành năm nhóm gen khác nhau: từ G1 đến GV [38],[80] NoV ở người thuộc GI, GII và GIV, nhưng hâu hết các chủng gây bênh ở người đều thuộc nhóm gen GI và GIL NoV GIII va GV cho dén nay đã được tìm thấy ở loài bỏ vả các loài chuột Trong các nhỏm gen (genogroups), NoV được chúa tiếp thành các

kiểu gen (genotypes), trong số đỏ có ít nhất 29 kiêu gen đá được báo cáo Hiện nay

nhóm gen G1 được chia thành tám kiểu gen (G11 đến GL8), GII bao gồm ít nhất 17 kiểu gen (GIL.1 đến GIL.17), GIH cỏ hai kiểu gen (GII.1-GIH.2) và mỗi GIV vả GV bao gồm một kiểu gen [99]

Các phân tích về trình tự toàn bộ chiều dài bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng các chủng virus trong một nhỏm gen thường có nhiêu hơn 69% tương đồng về nucleotide, trong khi các chủng trong các nhóm gen khác chỉ chiếm 51-5634 sự tương đồng, Ngoài ra, sự phân loại dựa trên trình tự nucleotide cúa gen cho protein

vé capsid cho thấy rằng các trình tự chênh lệch nhan bởi 6094 giữa các genogroups

và 20- 3014 giữa cdc genotypes Trong cimg genoclusler, trình tự vô capsid cia virus thường rất giống nhau [20]

Thông qua việc giám sát địch tễ của NeV trên thể giới đã cho thây vai trò chủ yêu của những chủng có nhôm gen GII, đặc biệt là những chũng cỏ kiểu gen GI1/4 chiếm ưu thế là nguyên nhân của các vụ dịch (hiện tại ước tính khoảng gan 80% của tắt cã các trưởng hợp lây nhiễm, nó cũng là nguyên nhân của cả 5 vụ dịch trong hon thập kỹ qua) và có các biển thể GIT.4 rời xuất hiện từ 1-2 năm gản dây Dường như

sự tăng lên thưởng xuyên của biến thể G11.4 mới đã tiếp diễn trong những năm gẫn đây và đã Irở thành một hiện Lượng toàn câu [76], [77] Các nghiên cứu vẻ dịch tiêu

chảy cắp ở quân đội Iaracl chủng, phân lập là GIL.6 nhưng nhanh chóng chuyển thành chúng GLL4 [30] Diéu tra 6 My do CDC tién hành vào năm 2006 tỷ lệ các ca do GI1.4 tăng lên rô rệt trong toàn nước Mỹ [43] Một nghiên cứu của Nhật vào năm 200/-2005

cho thấy GII chiếm 98,6% trong do GII.4 chiếm tới 77,4% [37] Tại Brazil trễ tiêu

chảy cấp nhiễm NoV gencgroup GI chiếm 6,1%, genogroup GI chiém 78,7%, còn lại

là bộ nhiễm của 2 genogroup này [19] Mặc đủ địch bệnh NoV được báo cáo quanh năm, nhưng đính điềm của việc bùng phát dịch là trong mùa đông [21]

Ở Việt Nam, từ năm 2007-2013, kiến gen NoV GIL4 luôn luôn là kiếu gen

luu hành chiếm ưu thế Sự xuất hiện cũ dòng GIL.4 ở Việt Nam cùng thời điểm trên thể giới xuất hiện dòng GIL.4 mới tương ứng: sự chiếm ưu thể của dong US95/96 ở nước ta trong những năm 1998-1999, sự tẳn tại của chủng 2006b ở nước

1a từ 2007 2013, sự xuất hiện của chúng New Orlcars-2010 trong giai đoạn 2009-

2011 va sy nỗi trội của chúng Sydney 2012 trong năm 2013 Song song tốn tại với

các đa dạng chủng GIL.4 là genotvpe GIL3, chiểm tỷ lệ khâng đưới 20% (hình 1.3)

Thư vậy, sự xuất hiện của các đa dạng chủng GIL.4 ở nước ta đồng thời với sự lưu

lành toàn cầu của các ching nảy trên thế giới [22] Các chúng NoV phỏ biển ở

mién Bac bao pém GL8, GIL3, GIL4, GIL13, trong khi đỗ các genotype NoV lưu

hành ở miễn Nam da dang hon voi viée thém nhiéu type thuéc nhém gen GT va GIT như GL3 GL4, GL5, GLL6, GIL9 va GIL12 (Hinh 1,3)

"GIE "GI2 — *G@ GI7 GIL

“GI.1U AGIs ZGM16 GII3eG14 NT

7A4

x

Hình 1.3 Phân bố genotype khác nhau cúa NoV ứ miền Bắc và miền Nam

nước ta trong năm 2010 [69]

TNoV là thành viên của chỉ Nerovirus, trong họ Calieiviridae, Hại NgV dược tạo

7-40

thành bởi 3 cầu trúc đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng, kích thước

m Bê mặt điển hình của hạt virus có hình dáng lõm của cái tách Võ capsid gồm có

90 dimer của một prolein về đơn, có trọng lượng phân tử là 58 Kd (ình 1.4)

10

Hình 1.4 Câu trúc của NoV [6]

Bộ gen của NoV bao gổm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nueleotide của sRNA Bộ gen được polyadenyl hóa vả chia thảnh 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2 vả ORF3), ORF1 mã hóa cho một polyprotein được tách ra từ enzym thủy phân protein, tạo thành NTPase, protease, và RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) ORF2 chủ yếu mã hỏa cho protein vỏ VPI tạo thành lớp capsid và mang

tinh kháng nguyên của virus Gen VPI là gen biển đổi lớn nhất trong hệ gen của

NoV và được chia thành ba miễn, miễn vỏ (S) được liên kết với miễn nhô ra ngoài (miên P2) nhờ khớp nói lỏng lẻo (miền P1) Miền § có tính bảo thủ rất cao, hình thành bộ xương của câu trúc capsid, miền P2 có chứa vùng liên kết với tẻ bảo vật

chủ, do vây miễn nảy mang tỉnh kháng nguyên của virus Còn ORF3 mã hỏa cho

protein VP2 co chite nang trong quả trình lắp ráp và ôn định hạt virus (hình 1.5)

[38] NoV được phân nhóm dựa vào trình tự axit amin của protein VPI- các virus

có sự khác biệt nhỏ hơn 14,3% thuộc cùng một chủng, khác biệt từ 14,3-43,8% thuộc củng một kiêu gen, khác biệt từ 45-61% thuộc cùng một nhóm gen

Norm NIPase VPg SA-tke Pro Pol | VPI (Gapsiq) | VP2 Ỉ ”'“ A(n)

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gen của NoV

"1

1.23 Sue lay truyền, đặc điểm lâm sing va sinh Ij bénh

"_ Dường lây truyền của Novovirus

Su lan truyền phố biến của NeV là thông qua thức ăn, nước và mỗi trường bị

6 nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với người, trong không khi Ví dụ, NoV lan

truyền qua việc thay tã, chia sẻ để đừng ăn uống, ăn thrc phẩm hoặc uống chat long

trị nhiễm virus, ho’ đụng chạm vào œ bề mặt hoặc đồ vật nhiễm virus va sau dé

cho tay vào hoặc đặt gần miệng

Các NoV duoc tìm thấy trong mẫu phân và mẫu nên của một người bị nhiém bệnh Có ít nhật 2 nhân tổ góp phẩn vào khả năng búng phát địch bệnh của virus Thử nbat, virus lay nhiềm rất cao vả chỉ một lượng nhỏ, khoảng 10-100 hạt virion di dé gây bệnh Thứ hai, virus tương đối bền trong môi trường, ví dụ khả năng lanh khi dóng băng, nhiệt độ dén 6Ó°C, khử khuẩn với chỉo, diễu kiện axiL, giảm, rượu, các dung dich khử trùng tay vả nông độ đường cao [89] Giai đoạn ủ

bệnh trung bình của vius ngắn (12-48h) nhưng sự phát Lân cửa virus duge phát hiện

ta tuần sau khi xuất hiện các triệu chứng, tạo cơ hội để mở rộng phạm vị phát tản của virus sang cáo vật chú khác [83] Liện nay việc phỏng ngửa và khống chế các

vụ địch của NeV đều đựa vào việc xác định cáo phương thức truyền nhiễm Sự lan truyền bệnh được cắt dứt bằng việc kiểm soát sự ö nhiễm của thực phẩm vả nguồn nước, duy trì vệ sinh cá nhân và lâm giảm sự truyền bệnh từ người sang người

"_ Đặc điểm lâm sàng

Triệu chứng nhiễm NoV thông thường nhất lá nôn mứa hoặc tiêu chảy, dau

quan bung và đôi khi có sốt Phân tiêu chảy thường không có máu, ít chật nhờn, thể

lồng và có nước Các triệu chúng thường kéo đài khoảng 24-60 [47] Các nghiên cứu trên người tình nguyên cho thấy rằng có dến 30% các trường hợp nhiễm trùng,

mà không có triệu chứng nào Hiện nay chưa có phương pháp điểu trị đặc hiệu VDDRC do NoV, cũng như không có vacxin để phòng ngữa bệnh [38] Điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ, bỏ sung dinh dưỡng, dặc biệt là hổi phục nước vả điện giải Các biển chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trê sơ sinh và người cuo tuổi Người giả và trề em naất nuớc gây rối loạn điện giải có thể dẫn dến tử

12

vong nhanh chéng néu khỏng được cấp cứu kịp thời Tuy nhiên, đữ liệu moi cho thấy ring các dâu hiệu và cáo biến chứng lâm sảng bất thường từ sự lây nhiễm NoV'

có thể xây ra ở những người suy giảm miễn dịch và căng thẳng tinh than [48]

= Sinh lý bệnh

Các nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh bì nhiễm virus cho

thấy sự nhiễm trừng chỉnh thường xây ra ở phần đưới của ruột nen Khí niêm mac rudt

bị tốn thương thị khả năng hấp thu nước vá điện giải của ruột bị suy giảm, hậu qua la các chất đinh đưỡng khéng duoc dem vao mau ma tén dong trong long một khiến táng

áp lực thẩm thấu trong lòng ruột, sẽ kéo theo nước và điện giải theo phân ra rgoài thành tiêu chảy Nhiễm NoV kích thích cơ thể sinh ra kháng thể IgG, IạA dặc hiệu và khang thé IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có sự phơi nhiễm trước đó Hân hết các bệnh nhân dễu có sự dễ kháng với sự tái lây nhiễm với cùng ruột chủng gây nhiễm ban đầu wong khoảng 4 - 6 tháng Tuy nhiên, không có sự miễn dịch lâu dài [27]

Nghiên cứu ban đầu trong các nhórn tình nguyên đã chứng mink rằng khoảng, 30% trường hợp nhiễm bệnh mà không có triệu chứng di kèm |75] Gan day, nghién cứu cho thây rằng những người nhiễm bệnh NoV phụ thuộc vào sự hiện điện của các thụ thể tháng nguyên nhóm máu histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong đường tiêu hoa [59] HBGAs ở người là phức hợp các carbohydrate bao gồm một

cligosaccharide liên kết với protein hoặc lipid trên niêm mạc biểu mê của hệ hô

hap, sinh duc và ảng tiêu hóa, hoặc như các oligosaccharide ty do trong các dịch sinh học như nước bọt [66] Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO, Lewis va ho secretor)

đã cho thấy có sự liên quan đền việc nhận điện NaV Sự phối hợp của liên kết đặc

triệu chủng và biểu hiện biến đổi trên thụ thẻ HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm của người nhiễm khác nhau dược theo dõi trong các vu dich NoV và trong các nghiên cứu ở người tình nguyện [88]

1.24 Chén dodn

Cỏ nhiều phương pháp thích hợp dé chan doan nbiém NoV Nhing phuong pháp này bao gém: quan sát trực tiếp bang kinh én vi dién ti (EM), quan sat bằng kinh hiển vì điện tử miễn dich (TEM), thir nghiém ngung két hang cầu uuiễn dịch

13

(AHA), thử nghiệm miễn dịch phỏng xạ (RLA), thử nghiệm miễn dịch enzym

(HIA), thử nghiệm sắc ký miễn địch (TC), RT-PCR, real-time PCRvả giải trình tự nueleie acid Trong số những phương pháp này thi RT-PCR, real-time PCR va giai trinh ty nucleic acid được sử dụng rộng râi để phát hiện và xác định kiểu gen của NoV [S0], [71], [81], [98] Các kỹ thuật sinh học phân tử này đã thay thể các thử nghiệm miễn dịch truyền thống và trở thành tiêu chuẩn vàng cho chân đoán nhiễm trùng NoV trong thập ký qua

" _ Các kỹ thuật chẵn đoán thing tưường

- Quan sát trực tiếp bằng sử đụng EM: kỹ thuật này cho phép phát hiện

một lượng virus > 10%/ml trong dich huyén phủ phân, nó chỉ có thể thành công khi

áp đụng trong giai đoạn sóm của bệnh [89]

- Kỹ thuật TEM: trong kỹ thuật này, huyết thanh miễn dịch được sử dụng dễ xrâng cao sự phát hiện virus bới sự ngưng kết của các lạt virus trong dịch huyền phù phân Sự kết cụm virus xây ra trong sự luện diện của kháng thẻ đặc hiệu có thể phát hiện và cải thiện khả năng chân đoán đặc hiệu, Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ được sử dụng cho cáo mẫu phân thu nhận trong giai đoạn đầu của bệnh [58]

- Thủ nghiệm ngưng kết hông cầu miễn dịch [AHA) và miễn địch phóng

xe (RIA)}: 1AHA là thứ nghiệm dễ dánh giá nông độ kháng thể NoV trong rnột lượng,

lớn huyết thanh vì thế các nghiên cửu địch tế học về huyết thanh oó thể được thục hiện

tảng thử nghiệm nay [45] Những hạt virus được làm sạch từ mẫu phân có thể được dùng như một kháng nguyên vả tương tác của phúc hợp giữa kháng nguyễu/kháng thé được phát hiện bởi sự ngưng kết hẳng câu nhóm máu O ở người Mặc dù thử nghiệm

có kẽ thế là đòi hỏi kháng nguyên ít hơn, nó nhanh chống được thay thé bang RIA RIA đã được phát triển như là một phương pháp thay thể cho [EM để phát hiện kháng, nguyên NoV trong các mẫu phân [39] Hiện nay, 2 phương pháp nay đang được nghiên cửu đề phát triển thêm

"- Các kỹ thuật phân từ

Sau thành công về tạo dòng và giải trình tự bộ gen virus Norwallt (NoV), thứ nghiệm RT-PCR được phát triển để phát hiện NoV trong cả mẫu bệnh phẩm và mẫu môi

14

‘rong trong hai thap ky qua Ung dung RY-PCR va cae ky thuat giai trinh ty cDNA dé phát hiện và mô tả đặc điểm di truyền NoV đã tăng cường dáng kế sự hiểu biết của chúng te về dịch lễ học cũa bệnh nhiễm NoV |88I, |98] Gắn đầy, RT-PCR được sử dụng, rộng rãi như một công cụ để chân đoàn bệnh nhiễm NoV Một bước ngoặi đáng tin cây nhất cho chân đoán nhiễm NV là sự hiện điện RNA cửa NoV trong các mẫu phân Đề tạo điều kiện cho việc phần tích phân tử RNA của NoV, khuếch đại bộ gen RNA của chúng và trình tự của sản phẩm khuếch đại phải được thực biên Thêm vào đó, các ky thuật phân tử khác rửmr: DCR miễn dịch, RT-LAMP và realtine PCR, những kỹ thuật đó nhanh và nhạy hơn phương pháp RT-PCR chuẩn, gần đây các phương pháp realtine RT PƠR đã được phát triển để phát hiện nhanh XoV trong một số lượng lớn các mẫu phân

và mẫu hải sản trong suốt mùa địch bệnh và các vụ địch của NoV [414], [9Ø]

Trong những năm gân đây, protein võ NoV biểu hiện bởi baculovirus trên dòng,

tế bảo côn trùng để tạo hạt giống virus-iike particles (VLPs) Những VLPs nảy có hình thải và kháng nguyên giống với các hạt virus nguyễn thé Cac VLPs rit hia ich cho việc tạo miễn dịch của nhiễu loài dộng vật khác nhau (chuột, chuột lang và thở) dễ săn xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch da và don dong va sau do od thé duge sit dung dé thiết lập các thứ nghiệm chan đoán cơ bản HLA nbu thi nghiệm ELISA va thi nghiệm

TC [84] Mal sé bO kit ELISA dùng để phát hiện NoV trong các mẫu phân đã được phát triển và thương mại hóa Mặc dù các mẫu phân có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng những bộ kí ETLISA mà không cần bước tình chế và cô đặc quá phức lạp, độ nhạy của

phương pháp ELISA thì thấp hơn nhiền se với phương phap RT-PCR [28], [51] Dé nhạy thắp là hạn chế của phương pháp ELISA, điển đó làm cho nó không phủ hợp cho việc phát hiện trực tiếp NoV trong các mẫu phản, mẫu hải sản mà không có sự cải thiện

độ nhạy Gần đây, thử nghiệm phát hiện nhanh bằng bộ kit IC cũng đã trở thành

thương mại hóa, có sẵn để phát hiện NoV, Hộ kit IC nay đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với các thử nghiệm bằng HLISA Tuy nhiên, bạn chế của các thử nghiệm chân đoán LILA co ban để phát hiện NoV lá chỉ có một số kiểu gen NoV má các kháng, thể đơn đòng đặc hiệu có thể được phát hiện

15

1.2.5 Phuong pluip realtime RT-PCR (Realtime Reverse transcription polymerase

chain reaction)

Kỹ thuật Realtime RT-PCK cũng qua 2 bước cơ bân giống như RT-PCR tao cDNA va sau dé str dung cDNA nay dé thuc hign phan tng real-time PCR

- Giai đoạn phiên mã ngược: Dễ có thẻ thực hiện được phản ứng nay thi

trước hết RNA đích phải được phiêu má ngược (RT-reverse transcriplion) thành cDNA Linzym duoc sit dung trong giai đoạn này là Reverse transcriptase Mỗi str đụng trong giai đoạn nảy là mỗi “ngược” của PCR giai đoạn sau, có thế là oligonucleotic oligodT (để bất cặp với đuôi poly A của các nRNA) hoặc cũng có thể là một mỏi ngẫu nhiẻn (random primer) co ban chất là một hexan mracleotide bắt cấp ngẫu nhiên với một trình tr ngắn trên mRNA

- Phân ứng Resltime PCR: lả kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trinh sao chép DNA Reaitime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lấy

DNA khuếch đại ngay khí phần ứng đang xây ra Khả năng này được phát hiện nhớ

bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang Những hỏa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết IDNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Prehe Khi DNA tương hợp với primer thi quả trình sao chép sẽ xây ra và sự gia tăng lượng tin hiệu huýnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA Khi sử dụng máy DIO-RAD, máy có bộ camera có thể chụp được tiì hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xây ra Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nên ta không thể phát hiện sự g1a tăng tín hiệu cho dù có quá

trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hảm mũi Tiên một thải điểm xác định,

san phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiện huỳnh quang có thể phát hiện được Chủ

kỷ này được gọi là chu kỳ nguong Cy (Cycle of threshold), Day eiing là giá tri dé đánh giá kết quả phân tng

1.3 Tỉnh hình nghiên cứu No trong và ngoài nước

1.31 Tình hình nghiên cứu trên thể giới

NoV thuéc ho Calicwviridae 14 nouyén nhàn đứng thứ hai (sau RV) gây nên cúc vụ địch tiêu chảy ở cáo nhóm tuổi, trong đỏ gặp chủ yếu là ở trễ pm dưới 5 tuổi

16

[15] Theo nghiên cứu trên toàn thể giới, tý lệ ca tiêu chảy do nhiễm NoV thường, khá cáo (Brazil 33%, Nhật 29%, Ý 48,1%, Dài Loan 29,5%, Ấn Dộ vả Thái Lan: 13-449) Từ năm 1995 đến nay, trên thẻ giới đã xây ra 5 đại địch tiên chây cấp do NoV Những vụ dịch này lan rộng ra toàn thể giới trong vỏng vải tháng, Khoáng,

thời gian giữa các lần xuất hiện đại địch ngày càng ngắn hơn NoV là một trong

xhững vữus có mức độ đa dạng đi truyền cao tao điều kiện để chúng lưu hành phố biến và khá năng thích ứng rộng trong cộng đồng

Trang nghiên cứu của Castilho và công sự (2006) đã tiên hành kiếm tra 234 xấu phân từ trẻ em có hoặc không cỏ viêm dạ day ruột trong một khong thời gian

5 năm (1995-1999) ở bang São Paulo, Brazil NoV dược phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR vai việc sử đụng hai cặp mỗi oligonncleotiđe khác nhan nhắm vào 3" của gen RNA polymerase (ving B), cũng như ruột khu vực capsid mot phan ở dâu 3' của gen VPI (vùng D) Tổng cộng có 78 (33%) các mẫu xét nghiệm đương tính cho

NoV, trong dé ching GT chiếm 6,1% và GHI chiếm 78,7%, còn lại là hội nhiễm của

2 penogroup này |24| Năm 2009, Carlsson B và cộng sự, đã phát hiện ra cỏ 54,2% trong tổng số 116 người ở một nhà dưỡng lão giả ở L] Grao de Castellón, Tây Ban

Nha da nhiém NoV (GIL4) [23] Đến năm 2013, Najafi A vá công sự đã tiển hành

nghiên cứu trên 375 mẫu phân của trẻ em dưới 7 tuôi bị bệnh viêm dạ dày ruột cấp

tinh ở bệnh viện Nhi khoa Shahrivar, thành phé Dorazjan, Iran Trong tổng số mẫu

thu được, NoV được phát hiện ở 47 trong tổng sẽ 375 (12,53%) Tỷ lệ nhiễm cao nhất là ở trẻ em đưới hải tuôi (76,69) Đặc biệt, virus nảy đạt tỷ lệ cao nhất trong, mùa thu (63,83%) và thập nhất ở mùa hè (6,38%) [70]

1.32 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tiêu chây là một trong những bệnh có tỉ lệ mắc cao, dứng thứ bai chỉ sau các

bệnh về đường hẻ hấp ở trẻ đưới 5 tuổi, đặc biệt ở các nước đang phát triển

Nguyên nhân gầy bệnh tiêu chây bao gém virus, vi khuẩn và ký sinh trùng Nhờ có những nổ lực dưa giảm sát tiêu chảy kèm chan doản tác nhân vị rút, do Tế chức Y

tế thế giới tải trợ từ những năm 1998 đến nay, nghiên cứu vẻ các bệnh tiêu chây do

virus ở Việt Nam đã dại được nhiều thành tựu, tiêu thêm nhất la việc sản xual va

lưu hành vắc xin phòng tiểu ehay do RV NoV cũng là tác nhân phổ biên dừng thử 2 sau RV gây các vụ địch tiêu chảy không do vi khuẩn ở người lớn và trễ em Qua

nhiều nghiên cứu cho thây, tỷ lệ phát hiện NoV dao động trong khoảng lớn từ 5,5%

đến 36% giữa các nghiên cửu, do nhiễu nguyên nhân bao gồm sự khác nhau vẻ địa

điểm nghiên cứu, các kỹ thật sử đụng, phương pháp chọn lưa đổi tượng và thời

giam tiến bảnh nghiên cứu Trước đây, các nghiên cửu trong những răm 2000 đá chỉ

ra rằng, tý lệ phát hiện NoV trong mẫu phản tiểu chav không vượt quả 6% trong, những nghiên cứu trong giai đoạn này, phân nào đánh giá thập tâm quan trọng của virus này trong bệnh tiêu chây, Với việo các xét nghiệm phân tử có độ rhy cao hơi nhu realtime RY-PCR ngày cảng trở nên phỏ cập, tý lệ phát hiện vi rút nảy ở nước 1a khoảng 30% như nghiên cửu đầu tiên ở miễn Bac Ty 1é nay được tiếp tục khẳng định trong các nghiên cửu khác ở miễn Nam, cho thấy lầm quan ượng của vi rút này, chí sau RV [11], NoV còn có khá năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng Tuy nhiên, ở nước ta các nghiên cứu dịch tế học phân tử về virus này ở trễ nhiềm bệnh cũng như khốc mạnh tại các trường mâm non cảng hạn chế

Năm 2012, Xguyễn Dễ Phúc và cộng sự đã xây dựng thành công quy trình

phát hiện NoV bằng kỹ thuật Realtime PCR Kết quả ứng đựng quy trình Real time PCR ban dầu cho thấy có 12/40 mẫu nhuyễn thể hai mãnh vỏ phát hiện NoV nhòm GÌ

va GI [9] Nhóm nghiên cứu Phạm Thị Hà Giang và cộng sự (2013) đã xác định

được 7 tác nhân vi khuẩn và virus gây tiêu chảy ở trễ em đưới 5 tuổi trong tổng số

410 mẫu phân tiêu chấy thu thập ở Bệnh viện Nhi Thái Binh từ tháng 9/2011 đến tháng 9/2012 sử dụng bộ sinh phẩm Allsoresn-Interlabservice đo Cộng hòa Liên bang Nga lai try BO sinh phẩm này có khả năng xác định được tới 73,6% nguyên nhân gây tiêu chây trong dỏ tỉ lẻ NoV là 319% Đông nhiễm giữa RV và NoV diễn ra

phế biển nhất (chiếm 6,6%) [3]

Tại viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Vũ Thị Bích Hậu và cộng sự (2013), đã

tiến hành nghiền cứu sự biến động genotype của NoV lưu hánh tại miễn Bắc Việt Nam từ 2007 — 2013 Kết quả cho thay, trang hon 1800 mau phản tiêu chảy tại bệnh viện ở một số lĩnh miền Bắc nước ta từ 2007-2013, NoV GII.4 là genotype lu

18

hanh phé bién nhat (74,5%), ké tiép la genotype GIL.3 (20%) Su bién dộng dang kế

và nhanh chúng của chủng NeV GIL.4 trong thời gian ngắn với các đa dang chủng khác nhau bao gồm: Nhóm 2006b chiếm ưu thê trong những nắm 2007-2008 đã dan

thay thể bởi nhom Sydney-2012 trong nim 2013 Genotype GIL4 nhỏm New Orleans-2009 tên tại trong giai đoạn 2010-2012 và không xuất hiện trong năm

2013 Tương tự với NoV GIL.4, vi trí lương |

xăm 2013, lác giả Nguyễn Vân Trang cũng dã tiểu hành dánh giá vai trò của khang nguyên nhóm máu (HBGA) trong tỉnh cảm nhiễm với 2 loại virus là RV và NoV ở

trể nhập viện đo tiêu chây tại Thái Bình Kết quả cho thay, trong số 260 trê nhập

viện có dồng thời mẫu phân và nước bọt, 158 trẻ (61%) có kiểu hình tiết kháng,

nguyên LIBGA (Le™'”), 31 tré (12%) od kidu hinh khong tiết kháng nguyên (Le,

và 71 trẻ (27%) có kiểu hình tiết kháng nguyên không hoàn toàn (Le"'®") NoV

260 trẻ này với GIL3 và GII.4 là những kiểu gen phd

tiến nhất Toản bộ trẻ nhiễm GT1.4 có kiêu hình tiết TIGA Trong số trẻ nhiễm

GII3, có 5 trong số 28 trường hợp trê không tiết kháng nguyên [10]

dược phát hiện 6 50 trong

1-4 Kiểu gen ZUT-2 ử người và tính cảm nhiễm NøE”

Múc đệ cảm mg của cơ thế đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của

gen FUT-2 Gen FUT-2 ma hoa cho enzym [ucosylưanaferase u(1,3) để điều hòa sự biểu hiện của kháng nguyễn H (tiền chất cần thiết của các kháng nguyên A và B) trên bễ mặt của cơ và dịch cơ thế, từ đó xác định tình trạng tiết trong các nhóm máu của các khang nguyén ABH Trạng thái tiết trong các nhóm quận của mỗi cá thể rất quan trong cho các nghiên cứu môi liên quan của bệnh va các dột biến nucleotit được tìm thây trong gen EUT-2 đặc trưng cao của mãi dân tộc

19

Chiéu dai ctta KUT-2 khodng 9980 bp, bao gdm 2 exon (118 va 2995 bp) bi tach

ra bởi một intron có kích thước G865 bp xen đầu tiên tạo thành vimg mã hóa không được dịch mã, exon thứ 2 mã hỏa cho 343 amino axit cña protein đã được nghiên cứu rộng rấi [32] Sự đa hình được tìm thấy trong gen 7-2 cho thầy tính đặc trưng đân

tộc cao với đột biên võ nghĩa ở vị trí Œ28A có liên quan đến quân thế người đa trắng,

và đội biển võ nghĩa alen CS7TT được tìm thấy phần lớn của người ở các đảo tude Thải Binh Dương [11] Dột biển ở vị trí A385E làm giám hoạt động của cnzyme fueosyltransferaseø(1,2) do đột biển mật ở vị trí 129 (Ile-Phe) là nguyên nhân chủ yếu nhái đân đến kiểu hình không tiết (nonsceretor) của người phúa Đông và Đông Nam_ chau Á Đã có một số nghiên cứu về môi quan hệ giữa gen FUT-2 va tinh trang nhiễm 'NoV Nghiên cửu mới nhất trên gen secretor (gen tiết) ở các nhóm quản thế người khác nhau đã xác định dược một vải dột biến của các gen này nà có thể làm mắt hoặc giảm

sự hoạt động của enzyme fucosyltransferase Đó la đột biển Œ428A, CS71T, C628T và

849A, lắt cả chúng, tạo thành bộ ba kết thúc, rong khi đó rất 3 rucletit ở vị trí 685

tạo thành protein không hoạt dộng và dột biến A385T tạo nên mét enzyme không én định [86] Dột biến C357L khổ

fueosyltransferase nhưng nó được tìm thây trong nhiều quân thế [53]

làm thay di amincaxit trong enzym

Các nghiên cửu trên thế giới đã chỉ ra rằng, tỉnh trạng nhiém NoV hiém khi

vượt quả 70% bởi một số yêu tổ di truyền đóng vai trỏ lớn trong việc ngắn chân một

sẽ người không bị nhiễm NoV Người ta cho rằng tình trạng secretor, khả năng biểu hiện HBGA (histo-blood group antigen) trén mêm mạc và trong dịch tiết có thể có

nguy cơ bị nhiễm KoV Những người non-secretars (những người không biểu hiện

Fuc-TI a1,2-fucosyHrarsferase và do đó không thể hiện H type 1 hay Lewis b (Leb) khang nguyén) cho thay ring giảm bị nhiễm hoặc thàm chi dé kháng với sự nhiễm 1NoV Ngoài ra, các nghiên cứu huyết thanh địch tế học đã cho thấy rằng những người seerelor có đâu hiệu kháng thể cao hơn đáng kế và xuất hiện lại NoV' nhiều hơn những người non-secretor [20]

Có thế có mỗi quan hệ giữa alen #U/7-2 và sự nhạy cảm hình thành bệnh cũng đã được nghiên cứu rộng rồi Alen vô nghĩa 428A cho thấy có sự bâu về cho

20

su nhiém NoV GIL, do 1a nguyén nhan chinh cita bénh viém da day cap tinh [23] Alen v6 nghia 1284 cing có mới liên hệ chặt chế với quá trinh làm chậm sự nhiễm virut HTV- 1 [52]

1.5 Kháng nguyên nhóm máu tương dung (ổ chức (HBGA) và khá năng cắm nhiễm của NoV'

Khoảng một thế kỹ rước, Karl Iamdsteiner đã phát hiện ra kháng nguyên nhỏm mau ALO ở trong khang thé va tế bảo hồng cầu ở người Gần đây đổi tên thành kháng nguyên nhóm máu tương dung tế chức (HBGA) vì sự hiện điện của nó trong nước bọi, một số mô tổ bảo và ruột |66J Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, NoV và RV là hai tác nhân nhận biết khang nguyên nhóm máu tương dung tỏ chức (HBGA) là thụ thé trong quá trình nhiễm Kháng nguyên nhỏm máu tương dung tổ chức (HBGA) là một phức hợp carboohydratc liên kết với gÌyooprotein hoặc glycolipid có mặt trên bể mặt tế bảo hồng cầu hoặc các tế bảo nội biểu mé va

FUT-2 va FUT-3 xac dinh kiểu hình của kháng nguyên Lewis Khi gen FUT-2 hoạt động, kiểu hình của kháng nguyễn Lewis là Le**” và Le**" (trạng thái tiết hoán toàn) nhưng khi gen FUT-2 không hoạt động, kiểu hình của kháng nguyên Lewis 18

Le" và/hoặc Le°*'(trang thái khống tiế) Kiểu hình Le" *' trang,

thải tiết không hoàn toàn) xuất hiện khi gen #U/7-2 bị đột biến làm giảm mức độ

và/hoặcLe

tiểu hiện yêu tổ 1ï hoặc đo quá trình fucosylation không, hoàn toàn của tiên chất I1

Sự không hoạt động của gen FU7-3 dẫn đến kiểu hình Te*®" và Te*#" (không xác dinh) Những tiến bỏ trong các nghiên cửu gần dây về sự tương tác giữa NoV với vật chủ và các thụ thế của virus đã mỏ ra hướng mới trong nghiên ứu phố vật chủ

đặc hiệu và quá trình phát sinh bệnh của virus này Larsson đã chứng trình rằng,

hiệu giả kháng thể kháng NoV nhỏm GII ở những người thuộc trạng thải không tiết thấp hơn dang kế so với những người ở trạng thái tiết Tuy nhiên, có NoV có rất nhiều kiểu gen khác nhau và một số chủng có khả năng hên kết với kháng nguyên

21

Le" ở những cá thể không tiết và gây ra hiện tượng nhiệm không triệu chứng Các nghiên cửu trên mẫu mước bọt cho thấy các chủng NoV khác nhau nhận biết các THBGA khác nhan, trong đó NoV nhóm Gĩ liên kết với các HBGA ở những cả thể tiết và thuộc nhỏm máu A hoặc © má không liên kết hoặc liên kết ở mức độ thấp với IIBGA của các cả thể không tiết hoặc mang nhóm máu l Hạt VLP của các chúng GII.4 liên kết chủ yếu với HBGA của cá thế tiết mà không phân biệt cá thê thuộc nhóm máu nảo [#7]

ING PHAP NGHIEN CUU

CHUGONG 2 ĐÔI TƯỢNG VÀ PHL

2.L Đối tượng nghiên cứu

Tré khée mạnh trong lửa tuổi từ 6-36 tháng từ 7 lớp ở nhà trể thuộc tính Hà

Nam duce diva vào giám sái Các lớp lọc của nhà trể mày năm lrên 2 địa bản KẾ và

CƠ, cách nhau | con séng khoảng 3-5km Trong đó, nhà trẻ địa bản CƠ có 3 lớp

(lớp cô D, cô Hu và Có V), mỗi lớp có 20-30 trẻ Còn nhà trẻ thuộc dia ban KK 66 4

lớp (cò Ha, cố Hạ, cô O và cô Q), mỗi lớp có 20-30 trẻ (do yêu cầu bảo mật, danh

tính của nhà trẻ không được tiết lô) Tổng số 230 được đua vào giám sát trong thời

giam từ tháng 3/2014- hết tháng 5/2015 Hàng tháng, mẫu của 40 đến 50 trẻ được thu thập vào tuần thử 2 hang thang trong Š ngày, thông tin nhãn chúng học (tuổi, giới tính, cân nặng, chiều cao) và các thông tin lâm sang, có hoặc không mắc tiêu chây hoặc các triệu chứng khác của trổ khi đến trường được gủ chứp Trong trường, hợp trẻ nghí học, nguyên nhân nghí học cũng được điểu tra nhằm phát hiện kịp thời

những trường hợp tiêu chãy Trš mắc tiêu chảy được nhận biết khi trẻ vắ

bệnh tiêu chảy Trong thời gian nghiên cửu có 10 mẫu phân của trề có biểu hiện tiêu

mit vi

chảy và 694 mẫu phân của trẻ không có triệu chứng tiêu chảy:

Ở mục tiêu 1, chímg tôi sử đựng mẫu phân cỏa trẻ khỏe mạnh không có biển hiện

tiêu chấy để nhàt hiện NoV trong mẫn phân bằng phương pháp Real time RT-PCR

Ở mục tiêu 2, chúng tôi sử đụng mẫu quệt riêm mạc miệng của trẻ đã khuếch đại gen FUT-2, gidi trinh tự phát hiện SNP trên gen FU7-2 đế đánh giá liên quan giữa tính câm nhiễm NoV và kiểu gen EUT-2

Ở mục tiêu 3, chúng tôi sử đụng mẫu nước bọt của những trẻ này đề phát hiện kháng nguyên A, Ð, H, Le", Le’, I.e", Le bằng kỹ thuật EILISA để đánh giá mỗi tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tỏ chức và khả năng, cảm nhiễm NoV

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

a, Dia diễm

- Phòng thí nghiệm Miễn dich vắc xin - Viện Vệ sinh dich té Trung uong (thực hiện các xót nghiệm)

ö Thời gian

- Thu thập mẫu trong 15 tháng (từ tháng 3/201⁄4 đến tháng 5/2015)

-_ Xét nghiệm (xét nghiệm và định type NoV): Tháng 4 - tháng 7 năm 2015

2-3 Vật liệu

231 Máy móc, đụng cụ

- May real time PCR Rologene (Qiagen, Bite)

- Máy luân nhiệt ([ippendorf, Lloa Kỷ)

- May dign di (BioRad, Hoa Ky)

- May chup anh gel VersaQoc (BioRad, Hoa Ky)

- Tủ lạnh thường -20°C

- Tủ lạnh âm sâu -80°C

- Máy ly tân (Hettick, Đức),

- Dia 96 giéng Maxisorp (Nunc, Hoa Ky)

- Dau cén co loc, dng khit tring: 0,1 wl, 0,2 ml, 1,5 ml

Ngoài re, còn có các thiết bị khác phục vụ chơ quả trình nghiên cứu như: cân phân tich, may do pll, máy trộn, micrepipet, máy minispin, lò vị sóng

232 Sinh phẩm

- Bình phẩm cho phản ứng Realtre phát hiện các chúng MoV trong mau phan

+ Kit tach chiét ARN —Iligh pure viral RNA kit (Roche, Due)

| B6 sinh phim real time RT-PCR (SuperScript I Platinum One-Step qRT- PCR Kits-lnvitrogen, Hoa Ky)

+ Chímg đương NoV chủng G11 vả GH.4 (Phang Min dich Vac xin, Vién

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)

+ Cặp mỗi và dầu dò đặc hiệu NoV trong phân ứng Realtime RT-PCR

| Bé sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Đủc)

+R6 Kit Wivurd SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Ky)

- Sinh phẩm cho xác dịnh kiểu gen 7-2

| Kit tach chiét Gentra Puregene Buccal Cell Kát (Qiagen, Đức)

+ Méi amplify doan 1033 bp cia gon FUT 2 (IDT, Hoa Ky)

24

+ Bé Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Ky)

- Sinh phâm cho xác định kiểu hinh IIBGA (ABI va Lewis)

| Cée loai khang thé don dang A, B, H, Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b (Covance, Hoa ky)

+ Các loại kháng thẻ cộng hop dé khang chuột (KPL, Hoa Ky)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

241 Thu thập bệnh phẩm

- Thu thập mẫu phân: Dùng thìa sạch lây khoảng 5 g phân từ bô của trẻ không

có biểu hiện tiêu chây cho vào ông vô trùng, không có chất bão quần Bảo quần dng 6 - 20°C rồi vận chuyển đến viện Vệ sinh Dịch tế Trung wong dink ky 1 tháng/1 lần Tại phòng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở -70”C đến khi làm xét nghiệm

~ Thu thập mẫu niêm mạc: Lấy mẫu niêm mạc ít nhất 30 phút sau khi trẻ ăn Dùng chỗi lẫy mẫu quệt vào 2 má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần Cắt phân lông chỗi chờ vào ông có chứa 1 ral đệm bảo quân Bảo quần ở rhiệt độ phòng lối đa 1 tháng

trước khi tách chiết mẫu ADN

- Thu thập mẫu nước bot: Lay nude bot bing ông hút Mỗi trẻ lây khoảng 100-200] nước bọt, bảo quản mẫn ở 41°C réi vận chuyển đến viện Vệ sinh địch tế

242 Kj thudt real time-RT PCR phat hién ARN cia NoV

œ Phương pháp lách chiết ARN từ mẫu nhân

Xử lý mẫu:

Bude 1: Mẫu phân được lấy từ -80°C Sau khi tan băng, pha loãng 4 lần bằng

xước DBPC-HO (100 pl mau: 300 pl nude DEPC-H;O)

ước 2: Ly tâm 4.000 vỏng/phút trong 30 phút ở 4C, thu dịch nổi

ARN được tách chiết theo hướng dẫn của bộ kít High pure viral ARN của nha san xuat Roche, Đức Cụ thể:

ước I: Cho 200 ul dich néi mẫu pha loãng vào ông eppendorf 1,5 mÌ chứa hỗn

hop poly (A) carricr ARN: Binding Buller, trộn du trong 15 gidy

Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thưởng (15-25°C) trong 10 phút sau đỏ spindown

Tước 3: Dặt oột vào tưýp húng 2 ml mdi Dua toan bé dung dich min va poly (A) cartier ARN: Binding Buffer lén cột (tránh không làm ướt mép cộU Đồng rấp lại và ly tảm 8.000 vòng/phút trong 15 giây Chuyển cột sang tuýp 2 mÌ mới

Thước 4: Cần thận mở nắp cột, tránh không làm bắn giọt và nhiềm chéo Thêm

500 j.] Inhibitor Removal Buller vaa e6-Béng nip va ly tâm 8.000 vòng/phúi trong 1 phút Chuyên cột sang tuýp 2 ml mdi

Bude 5: Can thin mở nắp cột và cho 450 ml Wash Eiuffer vào ống lọc Đóng

nap và ly tâm 8000 vỏng/ phút trong 1 phúi Chuyên cột sang tbe 2 rảÌ mới

ước 6: Cân thận mỡ nắp cột và cho 450 ml Wash Buffer (lần 2) vào ống lọc Đồng nẫn và ly lâm 8000 vòng/ phút trong 1 phát BS dich trong tube 2 ml Ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 1Ô giây

Bước 7: Chuyển cột sang tưýp 1,5 ml mới và cho 5Ó pil dung dich Lilution Buffer vào giữa cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

Bude 8: Bs cét, thu dich, bio quin ARN eta virus 6 -80°C

b Kj thudt realtime-RT PCR phat hign ARN ctia Nol”

Phat hién ARN ctia NaV trang bệnh phẩm với cắp môi và đầu đỏ đặc hiệu có

độ nhạy và đặc hiệu cao Sử dụng dầu dò đặc hiệu cho phép phát hiện và khẳng, định sự có mặt ARN của NoV Cặp môi nhằm vào đoạn gen tiếp nối giữa gen mã

26

hea protein polymerase va gen ma hoa vé (capsid) của virus (vimg C), day là doạn

ít thay đổi nhất của NoV Mét đoạn ngắn có kích thước ~100 bp sẽ được nhân lên

và nhận biết bởi đầu đô đặc hiệu trong vừng gen này Dựa vào tin hiệu huỳnh quang

để nhận biết sự có mặt cúa ARN của virus Trình tự mỗi, đầu dò vá quy trình kỹ thuật đã được Kageyama và cộng sự (2003) [44] sử đụng Ngưỡng đương tinh thông,

thường của kỹ thuat real time RT-PCR phat hién NoV này là 40 [44] Các mẫu

dương tỉnh có Ct<30 được giải trình tự gen để xác định kiểu gen NoV dựa trên việc

phân tích ving gen capsid

Bảng 2.1 Thanh phin ky thuat Realtime RT-PCR don cap primer va probe

phat hign No¥ genotype GL

3 | Prmer G11'-Pri.3007 (20 uM) 15 pl 2uM

4 | Primer GIR-Pri.3010 (20 uM) 1,125 ul 1,5 uM

5 | Probe JIVIP-Pro.3015 (3 uM) 1,5 m 03uM

Bang 2.2 Thành phần kỹ thuật Realtime RT-PCR đơn cặp primer va probe

phát hiện NoV genotype GUL

4 Primer COG2R-Pri.3002 (20 uM) 1,125 pl 1,5 uM

Phản ứng được thực hiện trén may Q-Rotorgene (Qiagen, GmbH, Germany)

Điều kién nhw sau: 50°C trong 30 phút, 95°C trong 10 phút, 45 chu kỳ bao gồm

94°C trong 20 giây, 55°C trong 30 giây và chọn kênh đọc Green

243 Kỹ thuật RT PCR khuếch đại đoan yen vùng C cia NoV

Các mẫu dương tỉnh NoV tiếp tục được khuếch đại đoạn gen vùng C bằng

cặp mỗi đặc hiệu NeV, sử dụng bộ sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Dite)

Cặp mỏi đặc hiệu NoV có trình tự là

GISKE: S- CTG CCC GAA TY CTA AAT GA- 3`

GISKR: ICA ACC CAR CCA TTR TAC A- 5°

Va G2SKF: 5'- CNT GGG AGG GCG AIC GCA A-3

3CR CCN GCA TRIT CCR TTR TAC AT-3 [4]

Bang 2.3 Thanh phan phan ing RT-PCR don cap primer doi với G1

trong 30 giây, T2°C trong 45 giây ), 72°C trong 10 phiit, 10°C

Sân phẩm PƠR có kích thước khoảng 330 bạ (đối với GI) và 368 bp (đổi với

GI) Sản phẩm PCR được tỉnh sạch theo quy trình hướng đẫn của bộ kit Winzard

SV gel and PCR Clean-up System (Hing Promega-Hoa Ky) Cy the

Bude 1: Gel sau khi chạy điện di ding dao sạch và sắc để cắt gel có chứa sẵn

phẩm mong muốn dướt la cực tím Tránh để gel tiếp xúc với Lia cue Lim trong

thời gian dai

Bude 2: Dit gel dĩ vào trong tuýp 1,5ml, cân tuýp chứa gel Tink khéi lượng gel thu duge Nhé dung dich Membrane Binding Solution vao tuyp chita gel theo ty

lệ 100p] đang dịch Membrane Binđing Solurion tương ứng với 100mg gel

Bước 3: Trộn và ủ tuýp trong bể ồn nhiệt ở S0°C-6S°C trong 10 phút hoặc hon

dé gel tan hồn tồn, cứ 2-3 phút trộn đều hỗn địch 1 lần Néu gel >2% thi Ling thời gian ủ

Buớc 4: Sau khi gel tan hồn tồn, đưa 350H] vào cội SV Mimieolunm Ủ cột 1 phút tại nhiệt dộ phịng, Ly tâm 13.000 vỏng/phút trong | phat

Buớc 5: Nếu lượng hỗn địch >350u], lập lại bước trên

Tước 6: Loại bỏ địch Nhỏ 0,75ml dung dich Membrane wash sơlution vào cột Bước 7: Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch

Bude 8: Thém 0,$m! Membrane wash solution vào cột, ly lâm 13.000 vịng/phút trong 5 phút

Buớc 9: Lòi bỏ địch và ly tâm 13.000 vịng/phít trong 1 phút

Bước 10: Chuyển cột sang tuýp 1.5rnl mới Nhỏ 50ul H;O-DEPC vào chính giữa mảng, ủ ở nhiệt độ thường trong 1 phút sau đĩ ly lâm 13.000 vỏng/phút trong 1 plút Nếu cần tăng nịng độ sẵn phẩm mong muốn thì cĩ thể giảm lượng, H,0 cho vào ít nhật là 15L

Bước 11: Bồ cột và bảo quản sắn phẩm é -20'

Sản phẩm PCR sau tĩnh sạch được kiểm tra độ tink sạch và hàm lượng bằng phương pháp do OD tai bude sĩng 260 nm vả diện di trên gel agarose 1% Những mẫu đạt tiêu chuẩn về độ tỉnh sạch (I bang duy nhất trên gel agarese) và liảm lượng (nồng đơ tối thiêu 20 ng/HÏ} dược gửi di giải trình Lự gen ở cơng ty

Macrogen (làn Quốc)

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần miên Moga5 Cây phân loại được xây dụng dựa vào các trình tự trên Genbank và các trình tự gen của các chúng NoV được tìm thấy trong nghiên cứu nay

30

244 Phương phúp xác định kiéu gen FUT-2

ADN được tách chiết từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ theo hướng dẫn của bộ kit Gentra Puregene Buccal Cell cia nha san xuat Qiagen, Pate Cu thé:

Bude 1; Mau té bao niém mạc miệng được thu thập bằng cách: Dùng chỗi lây mẫu

quệt vào 2 má trong cửa trẻ, mỗi bên 10 lần để thu các tế bảo miéng Dé thu đc

Bước 3: Phá vỡ tế báo lam theo bước 3a hoặc 3b dưới đây:

3a Ủ mẫu ở 65 °C trong vòng ít nhất 15 phút (dễ dạt hiệu quả cao có thẻ ủ mẫu trong vòng 60 phút),

3b Để dạt hiệu quá tách, thêm 1,5 yl Puregene proteinase K (cat no 158918), đảo trộn 25 lần và ú ở 55°C trong vòng it nhat 1 h (hoặc qua đêm để đạt hiệu quá cao nhất),

Bude 4: Lay

địch nhiều nhất

au dung cura bang cach quel lên thành ông làm sao cho giữ đuợc

Bước 5: Thém 1,5 pl RNase va dao tron 25 lan U mẫu ở 37°C trong 15 phút

(hoặc 1 giờ) Sau đó, làm lạnh nhanh bằng cách thã vào đá trong vòng 1 phút, Bude 6 Thêm 100 pl Protein Precipitation Solution va vortex manh trong khoảng 20s

Bước 7: Ú trong đá trong khoảng 5 phút

Bước & Ly tam miu ở 13000-16000 vòng/phút trong vòng 3 phút Các protein

tủa thành hạt cứng Nếu protein không tủa thành viên cứng thì tiếp tục ủ mẫu

trong đá 5 phút và ly ỡ 13000-16000 vỏng/phút trong vòng 3 phút

Bước 9: Hút Ioàn bộ dịch nội sang một eppendorf 1,5 ml sach Bé sung 300 ul

31